CN102171242A - G6PC2编码的β细胞表面标签 - Google Patents

Abstract

本发明涉及G6PC2编码的β细胞表面标记、鉴定和获得包含完全分化的β细胞的培养细胞的方法。本发明还包括分选这类细胞、其分离细胞及组合物的方法。

Description

G6PC2编码的β细胞表面标签

发明领域

本发明涉及选择性细胞表面标记，其是由G6PC2编码的胰岛特异性葡糖-6-磷酸催化亚基相关蛋白(IGRP)的胞外部分，并且可供选择和定量测定包含完全分化的胰腺内分泌β细胞表型的细胞的独特亚群。在一个实施方案中，G6PC2编码的β细胞表面标签是剪接变体。还包括其序列、组合物、细胞培养物和完全分化的β细胞的细胞群体以及产生完全分化的β细胞和检测完全分化的β细胞的方法。

发明背景

β细胞移植对改进1型糖尿病的治疗有着巨大前景，但是首先需要克服许多障碍。其中之一是缺乏可利用的供体胰岛。胚胎干(ES)细胞衍生的β细胞基本上可以供应无数的β细胞用于移植，但是还未开发出用于产生完整功能的β细胞的可靠方案。对于小鼠和人ES细胞两者，在例如WO 2005/116073、WO 2005/063971和US 2006/0148081中报道了由胚胎干细胞形成的定型内胚层(DE)细胞。由例如DE细胞有效地形成胰内胚层(PE)细胞对形成用于治疗糖尿病的产胰岛素β细胞是有利的。

在培养完全分化的胰岛细胞的尝试中，目标一直是分离胰细胞，包括能够分化成胰β细胞或胰岛的胰内分泌先祖细胞。从外分泌谱系分离胰内分泌谱系的一个重要步骤可能是鉴定可识别的对胰内分泌先祖细胞和/或其子代有特异性的细胞标记，特别是对成熟的产胰岛素的β细胞有特异性的标记。为此对胞内和胞外标记两者进行了研究。已经对胞内标记，特别是对在发育成完全分化的胰岛细胞的胚胎胰细胞中检出的转录因子作为祖代标记进行了广泛的研究。例如，对Pdx-1、Ngn3、Pax6和Isl-1等转录因子进行了研究。它们在胚胎发育成胰内分泌细胞期间进行编程的细胞中表达。然而，这些胞内标记提供比胞外标记少的实用价值，因为分析这些标记的表达需要杀死细胞或将报道基因经遗传工程改造至细胞中而对细胞进行永久修饰。

一经鉴定，胞外标记可提供优势，使得表达标记的细胞可在无菌条件下进行分选并继续生存。已对作为胰岛祖代标记的上皮细胞黏着分子(例如Ep-CAM和整联蛋白)进行了研究。

附图简述

图1表示全长人G6PC2编码的肽的整体组构--表示跨膜序列段以及5个ER腔结构域和5个胞质结构域。外显子-外显子间的边界用灰色圆圈和箭头标注。预测包含活性中心的氨基酸残基用实心黑色圆圈标注。残基92-94上的Asn-联糖基化位点用作寡糖的接纳体。

图2表示小鼠和人G6PC2编码的肽的全长ClustalW比对。在人和小鼠蛋白质序列间的行中，相同残基用氨基酸的一字母代码标注，保守取代用“+”标注，非保守取代用“”标注，即空白。

发明概述

在一个实施方案中，本发明涉及由G6PC2编码的分离肽，其中所述肽包含i)胞外部分和ii)G6PC2的一个或多个外显子的缺失，前提条件是所述肽不是MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYTFLNFMSNVGDPRNIFFIYFPLCFQFNQTVGTKMIWVAVIGDWLNLIFKWKSIWPCNGRILCLVCHGNRCPEPHCLWDG。在一个实施方案中，本发明涉及由G6PC2编码的分离肽，其中所述肽包含i)胞外部分，和ii)G6PC2的一个或多个外显子的缺失以及编码所述肽的分离核苷酸和表达所述肽的分离细胞。在一个实施方案中，本发明涉及鉴定完全分化的β细胞的方法，所述方法包括使包含胰细胞的细胞群体与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂接触。

在一个实施方案中，本发明涉及获得完全分化的β细胞的培养物的方法，所述方法包括：使包含胰细胞的细胞群体与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂接触，并且将对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞流分中的与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂结合的细胞从不与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂结合的细胞中分离出来。

在一个实施方案中，本发明涉及向在其至少一种胰腺激素产生中有缺陷的哺乳动物提供胰内分泌功能的方法，其中细胞通过本文限定的方法获得，所述方法还包括以下步骤：将所获得的细胞以足以在哺乳动物中产生可测量的至少一种胰腺激素的量植入哺乳动物。在一个实施方案中，所述至少一种胰腺激素是胰岛素。在一个实施方案中，哺乳动物是人。

在一个实施方案中，本发明涉及通过以下步骤定量测定对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的包含胰细胞的细胞的方法：a)使细胞与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂接触；和b)测定展示作为细胞表面标记的G6PC2编码的β细胞表面标签的细胞(对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞)的量。

在一个实施方案中，本发明涉及用于体外方案优化的方法，其中定期监测表达G6PC2编码的β细胞表面标签的细胞(对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞)的数目。

在一个实施方案中，本发明涉及通过本文限定的方法获得的分离的完全分化的β细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及包含通过本文限定的方法获得的分离的完全分化的β细胞的组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂在鉴定或选择表达作为细胞表面标记的G6PC2编码的β细胞表面标签的细胞中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及作为细胞表面标记的G6PC2编码的β细胞表面标签在获得胰内分泌细胞的培养物中的用途。在一个实施方案中，同时或序贯使用一种或多种另外的细胞表面标记以获得胰内分泌细胞的培养物。在一个实施方案中，另外的细胞表面标记选自DNER蛋白、DDR1蛋白、膜突结合蛋白(prominin)1(亦称CD133)和CD49f。在一个实施方案中，另外的细胞表面标记是DNER蛋白或DDR1蛋白。在一个实施方案中，G6PC2编码的β细胞表面标签是全长IGRP的一部分。

在一个实施方案中，本发明涉及与G6PC2编码的β细胞表面标签特异性结合的抗体。

在一个实施方案中，本发明所述G6PC2编码的β细胞表面标签如本文中定义。

发明详述

出乎意料的发现，G6PC2编码的表位，任选其剪接变体，提供对完全分化的β细胞有用的标记。在一个实施方案中，G6PC2编码的全长肽和/或其片段提供对完全分化的β细胞有用的标记。在一个实施方案中，G6PC2编码的非全长肽和任选其剪接变体提供对完全分化的β细胞有用的标记。在一个实施方案中，非全长G6PC2编码的肽偏移到这类细胞的表面。在一个实施方案中，本文定义的G6PC2的特定剪接变体的N端序列偏移到这类细胞的表面。在一个实施方案中，所有已知的G6PC2的剪接变体与正常朝向ER(内质网)腔定位的全长变体有着共同的N端氨基酸序列。在一个实施方案中，非全长剪接变体不保留在ER中，而终止于细胞表面质膜，其中N端序列因此用作β细胞的纯化标签。

在一个实施方案中，分离肽存在于细胞的外表面和/或在细胞的外表面上可检出。在一个实施方案中，本文描述的方法，例如鉴定方法，可用于测定是否存在于细胞的外表面上和/或在细胞的外表面上可检出。

G6PC2

本文使用的“G6PC2编码的肽”、“胰岛特异性葡糖-6-磷酸催化亚基相关蛋白”或“IGRP”是指所有哺乳动物形式的IGRP，包括人和小鼠。在一个实施方案中，G6PC2是编码IGRP的人基因。IGRP具有十分有限的内分泌β-胰岛表达。IGRP还以低水平在胸腺中表达。全长IGPR由5个外显子编码，是一种复杂的内质网(ER)的膜蛋白，具有9个跨膜序列段，导致5个蛋白质结构域定位于ER腔，5个结构域定位于胞质，参见图1。小鼠G6PC2的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)见图2。人G6PC2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)如下，其中有下划线的氨基酸表示外显子接点。

1   MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYTFLNFMSNVGDPRNIFFIYFPLCFQFNQTVGTKMIWV

61  AVIGDWLNLIFKWILFGHRPYWWVQETQIYPNHSSPCLEQFPTTCETGPGSPSGHAMGAS

121 CVWYVMVTAALSHTVCGMDKFSITLHRLTWSFLWSVFWLIQISVCISRVFIATHFPHQVI

181 LGVIGGMLVAEAFEHTPGIQTASLGTYLKTNLFLFLFAVGFYLLLRVLNIDLLWSVPIAK

241 KWCANPDWIHIDTTPFAGLVRNLGVLFGLGFAINSEMFLLSCRGGNNYTLSFRLLCALTS

301 LTILQLYHFLQIPTHEEHLFYVLSFCKSASIPLTVVAFIPYSVHMLMKQSGKKSQ

作为内质网(ER)膜蛋白的G6PC2编码的蛋白质由于其胞内定位而不被视为细胞表面标记的候选标记。然而，替代性mRNA加工很可能导致ER滞留信号(与作为ER滞留信号的典型的C端KDEL序列相比，其可能具有不明确的特征)丢失，且这类剪接变体然后可偏移到表面上。

本文公开的新数据表明，鉴定出在胰岛中表达的迄今未知的G6PC2编码的剪接变体。这些变体中的一些与导致表位中新的氨基酸序列段的移码以及缩短的蛋白质偏移到细胞表面有关，在此它们用作胰岛β细胞的独特标记。在一个实施方案中，剪接变体保持完整N端。若干剪接变体表现出相当的结构改变，包括特定结构域由胞质暴露转变为胞外暴露，而且包括丢失ER滞留信号并在细胞表面膜上蓄积。

本发明的发明人发现，N端表位以及β细胞选择性剪接变体产生的IGRP表位是成熟产胰岛素细胞的新的表面标签。在一个实施方案中，所述表位(亦称标签或表面标签)可用于例如抗体介导的来源于细胞制备物的成熟β细胞的细胞纯化(例如由分化的hESC产生的人β细胞)以及使用这类标签作为β细胞群体体外和体内定量或成像的靶标。

