CN102197146B - 盐皮质激素受体激活的生物标志物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和SERPINA3用作患者中盐皮质激素受体(MR)激活的生物标志物的用途。更具体地，本发明涉及预测患者对MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂的治疗的反应性的方法，所述方法包括测定得自所述患者的生物样品中NGAL基因和/或SERPINA3基因的表达水平。

Description

盐皮质激素受体激活的生物标志物

技术领域

本发明涉及患者中盐皮质激素受体(MR)激活的生物标志物。

背景技术

盐皮质激素受体(MR)是包括糖皮质激素受体(GR)、雄激素受体(AR)、孕激素受体(PR)和雌激素受体(ER)的经典类固醇激素受体中的一个成员(Funder，1997)。这些受体是调节从器官发育和分化到情绪控制和应激反应的多种生理过程的激素激活的转录因子(Beato等，1995)。针对MR的生理激素是醛固酮，其是由肾上腺分泌的类固醇激素。

MR已在血管、脑和心脏的非上皮位点上被定位(Bonvalet JP等，1995；Lombes M等，1992；Tanaka J.等，1997)。在过去10年中，有许多研究表明盐皮质激素的非上皮作用造成血管和心肌的纤维化和营养效应(Brilla CG.等，1992，Ullian ME.等，1992；Young M.等，1994)。另外，已经在包括人内皮细胞和血管平滑肌细胞(VSMC)(Hatakeyama H.等，1994)以及动物试验中的心肌细胞(Silvestre JS.等，1988)中发现了MR。一些研究(Brilla CG等，1992；Young M.等，1994)通过刺激心肌细胞中的胶原形成将盐皮质激素与心肌纤维化联系起来。

Farquharson CA.等人(2000)间接地证明了醛固酮可能在慢性心力衰竭的内皮功能障碍发挥作用。因此MR是重要的药物靶点，特别是对于高血压和心力衰竭的治疗。

例如，醛固酮拮抗剂螺内酯(也称为ALDACTONE

，PFIZER)与盐皮质激素受体结合并阻断醛固酮的结合。这一类固醇化合物普遍用于治疗充血性心力衰竭。实际上，螺内酯已经显示出药理学作用和良好的耐受性，从而降低总体死亡风险、进行性心力衰竭导致的死亡和心源性猝死以及心脏原因导致住院的风险。在随机螺内酯评价研究(Randomized Aldactone Evaluation Study，RALES)中对螺内酯施用于严重心力衰竭患者进行了评估。RALES是随机、双盲、安慰剂对照的实验，其招募的参与者患有严重的心力衰竭且左心室射血分数不高于35％，和正在接受标准治疗(其通常包括血管紧张素转化酶抑制剂、袢利尿剂，且有些情况下包括地高辛)。以螺内酯治疗的RALES受试者相对于以安慰剂治疗的受试者在死亡率和住院发生率方面具有统计学显著的降低(Pitt B.等，1999)。

相似地，依普利酮(eplerenone)代表了结合在盐皮质激素受体上的另一种醛固酮阻断剂。相对于重组人糖皮质激素受体、孕激素受体和雄激素受体，伊普利酮优先与重组人盐皮质激素受体结合，因此其作用是选择性的。与施用伊普利酮有关的治疗效益已经在多个临床试验中得到了证明。在一个包括6600名受试者的这类研究[the EplerenonePost-Acute Myocardial Infarction Heart Failure Efficacy and SurvivalStudy(EPHESUS)]中，发现伊普利酮显著降低由心血管原因导致死亡的风险和心血管事件导致住院的风险(Pitt B.等，2003)。也观察到心源性猝死率的降低。

但是，醛固酮不是已知激活MR的唯一的内源性激素。例如内源性糖皮质激素也可激活MR。实际上，糖皮质激素已证明在心肌纤维化发展的早期阶段产生氧化应激和血管炎症。因此即使在不存在醛甾酮过多症时也可能在心血管系统中发生MR激活的不利效应(Funder JW，2006)，且醛固酮的血浆水平不提供心血管系统中MR激活的指示。而且，在心力衰竭、心肌梗塞或与高血压有关的终末器官(end-organ)损伤中，在心脏和血管中MR表达增加(Nagata K等，2006；Takeda M.等，2007)。

因此，本领域中仍需要开发用于评价心血管系统中MR激活的精确的和特异性的方法。

另外，给予患者MR拮抗剂可能会伴有严重的不良反应，例如高血钾症。实际上，RALES研究公布后已经有一些严重的高血钾症的报告。在一个这样的报告中描述了不少于25名患者出现了需要进行急救的螺内酯相关的高血钾症(Schepkens H.等，2001)。这25名患者中有4名需要心血管复苏治疗，25名患者中有2名死亡。一些作者估计在接受该MR拮抗剂的患者中，临床显著的高血钾症的发生率约为10％。

因此，本领域中仍然需要开发精确的和特异性的方法来预测心力衰竭患者对MR拮抗剂治疗的反应性，以防止或限制这种治疗的不良反应。

发明概述

本发明涉及一种评价患者中盐皮质激素受体(MR)激活的方法，包括测定从所述患者获得的生物样品中选自中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)基因和SERPINA3基因的一种或两种生物标志物的表达水平。

本发明也涉及一种预测患者对MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂的治疗的反应性的方法，所述方法包括测定从所述患者获得的生物样品中选自中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)基因和SERPINA3基因的一种或两种生物标志物的表达水平。

本发明还涉及MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂用于治疗患有心血管疾病、糖尿病、肥胖或代谢综合症(metabolic syndrome)的患者的用途，所述患者通过本发明方法被分类为响应者(responder)。

发明详述

定义

术语“MR”是指盐皮质激素受体。当用于本文时，术语“MR激活”是指通过盐皮质激素(即醛固酮)或糖皮质激素导致盐皮质激素受体的激活。

术语“MR拮抗剂”是指能抑制(部分地或完全地)MR的生物激活的天然的或非天然的化合物。已知有众多的MR拮抗剂，包括螺内酯、epoxymexrenone和依普利酮。本发明的范围包括所有目前已知的MR拮抗剂以及未来发现的MR拮抗剂。醛固酮拮抗剂可以是螺内酯型的化合物(螺内酯、螺内酯的活性代谢物如坎利酮或其盐，例如坎利酸钾)。醛固酮拮抗剂也可以是环氧-类固醇的醛固酮拮抗剂。另一毓系列的类固醇型MR拮抗剂以含环氧的螺内酯衍生物为例。例如，美国专利No.4,559,332描述了作为MR拮抗剂的螺内酯衍生物。进一步的MR拮抗剂可以是屈螺酮(DRSP)，其是螺内酯的类似物。

术语“醛固酮合成酶抑制剂”意图包括抑制醛固酮合成酶的化合物或试剂，醛固酮合成酶通过使皮质酮羟基化以形成18-OH-皮质酮和使18-OH-皮质酮形成醛固酮而将皮质酮转化成醛固酮。本领域已知许多的醛固酮合成酶抑制剂。本发明的范围包括所有目前已知的醛固酮合成酶抑制剂以及未来发现的醛固酮合成酶抑制剂。所述醛固酮合成酶抑制剂可以是类固醇类或非类固醇类醛固酮合成酶抑制剂。醛固酮合成酶抑制剂可以是非类固醇或类固醇芳香酶抑制剂。非类固醇芳香酶抑制剂可以包括阿那曲唑(anastrozole)和法倔唑(fadrozole)(包括其(+)-对映异构体)。类固醇芳香酶抑制剂的实例是依西美坦(exemestane)。另一非类固醇类醛固酮合成酶抑制剂是法倔唑盐酸盐的(+)-对映异构体(美国专利4617307和4889861)，其在Fiebeler A.等(2005)中也有描述。

