CN102181361A - 一种分选细胞的装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分选细胞的装置及方法，其以微流芯片为核心，外部连接无菌毛细管和医用抽注器后，在微流芯片内部形成完全封闭的无菌环境，使用抽注器将混合细胞培养液注入到微流芯片中的细胞分选室内部，使用飞秒光镊在细胞分选室中捕捉并将待分选的细胞移动到细胞收集室中，当细胞收集室中储存足够数量的细胞后，通过向细胞分选室中注入无菌培养液的方式将细胞收集室中的细胞注入到无菌毛细管中，取下毛细管密闭保存，从而完成整个分选细胞的操作过程。在细胞分操作过程中混合细胞培养液与外界隔离，避免了细胞培养液被污染。本发明具有装置结构合理、制作简单、分选操作方便、成功率高的优点，可应用于生命科学领域。

Description

一种分选细胞的装置及方法
技术领域
本发明涉及一种分选细胞的装置及方法，具体地说是一种使用微流芯片作为分选细胞容器，在微流芯片中使用飞秒光镊对细胞进行分选。
技术背景
细胞是生命活动的基本单位，一切生命问题的答案最终都可以在细胞中找到。细胞生物学的发展在很大程度上依赖于对单个活细胞的操作。在遗传工程中，将含有特殊基因片段的细菌用荧光基因标记，在荧光标记过程中并非所有细菌都会标记成功，因此需要将成功标记的细菌分选出来单独培养；另外在标记后的细菌增殖后为检测基因片段在细菌传代后是否能够稳定表达，仍然需要将含有荧光基因并能稳定遗传的细菌分选出来进行培养。在细胞或细菌分选时，所使用的传统手段一般为手工操作或机械手操作的接触式分选，这往往对细胞会造成机械损伤，对细胞的损伤程度只有通过细胞增殖后才能确定。另外在整个操作过程中必须要在无菌条件下进行，否则会造成细胞培养液污染，对实验操作环境要求很高。而且要在培养的细胞中选择出变异个体或有标记的个体时，使用传统机械方法往往导致细胞死亡或者操作过程中被外来细菌污染，选择成功率很难保证。
近年来发展起来的使用金磁性微粒对一类细胞进行筛选，如专利200610104760.2利用抗体与抗原一对一结合的原理实现对一类具有表面抗原的细胞进行分选，该方法首先将抗体与金磁性微粒结合，然后加入细胞培养液，通过抗原抗体特异结合反应将细胞结合到金磁性微粒上，再使用磁性分离器将磁性微粒分离出来并将细胞从磁性微粒表面洗脱下来。该方法整个分选过程操作复杂，当待分选细胞表面不含有抗原或待分选细胞为变异个体或待分选细胞为细菌时，该方法则无法实现细胞分选功能。
自激光光镊被发明以来，由于其具有非接触、无损伤地操纵微纳尺度粒子的特性，被认为是最理想的单分子、单细胞、微粒、微纳器件操作技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种组成合理，加工简单，具有良好的光学加工性能，化学稳定性好，可对细胞进行无损伤捕捉和移动，分离效果好的分选细胞的装置及方法。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一种分选细胞的装置，其特征在于：其设有一微流芯片，微流芯片中设有一储存混合细胞的细胞分选室和若干个细胞收集室，细胞分选室和各细胞收集室分别通过中间微流通道连接；细胞分选室侧面设有一条通向芯片外部的侧微流通道，并通过毛细管与培养液抽注器连接；细胞分选室后部设有一后微流通道，并通过毛细管与混合细胞抽注器连接；每个细胞收集室设有一条通向芯片外部的前微流通道，并分别通过毛细管与分选细胞抽注器连接。
本发明所述中间微流通道与细胞分选室的连接口位于细胞分选室前侧，后微流通道与细胞分选室的连接口位于所述细胞分选室前侧相对的后侧。
本发明所述侧微流通道与细胞分选室的连接口位于细胞分选室侧面前1/3-1/4处，侧微流通道入口方向向前倾斜。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案还是：一种利用上述装置进行分选细胞的方法，其特征在于具体步骤是：
(1) 在无菌操作台上，通过培养液抽注器将无菌培养液注入微流芯片，使培养液充满整个微流芯片内部；
(2) 通过混合细胞抽注器将含有混合细胞的培养液从细胞分选室后侧缓慢注入到细胞分选室中，使混合细胞培养液距离细胞分选室侧微流通道入口1~2mm；
