CN102191332A - 中高温油藏细菌种群检测基因芯片及其用途 - Google Patents

中高温油藏细菌种群检测基因芯片及其用途 Download PDF

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CN102191332A CN2011101224792A CN201110122479A CN102191332A CN 102191332 A CN102191332 A CN 102191332A CN 2011101224792 A CN2011101224792 A CN 2011101224792A CN 201110122479 A CN201110122479 A CN 201110122479A CN 102191332 A CN102191332 A CN 102191332A
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chip
hybridization
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郭省学
宋智勇
汪卫东
赵凤敏
高光军
郭辽原
郝斌
安申法
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China Petroleum and Chemical Corp
Oil Production Technology Research Institute of Sinopec Shengli Oilfield Co
Original Assignee
China Petroleum and Chemical Corp
Oil Production Technology Research Institute of Sinopec Shengli Oilfield Co
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Abstract

本发明公开了中高温油藏细菌种群检测基因芯片及其用途。本发明是以待检测样品的基因组为模板，用标记的引物组进行扩增，然后将得到的扩增产物与生物芯片上的探针进行杂交，根据杂交结果确定油藏细菌群落构成；所述样品是指预测含有目的核酸序列的石油开发流体材料；所属油藏包括天然油藏及人工模拟油藏；所述引物组包括一种或一种以上的共用引物或者特异引物，并且能扩增包括油藏微生物识别碱基在内的核苷酸片段，长度是5-30nt；所述生物芯片包括若干种探针，探针能与所检测的微生物分子特异结合。本发明将为研究油藏环境细菌群落组成、结构和功能活动等提供一种快速、准确、高通量的工具；同时为现场实施效果提供理论依据和技术支持。

