CN102154228B - 大生物分子流通纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明至少部分涉及新的和改良的用于将样品中的大生物分子如包囊的病毒、病毒样颗粒以及结合疫苗与一或多种污染物分离的流通纯化方法，其中所述方法利用至少一种固体多孔颗粒群，该颗粒群包含最小化的颗粒每单位体积外表面积以及相对于不具有最小化外表面积的相似颗粒群未降低25％以上的每单位体积内表面积。
Description
相关申请
本申请要求2009年12月16日提交的美国临时专利申请No.61/284,368的优先权，其以全文援引加入本文。
发明领域
本发明至少部分涉及新的及改良的用于使样品中大生物分子如例如包囊的病毒、病毒样颗粒以及结合疫苗(conjugate vaccine)与一或多种污染物分离的流通(flow-through)纯化方法。
发明背景
在大生物分子如例如包囊的病毒、感染的宿主细胞或卵中的病毒样颗粒或者结合疫苗产生后，希望将所述生物分子与感染的宿主细胞或者卵的其它成分例如DNA、RNA及宿主细胞蛋白分离以获得所述生物分子的基本纯的群体。此外，所产生的生物分子需要与通常用于促进该生物分子产生的一些添加剂分离，因为所述添加剂常能与该生物分子共纯化。
常规地，许多技术如超速离心、层析和膜过滤已经用于纯化浓缩大生物分子如包囊的病毒和病毒样颗粒(见例如PCT公开WO2008/073490和WO2004/112707)。用于纯化这种生物分子的各种类型的层析技术包括例如大小排阻层析(SEC)、阴离子交换层析(AEX)和亲和层析(见例如WO2004/112707；Transfiguracuin et al.，J Virol Methods 142：21-28(2007)和Kalbfuss et al.Biotech.Bioeng.96：932-944(2007))。
虽然前述技术在一定程度上用于纯化大分子如包囊的病毒和病毒样颗粒，但是所有这些层析技术一般以结合和洗脱模式使用。特别地，由于这种生物分子的大尺寸(例如～15-400nM)，其不能穿透大多数可商购的介质的孔，且因此其通常与该介质的外部结合并随后被洗脱。然而，污染物和杂质一般结合至颗粒的内表面，但有时部分地与所述大生物分子一起洗脱。此外，一或多种这些技术有时以非连续模式使用，然而总产量一般较差。
发明概述
本发明至少部分提供了改良的用于使样品中大生物分子如例如包囊的病毒、病毒样颗粒及结合疫苗与一或多种污染物分离的流通方法。本发明利用一或多种层析技术以流通模式纯化大生物分子如包囊的病毒、病毒样颗粒、结合疫苗以及细菌细胞表面多糖，所述层析技术包括例如阴离子交换层析(AEX)、阳离子交换层析(CEX)及疏水性相互作用层析(HIC)。
本发明的方法通常使用单一连续流通方法致使大生物分子如病毒、病毒样颗粒或者结合疫苗的回收改良，这种方法远远优于本领域目前常用的一般为结合和洗脱模式且非连续的常规方法。本发明的方法至少部分基于使用至少一种类型的层析颗粒(例如固体多孔珠)，其每单位体积外表面积被最小化而相对于通常用于层析方法中而其每单位体积外表面积未被最小化的相似层析颗粒，其每单位体积内表面积未降低25％以上。一般而言，本发明至少部分依赖于反向模式操作，即通过以流通模式使用一或多种AEX、CEX和HIC层析介质，其中至少一种这样的介质包含致使回收改良的特性，例如最小化的每单位体积外表面积以及未降低25％以上的每单位体积内表面积。
本发明的方法使得可以在单一步骤中回收大生物分子以及提供了与需要许多纯化前和纯化后步骤的常规层析方法相比最少的进料(feed)和产物流的上游和下游处理。此外，本发明的方法在含有大生物分子的样品中存在和不存在宿主细胞蛋白质的情况下均导致所述大生物分子回收的改良。
在本发明的一个方面，提供了用于从包含大生物分子和一或多种污染物的样品中对所述大生物分子的回收进行改良的流通方法。这种方法包括使样品与具有小于所回收的大生物分子的分子量截断值的一或多种固体多孔颗粒群接触，其中所述流通方法中使用的至少一种固体多孔颗粒群的每单位体积外表面积是最小化的并且其中每单位体积内表面积相对于不包含最小化的每单位体积外表面积的固体多孔颗粒群未降低25％以上，从而改良所述大生物分子的回收。
在一些实施方案中，将所述一或多种固体多孔颗粒群填充在层析柱中。
与不使用包含最小化的每单位体积外表面积以及每单位体积内表面积未降低25％以上的至少一种固体多孔颗粒群的流通方法的大生物分子的回收相比，本发明的流通方法导致大生物分子的回收改良例如至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％。
在一些实施方案中，本发明的流通方法导致大生物分子的纯度改良至少20％。
在一些实施方案中，本发明的流通方法导致一或多种污染物减少至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％或更多。
在一些实施方案中，所述一或多种固体多孔颗粒群选自用于阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水性相互作用层析的一或多种珠。
可以使用本发明的方法回收的大生物分子选自由包囊的病毒、病毒样颗粒和结合疫苗组成的组。
在一些实施方案中，所述一或多种污染物选自由核酸、蛋白质、赋形剂和细胞培养添加剂组成的组。在一些实施方案中，所述一或多种污染物是宿主细胞蛋白质。
在一些实施方案中，本发明的流通方法用于将病毒样颗粒与一或多种污染物分离。示例的病毒样颗粒包括但不限于BSA包被的苯乙烯颗粒。
在一些实施方案中，本发明的流通方法用于将包囊的病毒与一或多种污染物分离。示例的包囊的病毒包括但不限于流感病毒(例如H1N1株)、腺病毒和噬菌体。
在一些实施方案中，所述大生物分子在细胞培养物或者卵中产生。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含MDCK细胞。在一些实施方案中，包含大生物分子和一或多种污染物的样品是细胞培养上清，对其进行本发明的流通方法。
在本发明的流通方法的各种实施方案中，所述方法中包括的至少一种固体多孔颗粒群包含在200μm-600μm范围的平均直径。
在各种实施方案中，本发明的流通方法使得能够从样品中回收至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％的大生物分子。
附图简述
图1是对通过0.5ml柱的Phi6与BSA的溶液混合物中的噬菌体Phi6的流通效价进行测量的示例性实验结果的图，所述柱含有如下之一：S4FF(对照)珠、QS4FF(90μm)珠、或QSBB(200μm)珠。X轴表示经过每个柱处理的进料的柱体积而Y轴表示每个柱的流通液中的Phi6效价。
图2是对通过1ml柱的含有B型流感病毒、宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白质、胎牛血清及其它细胞培养添加剂的溶液混合物中B型流感病毒的流通效价进行测量的示例性实验结果的图，所述柱含有如下之一：QSepharose HP(30μm)珠、QSepharose 4FF(90μm)珠、或QSepharose BB(200μm)珠。X轴表示经过每个柱处理的进料的柱体积而Y轴表示每个柱的流通液中的B型流感病毒效价。
