CN102183638A - 一种加替沙星的电化学酶联免疫检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于食品分析和环境检测中的加替沙星的电化学酶联免疫检测试剂盒及其应用，属于药物残留分析和免疫分析技术领域。一种加替沙星的电化学酶联免疫检测试剂盒，包括包被有加替沙星包被抗原的酶标板、加替沙星多克隆抗体溶液、酶标二抗溶液和电活性物质溶液。本发明所述加替沙星的电化学酶联免疫检测试剂盒以免疫学反应为基础，将抗原、抗体反应的高度特异性和酶对底物的高效催化同电化学高灵敏度有机的结合起来，通过测量反应的电流变化来检测加替沙星的含量。它具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，可在检测食品、饲料和动物尿样中叶酸加替沙星含量方面发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于食品分析和环境检测中的加替沙星的电化学酶联免疫检测试剂盒及其应用，属于药物残留分析和免疫分析技术领域。
背景技术
加替沙星(gatifloxacin)是日本杏林制药公司研制的第四代广谱氟喹诺酮类抗生素之一，于1999年12月获美国FDA(Food and Drug Administration)批准上市，于2003年3月在中国上市。加替沙星通过抑制DNA旋转酶和拓扑异构酶IV的活性，来阻止细菌DNA合成和复制，产生快速杀菌的作用。它可以渗透至骨骼、肺、皮肤、中枢和泌尿等组织，其抗菌能力很强，对大肠杆菌、流感和副流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌等具有良好的抗菌效果。但其有一定的脂溶性，易引起神经系统的不良反应和血糖代谢混乱，特别是对一些糖尿病患者和胰岛素功能不良者慎用。鉴于此，为了保证动物和人类的健康，必须建立一套快速、方便、灵敏、有效的用于检测加替沙星的方法。
据报道，目前检测加替沙星的方法主要有：高效液相色谱法，紫外分光光度法以及酶联免疫法。其中高效液相色谱法是目前主要检测方法，该方法具有特异性强，灵敏高的特点，但其缺点也十分的明显，首先所用的仪器十分的昂贵和笨重，同时操作的人员必须具有相当高的科学素质，其次需要花大量的时间对样品进行前处理，处理时需要消耗大量有机试剂，使其不具备方便快速检测的特点。紫外分光光度法由于其检出限低没有被广泛的应用。酶联免疫法与其他的方法比，在具有高选择性和专一性的特点同时，可以现场进行大批量检测的特点，特别是电化学酶联分析检测，它把电化学分析的高灵敏度优势的也有效地融入酶联免疫法中。在电化学检测中，碳纤维电极是被认为是最具有生物兼容性的材料，对其研究也十分的透彻，生产工艺也十分的成熟。因此，以碳纤维为工作电极的电化学酶联免疫分析法是十分可行的途径，其具有广阔的市场、极高的经济价值和社会价值。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种加替沙星的电化学酶联免疫检测试剂盒及其应用。
一种加替沙星的电化学酶联免疫检测试剂盒，包括包被有加替沙星包被抗原的酶标板、加替沙星多克隆抗体溶液、酶标二抗溶液和电活性物质溶液；
所述包被有加替沙星包被抗原的酶标板中的加替沙星包被抗原按照如下方法制备：由加替沙星通过碳化二亚胺活化酯与分子量范围是4.2Ka～4.8Ka的卵清蛋白偶联制得；
所述加替沙星多克隆抗体溶液中的加替沙星多克隆抗体按照如下方法制备：由加替沙星与分子量范围为6.7Ka～6.8Ka的牛血清白蛋白偶联所得的偶联物作为免疫原免疫动物新西兰大白兔制备得到；
所述的酶标二抗是用过碘酸钠将辣根过氧化物酶与羊抗兔抗体进行偶联制得。
所述包被有加替沙星包被抗原的酶标板中的酶标板为透明高吸附聚苯乙烯96孔酶标板，包被浓度为1.5μg/ml。
所述加替沙星多克隆抗体溶液的浓度为1∶8000～1∶16000；优选的，浓度为1∶10000。
优选的，所述酶标二抗溶液的浓度为1∶2000。
所述的电活性物质溶液是2mM对苯二酚和2mM双氧水的超纯水混合液。
所述的试剂盒中还包括加替沙星系列标准品溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、碳纤维工作电极。
所述加替沙星系列标准品溶液浓度分别为0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。
所述浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaCl 80g、KH2PO42.0g、Na2HPO4·12H2O229.0g、KCl2.0g的水溶液。
所述浓缩洗涤液为含有体积分数0.05％吐温-20的pH7.40.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
所述的碳纤维工作电极工作电位为-0.15V。该工作电极与电化学工作站联用。