术语“脂质运载蛋白2”或“NGAL”在本领域中具有一般的含义，其是指如在Schmidt-Ott KM.等(2007)中描述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。NGAL可以是任何来源的，但是通常是哺乳动物(例如人类和非人类灵长类动物)NGAL，特别是人NGAL。术语“NGAL基因”是指编码NGAL mRNA和蛋白质的任何核苷酸序列，例如基因组DNA序列和任何天然存在的NGAL及其变体和修饰形式。其也包括编码NGAL mRNA和蛋白质的人工序列，例如cDNA。在GenBank数据库中提供了人天然NGAL核苷酸序列的实例，其登陆号为NM_005564。术语“NGAL mRNA”在本领域中具有一般的含义，是指在表达NGAL基因时合成的信使RNA。术语“NGAL蛋白质”是指由NGAL基因的表达获得的氨基酸序列，及任何天然存在的NGAL及其变体和修饰的形式。

在GenPept数据库中提供了人天然NGAL氨基酸序列的实例，其登陆号为NP_005555。当用于本文时，术语“NGAL蛋白质”也包括由NGAL与金属蛋白酶MMP-9(也称为明胶酶B)、92kDa的IV型胶原酶、92kDa的明胶酶和V型胶原酶形成的异二聚体(Kjeldsen等人，1993)。

术语“抗NGAL抗体”指的是识别NGAL的抗体或其片段。

术语“SERPINA3”基因具有本领域中的一般含义，其也称为CT、AACT、GIG24、GIG25、MGC88254。该基因的正式全称为丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)肽酶抑制剂，分化体A(α-1抗蛋白酶、抗胰蛋白酶)，成员3。SERPINA3可以是任何来源的，但是通常是哺乳动物(例如人类和非人类灵长类动物)SERPINA3，特别是人SERPINA3。术语“SERPINA3基因”是指编码SERPINA3 mRNA和蛋白质的任何核苷酸序列，例如基因组DNA序列和任何天然存在的SERPINA3及其变体和修饰形式。其也包括编码SERPINA3 mRNA和蛋白质的人工序列，例如cDNA。术语“SERPINA3 mRNA”具有本领域的一般含义，是指在SERPINA3基因表达时合成的信使RNA。术语“SERPINA3蛋白质”是指由SERPINA3基因的表达所得的氨基酸序列，以及任何天然存在的SERPINA3及其变体和修饰的形式。

术语“SERPINA3抗体”是指识别SERPINA3蛋白质的抗体或其片段。

术语“心血管系统”具有本领域中的一般含义，表示由心脏、血管或脉管以及构成血液的细胞和血浆组成的系统。

术语“心血管疾病”具有本领域中的一般含义，且用于归类影响心脏、心脏瓣膜、血液和身体的脉管系统的多种病症。心血管疾病包括内皮功能障碍、冠状动脉病、心绞痛、心肌梗死、充血性心力衰竭、高血压、脑血管病、中风、短暂性缺血发作、深静脉血栓形成、外周动脉疾病、心肌病、心律失常、主动脉狭窄和动脉瘤。

当用于本文时，术语“生物标志物的预定值”是指从普通群体或从选定的受试群体获得的生物样品中该生物标志物的量。例如，选定的群体可由明显健康的受试者组成，例如之前没有任何表明存在心血管疾病的征兆或症状的个体。在另一实例中，预定值可以是从患有已确认的心血管疾病的受试者获得的生物标志物的量。预定值可以是阈值或范围。预定值可基于明显健康的受试者与患有已确认的心血管疾病的受试者之间的比较测量而设定。

当用于本文时，术语“患者”是指哺乳动物，例如啮齿动物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物。优选地，本发明的患者为人类。

对于MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂治疗的“响应者”或“具有反应性”的患者或患者组是指在分别以MR拮抗剂或以醛固酮合成酶抑制剂治疗时，表现出或会表现出心血管疾病的明显的临床改善的患者。根据本发明的方法，如果患者中选自中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)基因和SERPINA3基因的一种或两种生物标志物的表达明显不同于从普通群体或健康受试者获得的预定值，则将该患者分类为对治疗的响应者。优选地，如果患者中选自中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)基因和SERPINA3基因的一种或两种生物标志物的表达水平高于从普通群体或健康受试者获得的预定值，则该患者为响应者。

通常，如果患者中所述一种或两种生物标志物的表达水平与所述预定值的表达水平的比高于1.2、优选1.5、甚至更优选2、甚至还更优选5、10或20时，则认为该患者中所述一种或两种生物标志物的表达水平高于从普通群体或健康受试者获得的预定值。

当用于本文时“健康受试者”是指未患有任何已知病症的受试者，特别是未患有任何心血管疾病、糖尿病、肥胖或代谢综合症等任何疾病的受试者的群体。

术语“生物样品”是指任何得自患者的生物样品。这类样品的实例包括体液、组织、细胞样品、器官、活组织样品等。优选的生物样品是细胞或组织样品。优选的生物样品是全血、血清、血浆或尿液。

当用于本文时，术语“生物标志物”一般是指一种分子，即基因(或编码所述基因的核酸)、蛋白质，在来自患者的生物样品中所述分子的表达可通过本领域中标准的方法(以及本文公开的方法)检测并且预示或指示提供样品的患者的病症。

本发明的预测方法

本发明涉及一种评估患者中MR激活的方法，包括测定从所述患者获得的生物样品中选自中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)基因和SERPINA3基因的一种或两种生物标志物的表达水平。

在具体的实施方式中，本发明涉及一种评估所述患者的心血管系统中MR激活的方法，包括测定从所述患者获得的生物样品中选自中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)基因和SERPINA3基因的一种或两种生物标志物的表达水平。

本发明还涉及一种预测患者对MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂治疗的反应性的方法，所述方法包括测定从所述患者获得的生物样品中选自中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)基因和SERPINA3基因的一种或两种生物标志物的表达水平。

在具体的实施方式中，患者患有心血管疾病。更具体地，所述患者患有：内皮功能障碍、冠状动脉病、心绞痛、心肌梗死、充血性心力衰竭、高血压、脑血管病、中风、短暂性缺血发作、深静脉血栓形成、外周动脉疾病、心肌病、心律失常、主动脉狭窄或动脉瘤。在具体的实施方式中，所述患者患有充血性心力衰竭或高血压。

在具体的实施方式中，所述患有心血管疾病的患者已经进行了标准的治疗，所述标准的治疗选自：血管紧张素转化酶抑制剂、利尿剂、血管扩张剂、β受体阻断剂、洋地黄和抗凝剂。

在另一具体的实施方式中，患者患有肥胖、糖尿病或代谢综合症。实际上，已经证明MR激活与肥胖和代谢综合症的病理生理学发展有关(Caprio M.等人，2007；Lamounier-Zepter V.等人，2005)。

在一个实施方式中，本发明涉及评估患者中MR激活的方法，包括测定得自所述患者的细胞或组织样品中一种或两种生物标志物mRNA的量。

本发明也涉及预测患者对MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂治疗的反应性的方法，该方法包括测定得自所述患者的细胞或组织样品中一种或两种生物标志物mRNA的量。

优选的细胞是外周血单核细胞(PBMC)、巨噬细胞、多核细胞和内皮细胞以及内皮祖细胞(EPC)。甚至更优选地，本发明的细胞为PBMC或内皮细胞。可容易地从其中提取总RNA。细胞或组织样品可在使用之前进行处理，例如以使得核酸可得。细胞或蛋白质裂解、核酸的浓缩或稀释的技术是本领域技术人员已知的。