图3是对通过0.8ml柱的宿主细胞蛋白质与DNA的混合物中A型流感病毒的临界点(breakthrough)进行测量的示例性实验结果的图，所述柱含有如下之一：S4FF(对照)珠、QS4FF(90μm)珠、或QSBB(200μm)珠。X轴表示经过每个柱处理的进料的体积而Y轴表示每个柱的流通液中的A型流感病毒效价。
图4是对通过0.8ml柱的A型流感病毒与DNA的溶液混合物中宿主细胞蛋白质(HCP)的临界点进行测量的示例性实验结果的图，所述柱含有如下之一：S4FF(对照)珠、QS4FF(90μm)珠、或QSBB(200μm)珠。X轴表示经过每个柱处理的进料的体积而Y轴表示每个柱的流通液中的HCP效价。
图5是对通过柱的HCP与宿主细胞DNA的溶液混合物中A型流感病毒的临界点进行测量的示例性实验结果的图，所述柱含有如下之一：0.8ml的QS4FF(90μm)珠；0.8ml的QSBB(200μm)珠；连续的0.8ml的QSBB和0.8ml的SP Sepharose大珠(200μm)(AC)；连续的0.8ml的QSBB和0.8ml的Phenyl Sepharose大珠(200μm)(AH)；连续的0.8ml的QSBB、0.8ml的SP Sepharose大珠和0.8ml的Phenyl Sepharose大珠(ACH)；或者2.4ml的QSBB、SP Sepharose大珠和Phenyl Sepharose大珠的混合物(MACH)。X轴表示经过每个柱处理的进料的体积而Y轴表示每个柱的流通液中的B型流感病毒效价。
图6是对通过柱的A型流感病毒与宿主细胞DNA的溶液混合物中HCP的临界点进行测量的示例性实验结果的图，所述柱含有如下之一：0.8ml的QS4FF(90μm)珠；0.8ml的QSBB(200μm)珠；连续的0.8ml的QSBB和0.8ml的SP Sepharose大珠(200μm)(AC)；连续的0.8ml的QSBB和0.8ml的Phenyl Sepharose大珠(200μm)(AH)；连续的0.8ml的QSBB、0.8ml的SP Sepharose大珠和0.8ml的Phenyl Sepharose大珠(ACH)；或者2.4ml的QSBB、SP Sepharose大珠和Phenyl Sepharose大珠的混合物(MACH)。X轴表示经过每个柱处理的进料的体积而Y轴表示每个柱的流通液中HCP的效价。
发明详述
本发明提供了改良的将样品中大生物分子(例如包囊的病毒、病毒样颗粒或者结合疫苗)与一或多种污染物分离的流通方法，其使用至少一种类型的层析珠，该层析珠包含最小化的每单位体积外表面积且相对于相似类型的层析珠每单位体积内表面积未降低25％以上，所述相似类型的层析珠不包含最小化的每单位体积外表面积且每单位体积内表面积未降低。
I.定义
为了使本公开更易于理解，首先定义某些术语。另外的定义在详细描述中阐述。
术语“流通方法”、“流通模式”和“流通层析”在本文可互换使用，是指产物分离技术，其中与一或多种污染物一起包含于样品中的至少一种产物(例如大生物分子如本文描述的那些)流经层析树脂或者介质，而至少一种潜在的污染物或者杂质结合所述层析树脂或者介质。所述“流通模式”通常是无梯度操作(即期间移动相的组成成分不变的层析方法)。这种流通层析方法可以使用单一柱、连续或者平行的多个柱、串联柱、模拟移动床(SMB)及其组合来进行操作。
术语“结合及洗脱模式”及“结合及洗脱方法”在本文可互换使用，是指产物分离技术，其中样品中包含的至少一种产物(例如大生物分子，如本文描述的那些)结合层析树脂或者介质并随后被洗脱。
术语“污染物”、“杂质”和“碎片”在本文可互换使用，是指任何异种或者不适宜的分子，包括生物大分子如DNA、RNA，一或多种宿主细胞蛋白质，内毒素，脂质及一或多种添加剂，其可存在于含有感兴趣的大生物分子的样品中，所述感兴趣的大生物分子使用本发明的流通方法与一或多种异种或者不适宜的分子分离。此外，这种污染物可包括可在分离方法之前进行的步骤中使用的任何试剂。通常，含有所述大生物分子的样品中存在的污染物的大小小于所述大生物分子。例如，大多数宿主细胞蛋白质的范围在大约3KD到150KD，其小于使用本文所述方法分离的大多数大生物分子的大小。
如本文所用，术语“大生物分子”是指感兴趣的生物材料，其具有的平均直径为至少15nm，或者至少20nm，或者至少25nm，或者至少30nm，或者至少35nm，或者至少40nm，或者至少45nm，或者至少50nm，或者至少55nm，或者至少60nm，或者至少65nm，或者至少70nm，或者至少75nm，或者至少80nm，或者至少90nm，或者至少100nm，或者至少110nm，或者至少120nm，或者至少130nm，或者至少140nm，或者至少150nm，或者至少160nm，或者至少170nm，或者至少180nm，或者至少190nm，或者至少200nm，或者至少210nm，或者至少220nm，或者至少230nm，或者至少240nm，或者至少250nm，或者至少260nm，或者至少270nm，或者至少280nm，或者至少290nm，或者至少300nm，或者至少310nm，或者至少320nm，或者至少330nm，或者至少340nm，或者至少350nm，或者至少360nm，或者至少370nm，或者至少380nm，或者至少390nm，或者至少400nm，使用本文所述的流通方法将其与含有所述生物材料的样品中存在的一或多种污染物分离。示例性的大生物分子包括例如包囊的病毒、病毒样颗粒及结合疫苗。在一些实施方案中，使用本发明的方法分离的大生物分子从层析珠的孔中排出或者仅结合至珠的外表面。
如本文所用，术语“包囊的病毒”是指包括壳体内核酸分子(例如DNA或者RNA)且通常仅结合至层析珠外表面的任何病毒。在一些实施方案中，所述壳体在壳体周围有脂质包膜。在一些实施方案中，包囊的病毒包括封闭在复杂膜结构内的RNA或者DNA分子(例如来自痘病毒科的天花病毒)。通常，大多数包膜的病毒具有15-400nm的大小范围。
如本文所用，术语“病毒样颗粒”是指其大小和/或免疫原性类似于病毒但缺乏如病毒那样复制能力的颗粒或者物质(例如人乳头瘤病毒(HPV)疫苗)。
如本文所用，术语“结合疫苗”是指通过将细菌细胞表面多糖与蛋白质或者毒素反应产生的疫苗。示例性的结合疫苗包括但不限于肺炎球菌(Pneumococcal)疫苗和肺炎链球菌(Streptococcal pneumoniase)疫苗。
如本文所用，术语“层析”是指将感兴趣的大生物分子(例如包囊的病毒，病毒样颗粒或者结合疫苗)与样品中与所述感兴趣的大生物分子一起存在的一或多种污染物分离的任何种类的技术。
如本文所用，术语“阴离子交换层析”或者“ACE”是指使用带正电的珠将感兴趣的生物分子(例如大生物分子如包囊的病毒、病毒样颗粒或者结合疫苗)与样品中的一或多种污染物分离的层析方法。示例性的可商购的AEC介质包括购自GE Healthcare的Q SepharoseFF、Q Sepharose XL、CaptoQ、Q Sepharose HP；购自EMD Chemicals Inc的Fractogel EMD TMAE、Fractogel EMD DEAE以及购自TOSH Bioscience的Toyopearl DEAE、Toyopearl QAE和Toyopearl SuperQ。
