CN102197801A - 一种非冷冻长期保存细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种非冷冻长期保存细胞的方法。该方法的操作步骤包括：1)原代培养；2)传代培养；3)非冷冻长期细胞保存-接触抑制。本发明的有益效果是：使用本发明方法相对常规液氮罐保存细胞成本更低、污染更少、操作简便可靠。特别对于一些特殊的项目，比如稀少、珍贵转基因细胞进行一批体细胞克隆后，需要进一步验证胚胎体内发育情况才可以决定是否大批量进行胚胎生产即胚胎移植。妊娠期间的这些特殊细胞如果用于冷冻保存，存活率难以保证，同时增加了污染机会；如果继续进行常规传代会增加细胞变异和污染的概率，进而影响胚胎体内外正常发育。因此，使用非冷冻长期保存细胞更是一种可供选择的方法。

Description

一种非冷冻长期保存细胞的方法

技术领域：

本发明属于生命科学领域，具体是一种非冷冻长期保存细胞的方法。

背景技术：

至今并未发现有与本发明相同或相似的报导。

发明内容：

本发明的目的是提供一种非冷冻长期保存细胞的方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下。

该方法的操作步骤如下：

一种非冷冻长期保存细胞的方法，该方法的操作步骤如下：

1)原代培养

利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离成纤维细胞，无菌采集动物活组织块，用75％酒精快速冲洗约60S，立即放入含3倍双抗的DPBS中；提前30min开启无菌超净台紫外线创造无菌环境，将浸泡于3倍双抗的DPBS中的组织块用手术剪剪成适当小块，用经消毒的镊子将组织块转入高压灭菌的青霉素小瓶中，再用手术剪剪成碎块，加入2～3ml含3倍双抗的DPBS，转入灭菌的塑料离心管，于震荡器上震荡，然后1100r/min离心4min，如此反复离心2～3次，最后加入2～3mL DMEM混匀，1100r/min离心4min，弃去上清液，补充2～3ml新鲜DMEM；用移液器混匀，吸取适量组织块于细胞培养皿内，轻轻震荡，使组织块分布均匀，放入37～39℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱培养过夜，第二天补加1～2mL新鲜DMEM，这样培养3～5d就可以看到成纤维细胞游出，根据培养液体颜色变化，颜色渐黄，2～3d换液一次，随着培养时间的延长，细胞逐渐汇合，待原代细胞生长80％以上汇合时开始传代；

2)传代培养

待原代细胞生长80～100％汇合时，弃去旧培养液，加入无Ca²⁺、Mg²⁺DPBS2～3mL室温下漂洗1～2次，弃去漂洗液，加入0.5～1mL胰蛋白酶-EDTA消化液，微浸细胞即可，置于37～39℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱3min后，显微镜下观察，待大部分细胞趋向变圆，轻轻震荡培养皿，立即加入2～3mL预热的DMEM培养液，并用移液器轻轻吹吸数次，收集细胞悬液于灭菌的离心管内，1000r/min离心4min，弃去上清液，加入2～3mL新鲜DMEM，进行传代，2d后更换新鲜培养液，以后2～3d换液一次。待纯化细胞生长80％以上汇合时开始传代；

3)非冷冻长期细胞保存-接触抑制

待纯化细胞生长至100％汇合时，维持细胞生长原状态，不进行常规传代即进行长期接触抑制处理，记为接触抑制0天；接触抑制的前1～2周按2～3d换一次培养液，以后根据液体颜色和细胞代谢状态随时更换培养液，根据需求适时解除抑制按上述2)传代培养方法进行细胞传代，解除抑制1～2代后细胞形态和生长规律即可恢复正常。

本发明的有益效果是：

使用本发明方法相对常规液氮罐保存细胞成本更低、污染更少、操作简便可靠。

特别对于一些特殊的项目，比如稀少、珍贵转基因细胞进行一批体细胞克隆后，需要进一步验证胚胎体内发育情况才可以决定是否大批量进行胚胎生产即胚胎移植。妊娠期间的这些特殊细胞如果用于冷冻保存，存活率难以保证，同时增加了污染机会；如果继续进行常规传代会增加细胞变异和污染的概率，进而影响胚胎体内外正常发育。因此，使用非冷冻长期保存细胞更是一种可供选择的方法。

附图说明

图1是接触抑制前肾脏成纤维细胞图片。

图2接触抑制90天肾脏成纤维细胞。

图3解除抑制后肾脏成纤维细胞。

图4接触抑制前附睾成纤维细胞。

图5接触抑制90天附睾成纤维细胞。

图6解除抑制后附睾成纤维细胞。

具体实施方式

下面以新生广西巴马香猪附睾成纤维细胞和肾脏成纤维细胞为例对本发明作进一步描述。需要说明的是，本实施例仅是本发明的具体施例。显然，本发明不限于实施例。本领域的技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