Description

中高温油藏细菌种群检测基因芯片及其用途
技术领域：
本发明涉及一种基因芯片领域，特别涉及一种中高温油藏细菌种群检测基因芯片及其用途。
背景技术：
随着微生物技术在石油天然气勘探开发和环境修复等领域的广泛应用，相关微生物的检测鉴定及群落分析也成为重要的研究内容。在油藏极端环境下，有丰富的微生物种群，其中，细菌广泛存在并发挥重要代谢作用，但细菌种类繁多、丰度较低，且难以利用实验室纯培养法进行分类检测。
聚合酶链式反应(PCR)、限制性片断长度多态性分析(RFLPs）、AFLPs及变性梯度凝胶电泳(DGGE）等分子生物学技术推动了石油微生物研究的发展。然而，目前常用的分子多态性技术存在许多不足：
1、            操作较复杂，人为干预环节多，准确性差；
2、            检测通量低，提供信息少，且耗时费力。
这给在及时有效地对细菌群落进行调控带来了不便。
作为一种革命性的分析技术，生物芯片以其所具有的集成化、微型化和自动化的性能在分析生物技术领域发挥了越来越重要的作用。生物芯片高通量、多指标并行检测的优势，恰恰可以满足油藏微生物群落的研究需求，应用细菌种群检测芯片进行群落的鉴定分析，可以在分子水平下对微生物群落进行研究，认识不同环境条件下细菌种群信息，确定优势种群，为微生物技术研究水平和现场实施效果提高提供方法基础。
发明内容：
本发明的目的就是针对现有技术存在的上述缺陷，提供中高温油藏细菌种群检测基因芯片及其用途。
本发明所指的检测油藏中细菌种群的检测型基因芯片，有以下步骤制成：
（一）设计油藏细菌特异性探针
(1)油藏样品采集；
(2)油藏细菌16 S核糖体RNA序列收集：以通用引物，对细菌16S核糖体RNA片段进行扩增，并测序；
(3)细菌特异性探针：依据测序结果，设计油藏细菌属特异性探针；芯片上的条码序列探针序列结构通式为：NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-条码序列，为探针的5′端氨基修饰，氨基旁边连接poly-T15；
其中探针序列表如下：
Figure 455593DEST_PATH_IMAGE001
（二）制备基因芯片：
使用点样仪将探针以设定的顺序固定到醛基化修饰的玻片上，基因芯片是由针对109个细菌属的429条探针、点样的阳性质控QC、点样的阴性质控BC、杂交的阴性质控NC和杂交的阳性质控PC组成的阵列；
QC是一端带有Hex标记，另一端氨基修饰的寡核苷酸探针，用于观察芯片点样和固定的效率，其序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTTAGAGTGCTTGGTGCCATAAC-HEX；BC为50％的二甲亚砜DMSO，用于质控点样过程中有无样品残留污染；NC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，与杂交液中的所有待检测序列不会杂交，用于观察有无非特异杂交，其序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGCAACCACCACCGGAGG； PC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，可以与杂交液中添加的荧光标记的互补序列杂交，用于杂交过程的质控，其序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGGTATCGCGACCGCATCCCAATCT。
本发明所述的检测油藏中细菌种群的检测型基因芯片，其使用方法是（以下百分比均采用重量百分比）：
（a）核酸扩增
分别以油藏样品基因组DNA为模板，用上游引物和下游引物PCR扩增；
（b）基因芯片杂交
取PCR产物加到杂交缓冲液中，变性，冰浴, 杂交混合物加入到点阵中反应；然后将芯片放置在水浴中杂交1小时；取出玻片分别在两种洗液中42℃各洗2 min，洗液Ⅰ：0.3×SSC/0.1%SDS，洗液II：0.06×SSC，最后，玻片稍离心甩干；其中杂交缓冲液：6×SSC, 5×Denhardt′s reagent, 25％甲酰胺, 0.1%SDS, 5nM c-PC；
（c）数据分析
使用芯片扫描仪扫描芯片，根据荧光信号强度及扫描图像分析目的油藏细菌群落结构。
本发明的有益效果是：一是特异性强：只有与探针特异性结合的序列才能显示荧光；二是灵敏度高：可以检测105个/ml菌体，灵敏度高；三是适于批量样本检测：本发明同时将大量探针固定于支持物上，可以一次性对样品大量样品进行检测和分析。本发明适用于天然、模拟油藏的细菌种群分析。
附图说明：
附图1是本发明的实施例的杂交点阵图谱。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例来说明本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的适用范围，下述实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例：用本发明的基因芯片和方法检测胜利油田样品：
1. 油藏样品采集
选择某生产井，按照常规方法进行取样。
2. 油藏样品核酸制备
用常规方法基因组DNA。
3．核酸扩增
分别以油藏样品基因组DNA为模板，用上游引物和下游引物PCR扩增；PCR在1管中进行。
扩增体系如下, 包括0.2 mM dNTPs, 1×Qiagen PCR buffer, 添加MgCl2至2mM, pH 8.7, 1 单位HotStarTaq DNA Polymerase (Qiagen, Hilden, Germany)，和0.1ng 质粒DNA，上下游引物。25μl扩增体系中，引物的浓度为0.02μM。
扩增参数为：
先95℃ 15 分钟；然后94℃30秒, 55℃ 1分钟，72℃ 90秒，35个循环；
最后72℃ 10分钟；4℃保存。
4．制备基因芯片
芯片是由针对109个细菌属的429条探针、QC(点样的阳性质控)、BC（点样的阴性质控）、NC（杂交的阴性质控）和PC（杂交的阳性质控）组成的阵列。
使用点样仪将探针以设定的顺序固定到醛基化修饰的玻片上。封闭芯片上未与寡核苷酸结合的醛基。待芯片自然干燥后备用。
4．基因芯片杂交
取10 μl PCR产物加到20 μl杂交缓冲液中 (6×SSC, 5×Denhardt′s reagent, 25％甲酰胺, 0.1%SDS, 5nM c-PC（与芯片PC互补的序列，5′端TAMRA标记）。98℃变性5分钟，冰浴, 杂交混合物加入到点阵中反应。然后将芯片放置42℃水浴中杂交1小时。取出玻片分别在两种洗液中42℃各洗2 min，洗液Ⅰ：0.3×SSC/0.1%SDS，洗液II：0.06×SSC。最后，玻片稍离心甩干。
5．数据分析
使用芯片扫描仪扫描芯片。根据荧光信号强度分析，其主要细菌类型共5种，分别是Arcobacter sp., Bacillus sp., Thermacetogenium sp., Beta proteobacterium sp., Anoxybacillus sp.。同时含有Firmicutes sp., Achromobacter sp., Petrobacter sp., Thermincola sp., Clostridium sp., Thermoanaerobacterium sp. , Acinetobacter sp.Serratia sp., Caldicoprobacter sp.。这与将PCR产物建克隆文库测序分析的结果相一致。
序列表
<110> 中国石油化工股份有限公司、中国石油化工股份有限公司胜利油田分公司采油工艺研究院
<120> 中高温油藏细菌种群检测基因芯片及其用途
<160>429
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VTTATAAGGCATTACTCCCA        20
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CCGGRACTTTCTTCTTGGGT        20
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ACCGGTTACCCATCGTGGCC        20
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GAGGCTATTCCTTTCCAKAG        20
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CACTCTCACATCTCTGCAAG        20
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CGAACCCTGCCGTGGTAATC        20
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GCAAGCCGTCCAACAACCAG        20
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GTTGCCGACTGATCTATCTC        20
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TTGTTTCAGGTCGTTGCCGA        20
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TCCGGTGTTAGCGTCGTTTC        20
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GTATCCGGTGTTAGCGTCGT        20
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CTCTCAAGGAGCCCAACGGC        20
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<211>20
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TAGCCTGCACGATTTCTTCC        20
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<220>
<223>
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>177
ACCTGTGCAGGCTCCYTAAC        20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>178
TCTCCCGAGTCTATGKCGGT        20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>179
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
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<213>人工序列
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<400>181
AGACCGACTTCTCCACCGGC        20
<210>182
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>182
TAAGGTTCTTGGCTTAGCKT        20
<210>183
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>183
TAAGGTACTGTCACTTCTTC        20
<210>184
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>184
GATTGTCTCTGGCAGTCTAC        20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