AEC已常规用于使用珠、膜和块体(monolith)的病毒纯化。AEC通常基于这样的原理，即包囊的病毒如例如流感病毒和腺病毒在大于5.5的pH是带负电的。因此，在高于5.5的pH下，其可以使用带正电的树脂通过离子相互作用结合及洗脱。通常，由于大多数包囊的病毒的大小，其不能透过大多数可商购的AEC介质且仅可以结合至介质的外表面，从而限制层析柱的病毒容量。因此，克服柱容量问题的一般方法是降低AEC介质的大小(见例如PCT出版物WO2004112707)。
如本文所用，术语“阳离子交换层析”或者“CEC”是指层析方法，其使用带负电的珠将感兴趣的生物分子(例如大生物分子如包囊的病毒、病毒样颗粒或者结合疫苗)与样品中的一或多种污染物分离。示例性的可商购CEC介质包括得自GE Healthcare的SP Sepharose、SP Sepharose HP，得自EMD Chemicals Inc的Fractogel EMD SO3 -，以及得自TOSH Bioscience的Toyopearl SP和Toyopearl CM。
如本文所用，术语“疏水性相互作用层析”或者“HIC”是指层析方法，其使用固定有芳香族或者脂肪族碳氢化合物作为疏水性基团的珠来分离感兴趣的生物分子。在一个实施方案中，HIC用于将大生物分子如例如结合疫苗与样品中的一或多种污染物分离。示例性的可商购的HIC介质包括得自GE Healthcare的Phenyl Sepharose，得自EMD Chemicals Inc的FractogelEMD Propyl 650、Fractogel EMD Phenyl 650，以及得自TOSH Bioscience的Toyoperal Phenyl、Toyopearl Butyl、Toyopearl Hexyl和Toyopearl Ether。
如本文所用，术语“大小排阻层析”或者“SEC”是指层析方法，其基于这样的原理，即当含有不同大小溶质的溶液经过具有适当孔大小的多孔介质时，较小的溶质花费较长时间在介质中扩散并因此具有较长的保留时间，而较大的溶质迅速扩散，从而使得可以将其与所述较小溶质分离。示例性的可商购的SEC介质包括Toyopearl HW、Sepharose、Sephacryl和Fractogel EMD BioSEC。
由于大多数病毒的大小，其不能透过大多数可商购的SEC介质并通常在SEC层析柱的空隙体积中洗脱。然而，SEC一般有一些缺点，例如通常SEC层析需要长的柱长度，最大荷载容量不可超过20％，处理时间非常长且经常导致感兴趣产物的稀释。
术语“混合模式层析”或者“双模(bimodal)层析”或者“多模(multimodal)层析”在本文可互换使用，是指使用在单一珠上具有一个以上官能团和/或不同官能团组合的珠的层析方法。这种珠可以称作为混合模式树脂或珠、双模树脂或珠或者多膜树脂或珠。例如，单一珠可在同一珠上具有带正电的基团和带负电的基团或者具有带正电的基团和疏水性基团或者具有带负电的基团和疏水性基团或者具有带正电的基团、带负电的基团和疏水性基团的每一个。这种珠可用于使感兴趣的生物分子与样品中的一或多种杂质分离。示例性的可商购的混合模式介质包括例如得自GE healthcare的Captoadhere，得自Pall Corporation的HPA和PPA HyperCelTM。
如本文所用，术语层析介质的“动态结合容量”是指在未结合的生物分子的显著临界点发生之前在流通方法中所述介质结合的靶生物分子的量。层析介质的动态容量反映随着流速增加可发生的传质限制(mass transferlimitations)的影响且其可用于预测与介质的饱和或者静态结合容量确定相比的实时进程情况。一般，介质的动态结合容量低于静态结合容量。
如本文可互换使用的术语层析介质的“静态结合容量”和“饱和结合容量”是指如果珠上每一可用结合位点均被利用时，介质(例如填充在柱中的珠)在静态平衡条件下可结合的靶生物分子的量。静态结合容量可以通过例如以非常慢的流速或者在柱中珠的密闭系统中延长时间温育之后加载大量过量的靶生物分子而确定。实际上，静态结合容量在使用填充柱的处理条件下是从不可得的。
如本文所用，术语“每单位体积外表面积”是指可用于结合感兴趣的生物分子的层析颗粒群(例如珠)的外表面的总面积。例如，在一些实施方案中，每单位体积外表面积定义为填充在柱中的固体多孔颗粒群可用于结合大生物分子的外表面的总面积。
评估珠的每单位体积外表面积可以通过数学或者经验计算。例如，从数学上，可以使用如下等式估计每单位体积外表面积：
其中，Aes/v＝每单位体积外表面积；d＝使用的珠的直径；而η＝柱的填充密度。对于充分填充的柱，假设珠是六方密填充(HCP)，其等于0.74。
此外，η＝1-空隙体积。柱的空隙体积可以使用与珠不相互作用且从珠的孔排出的分子实验确定(见例如Gel filtration-Principles and Methods，Amersham Biosciences)。
经验上，如下所述估计每单位体积外表面积。通常，使用与所述大生物分子相同大小和电荷的球形纳米粒子进行经验计算。所获得的纳米粒子的浓度通常由厂商指定或者可以通过使用用于确定病毒颗粒的标准技术获得，所述标准技术如动态光散射或者UV-Vis光谱学(见例如Wolfgang Haisset al.，Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles fromUV-Vis Spectra，2007，79，4215-4221)。所述纳米粒子与固定体积的珠的结合通过使用例如本文所述的静态结合容量实验来研究。与珠结合的纳米粒子的量可以使用如下公式估算：
Nn＝(Cin-Cf)v(等式II)
其中，Ns＝饱和时与珠结合的纳米粒子的量；Cin＝测量为单位体积颗粒的溶液中纳米粒子的初始浓度；Cf＝测量为单位体积颗粒的溶液中纳米粒子的终浓度；v＝使用的溶液的体积。
含有纳米粒子的柱的每单位体积外表面积可以如下确定：
其中，dn＝纳米粒子的直径；而V＝柱体积。
如本文所用，术语层析颗粒(例如珠)群的“每单位体积内表面积”可以定义为颗粒的每单位体积总表面积减去颗粒的每单位体积外表面积并可以如下估算：
Ain/v＝At-Aes/v(等式IV)
其中，Ain/v＝珠的每单位体积内表面积；At＝珠的每单位体积总表面积；At＝A×BD，其中A＝珠每单位质量表面积，其可以使用由Brunauer，Emmett，and Teller(BET)(见例如S.Brunauer et al.，J.Am.Chem.Soc.，1938，60，309)开发的方法计算；BD＝体密度(bulk density)，其具有每单位体积质量的单位。一般Aes/v与At相比可忽略。因此，可以认为At是内表面积的直接估算值。
每单位体积内表面积的估算值也可以得自珠对于宿主细胞蛋白质的大小和电荷具有代表性的小分子及进料流中其它杂质的静态和动态结合容量。这种代表性分子的例子可包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、溶菌酶或者单克隆抗体(Mab，或者IgG)。对于所有实用目的，这种方法是估算用于结合杂质的表面积的比较可行的方法。
流通方法中感兴趣的产物的回收百分比可以使用如下等式计算：
其中，Pfeed＝进料中大生物分子的量，Pflow-through＝产物中大生物分子的量。
使用本发明方法的感兴趣产物的回收百分比可以使用如下等式计算，其中回收百分比是改良的回收百分比：
其中，Rb＝从其中颗粒群的每单位体积外表面积被最小化的方法中的回收；而Rs＝从其中颗粒群的每单位体积外表面积未被最小化的方法中的回收。