上述加替沙星的电化学酶联免疫检测试剂盒在检测食品、饲料和动物尿样中叶酸加替沙星含量方面的应用。
本发明的优点和有益效果：
本发明所述加替沙星的电化学酶联免疫检测试剂盒以免疫学反应为基础，将抗原、抗体反应的高度特异性和酶对底物的高效催化同电化学高灵敏度有机的结合起来，通过测量反应的电流变化来检测加替沙星的含量。它具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，可在检测食品、饲料和动物尿样中叶酸加替沙星含量方面发挥重要作用。
附图说明
图1为本发明加替沙星抗体的抑制率曲线。
图2为本发明加替沙星的酶电化学联免疫检测试剂盒的标准曲线。
具体实施方式
实施例中所述试剂如无特别说明，均为本领域常用市售产品。
实施例1、免疫原、包被抗原的合成及抗体溶液的制备
1、免疫原的制备
A、称取加替沙星(GAT)13.0mg(35μmol)溶于4mL二甲基亚砜(DMF)中，室温搅拌至完全溶解，得A反应液；
B、分别称取碳化二亚胺(EDC)50.4mg(175μmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)18.1mg(15.2μmol)加入到上述A反应液中，室温避光搅拌反应24小时，得B反应液；
C、将62.0mg(0.83μmol)的牛血清白蛋白(BSA)溶于8mL磷酸缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)中，室温搅拌溶解，得C反应液；
D、室温条件下，将B反应液缓慢滴加到C反应液中，搅拌反应4小时，得D溶液；
E、将D溶液转移到透析袋中，在0-4℃条件下用磷酸缓冲液(PBS，0.01M，pH 7.4)透析3天，每天换三次透析液；之后用超纯水透析3天，每隔5-6小时换一次透析液；
F、待透析完毕后，将透析袋中溶液取出，用冻干机将其冻干，得免疫原，-20℃保存备用。
2、包被抗原的制备
I、称取加替沙星(GAT)13.0mg(35μmol)，碳化二亚胺(EDC)67mg(350μmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)20mg(168μmol)溶于4mL二甲基亚砜(DMF)中，室温搅拌反应3小时，得I反应液；
II、称取37.8mg卵清蛋白(OVA)溶解在8mL磷酸缓冲(PBS，0.01M，pH 7.4)中，得II反应液；
III、在室温搅拌条件下，将I反应液滴加到II反应液中，反应3小时，得III溶液；
IV、待反应完毕，将III溶液转移到透析袋中，在0-4℃条件下用磷酸缓冲液(PBS，0.01M，pH 7.4)透析3天，每天换三次透析液；之后用超纯水透析3天，每隔5-6小时换一次透析液；
V、待透析完毕，将透析袋中溶液取出，将其冻干成固体，得包被抗原，-20℃保存备用。
3、加替沙星多克隆抗体溶液的制备
以加替沙星与牛血清蛋白的偶联物为免疫原来免疫雄性新西兰大白兔。首次免疫，将弗氏完全佐剂与免疫原按体积比1∶1混合成油包水的乳浊液，每只兔注射0.5mg乳浊液，进行背部皮下多点注射(5～10点)；以后每隔两周加强免疫，用弗氏不完全佐剂与等体积免疫原混合成油包水的乳浊液，剂量减半，方法同首次免疫；第五次加强免疫不加佐剂只用生理盐水进行末次免疫，第五次加强免疫七天后进行心脏采血。血液在4℃静置过夜，次日10000rpm离心15分钟得抗血清，上清即为加替沙星多克隆抗体血清，用饱和硫酸法将加替沙星抗体沉淀，用磷酸缓冲液(PBS，0.01M，pH 7.4)将沉淀复溶即为加替沙星多克隆抗体溶液。
实施例2、ELISA检测方法的建立
1、抗体与包被抗原浓度的优选实验(方阵法)
纵向用实施例1中第2步制得的包被抗原按3.0μg/mL、2.5μg/mL、2.0μg/mL、1.5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL的系列浓度包被酶标板，100μL/孔，放置15小时，用洗涤液300μL/孔洗板三次；再用封闭溶液250μL/孔封闭，0～4℃放置过夜，洗板三次；横向加入100μL/孔一系列稀释的抗体(1∶2000至1∶60000)，37℃放置30分钟，洗板三次；加入100μL/孔1∶2000的酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体溶液，37℃放置30分钟，洗板五次；加入100μL/孔的电活性物质溶液，37℃放置10分钟，测定电流值。以电流值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。
2、抗体灵敏度的测定
根据上述对抗体及包被抗原浓度的优选实验，选择并确定抗体浓度为1∶10000，包被抗原浓度为1.5μg/mL进行抗体的灵敏度的测定：