对基因表达水平的测定可通过多种技术进行。通常，检测的表达水平是相对表达水平。

更优选地，测定包括使样品与选择性试剂(例如探针、引物或配体)接触，从而检测样品中原有的感兴趣的核酸的存在或测量其量。

在优选的实施方式中，表达水平可通过测定mRNA的量来确定。

本领域公知测定mRNA的量的方法。例如先根据标准方法(例如使用水解酶或化学溶液)提取包含在样品(例如得自患者的细胞或组织)中的核酸，或按照制造商的指示使用核酸结合树脂提取。然后通过杂交(例如RNA印迹分析)和/或扩增(例如RT-PCR)检测提取的mRNA。在优选的实施方式中，一种或两种生物标志物的表达水平通过RT-PCR，优选定量或半定量RT-PCR，甚至更优选实时定量或半定量RT-PCR测定。在优选的实施方式中，NGAL基因的表达水平通过定量PCR使用正向引物5′-GGACCAGGGCTGTCGCTACT-3′(SEQ ID NO：1)和反向引物5′-GGTGGCCACTTGCACATTGT-3′(SEQ ID NO：2)进行测量，或使用正向引物5′-TCACCCTGTACGGAAGAACC-3′(SEQ ID NO：3)和反向引物5′-GGTGGGAACAGAGAAAACGA-3′(SEQ ID NO：4)进行测量。

其它扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)，链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。

含有至少10个核苷酸并且表现出与本文关注的mRNA的序列互补性或同源性的核酸可用作杂交探针和扩增引物。应该理解的是所述核酸不必与大小相当的同源区域完全相同，但是通常与大小相当的同源区域至少约80％相同，更优选地85％相同，再更优选地90％～95％相同。在某些实施方式中，有利的是将核酸与合适的手段(mean)(例如可检测标记)组合使用以检测杂交。本领域已知许多合适的指示剂，包括荧光的、放射性的、酶的或其它配体(例如抗生物素蛋白/生物素)。

探针通常包含长度为10至1000个，例如10至800个、更优选为15至700个，典型地为20至500个核苷酸的单链核酸。引物通常是长度为10至25个核苷酸的较短的单链核酸，其设计为与待扩增的目的核酸完全或几乎完全匹配。探针和引物对其杂交的核酸是“特异的”，即它们优选在高严格杂交条件(相应于最高解链温度Tm，例如50％的甲酰胺，5x或6x的SCC。SCC是0.15M NaCl，0.015M的柠檬酸钠)下杂交。

上述扩增和检测方法中所用的核酸引物或探针可以组装成试剂盒。所述试剂盒包括通用引物(consensus primer)和分子探针。优选的试剂盒也包括确定是否发生扩增所需的组分。试剂盒还可包括例如PCR缓冲剂和酶；阳性对照序列，反应控制引物(reaction control primer)；和用于扩增和检测特定序列的说明。

在另一实施方式中，本发明涉及评估患者中MR激活的方法，包括测量得自所述患者的生物样品中一种或两种生物标志物蛋白的浓度。

在另一实施方式中，本发明涉及预测患者对MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂治疗的反应性的方法，该方法包括测量得自所述患者的生物样品中一种或两种生物标志物蛋白的浓度。

在优选的实施方式中，测量一种或两种生物标志物蛋白在得自所述患者的血液样品、血浆样品、血清样品或尿液样品中的浓度。

在具体的实施方式中，本发明的方法包括使生物样品与能够选择性地与生物样品中的一种或两种生物标志物蛋白相互作用的结合伴体接触。该结合伴体可以是多克隆的或单克隆的抗体，优选是单克隆抗体。在另一实施方式中，结合伴体可以是适体。

本发明的多克隆抗体或其片段可根据已知的方法通过给予宿主动物合适的抗原或表位制备，所述宿主动物可选自例如猪、奶牛、马、兔、山羊、绵羊和小鼠等。本领域已知的各种助剂也可用于提高抗体产率。尽管用于实现本发明的抗体可以是多克隆抗体，但优选使用单克隆抗体。

本发明的单克隆抗体或其片段可使用任何用于由培养中的传代细胞系产生抗体分子的技术制备和分离。用于制备和分离的技术包括但不限于：由Kohler和Milstein(1975)最初说明的杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Cote等，1983)和EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985)。

或者，描述用于制备单链抗体的技术(见例如美国专利No.4,946,778)可适用于制备抗NGAL或抗SERPINA3单链抗体。用于实施本发明的抗体也包括抗NGAL或抗SERPINA3片段，包括但不限于F(ab′)2片段和Fab片段，F(ab′)2片段可通过胃蛋白酶消化完整的抗体分子生成，Fab片段可通过还原F(ab′)2片段的二硫键生成。或者，可构建Fab和/或scFv表达文库以使得能够快速识别具有期望的地NGAL或SERPINA3的特异性的片段。例如，可使用抗体的噬菌体展示。在这种方法中，单链Fv(scFv)或Fab片段在合适的噬菌体(例如M13)的表面上表达。简言之，移除已经以蛋白质进行免疫的合适宿主(例如小鼠)的脾细胞。从这些产生期望的抗该蛋白质的抗体的细胞获得VL和VH链的编码区域。然后将这些编码区域与噬菌体序列的末端融合。一旦噬菌体掺入了合适的载体，例如细菌，噬菌体会展示该抗体片段。抗体的噬菌体展示也可通过本领域技术人员已知的组合方法提供。然后噬菌体展示的抗体片段可用作免疫分析的一部分。

例如Kjeldsen等人(1996)描述了NGAL的单克隆抗体。市售的NGAL的单克隆抗体的实例包括从Antibody Shop(丹麦，哥本哈根)获得的那些，如HYB-211-01、HYB-211-02和NYB-211-05。通常HYB-211-01和HYB-211-02可以以其还原(reduced)和未还原(unreduced)的形式与NGAL一起使用。NGAL抗体也可从R&D Systems购得，编号为AF 1857。

市售的SERPINA3的单克隆抗体的实例包括从Abgent Inc.(圣地亚哥)和从Sigma-Aldrich Co.获得的SERPINA3的单克隆抗体。

在另一实施方式中，结合伴体可以是适体。适体是在分子识别方面作为抗体的替代物的一类分子。适体是能以高亲和力和特异性识别几乎任何类型的靶分子的寡核苷酸或寡肽。如Tuerk C.(1997)所述，这类配体可通过随机序列文库的指数富集的配体系统进化(systematicevolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)分离。随机序列文库可通过DNA的组合化学合成获得。在该文库中，各个成员是具有独特序列的线性寡聚物(最终经化学修饰的)。Jayasena S.D.(1999)综述了该类分子的可能的修饰、用途及优点。肽适体由通过两种杂交方法选自组合文库的由平台蛋白(platform protein)(例如大肠杆菌硫氧还蛋白A)展示的构象约束性抗体可变区组成(Colas等，1996)。

本发明的结合伴体，例如抗体或适体，可以用可检测的分子或物质标记，例如荧光分子、放射性分子或任何其它本领域已知的标记。本领域已知通常直接地或间接地提供信号的标记。

当用于本文时，涉及抗体的术语“标记的”意图包括通过将可检测物质，例如放射性物质或荧光团(例如异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)或靛青(Indocyanine)(Cy5))偶联(即物理连接)至抗体或适体而对抗体或适体进行直接标记，以及通过与可检测物质的反应性对探针或抗体进行间接标记。本发明的抗体或适体可通过本领域已知的任何方法用放射性分子标记。例如放射性分子包括但不限于用于闪烁扫描研究的放射性原子，例如I123、I124、In111、Re186、Re188。