使用流通方法回收的产物纯度可以定义为在回收的流通液集合中杂质与大生物分子的量的比率。例如，含有流感病毒的产物的纯度可以表示为μg/HAU(HAU＝血凝素单位)，其通过将流通液集合中杂质(例如宿主细胞蛋白质)总量除以病毒总量而获得。使用本发明方法的感兴趣产物纯度的改良百分比可以使用下式计算：
(等式VII)
其中，当使用具有最小化的每单位体积外表面积的颗粒(例如固体多孔珠)群的方法时，rb＝产物中宿主蛋白质总量与产物中大生物分子总量的比率。例如，对于流感病毒纯化，这个比率可以μg/HAU表示，其中μg是宿主细胞蛋白质的单位而HAU表示流感病毒的单位；当其中不使用具有最小化的每单位体积外表面积的颗粒(例如固体多孔珠)群的方法时，rs＝产物中宿主细胞蛋白质总量与产物中大生物分子总量的比率。
一般，相对于不具有最小化的每单位体积外表面积的颗粒，本发明方法中使用的具有最小化的每单位体积外表面积的颗粒具有未降低25％以上的每单位体积内表面积。
II.示例性用于流通方法中的层析介质
可用于流通纯化中的示例性层析介质包括但不限于阴离子交换层析介质(例如Q Sepharose大珠，Q SepharoseFF，Q Sepharose XL，Capto Q，QSepharose HP，Fractogel EMD TMAE，Fractogel EMD DEAE，ToyopearlDEAE，Toyopearl QAE和Toyopearl SuperQ)，阳离子交换层析介质(例如SP Sepharose大珠，SP Sepharose，Fractogel EMD SO3 -，SP Sepharose HP，Toyopearl SP和Toyopearl CM)，疏水性相互作用层析介质(例如PhenylSepharose，Toyoperal Phenyl，Toyopearl Butyl，Toyopearl Hexyl和ToyopearlEther)以及大小排阻层析介质(例如Toyopearl HW，Sepharose，Sephacryl和Fractogel EMD BioSEC)。在本发明的方法中可以使用单一类型的层析介质或者一或多种类型层析介质的任意组合。本领域技术人员很容易清楚本发明方法中可以使用的层析介质很大程度上是基于要分离的大生物分子及需要除去的杂质。
III.使生物分子与一或多种污染物分离的流通方法
流通层析分离已经成为重要的最终完善步骤用于从单克隆抗体制备物中除去微量杂质如内毒素、病毒和DNA。流通分离具有优于常规结合及洗脱层析模式的优点，因为其在层析分离方法期间消除了对复杂步骤的需求，如更换缓冲液、梯度和峰分离。
流通层析分离的方法一般包括使含有感兴趣的生物分子和一或多种杂质的进料溶液与介质如珠或者膜接触并收集经处理的进料。在一些流通方法中，介质填充在流通装置如柱的内部。在一些方法中，这种装置含有这样的介质(例如固体多孔珠)，其可以捕获进料流中大多数杂质，与感兴趣的产物最小程度结合或者不结合，因此导致流通装置的更纯的下游产物。
在本发明的一些实施方案中，所述流通装置由填充了如本领域已知和/或本文所述的一或多种类型的层析珠的柱所组成，其中至少一种类型的珠包含最小化的珠每单位体积外表面积及相对于不具有最小化的外表面积的珠未降低25％以上的珠每单位体积内表面积。
在一些实施方案中，将含有大生物分子如包囊的病毒(例如流感病毒)、病毒样颗粒(例如牛血清白蛋白(BSA)包被的苯乙烯颗粒)或者结合疫苗的进料与一或多种类型的层析珠接触，每个所述珠具有小于所述生物分子的分子量截断值，以使所述大生物分子与进料中一或多种污染物分离，其中至少一种类型的珠具有最小化的所述一种类型的珠的每单位体积外表面积以及所述一种类型的珠的每单位体积内表面积相对于不具有最小化的珠每单位体积外表面积的相同类型的珠的每单位体积内表面积未降低25％以上。
例如，在本文描述的示例性实验中，使用MDCK细胞系生长流感病毒。含有病毒的进料通过离心随后使用0.45μm膜过滤来预澄清以除去大的细胞碎片，然后将缓冲液更换为希望的缓冲液，之后通过含有层析珠的流通装置纯化。通常，可以对含有得自不同来源(例如细胞培养物，卵等)的病毒的各种进料进行一或多个预备步骤，如例如离心、深度过滤、切向流过滤、透析过滤和缓冲液置换，之后使用如本文所述的流通层析模式进行纯化。
在预澄清含有感兴趣的生物分子的进料之后，对预澄清的进料进行流通分离。流通分离可以使用一或多个方案进行。在示例性方案中，连续使用容积式泵(positive displacement pump)(例如Mighty-Mini，ScientificSystems Inc.)和流通柱。例如，所述泵和装管首先用20％乙醇清洁，然后用水和缓冲液清洗。含有感兴趣的大生物分子的进料随后通过使用泵而经过柱，在柱的下游人工收集级分入eppendorf管中。
在另一示例性方案中，可以使用更自备的仪器如Akta(GE Healthcare)或者BioCad(Applied Biosystems)。这些系统使得可以自动化的泵出和控制进料和缓冲液、在线(inline)测量UV和流通流的传导性信号及自动化级分收集。收集的级分进一步用于离线(offline)测量。
IV.测量流通方法中回收的生物分子效价的方法
在将大生物分子与样品中的一或多种污染物分离之后，一般测量回收的大生物分子的效价。
检测各种生物分子包括病毒、蛋白质、核酸、结合疫苗等的技术为本领域熟知且已经在文献中描述。使用层析方法回收的生物分子的效价可以在线或者离线测量。在线检测技术包括置于层析柱下游的连续的检测仪。而离线分析方法通过收集流经层析柱的溶液的级分及使用标准技术测定那些级分来完成。如果在在线技术中存在来自不同物种的干扰、如果使用可获得的在线技术不能检测到生物分子或者如果感兴趣的生物分子的浓度低于在线技术的检测限度或者不代表实际浓度，则通常使用离线检测。
用于病毒、蛋白质和DNA的常用在线测量技术是在280nm和260nm的UV光谱学(见例如欧洲专利申请EP 1801 697 A1)。此外，近来多角度激光光散射(MALS)已经成功用于在层析方法中在线检测病毒(见例如Opitz etal.，Biotech.Bioengg.，103：1144-1154(2009))。
离线测量技术包括上述技术，如UV光谱学和动态光散射(见例如Opitzet al.，J.Biotech.，131：309-317(2007))以及对于所测量的感兴趣生物分子独特的其它技术。例如，针对蛋白质的一些常用的离线测量技术包括双金鸡宁酸测定(bicinchoninic acid assay，BCA)(见例如美国公开20050118140)、Bradford测定(见例如Nayak et al.，J.Chrom.，823：75-81(2005))以及酶联免疫吸附测定(ELISA)(见例如美国公开20050118140)。
相似地，核酸(例如DNA)可以通过使用picogreen测定(见例如Opitz etal.，Biotech.Bioengg.，103：1144-1154(2009))或者定量聚合酶链反应(Q-PCR)来进行测量。