A、包被：用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液将加替沙星的包被抗原配成1.5μg/mL的溶液，每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加100μL，4℃放置15小时。弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，300μL/孔，每次3分钟，拍干。(此步简称洗涤，下同)。
B、封闭：用封闭溶液封闭上述已包被的酶标板，250μL/孔，37℃放置两小时，然后洗涤。
C、加样：加稀释加替沙星抗体溶液(稀释比例1∶10000)50μL/孔与不同浓度的加替沙星系列标准品溶液50μL/孔于上述已封闭的反应孔中，37℃放置30分钟，然后洗涤。
D、加酶标二抗：于上述各反应孔中，加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(稀释比例1∶2000)100μL/孔，30分钟，洗涤。
E、电信号增强：于各反应孔中加入临时配置电活性物质溶液100μL/孔，37℃放置10分钟，立即用电化学工作站检测。
F、计算：检测结果以抑制率计算，％抑制率＝％I/I0，I是加入药物作为竞争者的电流值，I0是不加竞争者的电流值。计算50％抑制率时加替沙星的浓度即为该抗体的灵敏度。以加替沙星的浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，作图得到抑制率曲线(图1)。
3、工作曲线的建立
根据上述对抗体及包被抗原浓度的优选实验，选择并确定抗体浓度为1∶10000，包被抗原浓度为1.5μg/mL进行工作曲线的建立：
A、包被：用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液将加替沙星的包被抗原配成1.5μg/mL的溶液，每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加100μL，4℃放置15小时后，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，300μL/孔，每次3钟，拍干。(此步简称洗涤，下同)。
B、封闭：用封闭溶液封闭上述已包被的酶标板，250μL/孔，37℃放置两小时，然后洗涤。
C、加样：加稀释加替沙星抗体溶液(稀释比例：1∶10000)50μL/孔与浓度梯度为0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的加替沙星系列标准品溶液50μL/孔于上述已封闭的反应孔中，37℃放置30分钟，然后洗涤。
D、加酶标二抗：于上述各反应孔中，加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1∶2000)100μL/孔，30分钟，洗涤。
E、电信号增强：于各反应孔中加入临时配置电活性物质溶液100μL/孔，37℃放置10分钟，立即用电化学工作站检测。
F、计算：检测结果以抑制率计算，％抑制率＝％I/I0，I是加入药物作为竞争者的电流值，I0是不加竞争者的电流值。以加替沙星的浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，作图得到标准曲线(图2)。
实施例3、检测加替沙星的电化学酶联免疫检测试剂盒的组装
1、检测加替沙星的电化学酶联免疫检测试剂盒的组成
A、包被有包被抗原(加替沙星与卵清蛋白的偶联物)的固相载体(96孔酶标板)；
B、加替沙星抗体工作液(体积比浓度为1∶10000)；
C、标准溶液6瓶，浓度分别为：0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml；
D、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体工作液(浓度为1∶2000)；
E、浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaCl 80g、KH2PO42.0g、Na2HPO4·12H2O229.0g、KCl 2.0g的水溶液。
F、浓缩洗涤液：是上述浓缩磷酸盐缓冲液加入体积比浓度为0.05％的吐温20(Tween20)；
G、电活性物质溶液：是含有2mM的对苯二酚和2mM的双氧水的超纯水混合液；
H、碳纤维工作电极：是以碳纤维材料制作成的工作电极。
2、酶标板的制备
用碳酸盐缓冲液(0.05M，pH9.6)将包被抗原稀释成1.5μg/mL，酶标板的每孔加入100μL，4℃孵育15小时，倾去包被液，每孔加入300μL洗涤液洗涤3次，拍干；然后每孔加入封闭液250μL，37℃封闭2小时，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用真空干燥器干燥2小时，再用锡箔纸真空密封4℃保存。
实施例4、检测加替沙星的电化学酶联免疫检测试剂盒的应用
1、试剂的配制
A、样品稀释液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用蒸馏水稀释10倍后使用。