上述分析通常涉及将结合伴体(即抗体或适体)结合至固体载体。可用于实施本发明的固体载体包括基底例如硝基纤维素(例如膜或微滴定孔的形式)、聚氯乙烯(例如片或微滴定孔)、聚苯乙烯胶乳(例如珠或微滴定板)、聚偏氟乙烯、重氮化纸(diazotized paper)、尼龙膜、活化珠、磁反应性珠(magnetically responsive bead)等。

一种或两种生物标志物蛋白的浓度可通过使用标准的免疫诊断技术进行测量，标准的免疫诊断技术包括免疫分析(例如竞争法、直接反应或夹心型测试(sandwich type assay))。这类免疫分析包括但不限于：凝集试验、酶标记和介导的免疫测试(例如ELISA)、生物素/抗生物素蛋白型测试、放射免疫测试、免疫电泳、免疫沉淀。

更具体地，可使用ELISA方法，其中微滴定板的孔涂覆有一系列识别所述一种或两种生物标志物蛋白的抗体。然后将含有或怀疑含有所述一种或两种生物标志物蛋白的生物样品加入涂覆的孔中。在孵育足够的时间以使得形成抗体-抗原复合物后，可以洗涤该板以除去未结合的部分，再加入可检测地标记的二级结合分子。使二级结合分子与任何捕获的样品标志物蛋白反应，洗涤板并以本领域公知的方法检测二级结合分子的存在。

Kjeldsen等(1996)、Mishra J.等(2005)和Wang等(2007)说明了用于检测NGAL的合适的ELISA方法。Blaser J.等(1995)说明了用于检测NGAL的夹心酶免疫分析方法。Xu SY.等(1994)说明了用于检测NGAL的放射免疫分析方法。

用于检测NGAL的ELISA试剂盒可购自AntibodyShop(Grusbakken8 DK-2820Gentofte-Denmark)，编号为KIT 036或KIT 037；R&DSystems Europe(Lille-France)，编号为DLCN20；MBL International(Woburn，MA 01801，USA)，编号为CY-8070。用于定量NGAL/MMP9复合物浓度的免疫测试可购自R&D Systems Europe(Lille-France)，编号为DM9L20。

测量一种或多种生物标志物蛋白的浓度(使用或未使用基于免疫测试的方法)也可以包括化合物的分离：基于化合物分子量的离心、基于质量和电荷的电泳、基于疏水性的HPLC、基于大小的分子排阻色谱和基于化合物对所用的特定固体相的亲和力的固相亲和分离。一旦分离，所述一种或两种生物标志物蛋白可基于该化合物已知的“分离特性”(例如保留时间)进行识别和使用标准技术进行测量。

或者，分离的化合物可通过例如质谱进行检测和测量。

在一个实施方式中，本发明方法还可以包括将所述一种或两种生物标志物蛋白的浓度与预定阈值比较的步骤。所述比较是患者中MR激活的指示，或是患者对MR拮抗剂治疗的反应性的指示。通常，如果在治疗前人类患者的血液NGAL蛋白的浓度高于70μg/l，优选高于80μg/l，甚至更优选高于85μg/l、90μg/l、95μg/l、100μg/l、125μg/l、150μg/l或200μg/l，则可以认为该人类患者是治疗的响应者。

本发明的试剂盒

本发明另一实施方式提供了试剂盒，该试剂盒包括用于实施评估患者中的MR激活的方法和用于预测患者对以MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂治疗的反应性的方法的物质。这些方法可通过诊断实验室、实验性实验室或操作人员实施。本发明提供可用于这些不同环境的试剂盒。

用于检测生物样品中的NGAL和/或SERPINA3的物质和试剂可一起组装在试剂盒内。

本发明的实施方式涉及包括如下部分的试剂盒：

a)检测NGAL蛋白的装置；及

b)检测SERPINA3蛋白的装置。

通常，所述试剂盒包括：

a)NGAL蛋白的结合伴体；及

b)SERPINA3蛋白的结合伴体；及

通常，所述结合伴体是抗体。

结合伴体可以被标记以便于检测。其可以固定或不固定在基底表面(例如珠、阵列等)上。通常，在试剂盒中可包括基底表面(例如膜)以用于固定结合伴体(例如经凝胶电泳和转移到膜上)。

另外，本发明的试剂盒通常也包括至少一种用于检测包括在试剂盒中的结合伴体与本发明生物标志物之间的复合物的试剂。

取决于具体过程，试剂盒还可以包含一种或多种：提取缓冲液和/或试剂、蛋白质印迹缓冲液和/或试剂及检测装置。试剂盒中可包括使用这些缓冲液和试剂实施该过程的不同步骤的方案。

本发明试剂盒中包括的不同试剂可以以固体(例如冻干的)或液体形式提供。本发明的试剂盒可任选地包括用于各种单独的缓冲液和/或试剂的不同容器(例如，小瓶、安瓿、试管、烧瓶或瓶子)。各种组分通常适当地作为在各自的容器中的等分试样或以浓缩的形式提供。也可提供适用于实施所公开的方法的特定步骤的其它容器。试剂盒的单个容器优选保持地用于商业销售的封闭空间中。

在某些实施方式中，试剂盒包括根据本发明方法使用其组分预测受试者的心力衰竭风险的说明书。根据本发明的方法使用试剂盒的说明可包括用于处理得自受试者的生物样品和/或用于进行测试的说明，或用于解释结果的说明。试剂盒也可以以由管理药品或生物制品生产、使用或销售的政府机构规定的形式包含注意事项。

本发明的治疗方法

本发明的方法可以用于对患有心血管疾病的患者进行分类，然后可用于给所述患者选择正确的治疗方法。例如，分类为响应者或非响应者的患者可以因此接受合适量的MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂。因此这种方法可有助于医生对治疗方法进行选择。从而可使治疗费用与患者的风险相适应。

因此，本发明另一方面涉及治疗患有疾病的患者和/或防止患者患疾病的风险的方法，包括如下步骤：

a)通过根据本发明在体外进行预测患者对MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂治疗的反应性的方法，确定所述患者是MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂治疗的响应者还是非响应者，其中如果所述患者中所述一种或两种生物标志物的表达水平高于从普通群体或从健康受试者获得的预定值，则将所述患者分类为响应者，以及

b)如果所述患者在步骤a)中被确定为响应者，则给予所述患者MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂。

在优选的实施方式中，所述疾病是心血管疾病。

在另一实施方式中，所述疾病是代谢综合症、肥胖或糖尿病。

MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂可以以药物组合物的形式给予。优选地，所述拮抗剂或抑制剂以治疗有效量给予。

“治疗有效量”是指在适用于任何医学治疗的合理效益/风险比下，MR拮抗剂或抑制剂足以治疗和/或预防心血管疾病的量。

应该理解的是，本发明化合物和组合物的总的每日使用量由主治医生在合理的医学判断的范围内决定。用于任何特定患者的具体的治疗有效剂量水平取决于多种因素，包括：待治疗的疾病和疾病的严重程度、所用的特定化合物的活性、所用的特定组合物、患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食、所用的特定化合物的给药时间、给药途径和排泄速率、治疗持续时间、与所用的特定多肽组合使用或同时使用的药物及医学领域内熟知的类似因素。例如，本领域技术人员熟知的是，在开始给予化合物时，其剂量低于获得期望治疗效果所需的剂量，再逐渐增加剂量直到获得期望的效果。但是，药物的日剂量可以在每位成人每天0.01至1000mg的较宽的范围内变化。优选地，组合物含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg活性成分，以对症调整用于所治疗的患者的剂量。药物通常含有约0.01mg至约500mg的活性成分，优选含有1mg至约100mg的活性成分。药物的有效量通常以每天0.0002mg/kg至约20mg/kg体重的剂量水平提供，特别是以每天约0.001mg/kg至7mg/kg体重的剂量水平提供。