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<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
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<213>人工序列
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<211>20
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<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<211>20
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<213>人工序列
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<211>20
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<213>人工序列
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<211>20
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>279
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>282
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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GCTGAATGCTATTAACATCC        20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>284
TCCGAGGAACCGAGCTTCTA        20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>285
TTGGGCTGATCTTATGGCGC        20
<210>286
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>286
AACGTCACAGCTGAATGCTA        20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>287
CACCATAAGGTACATTCCCA        20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>288
GCCATACTCTAGCTHGCCAG        20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>289
TCTGCCATACTCTAGCTHGC        20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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AGTTCTCTGCATGTCAAGGC        20
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>382
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>384
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>385
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>20
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<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>392
GTGCTAGAGCGCGTAGAGAT        20
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>393
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>394
TGCGTCCGGTGACTTTATCC        20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>395
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>396
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>397
TCGGGTTCCTACCACCAGCA        20
<210>398
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>398
GGCACTTAATGGTTTCCCTT        20
<210>399
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>399
TCCTACCACCAGCATGTCAA        20
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>400
CAGCTTGACAACTGCCCACA        20
<210>401
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>401
TCCACCACCGCTWAATCGCT        20
<210>402
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>402
GGACAGCTTGACAACTGCCC        20
<210>403
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>403
CACGGACAGCTTGACAACTG        20
<210>404
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>404
CGGCAYCTTATGCCGGCTTC        20
<210>405
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>405
TAARGGGCACGAGTACCTGA        20
<210>406
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>406
RGGGCACGAGTACCTGACGT        20
<210>407
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>407
AAGGTTCTTGGCTTAGCATC        20
<210>408
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>408
GCAGTTCCGTCTCCCTCTAC        20
<210>409
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>409
GTTCCGTCTCCCTCTACCGB20
<210>410
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>410
CCGTCTAGCCTGAGCGTATC        20
<210>411
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>411
CCYAGGTTCCCTAGCATGTC        20
<210>412
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>412
TCTAGCCTGAGCGTATCCCA        20
<210>413
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>413
TCCCACGCTCCYCCACGGTT        20
<210>414
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>414
CCCAGAGACCTAGCGCGCAT        20
<210>415
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>415
GTTTCAATCGCCRTTCCTAG        20
<210>416
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>416
TCACTGCTACTCCAGAAATT        20
<210>417
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>417
GCTTCGCAACTGTTTGTACC        20
<210>418
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>418
CGGTATTAACGTACGTTTCC        20
<210>419
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>419
TAGCTTACAAGTAGAGGCCA        20
<210>420
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>420
CAGTTDATGTTTAGTCACCT        20
<210>421
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>421
GCAACTTCAACATCACTCAA        20
<210>422
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>422
CCAGCAACTTCAACATCACT        20
<210>423
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>423
ATTCCAGCAACTTCAACATC        20
<210>424
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>424
CGTCAGTTKATGTTTAGTCA        20
<210>425
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>425
CATTACTGCCCTGACAAGCA        20
<210>426
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>426
GACAAGCAGGGCAACAACTA        20
<210>427
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>427
ACATAGGCTGATCCCATAGC        20
<210>428
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>428
AGGACATAGGCTGATCCCAT        20
<210>429
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>429
GTAAACTGGCACTCCCATAT        20