在一个实施方案中，针对G6PC2编码的β细胞表面标签产生的抗体可用来从混合细胞群体中纯化出成熟β细胞。在一个实施方案中，混合细胞群体来源于胰腺组织和/或来源于衍生自分化干细胞的内分泌培养物。

本文使用的“G6PC2编码的β细胞表面标签”、“G6PC2编码的表位”、“G6PC2编码的β细胞表面标记”或“G6PC2剪接变体编码的β细胞表面标签”是指由G6PC2编码的IGRP的胞外序列或其剪接变体。

在一个实施方案中，本发明的分离肽可用作G6PC2编码的β细胞表面标签。在一个实施方案中，G6PC2编码的β细胞表面标签包含在本发明的分离肽中。在一个实施方案中，G6PC2编码的β细胞表面标签是本发明的分离肽。

在一个实施方案中，本发明涉及由G6PC2编码的分离肽，其中所述肽包含i)胞外部分，和ii)G6PC2的一个或多个外显子的缺失。在一个实施方案中，所述肽包含胞外部分。在一个实施方案中，所述肽由胞外部分组成。在一个实施方案中，所述胞外部分包含表位。在一个实施方案中，所述分离肽包含选自G6PC2的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5的一个或多个外显子中所包含的序列。在一个实施方案中，所述分离肽是选自G6PC2的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5的一个外显子或若干邻接外显子中所包含的序列片段。在一个实施方案中，所述分离肽包含选自一个或多个选自G6PC2的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5的序列的缺失。

在一个实施方案中，所述分离肽包含N端的G6PC2编码的剪接变体部分的连续序列并且在C端截短。在一个实施方案中，所述分离肽包含选自以下的序列及其变体：

MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYT(SEQ ID NO：3)、MLVAEAFEHTPGIQ(SEQ ID NO：8)、LLSCRGGNNY(SEQ ID NO：5)和HMLMKQSGKKSQ(SEQ ID NO：6)。在一个实施方案中，所述分离肽包含序列MLVAEAFEHTPGIQTASLGT(SEQ ID NO：4)或其变体。在一个实施方案中，所述分离肽由选自以下的序列及其变体组成：MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYT(SEQ ID NO：3)、MLVAEAFEHTPGIQ(SEQ ID NO：8)、LLSCRGGNNY(SEQ ID NO：5)和HMLMKQSGKKSQ(SEQ ID NO：6)。在一个实施方案中，所述分离肽由序列MLVAEAFEHTPGIQTASLGT(SEQ ID NO：4)或其变体组成。在一个实施方案中，G6PC2剪接变体编码的β细胞表面标签包含在G6PC2的外显子1中。在一个实施方案中，N端G6PC2编码的β细胞表面标签是MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYT(SEQ ID NO：3)。在一个实施方案中，G6PC2剪接变体编码的β细胞表面标签来源于G6PC2的外显子1、2和5。在一个实施方案中，G6PC2剪接变体编码的β细胞表面标签选自MLVAEAFEHTPGIQ(SEQ ID NO：8)、LLSCRGGNNY(SEQ ID NO：5)和HMLMKQSGKKSQ(SEQ ID NO：6)。在一个实施方案中，G6PC2剪接变体编码的β细胞表面标签是MLVAEAFEHTPGIQTASLGT(SEQ ID NO：4)。

在一个实施方案中，所述分离肽包含与选自以下的氨基酸序列有至少80％，例如至少90％或至少96％同一性的天然存在的氨基酸序列：MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYT(SEQ ID NO：3)、MLVAEAFEHTPGIQ(SEQ ID NO：8)、LLSCRGGNNY(SEQ ID NO：5)和HMLMKQSGKKSQ(SEQ ID NO：6)。在一个实施方案中，所述分离肽包含与氨基酸序列MLVAEAFEHTPGIQTASLGT(SEQ ID NO：4)有至少80％，例如至少90％或至少96％同一性的天然存在的氨基酸序列。在一个实施方案中，G6PC2剪接变体编码的β细胞表面标签由至少4个，例如至少6、8、10、12、14或16个氨基酸组成。

在一个实施方案中，G6PC2编码的β细胞表面标签是全长IGRP的一部分。在一个实施方案中，G6PC2编码的β细胞表面标签是IGRP的非全长剪接变体的一部分。在一个实施方案中，G6PC2编码的β细胞表面标签是IGRP的非全长剪接变体。在一个实施方案中，G6PC2编码的β细胞表面标签是选自G6PC2的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5的一个外显子或若干邻接外显子中所包含的序列片段。

在一个实施方案中，本发明涉及编码本文限定的肽的分离核苷酸。在一个实施方案中，本发明涉及表达本文限定的肽的分离细胞。在一个实施方案中，G6PC2编码的β细胞表面标签包含胞外序列。在一个实施方案中，G6PC2编码的β细胞表面标签由胞外序列组成。

在一个实施方案中，G6PC2编码的β细胞表面标签是本文限定的分离肽的片段。在一个实施方案中，G6PC2编码的β细胞表面标签是全长IGRP的一部分。在一个实施方案中，本发明涉及编码本文限定的G6PC2编码的β细胞表面标签的分离核苷酸。在一个实施方案中，本发明涉及表达本文限定的G6PC2编码的β细胞表面标签的分离细胞。

本文使用的“剪接变体”是指RNA剪接变异机制，其中主要基因转录物pre-mRNA的外显子被分离并重新连接以产生替代性核糖核苷酸排列。这些线性组合然后进行翻译加工，其中限定了具体而独特的氨基酸序列，导致同工型蛋白。本文使用的“……的片段”是指比所提及的序列短的序列。本文使用的“……的部分”或“非全长”是指包含在所提及的较大序列中的序列。

在一个实施方案中，术语“肽”和“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或者这些当中任一个的片段。在一个实施方案中，术语“氨基酸”和“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或者这些当中任一个的片段，以及天然存在的或合成的分子。其中所列举的“氨基酸序列”是指天然存在的蛋白质分子的序列，“氨基酸序列”等术语并不把氨基酸序列限于与所引述的蛋白质分子有关的完全天然的氨基酸序列。

在一个实施方案中，特定核酸序列的“变体”定义为与一个核酸序列某一长度内的特定核酸序列有至少40％序列同一性的核酸序列。在一个实施方案中，特定核酸序列的“变体”定义为应用具有“BLAST 2序列”工具2.0.9版(1999年5月7日)、设置为默认参数的blastn，与一个核酸序列某一长度内的特定核酸序列有至少40％序列同一性的核酸序列。这类核酸对在某一限定长度内可具有例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或至少99％或更大的序列同一性。剪接变体可能与参比分子有显著同一性，但是由于mRNA加工期间的可变剪接，一般可具有较多或较少的多核苷酸数目。相应的多肽可具有额外功能结构域或缺乏存在于参比分子中的结构域。在一个实施方案中，特定多肽序列的“变体”定义为与一个多肽序列某一长度内的特定多肽序列有至少40％序列同一性或序列相似性的多肽序列。在一个实施方案中，特定多肽序列的“变体”定义为应用具有“BLAST 2序列”工具2.0.9版(1999年5月7日)、设置为默认参数的blastp，与一个多肽序列某一长度内的特定多肽序列有至少40％序列同一性或序列相似性的多肽序列。这类多肽对可在一个多肽某一限定长度内具有例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或更大的序列同一性或序列相似性。

在一个实施方案中，“同一性”或”序列同一性”在与其相比较的整个长度的序列(即参比序列)内进行测定。以测定两个序列之间的序列同一性的测定方法为例，对QBCDE和ABCDE进行比对。将经过比对的相同的残基数减去不同的残基数，除以ABCDE中残基的总数，得到QBCDE相对于ABCDE的序列同一性。因此，所述实例的序列同一性为(5-1)/5。

在一个实施方案中，用于多肽序列的表述“百分比同一性”和“％同一性”是指应用标准化算法比对的至少两个多肽序列之间相同残基匹配的百分比。多肽序列比对的方法是众所周知的。一些比对方法考虑了保守氨基酸取代。这类保守取代一般维持取代位点上的电荷和疏水性，因此维持多肽的结构(及其功能)。在一个实施方案中，用于多肽序列的表述“百分比相似性”和“％相似性”是指应用标准化算法比对的至少两个多肽序列之间残基匹配的百分比，包括相同的残基匹配和保守取代。相比之下，在计算多肽序列之间的百分比同一性时不包括保守取代。

在一个实施方案中，当并入MEGALIGN 3.12e版序列比对程序时，可采用CLUSTAL V算法的默认参数，来计算多肽序列之间的百分比同一性，例如序列同一性。对于应用CLUSTAL V的多肽序列的两两比对，默认参数设置如下：Ktuple＝1，空位罚分＝3，窗＝5，“diagonals saved”＝5。选择PAM250矩阵作为默认残基权重表。在一个实施方案中，NCBI BLAST软件套件可用于测定百分比同一性，例如序列同一性。例如，对于两个多肽序列的两两比较，可以应用具有设置为默认参数blastp的“BLAST 2序列”工具2.0.12(2000年4月21日)；这类默认参数可以是例如：Matrix：BLOSUM62；Open Gap：11，Extension Gap：I penalties；Gap x drop-off。-50；Expect：10；Word Size：3；Filter：on。

在一个实施方案中，百分比同一性，例如序列同一性，可以在整个限定的多肽序列长度内测定，例如由具体SEQ ID编号限定，或者可在较短长度内测定，例如在取自较大的限定多肽序列的片段长度内，例如至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段。这些长度只是示例性的，要理解的是，由在表格、附图或序列表中所示序列支持的任何片段长度，都可用来描述可在其间测定百分比同一性的长度。

在一个实施方案中，本发明不涉及 MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYTFLNFMSNVGDPRNIFFIYFPLCFQFNQTVGTKMIWVAVIGDWLNLIFKWKSIWPCNGRILCLVCHGNRCPEPHC