本发明另一目的在于MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂用于制备治疗患有心血管疾病、糖尿病、肥胖或代谢综合症的患者的药物的用途，所述患者通过上述方法被分类为响应者。

本发明另一目的涉及MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂用于治疗患有心血管疾病、糖尿病、肥胖或代谢综合症的患者的用途，所述患者通过本发明方法被分类为响应者。

因此，本发明另一目的涉及MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂用于治疗患有心血管疾病、糖尿病、肥胖或代谢综合症的患者的用途，其中所述患者的所述一种或两种生物标志物的表达水平高于从普通群体或健康受试者获得的预定值。

在优选的实施方式中，所述患者患有心血管疾病。

在优选的实施方式中，所述患者患有肥胖。

在优选的实施方式中，所述患者患有糖尿病。

在优选的实施方式中，所述患者患有代谢综合症。

本发明另一目的在于将选自中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)基因和SERPINA3基因的一种或两种生物标志物用作患者中MR激活的生物标志物。

本发明另一目的在于监测患者的MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂治疗，包括根据本发明方法评估MR激活，以及任选地将所述一种或两种生物标志物的表达水平与代表MR激活的预定阶段的预定值比较，所述一种或两种生物标志物相对于预定值的表达水平指示了MR激活的进展，从而指示了治疗的有效程度。

本发明将通过附图和实施例进一步说明。

附图说明

图1A：条件性MR心脏过度表达模型中NGAL表达的时间过程。Lcn2表示脂质运载蛋白2(NGAL)。HPRT表示管家对照基因(housekeeping control gene)。Cnt表示对照同窝小鼠。DT表示具有条件性hMR过度表达的双转基因小鼠。

图1B：在MR的心脏中NGAL蛋白的表达。Lcn2表示脂质运载蛋白2(NGAL)。GAPDH表示管家对照基因。Cnt表示对照同窝小鼠。DT表示具有条件性hMR过度表达的双转基因小鼠。

图2：在MR与GR过度表达的小鼠的心脏中的NGAL表达。Lcn2表示脂质运载蛋白2(NGAL)。HPRT表示管家对照基因。Cnt表示对照同窝小鼠。DT表示具有条件性hMR或hGR过度表达的双转基因小鼠。

图3：在各种模型中的NGAL表达。A和B：定量PGR；C和D：ELISA。Cnt表示对照同窝小鼠。DT表示具有条件性hMR过度表达的双转基因小鼠。醛固酮-盐表示以醛固酮灌注处理并给予1％NaCl的饮水的单侧肾切除小鼠。内皮特异性的MR表达通过仅靶向于内皮的条件性MR表达获得。

图4：在稳定表达大鼠MR的大鼠心肌细胞(H9C2细胞)模型中的NGAL表达。Cnt表示对照(稀释剂)。Aldo和cortico分别表示醛固酮和皮质酮。RU28318是MR拮抗剂，RU486是GR拮抗剂。β-肌动蛋白是用于进行归一化的管家基因。

图5A：II型糖尿病小鼠模型中的NGAL表达。

Lcn2表示脂质运载蛋白2(NGAL)。Cnt表示对照同窝小鼠。db/db表示糖尿病小鼠。

图5B：脂质运载蛋白2/NGAL血浆水平的演变。在对照和db/db小鼠中的血浆Lcn2，以坎利酸盐处理了17周或未处理。

图6：具有心力衰竭的大鼠的心脏和血浆中MR依赖性的脂质运载蛋白2/NGAL的诱导。A.具有恶病质诱导的心力衰竭的大鼠左心室中脂质运载蛋白2/NGAL的表达增加了两倍。有效剂量的螺内酯(50mg/Kg/天，能预防心力衰竭症状)完全阻止了诱导。B.具有心力衰竭的大鼠的血浆中脂质运载蛋白2/NGAL的血浆水平也升高(图6B)。当动物以50mg/Kg/j的螺内酯处理时(HF+螺内酯50mg/Kg/j相对于HF)，脂质运载蛋白2/NGAL的血浆水平升高被阻止。

图7：MR心脏过度表达的小鼠模型中微阵列识别的差异基因(differential gene)的验证。Serpina3的表达在过度表达MR的小鼠(DT-MR)的心脏中明显增加，但是在过度表达GR的小鼠(DT-GR)的心脏中没有变化。各样品中mRNA水平的值相对于ubc mRNA水平归一化。对照中的这些值对于各基因设置为1，图中显示了倍数的变化。*，p＜0.05，**，p＜0.01相对于对照，使用曼-惠特尼U检验。

图8：H9C2/MR细胞中serpina3表达的MR特异性。1nM的醛固酮(aldo)和10nM的皮质酮(cortico)处理24小时提高了serpina3的表达，该表达水平的提高是通过MR依赖性的机制，如使用RU28318(特异性的MR拮抗剂)所显示的。各样品中mRNA水平值相对于β-肌动蛋白mRNA的水平归一化。对于各基因对照(未处理的细胞)中的这些值设置为1，图中显示了倍数的变化。**，p＜0.01相对于对照(无类固醇)，使用ANOVA分析。

图9A：以10nM醛固酮处理的H9C2/MR细胞中Serpina3诱导的时间过程。在暴露在醛固酮下24小时后，高度诱导了Serpina3的表达。各样品中mRNA水平值相对于β-肌动蛋白mRNA的水平归一化。对于各基因对照(未处理的细胞)中的这些值设置为1，图中显示了倍数的变化。*，p＜0.05，**，p＜0.01相对于对照(无类固醇)，使用ANOVA分析。

图9B：以醛固酮诱导的Serpina3的剂量反应。

醛固酮对Serpina3表达的诱导是剂量依赖性的。各样品中mRNA水平值相对于β-肌动蛋白mRNA的水平归一化。对于各基因对照(未处理的细胞)中的这些值设置为1，图中显示了倍数的变化。*，p＜0.05，**，p＜0.01相对于对照(无类固醇)，使用ANOVA分析。

图10：患有心力衰竭的大鼠心脏中Serpina3的MR依赖的诱导。

具有恶病质诱导的心力衰竭的大鼠左心室中，Serpina3的表达高度增加。有效剂量的螺内酯(50mg/Kg/天，能预防心力衰竭症状)阻止了诱导。**，p＜0.01相对于假饲(sham)#，p＜0.05相对于安慰剂(心力衰竭，给予安慰剂)，使用ANOVA分析。

实施例

实施例1

MR和GR转基因小鼠：盐皮质激素受体(MR)和糖皮质激素受体(GR)转基因小鼠分别允许条件性地表达人MR或GR。MR和GR转基因小鼠通过繁殖自产的受体小鼠获得，该受体小鼠在与合适的反式激活(transactivator)小鼠杂交时允许条件性的诱导性hMR或hGR表达。Ouvrard-Pascaud等(2005)和Sainte-Marie等(2007)已经描述了这些条件性转基因模型。为识别心脏中的MR选择性地调控的基因，MR和GR受体小鼠与MHC-tTA反式激活小鼠(由G.Fishman提供，ColumbiaUniversity，NY，USA)杂交(Yu等人，1996)以分别允许hMR和hGR的心肌细胞特异性表达。与对照的同窝小鼠相比，这分别导致在MR或GR条件化小鼠的心脏中，4倍的MR过度表达或糖皮质激素结合3倍的增加。为避免早期胚胎致死性，MR子代从怀孕直至出生一直用Dox处理，使得仅在出生后第7天出现表达。