Claims (2)

1.一种中高温油藏细菌种群检测基因芯片，其特征是制备方法如下：
（一）设计油藏细菌特异性探针
(1)油藏样品采集；
 (2)油藏细菌16 S核糖体RNA序列收集：以通用引物，对细菌16S核糖体RNA片段进行扩增，并测序；
(3)细菌特异性探针：依据测序结果，设计油藏细菌属特异性探针；芯片上的条码序列探针序列结构通式为：NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-条码序列，为探针的5′端氨基修饰，氨基旁边连接poly-T15；
（二）制备基因芯片：
使用点样仪将探针以设定的顺序固定到醛基化修饰的玻片上，基因芯片是由针对109个细菌属的429条探针、点样的阳性质控QC、点样的阴性质控BC、杂交的阴性质控NC和杂交的阳性质控PC组成的阵列；
QC是一端带有Hex标记，另一端氨基修饰的寡核苷酸探针，用于观察芯片点样和固定的效率，其序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTTAGAGTGCTTGGTGCCATAAC-HEX；BC为50％的二甲亚砜DMSO，用于质控点样过程中有无样品残留污染；NC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，与杂交液中的所有待检测序列不会杂交，用于观察有无非特异杂交，其序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGCAACCACCACCGGAGG； PC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，可以与杂交液中添加的荧光标记的互补序列杂交，用于杂交过程的质控，其序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGGTATCGCGACCGCATCCCAATCT。
2.一种中高温油藏细菌种群检测基因芯片的用途，其特征是，以下百分比均采用重量百分比：
（a）核酸扩增
分别以油藏样品基因组DNA为模板，用上游引物和下游引物PCR扩增；
（b）基因芯片杂交
取PCR产物加到杂交缓冲液中，变性，冰浴, 杂交混合物加入到点阵中反应；然后将芯片放置在水浴中杂交1小时；取出玻片分别在两种洗液中42℃各洗2 min，洗液Ⅰ：0.3×SSC/0.1%SDS，洗液II：0.06×SSC，最后，玻片稍离心甩干；其中杂交缓冲液：6×SSC, 5×Denhardt′s reagent, 25％甲酰胺, 0.1%SDS, 5nM c-PC；
（c）数据分析
使用芯片扫描仪扫描芯片，根据荧光信号强度及扫描图像分析目的油藏细菌群落结构。
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