(3) 使用光镊在细胞分选室中捕捉细胞，然后将捕捉的细胞通过连接细胞分选室和细胞收集室的中间微流通道移动到相应的细胞收集室中，关闭光路中的快门，释放细胞；
(4) 通过混合细胞抽注器从细胞分选室中吸出混合细胞培养液，同时再次通过培养液抽注器向细胞分选室中缓慢注入无菌培养液，当细胞分选室中的混合细胞排除干净后混合细胞抽注器停止吸入，同时使用分选细胞抽注器将分选出的各细胞收集室中的细胞吸入到毛细管中，将毛细管从微流芯片上取下并密闭保存，实现分选细胞的目的。
本发明所述的光镊是由飞秒激光种子光经过计算全息图后形成飞秒涡旋光再经过显微物镜聚焦形成的涡旋光镊，或者直接将飞秒激光种子光由显微物镜聚焦形成的高斯光镊。
本发明所述的飞秒激光种子光聚焦形成的飞秒高斯光镊，重复频率为76MHz，波长为800nm。
本发明所述装置中微流芯片的玻璃基体材料具有良好的光学性能和化学稳定性，可适用于各种细胞培养液，并有利于飞秒激光聚焦，在微流通道、细胞分选室和细胞收集室内部能够形成光束质量良好的光镊。微流芯片为整体结构，外部链接无菌装置后，能够实现全密闭的无菌环境。所述方法利用飞秒光镊对少数细胞、细菌的变异个体及特殊标记的个体进行捕捉，可以快速、无损伤的将细胞、细菌从培养液中分选出来。可以在微流芯片中进行多种细胞或细菌的分离收集，并可以使用光镊在微流芯片中对单个细胞或细菌进行操作。本发明将光镊技术与微流芯片技术相结合可以快速有效的分选出单个细胞或多个同类细胞进行收集培养，使用飞秒光镊在微流芯片内对细胞进行捕捉和移动，实现分选细胞的目的。本发明方法可以广泛地应用于生命科学和遗传学。
附图说明
图1是本发明分选细胞装置的组成结构示意图。
图中的标号是：1.分选细胞抽注器，2.分选细胞抽注器，3.分选细胞抽注器，4.培养液抽注器，5.混合细胞抽注器，6.细胞分选室，7. 侧微流通道，8.中间微流通道，9.中间微流通道，10.中间微流通道，11.细胞收集室，12.细胞收集室，13.细胞收集室，14.后微流通道。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进一步说明。
一种分选细胞的装置，其设有一微流芯片，微流芯片中设有一储存混合细胞的细胞分选室6和若干个细胞收集室。本实施例设有三个细胞收集室11、12、13，用来收集三种不同类型的细胞。细胞分选室6和各细胞收集室11、12、13分别通过中间微流通道8、9、10连接；细胞分选室6侧面设有一条通向芯片外部的侧微流通道7，并通过毛细管与培养液抽注器4连接；细胞分选室6后部设有一后微流通道14，并通过毛细管与混合细胞抽注器5连接；细胞收集室11、12、13设有一条通向芯片外部的前微流通道，并分别通过毛细管与分选细胞抽注器1、2、3连接。
本发明所述中间微流通道8、9、10与细胞分选室6的连接口位于细胞分选室6前侧，后微流通道14与细胞分选室6的连接口位于所述细胞分选室6前侧相对的后侧。
本发明所述侧微流通道7与细胞分选室6的连接口位于细胞分选室侧面前1/3-1/4处，侧微流通道入口方向向前倾斜，一般来讲向前倾斜角度为30°到60°。这样，可以使培养液向前流动，避免并阻止混合细胞液进入中间微流通道8、9、10和各细胞收集室。
本发明所述各个抽注器可以是医用注射器，用来抽、注液体。
本发明所述的微流芯片主要成分为SiO2的透明玻璃介质，微流芯片能够进行高温及紫外灭菌处理，灭菌处理后的微流芯片在无菌操作台上通过毛细管和相应的抽注器连接。
本发明利用上述装置进行分选细胞的方法，其具体步骤是：首先将微流芯片进行高温灭菌处理，然后在无菌操作台上将微流芯片与外部连接的微流通道口处先连接医用无菌毛细管，再将分选细胞抽注器1、2、3直接与毛细管连接，将培养液抽注器4中吸入5ml无菌培养液后与毛细管连接，将混合细胞抽注器5中吸入1ml含有多种混合细胞的培养液后与毛细管连接，从而使微流芯片内部成为一个完全密闭的无菌环境。最后将微流芯片固定在飞秒光镊的操作平台上。分选细胞抽注器1、2、3，培养液抽注器4，混合细胞抽注器5可以是现有的医用无菌注射器。