大多数病毒可以使用组织培养感染性剂量测定(也称作TCID50噬斑测定)(见例如Dulbecco et al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，18：273-279(1953))进行检测和定量。然而，通常使用独特的测定来对特定病毒进行鉴别和定量，例如流感病毒通过使用如血凝(HA)测定、神经氨酸酶(NA)测定和单向免疫扩散(SRID)测定来进行定量(见例如Methods inMolecular Biology 436，Avian Influenza Virus，edited by Spackman，E.HumanaPress(2007))。
V.测量层析珠和病毒大小的方法
在一些实施方案中，本发明的层析方法使用一或多种类型的固体多孔层析珠，其中至少一种珠类型具有的平均直径大于其它珠类型的平均直径。这种珠在本发明中称作“大珠”。在一些实施方案中，大珠具有的平均直径为至少200μm。
基于使用本发明方法分离的生物分子的类型，本领域技术人员可轻易确定分离所述生物分子所需要的一或多种类型的层析珠(例如基于生物分子的成分、大小、电荷等)。
一般，本发明方法中使用的大多数层析珠可以商购获得。因此，层析珠的大小通常由厂商说明书阐述或者可使用本领域熟知的一或多种方法或仪器轻易确定，包括但不限于：(1)湿筛法(wet sieving)，其也可用于将具有广泛大小分布的珠分入窄的大小范围；(2)具有内置相机和微米玻片(micrometer slide)的光学显微镜或者对珠照相并使用软件如ImageJ分析；以及(3)使用标准颗粒大小测定器如Elzone II(Particle and Surface SciencesPty.Ltd)、Master Sizer(Malvern)和FlowCam(Fluid Imaging Technologies)。
可以使用本发明的方法分离的大多数大生物分子(例如病毒、病毒样颗粒和结合疫苗)的大小一般可以基于本领域经充分鉴定的方法确定。例如，病毒的大小可以使用本领域熟知的一或多种技术确定，包括但不限于扫描电子显微术(SEM)(见例如Nermut et al.，AIDS Res.，9：929-938(1993)和动态光散射(Dynopro，Wyatt Technology Corporation)(见例如Opitz et al.，J.Biotech.131，309-317(2007))。大生物分子大小的估算可以通过使用与所述大生物分子不相互作用且孔大小类似于流通纯化中使用的珠的大小的中性珠来获得。如果大生物分子大于珠的孔，其将在这种珠的柱的空隙体积中洗脱。这将可以提供大生物分子的大小是否大于珠的孔大小的估算。
VI.测量层析珠的孔大小的方法
表示层析珠的分子量截断值的孔大小一般由厂商指定。这些已经在文献中广泛论述(见例如Gu et al.，Enzy.Micro.Tech.33：430-437(2003))。用于测量珠的孔大小的常用技术包括但不限于：(1)葡聚糖排阻层析(见例如DePhillips et.al.，J.Chrom.A.883：39-54(2003))；(2)一般使用压的孔计法(porosimetry)(见例如Sobisch et al.，Colloid Poly.Sci.133：169-172(2006))；(3)SEM；(4)气体吸附(见例如Brunauer et al.，J.Am.Chem.Soc.，60：309-319(1938))；以及(5)热孔计法(Thermoporometry)(见例如Wulff et al.，Therchimi.Acta，419：291-294(2004))。
本发明通过如下实施例进一步说明，其不应理解为限制性的。本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请以及附图均援引加入本文。
实施例
实施例1：珠的每单位体积外表面积的确定
不同大小的珠的每单位体积外表面积可以如本文所述确定。在示例性试验中，如下珠的每单位体积外表面积使用上述数学方法估算，Q SepharoseHP平均直径为34μm，Q Sepharose FF平均直径为90μm，Q Sepharose BB平均直径为200μm(GE Healthcare)。
例如，使用本文所述等式I，可以如下计算平均直径为34μm的珠的每单位体积外表面积：
类似地计算所有其它AEC珠的外表面积并总结在表I中。
表I
| 珠的类型 | 珠大小(μm) | Aes/v(cm-1) |
| Q Sepharose HP | 34 | 1305 |
| Q Sepharose FF | 90 | 493 |
| Q Sepharose BB | 200 | 222 |
从表I可以看出，外表面积随着珠大小的增加而降低。
在另一示例性实验中，用本文所述的经验方法来计算珠的每单位体积外表面积。使用BSA包被的乳胶珠(Postnova Analytics)作为模型，根据经验获得Q Sepharose FF(90μm)和Q Sepharose BB(200μm)用于结合大生物分子如流感病毒或者腺病毒的外表面积的近似估算值。
将Sepharose 4FF(S4FF，GE Healthcare)、QS4FF或者QSBB珠每一种的5ml柱移至有盖的7ml试管中。S4FF是电中性的，用作对照珠。在每种珠中加入大约1.38ml的在PBS中BSA包被的苯乙烯颗粒溶液(1.4×1013颗粒/ml)。
将珠-颗粒混合物在旋转运动中混合过夜，允许所述珠沉降(settle)并使用UV光谱学在280nm测量上清中颗粒的吸收。颗粒的浓度通过绘制标准校准曲线得出。
使用上述等式III针对前述每一种珠使用BSA包被的苯乙烯颗粒测量表面积的示例性实验结果在表II中总结。
表II
*Seph-4FF表示进料的空隙体积稀释对照。所示数据解释了由于珠的空隙体积中的缓冲液所导致的进料稀释。
正如本文所观测到的，通过经验以及数学所计算的每单位体积外表面积随着珠的大小增加而降低。然而，经验数值提示可用于结合大生物分子的实际面积远低于通过数学计算的面积。在本文描述的流通方法中，希望使用至少一种珠群，所述珠具有增加的平均直径以及具有最小的每单位体积外表面积。因此，珠群的外表面积通过增加珠的大小而最小化，而不降低每单位体积内表面积。
实施例2：使用静态结合容量估算珠的每单位体积内表面积
如实施例1所述，分别具有较大和最小化外表面积的QS4FF(90μm)和QSBB(200μm)珠的每单位体积内表面积通过检测其对BSA的静态结合容量估算。BSA在层析中已经广泛用作模型蛋白。其具有大约66KD的平均分子量及～5的pI。BSA是大多数宿主细胞蛋白的大小和电荷的代表。
在一个示例性实验中，QS4FF和QSBB珠对于BSA(Sigma AldrichCorporation)的静态结合容量在两种不同类型缓冲液中在两个不同pH进行测量。通过填充含有QS4FF或者QSBB介质的1ml柱，在4ml缓冲液中使该介质浆化(slurring)并将0.5ml浆液加入14.5ml具有2mg/ml浓度的BSA溶液中来进行试验。4小时后，使混合物中的珠沉降，通过UV-Vis光谱学来测量上清中BSA的浓度。上清浓度的改变用于计算所述珠对于BSA的静态结合容量。
在不同溶液中测量所述珠对于BSA的静态结合容量的实验结果在表III中总结。
表III：
*S4FF是中性琼脂糖珠，其用作实验对照。Tris和Phos分别是指Trizma和磷酸钠缓冲液。