胰内分泌细胞及其祖代

在胰腺中，可存在若干不同类型的胰细胞。这些细胞包括例如多能胰祖细胞、导管/内分泌祖细胞、内分泌前祖细胞、内分泌祖细胞、早期内分泌细胞、完全分化的内分泌细胞和/或完全分化的β细胞。

在本文中可互换使用的“胰内分泌细胞”或“胰腺激素表达细胞”是指能够表达至少一种以下激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和生长素释放肽。

本文使用的“胰腺激素分泌细胞”是指能够分泌至少一种以下激素的胰内分泌细胞：胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和生长素释放肽。

本文使用的“胰内分泌前祖细胞”(亦称“胰内分泌前祖代”和“内分泌前祖代”)是这样的细胞，其已失去其发育成胰导管和外分泌细胞的潜力，尚未表达Ngn3蛋白，且不表达激素，但是其具有分化成胰内分泌细胞或胰腺激素分泌细胞的能力，并且通常还享有这些细胞的至少部分表型特征。

本文使用的“胰内分泌祖细胞”(亦称“胰内分泌祖代”和“内分泌祖代”)是这样的细胞，其是Ngn3蛋白表达细胞却不是激素表达细胞，但其具有分化成胰内分泌细胞或胰腺激素分泌细胞的潜力，并且通常还享有这些细胞的至少部分表型特征。

本文使用的“早期内分泌细胞”(亦称“胰早期内分泌细胞”)是这样的内分泌细胞，其已关闭Ngn3但不享有成体胰腺的胰岛中存在的完全分化的胰内分泌细胞的全部特征(例如对葡萄糖的响应性)。早期内分泌细胞可能对胰内分泌激素之一(胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和生长素释放肽)呈阴性或阳性。

本文使用的“完全分化的内分泌细胞”(亦称“胰成熟内分泌细胞”)是享有成体胰腺的胰岛中存在的完全分化的胰内分泌细胞的全部特征的细胞。“胰腺激素表达细胞”和“胰腺激素分泌细胞”被视为范围为早期表型到完全分化表型的“胰内分泌细胞”。

本文使用的“完全分化的β细胞”(亦称“成熟β细胞”)是葡萄糖敏感性产胰岛素β细胞，以构成成体胰腺中胰岛的主要细胞类型为特征。

本文使用的“β细胞谱系”是指对于转录因子Pdx-1和至少一种以下转录因子具有阳性基因表达的细胞：Ngn-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、IsI-1、Hnf-3β、MafA、Pax4和Pax6。表达β细胞谱系特有标记的细胞包括β细胞。

本文使用的“导管/内分泌祖细胞”是这样的细胞，其在早期胰腺发育中存在于中心部分并保持成为成熟导管细胞、完全分化的内分泌细胞或完全分化的β细胞的双潜能。此外，这些细胞表达转录因子Pdx1和Nkx6.1，而不表达Ptf1a。导管/内分泌祖细胞的实例可存在于小鼠约e12.0的发育阶段。

本文使用的“多能胰祖细胞”是代表胰腺最早期细胞的细胞。这些细胞独特的特征在于以下3个关键转录因子的三阳性细胞：Pdx1⁺/Nkx6.1⁺/Ptf1a⁺。

本文使用的“标记”是在目标细胞中差异性表达的核酸或多肽分子。在这种情况下，差异性表达是指阳性标记的水平升高和阴性标记的水平降低。与其它细胞相比，目标细胞中的标记核酸或多肽的可检测水平足够高或低，使得可采用本领域已知各种方法中的任一种，鉴定目标细胞，并且将目标细胞与其它细胞区分开来。

在一个实施方案中，通过本发明的方法获得的胰内分泌细胞是产胰岛素细胞，任选与分化成产胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和/或生长素释放肽细胞的细胞一起。本文使用的“产胰岛素细胞”是指产生和贮存或分泌可检出量的胰岛素的细胞。“产胰岛素细胞”可以是单个细胞或细胞集合体。

细胞的“传代”通常是指接种的培养容器由部分汇合状态到汇合状态的转变，届时将其从培养容器中取出，并以较低密度重新接种在培养容器中。然而，细胞可在达到汇合前传代。在细胞群体生长达到汇合的同时，传代通常导致细胞群体增殖。细胞群体的增殖取决于最初的接种密度，但通常为1-10、1-5、1-3或1-2倍增殖。因此，传代一般需要细胞在培养物中能够进行大量的细胞分离。

包含胰细胞的细胞群体

本文使用的术语“包含胰细胞的细胞群体”是指包含一种或多种选自以下细胞类型的细胞群体：腺泡和导管细胞、多能胰祖细胞、导管/内分泌祖细胞、胰内分泌前祖细胞、胰内分泌祖细胞、早期胰内分泌细胞、胰内分泌细胞、胰β细胞、胰腺激素分泌细胞、胎胰细胞、成体胰细胞和其它非胰细胞。细胞的“群体”是指通过特殊分离的起始细胞或培养步骤所获得的大量细胞。细胞群体的性质一般定义为具有特定性质的各细胞的百分比(例如特定标记染色呈阳性的细胞的百分比)或当测定整个群体时所述性质的总体平均值(例如由细胞群体制成的裂解物中mRNA的量或Ngn3、Pax6、胰岛素或胰高血糖素等组织化学可检测标记呈阳性的细胞的百分比)。

在一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群体由胰腺获得。在一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群体从胎胰腺或成体胰腺获得。在一个实施方案中，胰腺从哺乳动物(例如人)获得。

在本发明的一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群体由体细胞群体获得。在本发明的一个实施方案中，体细胞群体被诱导去分化成胚胎样干(ES，例如多潜能)细胞。这类去分化的细胞亦称诱导多潜能干细胞(IPS)。

在一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群体由胚胎干(ES，例如多潜能)细胞获得。在一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群体是多潜能细胞，例如ES细胞。在一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群体是多潜能细胞，例如ES样细胞。

在一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群体是胚胎分化型干(ES或多潜能)细胞。分化发生在胚胎样小体和/或单层细胞培养物或其组合中。

在一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群体来源于哺乳动物。在一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群体来源于人。在本发明的一个实施方案中，细胞群体分化成胰内分泌谱系。

在一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群体由一个或多个捐赠胰腺获得。本文描述的方法不依赖于捐赠胰腺的发育年龄。因此，可以使用从发育年龄范围为胚胎至成人的捐赠者中分离出来的胰材料。

一旦从捐赠者收获胰腺，通常采用不同的方法加工产生单个细胞或小群细胞以进行培养。一种这样的方法要求清洗和制备收获的胰腺组织以进行酶消化。采用酶加工以消化结缔组织，使得收获组织的实质分解成较小单位的胰细胞材料。收获的胰腺组织用一种或多种酶处理以从收获器官的整体结构中分离出胰细胞材料、亚结构和单个胰细胞。可预期与本文公开的方法一起使用的包括胶原酶、DNA酶、Liberase制备物(参见美国专利号5,830,741和5,753,485)和其它酶。

可进一步加工分离的起始材料以富集一种或多种所需要的细胞群体。然而，未分级分离的胰腺组织，一旦从培养物中分离，便还可直接用于本发明的培养方法而无需进一步分离。在一个实施方案中，分离的胰细胞材料通过密度梯度(例如尼可登(Nycodenz)、菲可(Ficoll)或珀可(Percoll))经离心纯化。例如，美国专利号5,739,033中披露的梯度方法，可用作富集加工的胰岛中的胰材料的方法。由供体源收获的细胞的混合物通常是异质的，因此含有α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞、导管细胞、腺泡细胞、兼性祖细胞和其它胰细胞类型。

典型的纯化步骤导致分离的细胞材料分离成许多层或界面。通常形成两个界面。上界面富含胰岛，悬液中通常含有10-100％胰岛细胞。第二界面通常是混合的细胞群，含有胰岛、腺泡和导管细胞。底层是在梯度底部形成的沉淀。该层通常主要含有腺泡细胞、一些截留胰岛和一些导管细胞。可分别收集导管树成分(Ductal tree component)用于进一步操作。选用于进一步操作的流分中的细胞组分将随选择的梯度的流分和每次分离的最终结果而变化。

当胰岛细胞是所需要的细胞类型时，分离流分中适当富集的胰岛细胞群体可含有至少10％-100％胰岛细胞。在富集后，还可收获其它胰细胞类型和浓度。例如，本文描述的培养方法可用于自第二界面、沉淀或其它流分中分离的细胞，这取决于所采用的纯化梯度。

在一个实施方案中，从富含胰岛(上部)的流分产生中间胰细胞培养物。然而，通常含有胰岛、腺泡和导管细胞或导管树组分、腺泡细胞和一些截留胰岛细胞的混合细胞群体的更混杂的第二界面和底层流分另外也可分别用于培养。虽然两层均含有能够产生本文所述G6PC2阳性群体的细胞，但是各层对用于所公开的方法，都可具有特殊优势。在一个实施方案中，从富含胰岛的(上部)流分中产生G6PC2阳性胰细胞培养物。

在一个实施方案中，细胞群体是干细胞群体。在本发明的一个实施方案中，细胞群体是分化成胰内分泌谱系的干细胞群体。

干细胞是由其以单细胞水平自我更新以及分化而产生子代细胞(包括自我更新祖代、非更新祖代和最终分化的细胞)的能力界定的未分化细胞。干细胞的特征还在于其体外从多胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞、以及移植后产生多胚层的组织和注射至胚泡后实质上有助于大多数(如果不是全部的话)组织的能力。

干细胞因其发育潜力而分为：(1)全能，是指能够产生所有的胚胎和胚外细胞类型；(2)多潜能(pluripotent)，是指能够产生所有的胚胎细胞类型；(3)多能(multi-potent)，是指能够产生细胞谱系亚群，但全都属于特定的组织、器官或生理系统(例如产生包括HSC(自我更新)、限于血细胞的寡能祖代及是血液正常组分的所有细胞类型和组分(例如血小板)在内的子代的造血干细胞(HSC))；(4)寡能，是指能够产生比多能干细胞更局限的细胞谱系亚群；和(5)单能，是指能够产生单一细胞谱系(例如生精干细胞)。