B、洗涤溶液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍后使用。
2、样品前处理
本尿样来源于济南农业科学研究院
尿样：将尿样样品在4℃，10000转/分钟离心15分钟，去除沉淀；将尿样上清用磷酸盐缓冲液稀释成1∶10，得到待测样品。
3、检测步骤
A、加样：向酶标板微孔中加入加替沙星系列浓度标准溶液或样品溶液50μL，然后加入加替沙星抗体溶液50μL，室温(25℃)恒温孵育30分钟；
B、洗涤：倾出孔中液体，每孔加入洗涤溶液300μL，洗涤3次，拍干；
C、加酶标羊抗兔抗体溶液：每孔加入酶标羊抗兔抗体溶液100μL，室温恒温孵育30分钟；
D、洗涤：倾出孔中液体，每孔加入洗涤溶液300μL，洗涤3次，拍干；
E、加电活性物质溶液：每孔加入电活性物质溶液100μL，室温(37℃)恒温孵育10分钟；
F、检测：用碳纤维工作电极连用电化学工作站在输出电压-0.15V的条件下测量电流值。
4、结果判断
标准曲线的绘制：横坐标为加替沙星浓度的对数值，纵坐标为各标准品和样品的电流值与标准液为0ng/ml的电流值的比值，即抑制率，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出(如图2所示)。
％抑制率＝％标准品电流值(或样品)/0标准品电流值。结果见下表。
| 样品编号 | 测量1(ng/mL) | 测量(ng/mL) | 平均值(ng/mL) |
| 1 | 0.4 | 0.5 | 0.45 |
| 2 | 2.4 | 3.0 | 2.7 |
实施例5、试剂盒精密度和准确度试验
取5，10，50ppb的加替沙星标样，添加到牛尿样品中，来检测加替沙星的回收率。每个浓度的批间变异系数都以不同的5天的5个重复数据进行计算，批内变异系数以同一天的5次重复数据计算。
根据制定的标准曲线的线性方程进行回收率的定量计算。结果见下表。
从上述测定结果看，变异系数低于15.4％，回收率在93.8～112.4％之间。表明本试剂盒有很好的重复性和准确度。
Claims (10)
1.一种加替沙星的电化学酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，包括包被有加替沙星包被抗原的酶标板、加替沙星多克隆抗体溶液、酶标二抗溶液和电活性物质溶液；
所述包被有加替沙星包被抗原的酶标板中的加替沙星包被抗原按照如下方法制备：由加替沙星通过碳化二亚胺活化酯与分子量范围是4.2Ka～4.8Ka的卵清蛋白偶联制得；
所述加替沙星多克隆抗体溶液中的加替沙星多克隆抗体按照如下方法制备：由加替沙星与分子量范围为6.7Ka～6.8Ka的牛血清白蛋白偶联所得的偶联物作为免疫原免疫动物新西兰大白兔制备得到；
所述的酶标二抗是用过碘酸钠将辣根过氧化物酶与羊抗兔抗体进行偶联制得。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被有加替沙星包被抗原的酶标板中的酶标板为透明高吸附聚苯乙烯96孔酶标板，包被浓度为1.5μg/ml。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述加替沙星多克隆抗体溶液的浓度为1∶8000～1∶16000。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，浓度为1∶10000。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗溶液的浓度为1∶2000。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的电活性物质溶液是2mM对苯二酚和2mM双氧水的超纯水混合液。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括加替沙星系列标准品溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、碳纤维工作电极。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述加替沙星系列标准品溶液浓度分别为0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。
9.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaCl 80g、KH2PO42.0g、Na2HPO4·12H2O229.0g、KCl 2.0g的水溶液；所述浓缩洗涤液为含有体积分数0.05％吐温-20的pH7.40.1mol/L的磷酸盐缓冲液；所述的碳纤维工作电极工作电位为-0.15V。
10.权利要求1所述的加替沙星的电化学酶联免疫检测试剂盒在检测食品、饲料和动物尿样中叶酸加替沙星含量方面的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110914 |