如表III所示，具有最小化外表面积的200μm珠以及90μm珠在Trizma和磷酸钠缓冲液中在pH 7.0具有相似的BSA容量。在Trizma缓冲液中在pH8.0下QSBB的容量略微降低(～20％)，而在pH8.0的容量高于pH7.0的。因此，可以估算出分别具有较高和较低每单位体积外表面积的QS4FF和QSBB珠具有结合BSA的相似的每单位体积内表面积。因此可以推断通过选择正确的缓冲液、pH和珠的大小，可以通过使用本发明提议的方法除去相似数量的杂质。
实施例3：从两个不同珠大小的阴离子交换介质中回收病毒样颗粒(即100 nm BSA包被的苯乙烯颗粒)的对比
在示例性实验中，测试了具有不同珠大小的两种单独的阴离子交换介质对病毒样颗粒的回收。特别地，测试了阴离子交换介质，具有平均直径为90μm的Q Sepharose 4FF珠(QS4FF，GE Healthcare)和具有平均直径为200μm的Q Sepharose大珠(QSBB，GE Healthcare)对于回收100nm牛血清白蛋白(BSA)包被的苯乙烯颗粒(Postnova Analytics)的静态结合容量，所述苯乙烯颗粒是具有与流感病毒或者腺病毒相似大小和电荷的示例性病毒样颗粒。QS4FF和QSBB介质含有带正电且可以结合BSA包被的乳胶颗粒的季铵基团。通常假定这些珠对于BSA包被的颗粒的静态结合容量应等于动态结合容量，因为所述颗粒仅结合至珠的外表面区。
将Sepharose 4FF(S4FF，GE Healthcare)、QS4FF和QSBB珠每一种的5ml柱移至有盖的7ml试管中。S4FF是电中性的，用作对照珠。在每种珠中加入大约1.38ml在PBS中的BSA包被的苯乙烯颗粒溶液(25mg/ml，1.4×1013颗粒/ml)。
将所述珠/颗粒混合物旋转过夜，允许珠沉降并使用UV光谱学在280nm测量上清中所述颗粒的吸收。颗粒的浓度通过绘制标准校准曲线来获得。
测量每种介质对BSA包被的苯乙烯颗粒的容量以及进料和上清中颗粒的浓度的示例性实验的结果在表IV中总结。
表IV：
*Seph-4FF表示进料的空隙体积稀释的对照。
此外，使用每种珠达成的对BSA包被的苯乙烯颗粒的回收在表V中总结。
表V：
所示数据解释了由于珠的空隙体积中的缓冲液所导致的进料稀释。
如表V所示，BSA包被的苯乙烯颗粒的回收随着珠大小增加而增加大约33％。因此，通过增加珠大小而降低每单位体积外表面积与改良的病毒样颗粒的回收相关。
实施例4：使用两种不同珠大小的阴离子交换介质从Phi6和BSA的混合物 中回收噬菌体-Phi6的对比
在另一示例性试验中，证明了从含有Phi6和BSA的溶液混合物中对病毒颗粒(Phi6)的回收。Phi6是脂质包膜的噬菌体，具有大约86nm的大小以及在7.0以上的pH带负电。因此，将其用作模型以代表流感病毒。此外，BSA是带负电的蛋白质，具有大约5.0的pI，用作模型以代表宿主细胞蛋白质。这些研究通过使用如下程序使溶液以大约1ml/min的流速流经填充珠的柱而以动态模式来进行。
通过将噬菌体Phi6(原液效价为～1.1x1012PFU/ml)加入(spiking)到大约600ml的PBS中以达到大约109PFU/ml的Phi6终浓度而制备进料溶液。将牛血清白蛋白(BSA，Sigma Aldrich Corporation)加入这个溶液中以达到由UV光谱学确定的0.18mg/ml的终浓度。
用大约0.5ml的平均直径为90μm的中性Sepharose 4FF(S4FF，GEHealthcare)、带正电的平均直径为90μm的Q Sepharose 4FF珠(QS4FF，GEHealthcare)或者带正电的平均直径为200μm的Q Sepharose大珠(QSBB，GEHealthcare)来填充玻璃柱(Omnifit，得自Fisher Scientific Corporation)。柱的质量通过使用丙酮脉冲方法来核实以保证其具有良好的不对称和HETP(即理论塔板高)，然后在PBS中平衡(见例如Ion Exchange Chromatography andChromatofocusing-Principles and Methods.Amersham Biosciences，11-0004-21，Edition AA所述)。
使大约200ml的进料溶液以1±0.1ml/min的流速经过每个柱并以20ml的级分收集流通液。
使用UV光谱学测在280nm测定级分的BSA浓度，使用在缓冲液中的Phi6溶液作为对照。噬菌体Phi6的浓度使用TCID50-噬斑形成单位测定法来确定。
测量经过含有S4FF(对照)、QS4FF(90μm)或者QSBB(200μm)珠的0.5ml柱的Phi6和BSA的溶液混合物中噬菌体Phi6的临界点(breakthrough)的一个这样实验的结果示于图1。
从图1中可以看出，Phi6经过对照珠S4FF而无任何相互作用，得到流通液浓度等于进料浓度。使用QSBB珠(200μm)的流通液提示Phi6最初结合该柱并在150柱体积(CV)内达到进料浓度。然而，使用QS4FF珠(90μm)的流通液中Phi6浓度在300CV后才达到进料浓度。这提示200μm珠仅结合90μm珠所结合病毒的一半。
测量含有上述在实验期间特定时间点经过含有S4FF、QS4FF或者QSBB的0.5ml的柱的溶液混合物的流通液中BSA和Phi6的量的一个这样实验的结果在表VI中总结。
表VI：
| 珠类型 | 时间(min) | BSA浓度(mg/ml) | Phi6浓度(PFU/ml) |
| S4FF | 40 | 0.18 | 8x 108 |
| QS4FF | 40 | 0.14 | 9x 107 |
| QSBB | 40 | 0.14 | 4.45x 108 |
基于表VI总结的结果，看起来虽然90μm和200μm大小的珠结合不同量的Phi6，但是其具有相似的BSA结合特性。此外，在经过每个柱大约80CV进料后，使用QSBB(200μm)与QS4FF(90μm)相比可以获得大于一个log的Phi6回收。
因此，基于前述结果，看起来对于指定柱体积(CV)，使用较大的珠(例如200μm)相对于较小的珠(例如90μm)可以回收更多的病毒，这是由于每单位体积外表面积降低所致。此外，溶液中蛋白质如宿主细胞蛋白质的存在看起来并不不利影响病毒回收且宿主蛋白质自身的去除看起来不依赖于珠的大小。
实施例5：使用三种不同珠大小的阴离子交换介质从B型流感病毒和宿主 细胞蛋白质混合物中回收B型流感病毒的对比
在另一示例性试验中，描述了从宿主细胞蛋白质、DNA及生长培养基中其它成分如胎牛血清(FBS)、酚红和非必需氨基酸的混合物中回收B型流感病毒。B型流感病毒是脂质包膜的病毒，具有～5.0的pI，大约80-120nm的大小。这些研究通过使含有B型流感病毒和宿主细胞蛋白质的澄清的细胞培养裂解物上清以1ml/min流速流经填充珠的柱而以动态模式进行。
使用标准方法制备了含有在MDCK细胞中生长的B型流感病毒的大约200ml进料。开始，用在10％FBS DMEM中大约2.0×107细胞/瓶向8个T150培养瓶接种。24小时后，将培养瓶中培养基更换为在DMEM中的1％FBS并用B型流感病毒株B/Lee/40(ATCC#VR-1535)感染细胞，所述病毒株是适合在MDCK细胞中生长的组织培养物。然后将培养瓶在37℃在5％CO2中温育5天，直至观测到完全CPE(致细胞病变效应)。随后在2500RPM离心上清，通过0.45μm膜滤器过滤以除去细胞碎片并在4℃贮存待用。