由干细胞获得胰细胞的方案以D′Amour，K.A.等(2006)，Nat Biotechnol 24，1392-401；Jiang，J.等(2007)，Stem Cells 25，1940-53；以及Kroon，E.等(2008)，Nat Biotechnol，2008年2月20日[印刷版前的电子版]中描述的方案为例，但不限于此。

由体细胞或诱导去分化成多潜能细胞(例如ES样细胞)的体细胞获得胰细胞的方案以Aoi，T.等(2008)，Science，2008年2月14日，[印刷版前的电子版]；D′Amour，K.A.等(2006)，Nat Biotechnol 24，1392-401；Jiang，J.等(2007)，Stem Cells 25，1940-53；Kroon，E.等(2008)，Nat Biotechnol，2008年2月20日，[印刷版前的电子版]；Takahashi，K.等(2007)，Cell131，861-72；Takahashi，K.和Yamanaka，S.(2006)，Cell126，663-76；以及Wernig，M.等(2007)，Nature 448，318-24中描述的方案为例，但不限于此。

分化是非特化(“非定型”)细胞或低特化细胞获得特化细胞(例如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化细胞或分化诱导细胞是在细胞谱系内呈更特化(“定型”)位置的细胞。术语“定型”当应用于分化过程时，是指已进行分化途径至某一点上的细胞，在此点上在正常情况下将继续分化成特定细胞类型或细胞类型的亚型，以及在正常情况下不能分化成不同的细胞类型或恢复到较不分化细胞类型。去分化是指细胞恢复到细胞谱系内较不特化(或定型)位置上的过程。本文使用的细胞的谱系界定了细胞的遗传，即它来源于哪些细胞并可产生什么样的细胞。细胞的谱系将细胞置于发育和分化的遗传方案内。谱系特异性标记是指与目标谱系的细胞的表型明确关联的特征，并且可用来评价非定型细胞向目标谱系的分化。

本文使用的“分化(differentiate/differentiation)”是指其中细胞从未分化状态到分化状态、从不成熟状态到较不成熟状态或者从不成熟状态到成熟状态发展的过程。例如，早期未分化胚胎胰细胞能够增殖和表达特征标记，像Pdx-1、Nkx6.1和Ptf1a。成熟或分化的胰细胞不增殖，且的确分泌高水平的胰内分泌激素或消化酶。例如，完全分化的β细胞在响应葡萄糖时分泌高水平的胰岛素。当细胞损失未分化细胞的标记或获得分化细胞的标记时，便发生细胞相互作用和成熟的变化。单一标记的损失或获得可表明细胞已“成熟或完全分化”。术语“分化因子”是指加入胰细胞以提高其分化为还含有产胰岛素β细胞的成熟内分泌细胞的化合物。示例性分化因子包括肝细胞生长因子、角质形成细胞生长因子、毒蜥外泌肽-4、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、神经生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子和胰高血糖素样肽1。在一个实施方案中，细胞的分化包括将细胞培养在包含一种或多种分化因子的培养基中。

胰内分泌谱系的特有标记选自Ngn 3、NeuroD、胰岛-1、Pdx-1、Nkx6.1、Nkx2.2、MafA、MafB、Arx、Brn4、Pax-4、Pax-6、Glut2、胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽(PP)和生长素释放肽。在一个实施方案中，胰内分泌细胞能够表达至少一种以下激素：胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、PP和生长素释放肽。适用于本发明的是表达至少一种胰内分泌谱系的特有标记的细胞。在本发明的一个实施方案中，表达胰内分泌谱系的特有标记的细胞是胰内分泌细胞。胰内分泌细胞可以是胰腺激素表达细胞。或者，胰内分泌细胞可以是胰腺激素分泌细胞。

在本发明的一个实施方案中，胰内分泌细胞是表达β细胞谱系的特有标记的细胞。表达β细胞谱系的特有标记的细胞表达Pdx1和至少一种以下转录因子：Ngn-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、IsI-1、Hnf-3β、MafA、Pax4和Pax6。在本发明的一个实施方案中，表达β细胞谱系的特有标记的细胞是β细胞。在一个实施方案中，胰内分泌细胞是表达标记Nkx6.1的细胞。在本发明的一个实施方案中，胰内分泌细胞是表达标记Pdx1的细胞。在本发明的一个实施方案中，胰内分泌细胞是表达标记Nkx6.1和Pdx1的细胞。

本文使用的“Pdx-1”是指涉及胰腺发育的同源域转录因子。本文使用的“Pax-4”是β细胞特异性转录因子，本文使用的“Pax-6”是胰岛细胞(特异性)转录因子；两者均涉及胰岛发育。“Hnf-3β”属于转录因子的肝核因子家族，其特征在于高保守的DNA结合结构域和两个短羧基端结构域。本文使用的“NeuroD”是涉及神经发生的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子。本文使用的“Ngn-3”是碱性环-螺旋-环转录因子的neurogenin家族的成员。本文使用的“Nkx-2.2”和“Nkx-6.1”是Nkx转录因子家族的成员。本文使用的“胰岛-1”或“IsI-1”是转录因子的LIM/同源域家族的成员，并在发育的胰腺中表达。本文使用的“MafA”是在胰腺中表达的转录因子，并控制参与胰岛素生物合成和分泌的基因的表达。

Nkx6.1和Pdx-1在可发育成存在于成体胰腺的所有细胞类型(例如腺泡、导管和内分泌细胞)的早期胰多能细胞中与Ptf1a共表达。在该细胞群体中，发现也瞬时表达Ngn3的细胞。一旦细胞表达或已经表达Ngn3，则将成为内分泌谱系的组成部分，产生后来将形成胰岛的内分泌细胞(一种类型为产胰岛素β细胞)。在不存在Ngn3时，在胰腺发育期间不形成内分泌细胞。当进行发育时，Nkx6.1和Pdx-1在胰腺的更中心区内共表达，胰腺此时变得缺乏Ptf1a表达，并且Nkx6.1和Pdx-1阳性细胞不再产生腺泡细胞。在这个Nkx6.1和Pdx-1阳性细胞群体内，可观数目的细胞瞬时共表达Ngn3，使得它们像早期发育中的内分泌谱系。

DNER

本文使用的“DNER”、“Dner”、“DNER蛋白”或“DNER蛋白”是指所有哺乳动物形式的DNER，包括人和小鼠。人形式的DNER亦称：“含有δ/notch样EGF重复序列”，亦称例如“bet”和“UNQ26”。小鼠形式的DNER亦称：“δ/notch样EGF相关受体”，亦称例如“BET”、“Bret”、“MGC39059”和“A930026D19Rik”。DNER在其C端含有单一跨膜结构域，并推测为推定的细胞表面蛋白。它在其胞外结构域还含有大量EGF样重复序列，并且其胞质羧基端结构域含有基于酪氨酸的分选基序。在人和小鼠两者中，它长为737个氨基酸，小鼠与人之间的相似性为90％。已在小鼠中鉴定出一个家族成员。Dner在小鼠小脑中的贝格曼神经胶质(Bergmann glia)细胞形态发生期间起Notch配体的作用。Dner在细胞-细胞间接触时与Notch1结合，体外激活Notch信号转导。

DDR1

本文使用的“DDR1蛋白”或“DDR1蛋白”是指DDR/TKT型蛋白质激酶，网柄菌凝素结构域受体家族成员1。当本文使用时，该术语可全部以大写字母书写“DDR1”，或仅首字母大写“Ddr1”，且可指来源于任何哺乳动物(包括人和小鼠)的网柄菌凝素结构域受体家族成员1。DDR1被各种类型的胶原(包括I-IV型)激活。胶原与DDR1蛋白结合导致自身磷酸化和延迟但持续的酪氨酸激酶活化作用。DDR1可在细胞-细胞间的相互作用或识别中起作用。已经报道了人的至少3种mRNA变体，产生876、913和919个氨基酸的不同的蛋白质同工型。已报道了小鼠中分别为874和911个氨基酸的两种同工型。已经证实，DDR1蛋白在人乳腺、卵巢、食道和儿科脑肿瘤中过量表达。该蛋白质具有胞内受体酪氨酸激酶活性，并被各种类型的胶原激活。通过迄今已测试的所有胶原(I-VI和XI型)实现其自身磷酸化。

鉴定方法

在一个实施方案中，本发明涉及鉴定完全分化的β细胞的方法，所述方法包括使包含胰细胞的细胞群体与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂接触。在一个实施方案中，可测定与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂结合的细胞(即对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞)的数目和/或比率。

在一个实施方案中，本发明涉及通过下列步骤定量测定包含胰细胞的对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞的方法：a)使细胞与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂接触；和b)测定展示作为细胞表面标记的G6PC2编码的β细胞表面标签的细胞(对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞)的量。

本领域的技术人员应认识到，有许多检测G6PC2编码的β细胞表面标签的方法。例如，与G6PC2编码的β细胞表面标签特异性结合的抗体可用于检测G6PC2编码的β细胞表面标签。G6PC2编码的β细胞表面标签的特异性抗体是本领域技术人员已知的，且市售可得自例如R&D Systems；Research Diagnostics，Inc.；Abcam；Ancell Immunology Research Products；eBioscience；the Developmental Studies Hybridoma Bank of the Univeristy of Iowa；和Zymed Laboratories，Inc.；Abnova Corporation，-Affinity BioReagents BioLegend；GeneTex Lifespan Biosciences；MBL International Novus Biologicals；Proteintech Group，Inc.；Santa Cruz Biotechnology，Inc。识别G6PC2编码的β细胞表面标签的胞外部分的抗体可用于本发明以分选细胞。识别G6PC2编码的β细胞表面标签的胞外部分的不同表位的不同抗体可单独使用或联用。在胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域中识别G6PC2编码的β细胞表面标签的任何部分的结合G6PC2编码的β细胞表面标签的任何试剂均可用于监测G6PC2编码的β细胞表面标签的表达。本领域的技术人员应当认识到，本文描述的G6PC2编码的β细胞表面标签的检测也可适用于预期可用作本发明的标记的其它胞外蛋白。