样品、RNA分离、标记和杂交：总RNA使用TRIZOL试剂(Lifetechnologies)从5只一个月大的MR转基因小鼠、5只一个月大的GR转基因小鼠的全心脏中分离。用于MR转基因小鼠的基准样品由提取自该MR转基因小鼠的5只对照同窝小鼠(相同的年龄，相同的家系)的全心脏总RNA组成。用于GR转基因小鼠的基准样品由提取自该GR转基因小鼠的5只对照同窝小鼠(相同的年龄，相同的家系)的全心脏总RNA组成。mRNA使用Oligotex mRNA试剂盒(Qiagen)分离。RNA和mRNA质量使用Agilent 2100生物分析仪器评价。合并来自MR转基因小鼠的mRNA并在三个单独的反应中用Cy5标记。合并来自用于MR转基因小鼠的基准的mRNA并在三个独立的反应中用Cy3标记。来自GR转基因小鼠的mRNA合并为3组，每一组用Cy5在两个独立的反应中标记。合并来自用于GR转基因小鼠的基准的mRNA并以Cy3在六个独立的反应中标记。使用CyScribe cDNA Post Labeling Kit(AmershamPharmacia Biotech)制备Cy3-和Cy5-标记的cDNA。对各微阵列独立地进行标记反应。对MR转基因小鼠进行三次微阵列杂交，和对GR转基因小鼠进行6次微阵列杂交。杂交混合物与人Cot-1 DNA(Gibco-BRL)、酵母tRNA和聚腺苷酸RNA一起预孵育，再杂交至微阵列。

微阵列：微阵列使用50-mer寡核苷酸探针(MWG Biotech

)自制。探针使用Lucidea Array Spotter(购自Amersham)点样到环氧-硅烷涂覆的玻璃载片上。基于参与心血管和/或骨骼肌正常和病理机能，对列于微阵列上的5419个基因进行选择。选择是基于1)减除杂交(subtractivehybridization)试验(Steenman等，2005)，2)基因组范围的微阵列杂交(Steenman等人，2003)和3)文献数据。微阵列包含小鼠特异性寡核苷酸和与相应的小鼠序列具有至少80％的同源性的人寡核苷酸。各基因探针一式三份点样。

原始数据的提取和整合：通过共聚焦荧光显微镜(Scanarray4000XL，GSI-Lumonics)扫描杂交阵列。对于各荧光染料以10μm/像素的分辨率独立地获得荧光信号测量。使用GenePix Pro 5.0(Axon)测量杂交和背景信号强度以及质量控制参数。进行Lowess归一化过程(Yang等人，2002)以纠正技术偏差。该过程根据先前所述(Workman等人，2002)逐通道地实施。对于各微阵列，Cy3-和Cy5-信号强度单独地相对于定义为所有Cy3-和Cy5-信号强度的中位数的原型归一化。

微阵列的统计分析：微阵列的显著性分析(SAM)(Tusher等，2001)和微阵列数据的线性模型(Limma)(Smyth 2004)用于识别具有统计学显著的差异表达的基因。一类分析(One-class analysis)用于识别转基因小鼠和基准小鼠间差异表达的基因，而二类分析(two-class analysis)用于识别两个转基因小鼠模型之间差异表达的基因。MR转基因小鼠的一类分析导致识别了520个基因，其同时被SAM(FDR(错误发现率)＝0.05％)和Limma(″FDR″-校正，p＜0.01)识别。GR转基因小鼠的一类分析导致识别了1232个基因，其同时被SAM(FDR＝0.03％)和Limma(″FDR″-校正，p＜0.01)识别。二类分析导致识别了529个基因，其同时被SAM(FDR＝0.09％)和Limma(″FDR″-校正，p＜0.01)识别。

MR激活的各种转基因或药理学小鼠模型中NGAL的表达：定量的NGAL mRNA表达通过定量PCR(Q-PCR，Light Cycler，Biorad)使用正向引物5′-GGACCAGGGCTGTCGCTACT-3′(SEO ID NO：1)和反向引物5′-GGTGGCCACTTGCACATTGT-3′(SEO ID NO：2)在使用2μg提取自1、2、3个月大的MR转基因小鼠的不含DNA的总RNA制备的25μl的RT-PCR上进行分析(使用Sybr Green I的qPCR Core试剂盒(购自Eurogentec))，并与匹配的同窝小鼠及2个月大的GR转基因小鼠(以及相应的的对照同窝小鼠)进行比较。使用特异性的NGAL抗体(AF1857，R&D Systems)分析来自2个月大的MR小鼠的心肌蛋白提取物中NGAL的蛋白表达。使用鼠类NGAL特异性的ELISA测定(由A.Xu，香港提供)评估NGAL的血浆浓度(Wang等，2007)。

也通过Q-PCR分析具有单侧肾切除及用醛固酮灌注(60μg/kg/j，0.25μl/h ALZET微型泵)和含有1％盐的饮水处理3周(与仅单侧肾切除的对照小鼠比较)的小鼠心脏中，和来自仅在上述MR转基因小鼠与使得仅在内皮内允许条件性hMR过度表达的内皮特异性的反式激活小鼠(由L.E.Benjamine，Harvard，USA提供)适当繁殖后获得的在内皮中条件性过度表达人MR的9个月大的小鼠的胸主动脉中的定量的NGALmRNA表达(Sun等，2005)。

对于3个月大的单侧肾切除的及用醛固酮灌注(60μg/kg/j，0.25μl/hALZET微型泵)和含有1％盐的饮水处理3周小鼠(与仅单侧肾切除的对照小鼠比较)以及9个月大的具有内皮特异性MR过度表达的小鼠(与对照同窝小鼠进行比较)，也对其血浆中的NGAL血浆浓度进行评估。

稳定地过度表达大鼠MR的大鼠心肌细胞(H9C2)的细胞模型中NGAL的表达(Fejes-toth，Endocrinology，2007)

定量NGAL的mRNA表达通过定量PCR(Q-PCR，Light Cycler，Biorad)使用正向引物5′-TCACCCTGTACGGAAGAACC-3′(SEO IDNO：3)和反向引物5′-GGTGGGAACAGAGAAAACGA-3′(SEQ ID NQ：4)在使用2μg提取自大鼠H9C2/MR细胞的不含DNA的总RNA制备的25μl RT-PCR上进行分析(使用Sybr Green I的qPCR Core试剂盒(购自Eurogentec))，所述大鼠H9C2/MR细胞用各种不同浓度的醛固酮或10^-8M的皮质酮或10^-6M的MR拮抗剂RU 28318或GR拮抗剂RU 486单独或组合处理。

II型糖尿病小鼠模型中NGAL的表达(瘦蛋白受体基因中具有自发突变的db/db小鼠)

对于以药理MR拮抗剂坎利酸盐(坎利酸盐，Sigma-Alderich，100mg/Kg/day，于饮水中，45天)处理前和处理后的db/db小鼠，使用鼠NGAL-特异性的ELISA测试(A.Xu，Hong-Kong提供)评估NGAL的血浆浓度(Wang等，2007)。

结果：

相比于1、1.5或3个月大的同窝对照小鼠(Cnt)，在具有条件性人MR过度表达的小鼠(DT)心脏中脂质运载蛋白2/NGAL mRNA强烈表达(×60-200)(图1A)。相比于同窝对照小鼠(Cnt)，在1.5个月大的具有条件性人MR过度表达的小鼠(DT)心脏中脂质运载蛋白2/NGAL蛋白也强烈地被诱导(图1B)。由于对照同窝小鼠中脂质运载蛋白2/NGAL表达的诱导从未超过1.3倍，因此这是高度敏感的。通过分析2个月大的GR过度表达小鼠的心脏中脂质运载蛋白/NGAL表达评估密切相关的GR的特异性(图2)。MR过度表达小鼠的心脏中诱导的NGAL表达比在GR过度表达的小鼠中高75倍。