用大约1ml的平均直径为90μm的中性Sepharose 4FF(S4FF，GEHealthcare)、带正电的平均直径为34μm的Q Sepharose HP(QSHP，GEHealthcare)、带正电的平均直径为90μm的Q Sepharose 4FF珠(QS4FF，GEHealthcare)或者带正电的平均直径为200μm的Q Sepharose大珠(QSBB，GEHealthcare)来填充玻璃柱(Omnifit，得自Fisher Scientific Corporation)。柱的质量通过使用丙酮脉冲方法进行核实以保证其具有良好的不对称和HETP，然后在20mM磷酸盐缓冲液pH 7.2中平衡。
将如上述制备的大约10ml澄清的流感病毒进料以1ml/min流速经过每个柱。以1ml的级分收集柱流通液并使用血凝(HA)测定一式两份测定流感病毒含量。
测量经过含有S4FF(对照)、QSHP(34μm)、QS4FF(90μm)或QSBB(200μm)珠的1ml柱的宿主细胞蛋白质、DNA、FBS及其它生长添加剂的溶液混合物中B型流感病毒的临界点效价的示例性试验结果在表VII和图2中示出。
表VII：
数据以血凝素(HA)单位表示。
在这个实验中评估了对应于三种不同每单位体积外表面积的三种不同大小的珠。在表VII和图2中可以看出，QSBB(200μm)珠示出B型流感病毒的瞬时(instant)临界点(在低于3CV的临界点)，而QSHP(34μm)在整个实验期间直至经过该柱9CV进料也无临界点。QSBB(200μm)的流通液浓度等于在9CV之后的进料溶液浓度，得到了比QS4FF(90μm)珠高16倍的回收以及比QSHP(34μm)珠高64倍的回收。因此，该结果表明相对于较小的珠，通过提高珠大小来降低每单位体积外表面积导致了B型流感病毒更高的回收。
此外，下表VIII总结了在实施例3、4和5中描述的实验中研究的各种类型的病毒颗粒的回收。使用在图1和图2中临界点曲线下的面积计算噬菌体-Phi6和B型流感病毒的集合回收(pool recovery)。
表VIII
如表VIII所总结的，通过将珠大小从90μm增加至200μm而将外表面积最小化使得病毒/病毒颗粒的产量改良了30-90％。
实施例6：使用阴离子交换介质从流感病毒和宿主细胞蛋白质以及DNA的 混合物中回收A型流感病毒及除去宿主细胞蛋白质的对比
在另一示例性实验中，对从宿主细胞蛋白质和DNA的混合物中回收A型流感病毒进行了测量。A型流感病毒是脂质包膜的病毒，具有～5.0的pI，大约80-120nm的大小。这些实验通过将澄清的及交换了缓冲液的含有A型流感病毒和宿主细胞蛋白质的进料以1ml/min流速流经珠的填充柱而以动态模式来进行。
使用标准方法制备含有在MDCK细胞中生长的A型流感病毒的进料。开始，在10％FBS DMEM中以MDCK细胞10％铺满接种50个T150培养瓶。2-3天后，一旦细胞达到80-90％铺满，将培养瓶中的培养基更换为无血清的DMEM并用A型流感病毒/WS(H1N1株)感染细胞，所述病毒株是适合在MDCK细胞中生长的组织培养物。然后将培养瓶在33℃在5％CO2中温育3天，直至观测到完全CPE。随后在2500RPM离心上清，通过0.45μm膜滤器过滤以除去细胞碎片并在-80℃贮存待用。
用大约0.8ml的平均直径为90μm的中性Sepharose 4FF(S4FF，GEHealthcare)、带正电荷的平均直径为90μm的Q Sepharose 4FF珠(QS4FF，GE Healthcare)或者带正电荷的平均直径为200μm的Q Sepharose大珠(QSBB，GE Healthcare)来填充玻璃柱(Omnifit，得自Fisher ScientificCorporation)。柱的质量通过使用丙酮脉冲方法进行核实以保证其具有良好的不对称和HETP，然后在50mM磷酸盐缓冲液pH 7.1中平衡。
就在进行实验之前，使大约200ml进料在4℃解冻过夜，然后使用10Kilo-Dalton Centricon离心过滤装置(Millipore Corporation)将缓冲液更换为50mM磷酸盐缓冲液pH 7.1。将如上述所制备的大约90ml这种流感病毒进料以0.16ml/min流速经过每个柱。以1ml的级分收集柱流通液并分别使用HA测定、BCA测定和Pico-green测定一式两份来测定流感病毒、宿主细胞蛋白质以及宿主细胞DNA含量。
测量经过含有S4FF(对照)、QS4FF(90μm)或QSBB(200μm)珠的0.8ml柱的宿主细胞蛋白质和DNA的混合物中A型流感病毒的临界点的示例性试验结果在图3中示出。
测量经过含有S4FF(对照)、QS4FF(90μm)或QSBB(200μm)珠的0.8ml柱的A型流感病毒和DNA的溶液混合物中的宿主细胞蛋白质的临界点的示例性试验结果在图4中示出。
表IX总结了描述图3和4所述实验的结果，其测量经过S4FF(对照)、QS4FF(90μm)或者QSBB(200μm)珠的0.8ml柱的上述溶液混合物中的A型流感病毒、HCP和宿主细胞DNA的临界点效价，根据在42ml进料经过所述柱之后A型流感病毒的回收和宿主细胞蛋白质的去除。
表IX：
如图3和4及表IX所总结的，很明显较大的200μm珠柱比90μm珠具有早得多的A型流感病毒临界点并产生高～65％的病毒回收。QS4FF和QSBB柱的宿主细胞蛋白质(HCP)临界点曲线看起来相似且通过QSBB柱除去总HCP看起来略低于QS4FF柱。但是由于200μm珠具有高得多的病毒回收，因此得自这个柱的产物的纯度比90μm珠柱高～60％。
实施例7：使用珠混合物从流感病毒和宿主细胞蛋白质的混合物中回收A 型流感病毒及除去宿主细胞蛋白质的对比
在示例性实验中，使用如下柱从含有A型流感病毒和宿主细胞蛋白质及宿主细胞DNA的混合物中流通纯化A型流感病毒：(1)阴离子交换珠柱；(2)含有连续的阴离子和阳离子交换珠的柱；(3)含有连续的阴离子交换和疏水性珠的柱；(4)含有连续的阴离子交换、阳离子交换和疏水性珠的柱；或者(5)含有阴离子交换、阳离子交换和疏水性珠混合物的柱。
用平均直径为90μm的大约0.8ml带正电的Q Sepharose 4FF珠(QS4FF)、或者平均直径为200μm的0.8ml带正电的Q Sepharose大珠(QSBB)、或者用平均直径为200μm的连续的0.8ml的Q Sepharose大珠及随后0.8ml的SP Sepharose大珠(AC)、或者用平均直径为200μm的连续的0.8ml的Q Sepharose大珠及随后0.8ml的Phenyl Sepharose大珠(AH)、或者用平均直径为200μm的连续的0.8ml的Q Sepharose大珠及随后0.8ml的SP Sepharose大珠及随后0.8ml的Phenyl Sepharose大珠(ACH)来填充玻璃柱(Omnifit，得自Fisher Scientific Corporation)，或者用平均直径为200μm的Q Sepharose大珠、SP Sepharose大珠和Phenyl Sepharose大珠的混合物填充玻璃柱(Omnifit，得自Fisher Scientifc Corporation)以形成2.4ml柱(MACH)。柱的质量通过使用丙酮脉冲方法进行核实以保证其具有良好的不对称和HETP，然后在50mM Trizma缓冲液pH 8平衡(见例如PCT出版物WO2008113011 A2所述，其援引加入本文)。