可得到许多不同的用于与抗体缀合的荧光分子，例如荧光素、cy2、cy3、cy5、PE、Alexa488或罗丹明。技术人员知道，在某些情况下，使用与荧光分子缀合的不同抗体可检测到不只一种胞外标记。在鉴定不只一种目标胞外标记的情况下，可进行FACS分析。

在一个实施方案中，结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂是与G6PC2编码的β细胞表面标签特异性结合的抗体。

在一个实施方案中，本发明涉及与G6PC2编码的β细胞表面标签特异性结合的抗体。在一个实施方案中，G6PC2编码的β细胞表面标签是全长IGRP的一部分。

“抗体”是指包含得自免疫球蛋白基因的构架区或其特异性结合和识别抗原的片段的多肽。抗体(亦称免疫球蛋白)是存在于脊椎动物血液或其它体液中的蛋白质，并被免疫系统用来鉴定和中和外来物质，例如细菌和病毒。虽然所有抗体的总体结构非常相似，但是蛋白质尖端的小区域十分不同，使得存在数百万具有略微不同的尖端结构的抗体。该区称为超变区。这些变体的每一个可与不同的称为抗原的靶标结合。抗体的这种巨大的多样性使得免疫系统识别同样广泛多样性的抗原。抗体识别抗原的独特部分称为表位。这些表位以称为诱导契合的高特异性相互作用与其抗体结合，使得抗体在构成生物体的数百万不同分子之中仅识别并结合其独特的抗原。

评价培养细胞或分离细胞中蛋白质和/或mRNA的表达的方法是本领域的标准方法，包括定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、RNA印迹法和原位杂交(参见例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等主编，2001增刊))和免疫测定法，例如切片材料的免疫组织化学分析、蛋白质印迹法及对于易进入完整细胞的标记的流式细胞术分析(FACS)(参见例如Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。还可使用内分泌细胞分化的常用组织化学标记。可将待通过免疫组织化学分析的细胞在玻璃室载玻片上培养用于显微镜观察。或者，可通过手工、酶促方法或通过使用无酶细胞解离缓冲液从培养物中提取在常规组织培养物中生长的细胞，并包埋在石蜡或TissueTech中用于分选。细胞分化标记可不同，且可通过常规免疫组织化学检测。一种普遍适用的方案如下。

将室载玻片中的细胞轻轻地用PBS漂洗，在4％低聚甲醛溶液中固定45分钟。细胞然后用PBS漂洗，并保存在+5℃下备用。在使用当天，使细胞通过等级系列的乙醇(以70％开始移至96％，然后至99％，然后再次至99％，然后至96％，最后至70％，各浓度5分钟温育)透化，然后在含有正常血清或TNB(得自Perkin Elmer的TSA(Tyramide Signal Amplification)试剂盒)的封闭溶液中于室温温育。以适当的稀释度制备第一抗体，并加到细胞中，在保温室中在室温(RT)下温育过夜(O/N)。与第一抗体温育后，将细胞在PBS中漂洗。将以适当稀释度制备的荧光第二抗体加到细胞中，在暗中温育。对于细胞核复染可包括第二抗体DAPI染料。然后漂洗细胞，除去过量液体，并除去载玻片的室部分，载玻片盖上盖玻片。将载玻片干燥，并保存在暗中直到使用荧光显微镜(例如共焦显微镜)检查。

或者，可以制备细胞用于使用HRP(辣根过氧化物酶)方法的免疫细胞化学法。使用生物素偶联抗体作为第二抗体。载玻片然后用PBS漂洗，并用抗生物素蛋白-HRP温育。再次漂洗载玻片，并用TSA试剂温育以观测第一抗体。装上载玻片，使用常规光学显微镜目测。

对于组织切片中的蛋白质鉴定，将组织在4％PFA(低聚甲醛)中固定过夜，然后在30％蔗糖中进行低温保护过夜后，包埋在TissueTech中。然后在切片机中切片，在PBS(磷酸缓冲盐溶液)中漂洗，在0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中进行微波处理15分钟以使表位复原。可采用上文或本文描述的方法将这类切片染色，但略去等级乙醇处理。在采用基于HRP的试验的情况下，使用过氧化氢溶液抑制内源性过氧化物酶活性。

对在Lillys固定剂中固定45分钟的细胞进行分析型FACS分选。为了除去上清液，将细胞在2ml管中于室温以1400rpm沉淀10分钟。此后将细胞在PBS与0.1％BSA中洗涤，加入得自产生第二抗体的动物的血清达到10％血清(终浓度)而将细胞封闭，封闭1小时。然后将细胞沉淀，弃去上清液。加入第一抗体溶液，在室温下温育过夜。次日，在2ml管(使用1.8ml)中洗涤细胞3x 5分钟。加入第二抗体，在室温下温育1小时。在PBS与0.1％BSA(使用1.8ml)中洗涤细胞3x5分钟。最后，通过FACS测定细胞。

可通过将细胞群体与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂接触并评价染色，来完成完全分化的β细胞的鉴定。该分析可采用以下方法进行：例如荧光激活细胞分选(FACS)、磁性细胞分选(MACS)、免疫组织化学(IHC)、蛋白质印迹、PCR或ELISA。

在一个实施方案中，本发明涉及通过本文限定的方法获得的分离的完全分化的β细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂在鉴定或选择表达作为细胞表面标记的G6PC2编码的β细胞表面标签的细胞中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及作为细胞表面标记的G6PC2编码的β细胞表面标签在获得胰内分泌细胞的培养物中的用途。在一个实施方案中，一种或多种另外的结合试剂与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂同时或序贯使用。在一个实施方案中，所述另外的结合试剂选自DNER、DDR1、膜突结合蛋白1(亦称CD133)和CD49f结合试剂。在一个实施方案中，同时或序贯使用一种或多种另外的细胞表面标记以获得胰内分泌细胞的培养物。在一个实施方案中，另外的细胞表面标记选自DNER蛋白、DDR1蛋白、膜突结合蛋白1(亦称CD133)和CD49f。在一个实施方案中，另外的细胞表面标记是DNER蛋白或DDR1蛋白。

分离方法

在一个实施方案中，本发明涉及获得完全分化的β细胞的培养物的方法，所述方法包括：使包含胰细胞的细胞群体与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂接触，在对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞的流分中，从不与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂结合的细胞中分离出与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂结合的细胞。

在一个实施方案中，分离步骤通过荧光激活细胞分选(FACS)进行。在一个实施方案中，监测步骤通过FACS进行。在一个实施方案中，分离步骤通过淘选进行。在一个实施方案中，分离步骤通过MACS进行。

使用与G6PC2编码的β细胞表面标签特异性结合的荧光标记分子(最常见为抗体)，结合荧光激活细胞分选仪(FACS)，来选择对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞。简单地讲，在一个实施方案中，将包含胰细胞的细胞群体与荧光标记的抗体一起温育，在抗体结合后，通过FACS分析细胞。细胞分选仪供悬浮于经由荧光计的液体中的单细胞通过。测定荧光的量，选择荧光水平可检测地高于对照未标记细胞的细胞作为阳性细胞。

磁性细胞分选(MACS)通过将与β细胞上的G6PC2结合的特异性抗体与铁颗粒标记的第二抗体一起温育，并使用磁体相继分选来进行。

在其中包含胰细胞的细胞群体由胰腺分离的实施方案中，首先将细胞培养一次或多次传代，然后用G6PC2编码的β细胞表面标签的特异性抗体标记。细胞然后用FACS扫描，以从对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阴性的细胞中分离出对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞。虽然该实例论述了用标记的抗体进行FACS分析，但是还可使用特异性结合G6PC2编码的β细胞表面标签的其它分子，例如凝集素和胶原以及G6PC2编码的β细胞表面标签的其它结合配偶体，例如上文或本文列举的结合配偶体，来实施本发明。

在一个实施方案中，从对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阴性的细胞中分离出对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞的方法是通过将对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞亲和吸附在固体支持体上。

还可以通过使用G6PC2编码的β细胞表面标签的特异性结合分子，从对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阴性的细胞中分离出对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞，其中结合分子与固体支持体连接。本领域的技术人员应认识到，G6PC2编码的β细胞表面标签的特异性分子可通过抗体结合分子(例如G蛋白或A蛋白)与固体支持体结合，或者，可与固体支持体直接缀合。具有连接的抗G6PC2编码的β细胞表面标签抗体的固体支持体是市售的，例如StemSep和EasySepTM磁珠，两者均得自Stem Cell Technologies。

还可通过淘选技术，从对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阴性的细胞中分离出对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞。用结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂包被固体表面，将表面上的胰细胞在适当条件下温育适当的时间，来进行淘选。用结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂包被平坦表面，例如培养皿。

将胰细胞加到表面上，使之与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂结合。

然后洗涤培养皿，从培养皿中弃去对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阴性的细胞。在一个实施方案中，使用G6PC2编码的β细胞表面标签的特异性抗体包被培养皿，在胰细胞群体中“淘选”对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞。

在一个实施方案中，可在通过将细胞分离成为Ptprn/IA2阳性细胞和Ptprn阴性细胞，经G6PC2编码的β细胞表面标签进行选择之前或之后纯化细胞。在一个实施方案中，可将细胞分离成为Abcc8/Sur1阳性和Abcc8/Sur1阴性细胞。在一个实施方案中，可将细胞分离成为Slc30a8/ZnT-8阳性和Slc30a8/ZnT-8阴性细胞。在一个实施方案中，可通过在G6PC2编码的β细胞表面标签与一个或多个另外的胞外标记(例如DNER蛋白或DDR1蛋白)组合进行选择之前或之后纯化细胞。在一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群体是β细胞阳性流分。在一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群体是ptprn/IA2阳性流分。在一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群体是Abcc8/Sur1阳性流分。在一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群体是Slc30a8/ZnT-8阳性流分。