在以药理学MR刺激(醛固酮/盐模型)3周的小鼠的心脏中以及在具有靶向于内皮的条件性MR过度表达的9个月大小鼠(DT，与同窝对照小鼠Cnt相比较)的主动脉中，脂质运载蛋白2/NGAL的表达增加(图3A-C)。有趣的是，在这两种小鼠模型中脂质运载蛋白2/NGAL的血浆水平也升高，这表明来自内皮壁的分泌(图3B-D)。

在以10^-8M醛固酮处理24小时的H9C2/MR细胞中，脂质运载蛋白2/NGAL表达增加(图4A)。该脂质运载蛋白2/NGAL表达的增加通过向10^-8M的醛固酮加入MR拮抗剂RU 28318阻止，但是不会通过加入GR拮抗剂RU 486阻止(图4A)。10^-8M的皮质酮(糖皮质激素)也刺激脂质运载蛋白2/NGAL在H9C2/MR细胞中的表达(图4B)。该增加也通过MR拮抗剂RU 28318阻止，但是被GR拮抗剂RU 486阻止(图4B)，这表明皮质酮也通过MR刺激脂质运载蛋白2/NGAL的表达。时间过程研究表明，在10^-8M醛固酮刺激24小时后诱导脂质运载蛋白2/NGAL的表达，并在48小时刺激后保持持续诱导(图4C)。通过增加醛固酮的浓度刺激了脂质运载蛋白2/NGAL的表达，这表明特异性的MR介导的效应(图4D)。

在II型糖尿病小鼠模型(db/db)的血浆中，脂质运载蛋白2/NGAL的血浆水平也升高(图5A和图5B对照相对于db/db)。也分析了在这些小鼠中17周的药理学MR拮抗的作用。图5B表示对照和db/db小鼠(以坎利酸盐处理或未处理)中脂质运载蛋白2/NGAL的血浆水平。以MR拮抗剂坎利酸盐体内处理db/db小鼠17周阻止了db/db小鼠中脂质运载蛋白2/NGAL血浆水平的升高(Figure 5B，db/db+坎利酸盐)。坎利酸盐对对照小鼠中的脂质运载蛋白2/NGAL血浆水平没有影响(对照+坎利酸盐)。这证明了脂质运载蛋白2/NGAL血浆水平可用于指示MR拮抗剂在II型糖尿病中的效力。

在与恶病质相关的大鼠心力衰竭(HF)模型中，如通过实时PCR评估的，心脏脂质运载蛋白2/NGAL mRNA表达被诱导最高至2倍(假饲相对于M1)(图6A)。当给予有效浓度的螺内酯以阻止心力衰竭症状的发展时(HF+螺内酯50mg/Kg/j相对于HF)，完全阻止了脂质运载蛋白2/NGAL mRNA的诱导(图6A)。患有心力衰竭的大鼠的血浆中脂质运载蛋白2/NGAL的血浆水平也升高(图6B)。当动物以50mg/Kg/j的螺内酯处理时(HF+螺内酯50mg/Kg/j相对于HF)，该升高被阻止。

因此，可通过确定NGAL基因的表达水平特异性地和有效地评价MR激活。患者对MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂治疗的反应性可通过确定从所述患者获得的生物样品中NGAL基因的表达水平进行预测。

实施例2

测量了健康受试者的群体中Lcn2/NGAL的血浆水平。

该研究纳入了年龄在18至85岁的男性和女性，只要他们在过去的7天内未表现出急性病变并且未接受任何心血管治疗。健康对照的进一步排除标准为：已知高血压(高于140/90mmHg，或如果年龄大于65岁血压高于160mm Hg)、已知肾衰竭、已知糖尿病、怀孕、过去5年内被诊断为癌症或进行性瘤形成(evolutive neoplasia)、慢性肝病、connectivitis、克罗恩病、进行性结核病(evolutive tuberculosis)、劳累型心绞痛、急性冠状动脉(coronarien)综合征、冠状动脉病(coronopathy)病史、颈动脉内膜切除术(carotid endarterectomy)和已知腹动脉瘤。

健康受试者的Lcn2/NGAL血浆水平通常达到40至80μg/ml。

也测量了患有心血管疾病、糖尿病、肥胖或代谢综合症的患者的Lcn2/NGAL血浆水平。其高于健康受试者的Lcn2/NGAL血浆水平。

实施例3

心肌细胞中MR或GR的长期过度表达可导致不同于短期皮质类固醇治疗诱导的信号通路改变(这代表了细胞的适应)。为分析心脏中的体内长期MR激活的分子后果，我们使用Cardiochips

(即包括由于其参与心血管和/或骨骼肌正常和病理机能而选择的5419个基因的微阵列)研究了MR-心脏小鼠的心脏基因表达。心肌细胞MR过度表达6周导致约24个上调的基因和23个下调的基因。有趣的是，这些基因中的大多数不同于在GR-心脏小鼠中平行确定的GR调节基因(大约74个GR上调的基因和70个GR下调的基因)。而且，大多数MR调节基因在GR心脏小鼠模型中不发生改变，这表明各类固醇受体控制心肌细胞中明显不同的基因表达谱。

MR和GR转基因小鼠：盐皮质激素受体(MR)和糖皮质激素受体(GR)转基因小鼠分别允许条件性地表达人MR或GR。MR和GR转基因小鼠通过自产受体小鼠的繁殖获得，该受体小鼠在与合适的反式激活小鼠杂交时允许条件性的诱导性hMR或hGR表达。Ouvrard-Pascaud等(2005)和Sainte-Marie等(2007)已经描述了这些条件性转基因模型。为识别由心脏中MR选择性地调控的基因，MR和GR受体小鼠与MHC-tTA反式激活小鼠(由G.Fishman提供，Columbia University，NY，USA)杂交(Yu等人，1996)以分别使得心肌细胞特异地表达hMR和hGR。与对照的同窝小鼠相比，这分别导致MR或GR条件性小鼠的心脏中，4倍的MR过度表达或3倍的糖皮质激素结合增加。为避免早期胚胎致死性，MR子代从怀孕直至出生一直用Dox处理，使得仅在出生后第7天出现表达。

样品、RNA分离、标记和杂交：总RNA使用TRIZOL

试剂(Lifetechnologies)从5只一个月大的MR转基因小鼠、5只一个月大的GR转基因小鼠的全心脏中分离。用于MR转基因鼠的基准样品由提取自该MR转基因小鼠的5只对照同窝小鼠(相同的年龄，相同的家系)的全心脏总RNA组成。用于GR转基因小鼠的基准样品由提取自该GR转基因小鼠的5只对照同窝小鼠(相同的年龄，相同的家系)的全心脏总RNA组成。mRNA使用Oligotex mRNA试剂盒(Qiagen)分离。RNA和mRNA质量使用Agilent 2100生物分析仪器评价。合并来自MR转基因小鼠的mRNA并在三个单独的反应中用Cy5标记。合并来自用于MR转基因小鼠的基准的mRNA并在三个独立的反应中用Cy3标记。来自GR转基因小鼠的mRNA合并为3组，每一组用Cy5在两个独立的反应中标记。合并来自用于GR转基因小鼠的基准的mRNA并以Cy3在六个独立的反应中标记。使用CyScribe cDNA Post Labeling Kit(AmershamPharmacia Biotech)制备Cy3-和Cy5-标记的cDNA。独立地进行各微阵列的标记反应。对MR转基因小鼠进行三次微阵列杂交，而对GR转基因小鼠进行6次微阵列杂交。杂交混合物与人Cot-1 DNA(Gibco-BRL)、酵母tRNA和聚腺苷酸RNA一起预孵育，再杂交至微阵列。