以与实施例6所述相似的方式产生含有A型流感病毒的进料，在-80℃贮存待用。在进行实验之前，所述进料在4℃解冻过夜，然后使用10Kilo-Dalton Centricon离心过滤装置(Millipore Corporation)将缓冲液更换为50mM Trizma缓冲液pH8.0。使大约60ml经缓冲液更换的进料以0.16ml/min流速经过每个柱。以1ml的级分收集柱流通液并一式两份分别使用HA测定、BCA测定和Pico-green测定法测定流感病毒、宿主细胞蛋白质和宿主细胞DNA含量。
测量经过含有如下之一的柱的HCP与宿主细胞DNA的溶液混合物中A型流感病毒的临界点的示例性试验结果在图5中示出：0.8ml的QS4FF(90μm)珠；0.8ml的QSBB(200μm)珠；连续的0.8ml的QSBB珠及0.8ml的SP Sepharose大珠(200μm)(AC)；连续的0.8ml的QSBB珠和0.8ml的PhenylSepharose大珠(200μm)(AH)；连续的0.8ml的QSBB珠、0.8ml的SPSepharose大珠和0.8ml的Phenyl Sepharose大珠(ACH)；或者24ml的QSBB珠、SP Sepharose大珠和Phenyl Sepharose大珠的混合物(MACH)。
测量经过含有如下之一的柱的A型流感病毒与宿主细胞DNA的溶液混合物中HCP的临界点的示例性实验结果在图6中示出：0.8ml的QS4FF(90μm)珠；0.8ml的QSBB(200μm)珠；连续的0.8ml的QSBB珠及0.8ml的SP Sepharose大珠(200μm)(AC)；连续的0.8ml的QSBB珠和0.8ml的Phenyl Sepharose大珠(200μm)(AH)；连续的0.8ml的QSBB珠、0.8ml的SP Sepharose大珠和0.8ml的Phenyl Sepharose大珠(ACH)；或者2.4ml的QSBB珠、SP Sepharose大珠和Phenyl Sepharose大珠的混合物(MACH)。
表X概述了图5和6所示实验的结果，其测量在42ml进料经过本文所述各个柱之后溶液混合物中A型流感病毒、HCP和宿主细胞DNA的临界点效价。
表X
上述计算假定在流通方法之后的理论缓冲液洗涤以及假定柱中40％空隙体积。
上述实验描述了在柱中使用单一或者多种类型珠对A型流感病毒的纯化。从图5和6中及表X中可以看出，使用多种类型的珠略微降低病毒回收。然而，即使使用较大体积，具有200μm珠的柱总是具有比90μm珠更高的病毒回收，这是由于其较低的每单位体积外表面积及其与病毒有限的相互作用所致。使用多种类型的珠相当程度地改良了总HCP去除和产物的纯度。这提示由于阳离子和疏水性珠不干预病毒回收因而增加柱的外表面积，但是这些珠的内表面积可以清除宿主细胞蛋白质，从而提高产物的纯度。使用多种类型珠的研究也提示使用组合阴离子、阳离子和/或疏水性树脂相互作用的200μm混合模式珠可以潜在地实现相似的纯化。
本说明书通过并入作参考的所引用的参考文献的教导而得到最彻底的理解。本说明书中的实施方案是举例说明本发明，不应理解为限制本发明的范围。技术人员可轻易地意识到本发明也涵盖许多其它实施方案。所有出版物和发明均以其全部内容援引并入本文。对于援引加入的材料与本说明书相矛盾或者不一致的范围，本说明书将替代任何这种材料。本文对任意文献的引用并不是承认此文献是相对于本发明的现有技术。
除非特别指出，则本说明书包括权利要求书中所用表示组分、细胞培养物、处理条件等数量的所有数字在所有情况中均应以修改为“大约”所表示的方式来理解。因此，除非特别指出，则所述数字均是近似值，可以根据本发明试图获得的所需性质而改变。除非特别指出，在一系列元素之前的术语“至少”应理解为是指这个系列中的每一元素。本领域技术人员会意识到或者能通过不超过常规实验来确定，许多本文所述的本发明的具体实施方案的等价物。这种等价物涵盖在如下权利要求书中。
在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行多种修改和改变，这些对本领域技术人员而言是很明显的。本文描述的特定实施方案只是示例性说明本发明而无任何限制本发明之意。本说明书和实施例只应作为举例说明本发明，通过如下权利要求书表明本发明的真正范围和精神。
Claims (20)
1.一种改良从包含大生物分子及一或多种污染物的样品中回收所述大生物分子的流通方法，所述方法包括使所述样品与一或多种固体多孔颗粒群接触，所述颗粒具有小于待回收大生物分子的分子量截断值，其中所述流通方法中使用的至少一种固体多孔颗粒群包含最小化的固体多孔颗粒群每单位体积外表面积以及相对于不具有最小化的每单位体积外表面积的固体多孔颗粒群，其固体多孔颗粒群的每单位体积内表面积未降低25％以上，从而改良所述大生物分子的回收
其中所述一或多种固体多孔颗粒群选自用于阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水性相互作用层析、大小排阻层析和混合模式层析的一或多种珠。
2.权利要求1的流通方法，其中将所述一或多种固体多孔颗粒群填充在层析柱中。
3.权利要求1的流通方法，其中与未使用包含最小化的颗粒群的每单位体积外表面积且颗粒群的每单位体积内表面积未降低的至少一种固体多孔颗粒群的流通方法的大生物分子的回收相比，所述大生物分子的回收改良至少10％、或者至少20％、或者至少30％、或者至少40％、或者至少50％、或者至少60％、或者至少70％、或者至少80％、或者至少90％。
4.权利要求3的流通方法，其中所述改良的回收包括大生物分子的纯度改良至少10％。
5.权利要求3的流通方法，其中所述改良的回收包括一或多种污染物减少至少10％、或者至少20％、或者至少30％、或者至少40％或者更多。
6.权利要求1的流通方法，其中所述一或多种固体多孔颗粒群选自用于阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水性相互作用层析的一或多种珠。
7.权利要求1的流通方法，其中所述一或多种固体多孔颗粒群包含混合模式层析珠。
8.权利要求1的流通方法，其中所述大生物分子选自由包囊的病毒、病毒样颗粒以及结合疫苗所组成的组。
9.权利要求1的流通方法，其中所述一或多种污染物选自由核酸、蛋白质、赋形剂和细胞培养添加剂所组成的组。
10.权利要求8的流通方法，其中所述蛋白质是宿主细胞蛋白质。
11.权利要求7的流通方法，其中所述病毒样颗粒是用BSA包被的苯乙烯颗粒。
12.权利要求7的流通方法，其中所述包囊的病毒是流感病毒。
13.权利要求7的流通方法，其中所述包囊的病毒是腺病毒。
14.权利要求7的流通方法，其中所述包囊的病毒是噬菌体。
15.权利要求11的流通方法，其中所述流感病毒是H1N1病毒。
16.权利要求1的流通方法，其中所述大生物分子在细胞培养物或者在卵中产生。
17.权利要求1的流通方法，其中所述样品是细胞培养上清。
18.权利要求15的流通方法，其中所述细胞培养物包含MDCK细胞。
19.权利要求1的流通方法，其中所述至少一种固体多孔颗粒群具有的平均直径在200μm-600μm范围。
20.权利要求1的流通方法，其中所述方法使得可以回收样品中至少50％、或者至少55％、或者至少60％、或者至少65％、或者至少70％、或者至少75％、或者至少80％、或者至少85％、或者至少90％的所述大生物分子。
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