1.成纤维细胞分离培养

获取1～2周龄内广西巴马香猪，无菌采集附睾和肾脏组织，按照上述介绍程序原代培养分离广西巴马香猪附睾成纤维细胞和肾脏成纤维细胞。

2.非冷冻长期细胞保存(接触抑制)

为进一步研究成纤维细胞非冷冻体外长期保存的能力，待细胞生长至100％汇合时记为0d对其进行长期接触抑制，根据细胞形态和生长规律研究其体外增殖潜力。

3.结果

为了研究肾脏成纤维细胞体外长期保存的潜力，待其生长至100％汇合时记为抑制0天，细胞形态如图1所示，对其进行了长达90d以上的长期接触抑制，抑制的前段时间细胞还仍在继续生长，呈典型的成纤维状或梭形或线状，整体排列成流水状、旋涡状或放射状，并出现明显的重叠式或复层式生长态势，原来的集团继续生长，与临近的成纤维细胞团交叉汇合并呈放射形的网格状生长，细胞形态如图2所示。开始由于细胞的重叠生长培养液颜色变化比较快，每2d换液，随着抑制时间的加长，细胞的生长逐渐缓慢或抑制，每3～4天换液。否则由于液体的过分蒸发，造成培养液渗透压、营养等发生改变，进而影响细胞的正常情况。解除抑制培养后细胞可以正常贴壁生长，并且在培养的当代内就可以恢复形态，与抑制前相同，按1∶2～3传代，约3～4d即可汇合细胞形态如图3所示。

为了研究附睾成纤维细胞体外长期保存的能力，待其生长至100％汇合时记为抑制0天，细胞形态如图4所示，对其进行了长达90d以上的长期接触抑制，每2～4d换液，防液体过分蒸发，以至影响细胞正常情况。形态呈铺路石状或大理石花纹状，细胞形态如图5所示，解除抑制后可以正常贴壁生长，形态和生长规律与抑制前相同，按1∶3传代，约3～4d即可长满，细胞形态如图6所示。

Claims (1)

1.一种非冷冻长期保存细胞的方法，其特征在于，该方法的操作步骤如下：

1)原代培养

利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离成纤维细胞，无菌采集动物活组织块，用75％酒精快速冲洗约60S，立即放入含3倍双抗的DPBS中；提前30min开启无菌超净台紫外线创造无菌环境，将浸泡于3倍双抗的DPBS中的组织块用手术剪剪成适当小块，用经消毒的镊子将组织块转入高压灭菌的青霉素小瓶中，再用手术剪剪成碎块，加入2～3ml含3倍双抗的DPBS，转入灭菌的塑料离心管，于震荡器上震荡，然后1100r/min离心4min，如此反复离心2～3次，最后加入2～3mL DMEM混匀，1100r/min离心4min，弃去上清液，补充2～3ml新鲜DMEM；用移液器混匀，吸取适量组织块于细胞培养皿内，轻轻震荡，使组织块分布均匀，放入37～39℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱培养过夜，第二天补加1～2mL新鲜DMEM，这样培养3～5d就可以看到成纤维细胞游出，根据培养液体颜色变化，颜色渐黄，2～3d换液一次，随着培养时间的延长，细胞逐渐汇合，待原代细胞生长80％以上汇合时开始传代；

2)传代培养

待原代细胞生长80～100％汇合时，弃去旧培养液，加入无Ca²⁺、Mg²⁺DPBS2～3mL室温下漂洗1～2次，弃去漂洗液，加入0.5～1mL胰蛋白酶-EDTA消化液，微浸细胞即可，置于37～39℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱3min后，显微镜下观察，待大部分细胞趋向变圆，轻轻震荡培养皿，立即加入2～3mL预热的DMEM培养液，并用移液器轻轻吹吸数次，收集细胞悬液于灭菌的离心管内，1000r/min离心4min，弃去上清液，加入2～3mL新鲜DMEM，进行传代，2d后更换新鲜培养液，以后2～3d换液一次，待纯化细胞生长80％以上汇合时开始传代；

3)非冷冻长期细胞保存-接触抑制

待纯化细胞生长至100％汇合时，维持细胞生长原状态，不进行常规传代即进行长期接触抑制处理，记为接触抑制0天；接触抑制的前1～2周按2～3d换一次培养液，以后根据液体颜色和细胞代谢状态随时更换培养液，根据需求适时解除抑制按上述2)传代培养方法进行细胞传代，解除抑制1～2代后细胞形态和生长规律即可恢复正常。

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