(2) 通过培养液抽注器4微流芯片注入无菌培养液，同时使用分选细胞抽注器1、2、3、5吸入，使无菌培养充满整个芯片内部。然后，使用混合细胞抽注器5将含有混合细胞的培养液缓慢注入到细胞分选室6中，使混合细胞距离侧微流通道7与细胞分选室连接口处1~2mm。混合细胞培养液中含有葡萄链球菌、枯草芽孢杆菌和染色的大肠杆菌。
(3) 使飞秒激光种子光，经过计算全息图产生频率为76MHz，波长为800nm，能量为60mW的飞秒涡旋光。将飞秒涡旋光经过聚焦物镜(100× 0.9NA，Nikon)聚焦到细胞分选室6中形成涡旋光镊，移动光镊操作平台使光镊分别捕捉葡萄链球菌、枯草芽孢杆菌和染色的大肠杆菌并通过连接细胞收集室的微流通道8、9、10移动到细胞收集室11、12、13中，然后将捕捉的细胞通过连接细胞分选室和细胞收集室的微流通道移动到相应的细胞收集室中，关闭光路中的快门，释放细胞；经过多次捕捉、移动，每个细胞收集室中储存10个细菌细胞。整个操作过程可以通过飞秒光镊系统的检测器观察。
(4) 而后，通过混合细胞抽注器5从细胞分选室6中吸混合细胞培养液，同时使用培养液抽注器4向细胞分选室6中缓慢注入无菌培养液，当细胞分选室中的混合细胞排除干净后混合细胞抽注器5停止吸入，同时使用分选细胞抽注器1、2、3将分选出的细胞吸入到无菌毛细管中。将毛细管从微流芯片上取下并密闭保存，在无菌操作台上将毛细管内的细菌移入培养基中培养。
经过以上操作步骤可以从培养液中分选出具有特殊标记或变异性的单细胞个体，也可以从被污染的培养液中分选出原菌种，可以实现对珍贵菌种的保护。
本发明操作简单，可以有效的从多种混合细胞中分选出具有特殊标记或变异的个体。微流芯片可以根据待分选细胞种类的多少进行制备，微流芯片为整体结构，外部链接无菌装置后，可以实现芯片内部完全密闭的无菌环境，不需要光镊实验操作间为无菌环境。所选择的飞秒光镊为800nm红外波段，对细胞和细菌损伤极小，可以实现几乎无损伤的细胞分选操作。

Claims (6)

1.一种分选细胞的装置，其特征在于：其设有一微流芯片，微流芯片中设有一储存混合细胞的细胞分选室和若干个细胞收集室，细胞分选室和各细胞收集室分别通过中间微流通道连接；细胞分选室侧面设有一条通向芯片外部的侧微流通道，并通过毛细管与培养液抽注器连接；细胞分选室后部设有一后微流通道，并通过毛细管与混合细胞抽注器连接；每个细胞收集室设有一条通向芯片外部的前微流通道，并分别通过毛细管与分选细胞抽注器连接。
2.根据权利要求1所述的分选细胞的装置，其特征在于：所述中间微流通道与细胞分选室的连接口位于细胞分选室前侧，后微流通道与细胞分选室的连接口位于所述细胞分选室前侧相对的后侧。
3.根据权利要求1所述的分选细胞的装置，其特征在于：所述侧微流通道与细胞分选室的连接口位于细胞分选室侧面前1/3-1/4处，侧微流通道入口方向向前倾斜。
4.一种使用权利要求所述装置分选细胞的方法，其特征在于具体步骤如下：
(1) 在无菌操作台上，通过培养液抽注器将无菌培养液注入微流芯片，使培养液充满整个微流芯片内部；
(2) 通过混合细胞抽注器将含有混合细胞的培养液从细胞分选室后侧缓慢注入到细胞分选室中，使混合细胞培养液距离细胞分选室侧微流通道入口1~2mm；
(3) 使用光镊在细胞分选室中捕捉细胞，然后将捕捉的细胞通过连接细胞分选室和细胞收集室的中间微流通道移动到相应的细胞收集室中，关闭光路中的快门，释放细胞；
(4) 通过混合细胞抽注器从细胞分选室中吸出混合细胞培养液，同时再次通过培养液抽注器向细胞分选室中缓慢注入无菌培养液，当细胞分选室中的混合细胞排除干净后混合细胞抽注器停止吸入，同时使用分选细胞抽注器将分选出的各细胞收集室中的细胞吸入到毛细管中，将毛细管从微流芯片上取下并密闭保存，实现分选细胞的目的。
5.根据权利要求4所述的分选细胞的方法，其特征在于：所述的光镊是由飞秒激光种子光经过计算全息图后形成飞秒涡旋光再经过显微物镜聚焦形成的涡旋光镊，或者直接将飞秒激光种子光由显微物镜聚焦形成的高斯光镊。
6.根据权利要求5所述的分选细胞的方法，其特征在于：所述的飞秒激光种子光聚焦形成的飞秒高斯光镊，重复频率为76MHz，波长为800nm。
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