在一个实施方案中，在β细胞阳性流分中进一步分离通过本文所述方法获得的胰内分泌细胞的培养物。在一个实施方案中，在ptprn/IA2阳性流分中进一步分离通过本文所述方法获得的胰内分泌细胞的培养物。在一个实施方案中，在Abcc8/Sur1阳性流分中进一步分离通过本文所述方法获得的胰内分泌细胞的培养物。在一个实施方案中，在Slc30a8/ZnT-8阳性流分中进一步分离通过本文所述方法获得的胰内分泌细胞的培养物。在一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群体是β细胞阳性流分，包括Ptprn阳性流分、Abcc8阳性流分和/或Slc30a8阳性流分。同样，在β细胞阳性/阴性流分中可进一步分离通过本文描述的任何方法获得的胰内分泌细胞的培养物，包括Ptprn阳性/阴性流分、Abcb9阳性/阴性流分和/或Slc30a8阳性/阴性流分。

本领域技术人员应当认识到，本文所有详细资料或上述有关分离方法的部分，尽管明确指明G6PC2编码的β细胞表面标签，但均可适用于其它胞外蛋白。这类胞外蛋白包括选自DNER、DDR1、膜突结合蛋白1(亦称CD133)和CD49f的蛋白质。具体地讲，这类胞外蛋白可是以DNER或DDR1。

在胚胎干(ES)细胞分化成β细胞期间，预期还将产生其它细胞类型，例如神经细胞和非胰内胚层。ES细胞可通过活化素A分化成内胚层细胞，然后分化成胰细胞。一旦取得胰腺命运，便可分离出所需要的细胞。在一个实施方案中，结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂可与胰腺的完全分化的β细胞特异性结合。在一个实施方案中，使用作为标记的G6PC2编码的β细胞表面标签可提供具有低比率的其它细胞类型的包含完全分化的β细胞的细胞群体，例如小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于2％或无其它细胞类型，例如内胚层细胞而不是胰细胞。在一个实施方案中，使用结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂和一种或多种另外的结合试剂进行双重分选。在一个实施方案中，可以产生包含胰内分泌细胞而基本上无其它细胞类型的组合物。在一个实施方案中，可以产生包含完全分化的β细胞而基本上无其它细胞类型的组合物。在一个实施方案中，表述“基本上无”对于细胞培养物或细胞群体而言，应理解为相对于细胞总数，包含比完全分化的β细胞少20％以下的其它细胞类型的细胞培养物或细胞群体。

在一个实施方案中，本发明涉及其中所得细胞群体由至少30％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％完全分化的β细胞组成的方法。

在一个实施方案中，本发明涉及其中起始细胞群体是内胚层源且所得细胞群体由至少30％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％完全分化的β细胞组成的方法。

在一个实施方案中，另外的结合试剂选自Kir6.2和Sur1。在一个实施方案中，另外的结合试剂选自DNER、DDR1、膜突结合蛋白1(亦称CD133)和CD49f结合试剂。在本发明的实施方案中，另外的结合试剂是DNER或Ddr1结合试剂。

在一个实施方案中，本发明涉及通过本文限定的任何方法获得的选自完全分化的β细胞的分离细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及包含通过本文限定的方法获得的分离的完全分化的β细胞的组合物。

细胞分化标记

有多种可用来鉴定胰细胞群体的细胞标记。分离和培养的供体细胞开始显示分化胰细胞的各种表型和基因型迹象。表型和基因型迹象的实例包括存在于受调节(例如上调或下调)的兼性祖细胞群体中的各种分子标记。这些分子标记包括CK-19或Pdx1/Nkx6.1/Ptf1a三阳性细胞，其被假定为胰兼性干细胞(即多能胰干细胞)的标记。

哺乳动物干细胞通常在它们成熟为其最后的发育终点时，经历了许多发育阶段。常常可通过鉴定发育细胞中标记的存在或不存在来确定发育阶段。因为人内分泌细胞以相似方式发育，所以当细胞从干细胞样表型转化成假胰岛表型时，可使用各种标记鉴定细胞。

通过本发明的方法诱导增殖或分化的细胞中标记的表达与正常人胰腺发育中标记表达的顺序具有某种相似性。在发育较早期，原始上皮细胞表达Pdx-1，一种早期细胞标记，这是同源域核因子。当细胞发育时，它们开始萌发形成导管。这些细胞表达细胞角蛋白19，一种上皮导管细胞的标记，并瞬时表达Ngn-3，导致发育成内分泌细胞。当这些细胞继续向内分泌细胞发育时，它们获得表达胰岛素、促生长素抑制素、胰高血糖素、生长素释放肽或胰多肽的能力。最终分化的细胞只能够表达一种，并成为α细胞(胰高血糖素)、β细胞(胰岛素)、δ细胞(促生长素抑制素)、ε细胞(生长素释放肽)和PP细胞。

可使用其它蛋白质，例如ptprn/IA2、Abcc8/Sur1和Slc30a8/ZnT-8，来鉴定、富集和/或分离完全分化的β细胞。

目标标记是在胰腺中以时间特异性和组织特异性方式表达的分子(参见Hollingsworth，Ann N YAcad Sci 880：38-49(1999))。将这些分子标记分成大致三类：转录因子、notch途径标记和中间丝标记。转录因子标记的实例包括Pdx-1、NeuroD、Nkx-6.1、Isl-1、Pax-6、Pax-4、Ngn-3和HES-1。

notch途径标记的实例包括Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jagged1、Jagged2、Dll1和RBPjk。中间丝标记的实例包括CK19和神经表皮干蛋白。胰β细胞前体的标记的实例包括Pdx-1、Pax-4、Ngn-3和Hb9。完全分化的胰β细胞的标记的实例包括胰岛素、ptprn/IA2、Abcc8/Sur1和Slc30a8/ZnT-8。

胰岛素mRNA表达

可用来表征胰细胞特征、分化或成熟的一个标记是胰岛素mRNA的水平。例如，本发明的中间细胞群体显示在限定范围内表达胰岛素mRNA。用于定量测定胰岛素mRNA的方法包括RNA印迹法、核酸酶保护和引物延伸。

在一个实施方案中，RNA由培养的细胞群体中提取，胰岛素原的信息量通过定量反转录PCR测定。在反转录后，使用与胰岛素cDNA序列杂交的引物和扩增条件由样品特异性和定量地扩增胰岛素cDNA，扩增条件下扩增产物的量与样品中存在的mRNA的量有关(参见例如Zhou等，J Biol Chem 272：25648-51(1997))。由于精确性优选动态定量方法，由其可测定起始mRNA水平。

通常将胰岛素mRNA的量归一化至组成型表达的mRNA，例如使用肌动蛋白特异性引物由同一RNA样品特异性扩增的肌动蛋白。因此，胰岛素mRNA的表达水平可用胰岛素mRNA扩增产物与肌动蛋白mRNA扩增产物的比率或仅胰岛素∶肌动蛋白mRNA比率报道。可通过同样的方法定量测定编码其它胰腺激素(例如促生长素抑制素或胰高血糖素)的mRNA的表达。胰岛素和肌动蛋白mRNA水平还可通过原位杂交测定，然后用来测定胰岛素∶肌动蛋白mRNA比率。原位杂交方法为本领域技术人员所知。

增殖方法

在一个实施方案中，本发明涉及多种完全分化的β细胞增殖的方法，所述方法包括：获得按照上文或本文描述的方法纯化的细胞，然后随即在有利于完全分化的β细胞增殖的条件下培养所获得的细胞。

用于来源于胚胎/成体组织的胰细胞以及干细胞增殖的方案以Heimberg，H.等(2000)，Diabetes 49，571-9；Heremans，Y.等(2002)，JCell Biol 159，303-12；Miralles，F.等(1998)，Development 125，1017-24；以及Miralles，F.等(1999)，Dev Dyn 214，116-26中描述的方法为例，但不限于此。

功能测定法

β细胞的一个重要功能是其根据葡萄糖水平调节其胰岛素分泌。通常，可对扩增的贴壁胰细胞进行静态葡萄糖刺激(SGS)测定法以鉴定它们是否能够在响应不同的葡萄糖水平时分泌胰岛素。一般将细胞在合适的基质上培养直到几乎汇合。在SGS测定前三天，将培养基更换为类似性质但缺乏胰岛素且只含1g/L葡萄糖的培养基。每天更换培养基达三天，在第四天进行SGS测定。

测定前，可收集培养基用于葡萄糖和胰岛素分析。为了制备用于该测定的细胞，细胞用Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(DPBS)+0.5％BSA洗涤两次，每次洗涤的同时温育5分钟，然后只用DPBS洗涤一次，同样温育5分钟。洗涤后，将细胞用10ml(在100mm培养皿中)或5ml(在60mm培养皿中)的Krebs-Ringers SGS溶液与60mg/dl葡萄糖(KRB-60)在37℃培养箱中温育30分钟。然后重复此温育。

为了进行SGS测定，将细胞在3ml(100mm培养皿)或4ml(T75培养瓶)或2ml(60mm培养皿)KRB-60中于37℃温育20分钟。吸出培养基并离心，收集用于胰岛素测定作为LG-1(低葡萄糖刺激步骤)。然后加入与上述体积相同的KRB-450+theo(KRB与450mg/dl葡萄糖和10mM茶碱)，将细胞在与上述条件相同的条件下培养。收集上清液用于胰岛素测定作为HG(高葡萄糖刺激)。再次将细胞与KRB-60一起温育，收集培养基作为LG-2，下一次作为LG-3。收集培养基用于胰岛素分析，并保存在-20℃下直到通过放射免疫测定法(RIA)或其它合适的测定法测定胰岛素含量。

SGS测定的结果常常用定义为HG胰岛素值除以LG-1胰岛素值的刺激指数表示。在SGS测定法中，约2或更大的刺激指数一般视为阳性结果，尽管可以使用其它值(例如1.5，2.5，3.0，3.5等)来界定特定的细胞群体。