微阵列：微阵列使用50-mer寡核苷酸探针(MWG Biotech

)自制。探针使用Lucidea Array Spotter(购自Amersham)点样到环氧-硅烷涂覆的玻璃载片上。基于参与心血管和/或骨骼肌正常和病理机能，对列于微阵列上的5419个基因进行选择。选择是基于1)减除杂交试验(Steenman等，2005)，2)基因组范围的微阵列杂交(Steenman等人，2003)和3)文献数据。微阵列包含小鼠特异的寡核苷酸和与相应的小鼠序列具有至少80％同源性的人寡核苷酸。各基因探针一式三份地点样。

原始数据的提取和整合：通过共聚焦荧光显微镜(Scanarray4000XL，GSI-Lumonics)扫描杂交阵列。对于各荧光染料以10μm/像素的分辨率独立地获得荧光信号测量值。使用GenePix Pro 5.0(Axon

)测量杂交和背景信号强度以及质量控制参数。进行Lowess归一化过程(Yang等人，2002)以纠正技术偏差。该过程根据先前的描述(Workman等人，2002)逐通道地进行。对于各微阵列，Cy3-和Cy5-信号强度单独地相对于定义为所有Cy3-和Cy5-信号强度的中位数的原型归一化。

微阵列的统计分析：微阵列的显著性分析(SAM)(Tusher等，2001)和微阵列数据的线性模型(Limma)(Smyth 2004)用于识别具有统计学显著的差异表达的基因。一类分析用于识别转基因小鼠和基准小鼠之间差异表达的基因，二类分析用于识别两个转基因小鼠模型之间差异表达的基因。MR转基因小鼠的一类分析导致识别了同时被SAM(FDR(错误发现率)＝0.05％)和Limma(″FDR″-校正，p＜0.01)识别的520个基因。GR转基因小鼠的一类分析导致识别了同时被SAM(FDR＝0.03％)和Limma(″FDR″-校正，p＜0.01)识别的1232个基因。二类分析导致识别了同时被SAM(FDR＝0.09％)和Limma(″FDR″-校正，p＜0.01)识别的529个基因。

MR或GR激活的转基因小鼠模型中serpina3的表达：定量的Serpina3 mRNA表达通过定量PCR(Q-PCR，Light Cycler，Biorad)使用正向引物5′-CATCCCTGTGGGAAGTCAGT-3′(SEO ID NO：5)和反向引物5′-CTTTTGGGTGGAGGCAGATA-3′(SEO ID NO：6)在使用2μg提取自1、2、3个月大的MR转基因小鼠的不含DNA的总RNA制备的25μl的RT-PCR(使用Sybr Green I的qPCR Core试剂盒(购自Eurogentec))上进行分析，并与匹配的同窝小鼠及2个月大的GR转基因小鼠(以及相应的对照同窝小鼠)进行比较。

稳定地过度表达大鼠MR的大鼠心肌细胞(H9C2)细胞模型中Serpina3的表达(Fej es-toth，Endocrinology，2007)

定量的Serpina3 mRNA表达通过定量PCR(Q-PCR，Light Cycler，Biorad)使用正向引物5′-AGACAAGGGGACACAACTGG-3′(SEQ IDNO：7)和反向引物5′-TGAGATGCTAAGTGGGGAGAA-3′(SEQ ID NO：8)在使用2μg提取自大鼠H9C2/MR细胞的不含DNA的总RNA制备的25μl的RT-PCR(使用Sybr Green I的qPCR Core试剂盒(购自Eurogentec))上进行分析，所述大鼠H9C2/MR细胞以各种不同浓度的醛固酮或10^-8M的皮质酮或10^-6M的MR拮抗剂RU 28318单独或组合处理。

恶病质诱导的大鼠心力衰竭模型中Serpina3的表达。螺内酯的药理学MR拮抗效应

定量Serpina3 mRNA的表达通过定量PCR(Q-PCR，Light Cycler，Biorad)使用正向引物5′-AGACAAGGGGACACAACTGG-3′(SEQ IDNQ：7)和反向引物5′-TGAGATGCTAAGTGGGGAGAA-3′(SEQ ID NQ：8)在使用2μg提取自左心室的不含DNA的总RNA制备的25μl的RT-PCR(使用Sybr Green I的qPCR Core试剂盒(购自Eurogentec))上进行分析。

结果：

经实时PCR确定，丝氨酸-蛋白酶抑制剂SERPINA3(或α1-抗凝乳蛋白酶)的mRNA表达在MR-心脏小鼠的心脏中上调了25倍，但是在GR-心脏小鼠中没有明显的变化(图7)。

为研究MR的慢性效应与较早发生的效应之间的可能联系，将在MR-心脏小鼠中识别的一些体内MR-调节基因在H9C2/MR+细胞系中进行测试。在低剂量的醛固酮(1nM)存在下24小时，SERPINA3 mRNA被诱导了约8倍(图8)。MR拮抗剂RU28318的存在抑制了诱导，这证明其涉及与MR的特异性相互作用。值的注意的是，10nM的皮质酮具有与醛固酮相似的作用，该作用可以被MR拮抗剂阻止(图8)。时间过程实验(图9A)表明醛固酮(10nM)作用10小时后诱导serpina3，24小时后具有强烈的诱导(x 15)。观察到了浓度依赖性的诱导，以1nM的醛固酮开始(图9B)。

在恶病质相关的大鼠心力衰竭(HF)模型中，如实时PCR估计的，心脏Serpina3 mRNA表达被诱导最高至6倍(假饲相对于HF)(图10)。当给予有效浓度的螺内酯以阻止心衰症状的发展时(HF+螺内酯50mg/Kg/j相对于HF)，完全阻止了Serpina3 mRNA的诱导(图10)。

如在过度表达MR的小鼠中所见的，这些数据表明SERPINA3涉及心肌细胞中对醛固酮的早期反应，还涉及对增强的MR信号传导的慢性适应。由于serpina3是分泌酶，其可用作与MR激活有关的心肌损伤的标志物。

参考文献：

在该申请中，各篇文献说明了本发明所属领域的现有技术状况。将这些文献在此以引用的方式合并入本发明。

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Claims (15)

1.测定从所述患者获得的生物样品中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)基因的表达水平的试剂在制备用于评估患者中盐皮质激素受体(MR)激活的药物中的用途，其中所述试剂为蛋白结合伴体或选自探针、引物或配体的检测核酸的选择性试剂。

2.测定从所述患者获得的生物样品中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)基因的表达水平的试剂在制备用于预测患者对MR拮抗剂或醛固酮合成酶抑制剂治疗的反应性的药物中的用途，其中所述试剂为蛋白结合伴体或选自探针、引物或配体的检测核酸的选择性试剂。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述试剂是选自探针、引物或配体的检测核酸的选择性试剂。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述检测核酸的选择性试剂是引物。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述NGAL基因的所述表达水平通过测定该NGAL mRNA的量来确定，并且所述生物样品是细胞或组织样品。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述细胞样品是外周血单核细胞(PBMC)样品或内皮细胞样品。

7.根据权利要求1-6任一项所述的用途，其中所述NGAL基因的表达水平通过RT-PCR测定。

8.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述试剂是蛋白结合伴体。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述蛋白结合伴体是抗体。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述NGAL基因的表达水平通过测量从所述患者获得的生物样品中的该NGAL蛋白的浓度而确定。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述生物样品是血液样品、血清样品、血浆样品或尿样品。

12.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述患者患有心血管疾病。

13.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述患者患有充血性心力衰竭或高血压。

14.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述患者已经用选自血管紧张素转化酶抑制剂、利尿剂、血管扩张剂、β受体阻断剂、洋地黄和抗凝剂的标准疗法进行了治疗。

15.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述患者患有肥胖、糖尿病或代谢综合症。

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