处理方法

在一个实施方案中，本发明涉及向在其至少一种胰腺激素产生中有缺陷的哺乳动物提供胰内分泌功能的方法，其中细胞通过上文或本文所述的任何方法获得，所述方法还包括以下步骤：将所获得的细胞以足以在哺乳动物中产生可测量的至少一种胰腺激素的量植入哺乳动物。

本领域的技术人员应认识到，使用G6PC2编码的β细胞表面标签选出的细胞或进一步培养的细胞在哺乳动物中提供用于植入和恢复胰功能的可再生资源。

如果用户需要，可在植入前将对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞进行囊化。

在植入哺乳动物前，胰细胞的分化可达到选自以下的分化阶段：完全分化的内分泌细胞和完全分化的β细胞，包括葡萄糖响应性产胰岛素β细胞，即等同于分离胰岛的β细胞。采用所谓的Edmonton方案植入分离胰岛的实例可参见Shapiro AM(2000)，N Engl J Med.；343(4)：230-8。

对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞进行囊化导致在囊中形成细胞聚集体。囊化可供将胰细胞移植入1型糖尿病宿主中，同时使宿主动物的免疫应答最小化。可以选择囊化膜的孔隙率以供生物材料(像胰岛素)从囊中分泌出来，同时限制宿主免疫系统接近外源细胞。

囊化方法是本领域已知的，可参见下列参考文献：van Schelfgaarde和de Vos，J.Mol.Med.77：199-205(1999)，Uludag等，Adv.DrugDel Rev.42：29-64(2000)及美国专利号5,762,959、5,550,178和5,578,314。

囊化方法详细记载于申请PCT/US02/41616中；通过引用结合到本文中。

植入或移植到哺乳动物及随后监测内分泌功能可按照通常应用于胰岛移植的方法进行；参见例如Ryan等，Diabetes 50：710-19(2001)；Peck等，Ann Med 33：186-92(2001)；Shapiro等，N Engl J Med 343(4)：230-8(2000)；Carlsson等，Ups J Med Sci 105(2)：107-23(2000)以及Kuhtreiber，WM，Cell Encapsulation Technology and Therapeutics，Birkhauser，Boston，1999。优选的植入部位包括腹膜腔、肝和肾囊。

本领域技术人员应当认识到，在使用包含不成熟胰细胞的胰细胞进行移植的情况下，β细胞功能的测定，例如胰腺激素和血液葡萄糖水平的测定在移植后应进行至少2周，例如至少4周、至少6周或至少8周。相比之下，当使用分化胰细胞进行移植时，β细胞功能的测定，例如胰腺激素和血液葡萄糖水平的测定应正好在移植后进行，例如移植后12小时前、24小时前或36小时前。

本领域的技术人员能够确定用于预期接受者的多种完全分化的β细胞或微囊剂的适当剂量。剂量将取决于接受者的胰岛素需要量。可用免疫学的方法或通过生物活性的量来测定由限定数目的β细胞或微囊剂分泌的胰岛素水平。当确定剂量时还可考虑接受者的体重。如有需要，在监测接受者对(任选囊化)细胞的反应时，可以进行一次以上的植入。因此，对植入的反应可以用作(任选囊化)细胞剂量的指导(Ryan等，Diabetes 50：710-19(2001))。

可以通过监测接受者对葡萄糖的反应来测定接受者中(任选囊化)细胞的功能。(任选囊化)细胞的植入可产生对血液葡萄糖水平的控制。另外，胰内分泌激素、胰岛素、C肽、胰高血糖素和促生长素抑制素水平升高的证据可表明移植(任选囊化)细胞的功能。

本领域的技术人员应认识到，可以不同的方法控制血液葡萄糖。例如，可直接测定血液葡萄糖，像可以测定体重和胰岛素需要量一样。还可进行口服葡萄糖耐量试验。也可测定肾功能，正如可测定其它代谢参数一样(Soon-Shiong，P.等，PNAS USA 90：5843-5847(1993)；Soon-Shiong，P.等，La71cet 343：950-951(1994))。

本文使用的术语“产胰岛素内分泌胰细胞”是指以血液葡萄糖依赖性方式产生胰岛素和分泌胰岛素的细胞。

在一个实施方案中，从培养源分离包含胰细胞的细胞群体(本发明)。然后将分离细胞用于例如进一步培养或按照美国专利号5,762,959的微囊化方法进行微囊化。

术语“向需要这类功能的哺乳动物提供胰功能”是指在自身不能产生这类激素的哺乳动物机体内产生胰腺激素的方法。在一个实施方案中，胰腺激素选自胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和生长素释放肽。在一个实施方案中，在糖尿病哺乳动物机体内产生胰岛素。通过将用本公开的方法产生的产胰岛素胰细胞植入或移植到哺乳动物中而产生胰功能。植入的聚集体的数目是在哺乳动物中足以产生可测量的胰岛素的量。可通过Elisa测定法或放射免疫测定法或通过本领域技术人员已知的其它检测方法测定胰岛素，包括胰岛素功能测定法，例如血液葡萄糖水平的维持。

胰岛素与C肽以等摩尔量共分泌。因此，还可通过检测血液中的C肽来测定胰岛素的分泌活性。在一个实施方案中，提供的胰功能足以降低或消除哺乳动物对机体外产生的胰岛素的依赖。

“囊化”是指用生物相容性细胞材料(如藻酸钠和聚赖氨酸)将细胞包封的方法。可从囊化细胞周围环境优选吸收小分子(诸如糖和低分子量蛋白质)或优选将小分子分泌到囊化细胞周围环境中。同时，较大分子和免疫细胞对囊化细胞的接近受到限制。

“植入”是将细胞移植或安排到接受者中。它包括囊化细胞和非囊化细胞。细胞可通过本领域已知方法经皮下、肌内、门静脉内或腹膜内安置。

在一个实施方案中，分离步骤通过荧光激活细胞分选进行。在一个实施方案中，分离步骤通过淘选进行。在一个实施方案中，分离步骤通过液化床进行。

在一个实施方案中，本发明涉及结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂在鉴定或选择表达作为细胞表面标记的G6PC2编码的β细胞表面标签的细胞中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及与一种或多种另外的结合试剂同时或序贯使用结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂以鉴定或选择表达作为细胞表面标记的G6PC2编码的β细胞表面标签的细胞，对其进行与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂一样的分析步骤。在一个实施方案中，另外的结合试剂选自Kir6.2和Sur1。在一个实施方案中，另外的结合试剂选自DNER、DDR1、膜突结合蛋白1(亦称CD133)和CD49f结合试剂。在一个实施方案中，另外的结合试剂是DNER或DDR1结合试剂。

在本发明的一个实施方案中，另外的结合试剂选自Ptprn/IA2、Abcc8/Sur1和Slc30a8/ZnT-8结合试剂，其可用来分离早期和完全分化的内分泌细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及通过向需要这类功能的哺乳动物提供胰功能而治疗I型糖尿病的方法。

本发明的实施方案

1.一种由G6PC2编码的分离肽，其中所述肽包含i)胞外部分，和ii)G6PC2的一个或多个外显子的缺失，前提条件是所述肽不是MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYTFLNFMSNVGDPRNIFFIYFPLCFQFNQTVGTKMIWVAVIGDWLNLIFKWKSIWPCNGRILCLVCHGNRCPEPHCLWDG。

2.前述实施方案中任一项的分离肽，其中所述肽由胞外部分组成。

3.前述实施方案中任一项的分离肽，其包含选自G6PC2的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5的一个或多个外显子中所包含的序列。

4.前述实施方案中任一项的分离肽，其包含选自一个或多个选自G6PC2的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5的序列的缺失。

5.前述实施方案中任一项的分离肽，其中所述肽包含选自以下的序列及其变体：MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYT(SEQ ID NO：3)、MLVAEAFEHTPGIQTASLGT(SEQ ID NO：4)、LLSCRGGNNY(SEQ ID NO：5)、HMLMKQSGKKSQ(SEQ ID NO：6)、MLVAEAFEHTPGIQ(SEQ ID NO：8)。

6.前述实施方案中任一项的分离肽，其中所述肽由选自以下的序列及其变体组成：MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYT(SEQ ID NO：3)、MLVAEAFEHTPGIQTASLGT(SEQ ID NO：4)、LLSCRGGNNY(SEQ ID NO：5)、HMLMKQSGKKSQ(SEQ ID NO：6)、MLVAEAFEHTPGIQ(SEQ ID NO：8)。

7.前述实施方案中任一项的分离肽，其中所述肽包含与选自以下的氨基酸序列有至少80％，例如至少90％或至少96％同一性的天然存在的氨基酸序列：MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYT(SEQ ID NO：3)、MLVAEAFEHTPGIQTASLGT(SEQ ID NO：4)、LLSCRGGNNY(SEQ ID NO：5)、HMLMKQSGKKSQ(SEQ ID NO：6)、MLVAEAFEHTPGIQ(SEQ ID NO：8)。

8.前述实施方案中任一项的分离肽，其中所述肽是实施方案1-7中限定的分离肽的片段或全长IGRP的一部分。

9.一种编码实施方案1-8中任一项限定的肽的分离核苷酸。

10.一种表达实施方案1-8中任一项限定的肽的分离细胞。

11.一种鉴定完全分化的β细胞的方法，所述方法包括使包含胰细胞的细胞群体与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂接触，其中G6PC2编码的β细胞表面标签任选如实施方案1-8中任一项的定义。

12.一种获得完全分化的β细胞的培养物的方法，所述方法包括：使包含胰细胞的细胞群体与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂接触，并且将对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞流分中的与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂结合的细胞从不与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂结合的细胞中分离出来，其中G6PC2编码的β细胞表面标签任选如实施方案1-87中任一项的定义。

13.一种向在其至少一种胰腺激素产生中有缺陷的哺乳动物提供胰内分泌功能的方法，其中所述细胞通过实施方案11-12中任一项的方法获得，所述方法还包括以下步骤：将所获得的细胞以足以在哺乳动物中产生可测量的至少一种胰腺激素的量植入哺乳动物。

14.实施方案11-13中任一项的方法，其中所述至少一种胰腺激素选自胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和生长素释放肽。

15.一种通过以下步骤定量测定对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的包含胰细胞的细胞的方法：a)使细胞与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂接触；和b)测定展示作为细胞表面标记的G6PC2编码的β细胞表面标签的细胞(对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞)的量，其中G6PC2编码的β细胞表面标签任选如实施方案1-8中任一项的定义。

16.一种用于体外方案优化的方法，其中定期监测表达G6PC2编码的β细胞表面标签的细胞(对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞)的数目，其中G6PC2编码的β细胞表面标签任选如实施方案1-8中任一项的定义。

17.实施方案11-16中任一项的方法，其中一种或多种另外的结合试剂与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂同时或序贯使用。

18.实施方案17的方法，其中另外的结合试剂选自DNER、DDR1、膜突结合蛋白1(亦称CD133)和CD49f结合试剂。

19.实施方案17的方法，其中另外的结合试剂是DNER或DDR1结合试剂。

20.实施方案11-19中任一项的方法，其中所述包含胰细胞的细胞群体获自胰腺。

21.实施方案11-19中任一项的方法，其中所述包含胰细胞的细胞群体获自体细胞群体。

22.实施方案11-19中任一项的方法，其中所述包含胰细胞的细胞群体获自多潜能细胞，例如ES细胞。

23.实施方案11-22中任一项的方法，其中所述包含胰细胞的细胞群体是是源于哺乳动物的细胞群体。

24.实施方案11-23中任一项的方法，其中所述包含胰细胞的细胞群体是源于人的细胞群体。

25.实施方案11-24中任一项的方法，其中所述包含胰细胞的细胞群体是β细胞阳性流分。

26.实施方案11-24中任一项的方法，其中所述包含胰细胞的细胞群体是ptprn/IA2阳性流分。

27.实施方案11-24中任一项的方法，其中所述包含胰细胞的细胞群体是Abcc8/Sur1阳性流分。

28.实施方案11-24中任一项的方法，其中所述包含胰细胞的细胞群体是Slc30a8/ZnT-8阳性流分。

29.实施方案11-24中任一项的方法，其中在β细胞阳性流分中进一步分离通过前述实施方案中任一项的方法获得的胰内分泌细胞的培养物。

30.实施方案11-24中任一项的方法，其中在ptprn/IA2阳性流分中进一步分离通过前述实施方案中任一项的方法获得的胰内分泌细胞的培养物。

31.实施方案11-24中任一项的方法，其中在Abcc8/Sur1阳性流分中进一步分离通过前述实施方案中任一项的方法获得的胰内分泌细胞的培养物。

32.实施方案11-24中任一项的方法，其中在Slc30a8/ZnT-8阳性流分中进一步分离通过前述实施方案中任一项的方法获得的胰内分泌细胞的培养物。

33.实施方案11-32中任一项的方法，其中结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂是与G6PC2编码的β细胞表面标签特异性结合的抗体。

34.实施方案11-33中任一项的方法，其中分离或监测的步骤通过荧光激活细胞分选进行。

35.实施方案中任一项的方法11-34，其中分离步骤通过淘选进行。

36.实施方案13的方法，其中所述至少一种胰腺激素是胰岛素。

37.实施方案11-37的方法，其中哺乳动物是人。

38.实施方案11-37中任一项的方法，其中细胞是完全分化的β细胞。

39.实施方案11-38中任一项的方法，其中G6PC2编码的β细胞表面标签如实施方案1-8中任一项的定义。

40.实施方案11-38中任一项的方法，其中G6PC2编码的β细胞表面标签是全长IGRP的一部分。

41.一种通过实施方案11-40中任一项限定的方法获得的分离的完全分化的内分泌β细胞。

42.一种通过实施方案11-40中任一项限定的方法获得的包含分离的完全分化的β细胞的组合物。

43.结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂在鉴定或选择表达作为细胞表面标记的G6PC2编码的β细胞表面标签的细胞中的用途，其中G6PC2编码的β细胞表面标签任选如实施方案1-8中任一项的定义。

44.作为细胞表面标记的G6PC2编码的β细胞表面标签在获得胰内分泌细胞的培养物中的用途，其中G6PC2编码的β细胞表面标签任选如实施方案1-8中任一项的定义。

45.实施方案44的用途，其中同时或序贯使用一种或多种另外的细胞表面标记以获得胰内分泌细胞的培养物。

46.实施方案45的用途，其中另外的细胞表面标记选自DNER蛋白、DDR1蛋白、膜突结合蛋白1(亦称CD133)和CD49f。

47.实施方案45的用途，其中另外的细胞表面标记是DNER蛋白或DDR1蛋白。

48.实施方案43-47中任一项的用途，其中G6PC2编码的β细胞表面标签如实施方案1-8中任一项的定义。

49.实施方案43-48中任一项的用途，其中G6PC2编码的β细胞表面标签是全长IGRP的一部分。

50.一种与G6PC2编码的β细胞表面标签特异性结合的抗体，其中G6PC2编码的β细胞表面标签任选如实施方案1-8中任一项的定义。

51.实施方案50的抗体，其中G6PC2编码的β细胞表面标签如实施方案1-8中任一项的定义。

52.实施方案50的抗体，其中G6PC2编码的β细胞表面标签是全长IGRP的一部分。

53.前述实施方案中任一项的分离肽，其中所述肽存在于细胞的外表面和/或在细胞的外表面上可检出。

实施例

实施例1：胰岛素表达和G6PC2的共定位

收获成人胰腺组织，并在4％低聚甲醛(PFA)的PBS溶液中固定过夜(O/N)。将组织在30％蔗糖的PBS溶液中平衡，并包埋在TissueTech中。切取8μm切片，保存于-80℃。将切片在室温(RT)下融化，在PBS中洗涤，在0.01M柠檬酸盐缓冲液进行微波处理后，用1％H₂O₂的PBS溶液温育30分钟，随后用0.5％TNB封闭试剂(得自Perkin-Elmer)封闭。在兔中产生抗通过C端半胱氨酸与KLH(匙孔血蓝蛋白)偶联的MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYTFC的抗G6PC2。然后加入兔抗G6PC2(Rb抗G6PC2)1∶9000、豚鼠抗胰岛素(Gp抗Ins)1∶150，在室温下温育过夜。次日，将切片在PBS中洗涤，加入生物素化驴抗兔和驴抗豚鼠-cy2抗体，温育45分钟。在PBS中洗涤细胞后，加入链霉抗生物素蛋白-HRP，温育15分钟。随后，将细胞在PBS中洗涤。最后，加入tyramid-cy3显现染色。

结果表明，G6PC2在胰岛中强表达。在胰岛外还观察到较弱的表达。在胰岛中，G6PC2信号与胰岛素共定位，这就表明了G6PC2在β细胞中表达。

实施例2：体外方案优化

在一个实施方案中，定期监测包含胰细胞的体外培养物的G6PC2编码的β细胞表面标签的表达。在一个实施方案中，一种或多种另外的标记可与G6PC2编码的β细胞表面标签同时或序贯使用。在一个实施方案中，另外的标记选自DNER、膜突结合蛋白1(亦称CD133)、CD49f、DISP2、LRP11、SLC30A8和SEZ6L2。在一个实施方案中，另外的标记选自DNER、DDR1蛋白、膜突结合蛋白1(亦称CD133)和CD49f。在一个实施方案中，另外的标记是DNER或DDR1蛋白。

为了有效优化胚胎干细胞的分化，非常重要的是具有识别胰细胞向完全分化的内分泌细胞和/或完全分化的β细胞的不同发育阶段的标记。可使用G6PC2编码的表面标签准确定位细胞分化的重要且特定的阶段，迄今为止使用其它标记仍无法检出此阶段。G6PC2编码的表面标签可与一种或多种另外的标记联用。

可采用本文所述方法，例如FACS、淘选、MACS，来鉴定、富集和/或分离表达G6PC2编码的β细胞表面标签的细胞。

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本发明包括适用法律所允许的随附权利要求书中所述主题的所有修改和等同内容。

Claims (15)

1.一种鉴定完全分化的β细胞的方法，所述方法包括使包含胰细胞的细胞群体与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂接触。

2.一种获得完全分化的β细胞的培养物的方法，所述方法包括：使包含胰细胞的细胞群体与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂接触，并且将对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞流分中的与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂结合的细胞从不与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂结合的细胞中分离出来。

3.一种向在其至少一种胰腺激素产生中有缺陷的哺乳动物提供胰内分泌功能的方法，其中所述细胞通过权利要求1-2中任一项的方法获得，所述方法还包括以下步骤：将所获得的细胞以足以在哺乳动物中产生可测量的至少一种胰腺激素的量植入哺乳动物。

4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少一种胰腺激素选自胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和生长素释放肽。

5.一种通过以下步骤定量测定对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的包含胰细胞的细胞的方法：a)使细胞与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂接触；和b)测定展示作为细胞表面标记的G6PC2编码的β细胞表面标签的细胞(对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞)的量。

6.一种用于体外方案优化的方法，其中定期监测表达G6PC2编码的β细胞表面标签的细胞(对G6PC2编码的β细胞表面标签呈阳性的细胞)的数目。

7.前述权利要求中任一项的方法，其中一种或多种另外的结合试剂与结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂同时或序贯使用。

8.权利要求7的方法，其中另外的结合试剂选自DNER、DDR1、膜突结合蛋白1(亦称CD133)和CD49f结合试剂。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞是完全分化的β细胞。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述G6PC2编码的β细胞表面标签是全长IGRP的一部分。

11.一种通过权利要求1-10中任一项限定的方法获得的分离的完全分化的内分泌β细胞。

12.一种包含通过权利要求1-10中任一项限定的方法获得的分离的完全分化的β细胞的组合物。

13.结合G6PC2编码的β细胞表面标签的试剂在鉴定或选择表达作为细胞表面标记的G6PC2编码的β细胞表面标签的细胞中的用途。

14.作为细胞表面标记的G6PC2编码的β细胞表面标签在获得胰内分泌细胞的培养物中的用途。

15.一种与G6PC2编码的β细胞表面标签特异性结合的抗体。

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