CN102150644A - 一种抗肿瘤蝇幼虫的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤蝇幼虫的培养方法，包括：将大头金蝇消毒后驯化两代以上，制得种蝇，培养基置于培养箱内发酵3～5小时后将种蝇放入培养箱内产卵，控制培养箱内氨气浓度为50～200ppm，卵孵化后，控制培养箱内温度为26～35℃，氨气浓度为500～1000ppm，继续培养24～120小时。本发明方法通过对幼虫培养各个阶段环境中氨气浓度和温度的控制，使得幼虫在发育阶段各个蛋白表达发生变化，这些异常表达的蛋白具有抗肿瘤的活性，而且本发明方法所使用培养基成分简单，操作方便，容易实现规模化养殖，具有较好的产业化前景。

Description

一种抗肿瘤蝇幼虫的培养方法

技术领域

本发明涉及一种蝇幼虫的培养方法，尤其涉及一种抗肿瘤蝇幼虫的培养方法。

背景技术

大头金蝇(Chrysomyia megacephala)，别名红头苍蝇，是节肢动物门有颚亚门昆虫纲有翅亚纲双翅目丽蝇科金蝇亚科昆虫的一种。它食物转化率高，生长速度快，繁殖力高，产卵期长，其虫体的蛋白质含量高，饲养条件和养殖设备相对简单，有利于大规模生产。

大头金蝇是一种完全变态的昆虫，生活史包括：卵→幼虫→蛹→成蝇4个阶段。大头金蝇卵为淡黄色，呈香蕉型，长度约一毫米，一克卵大约有7000粒。幼虫呈锥形，前端尖，后端钝圆，有明显的体节，体长为13～16毫米，一克幼虫约有15条，在适宜的温度环境下，成熟幼虫1～2天就可以成蛹，蛹经过5天左右，即可羽化出成虫。成虫体长8～11毫米，金属绿色，身被灰色，复眼红色。

中国专利200510060277.4公开了一种具有抗肿瘤生物活性蝇蛆的养殖方法。包括：1)大头金蝇饲养：采用全透明式蝇房，房内拉设有多根绳子供种蝇歇息，以动物蛋白、红糖、水果为食物，以中药淫羊藿、加赖氨酸、蛋氨酸、维生素作为催卵素，用集卵盘子收集蝇卵；2)蝇蛆饲养：采用通风的蝇蛆房，房顶用透明材料，房中装有换气扇和风扇，窗户、换气窗与房外相通的地方用纱窗严实封好，蝇蛆房内设有育蛆池，育蛆池温度控制28℃～60℃，在育蛆池内放入蝇蛆饵料，同时放入上述蝇卵。该方法使用的培养基价格昂贵，而且无法规模养殖。

发明内容

本发明提供了一种抗肿瘤蝇幼虫的培养方法，该方法所用培养基价格低廉，而且可以规模化操作。

一种抗肿瘤蝇幼虫的培养方法，包括：

将大头金蝇消毒后驯化两代以上，制得种蝇，培养基置于培养箱内发酵3～5小时后将种蝇放入培养箱内产卵，控制培养箱内氨气浓度为50～200ppm，卵孵化后，控制培养箱内温度为26～35℃，氨气浓度为500～1000ppm，继续培养24～120小时。

所述的培养基为蛙、家禽肉、家禽内脏、家畜肉、家畜内脏和淡水鱼肉中至少一种，这些基料易获得，成本低廉。

所述培养基可以选用以下几种配方：

(1)10～60％的淡水鱼肉、20～70％猪内脏和10～50％的青蛙；

(2)30～70％的猪内脏和30～70％的青蛙；

(3)10～50％的猪肉和10～50％淡水鱼肉及10～50％鸡肉；

(4)20～60％的牛肉和30～70％青蛙；

(5)30～70％的羊肉、10～50％淡水鱼肉及20～60％猪内脏。

本发明的关键点在于控制容器内的氨气浓度，而氨气浓度主要由培养基组分和培养温度决定，温度越高，发酵速率越大，氨气浓度越高，上述培养的氨气产生量也是不一样的，因此当温度较低时，可以选用产氨气较多的培养基，反之，则选用产氨气较少的培养基。本发明所用的容器时相对封闭的，只用一个可调节大小的通气孔，通过调节通气孔的大小，可以调节容器内气体浓度。

卵孵化前，培养箱内一氧化碳浓度小于30ppm，氧气浓度20～21ppm，二氧化碳浓度3000～6000ppm。

卵孵化后，培养箱内一氧化碳浓度小于10ppm。主要是让幼蝇生长的更好。

本发明方法通过对幼虫培养各个阶段环境中氨气浓度和温度的控制，使得幼虫在发育阶段各个蛋白表达发生变化，这些异常表达的蛋白具有抗肿瘤的活性，而且本发明方法所使用培养基成分简单，操作方便，容易实现规模化养殖，具有较好的产业化前景。

具体实施方式

实施例1

驯化野生大头金蝇

取自然界的大头金蝇，为避免野生种类的带菌传病之嫌，经过高猛酸钾消毒处理后，进行2～3代隔离饲养，然后在接近自然的养蝇房内养殖驯化，经过四代后，种蝇驯化完成，得到种蝇。

如来年不再驯化种蝇，就需要保存种蝇。保种的方法为：在9～10月份秋末时，把蝇蛹放入密封容器内，置于温度为5～10℃的冷藏室内，在该温度下蛹不会死亡也不会孵化，来年室外温度上升到22℃以上时，取出放进蝇房即可孵化。

培养幼虫

将20千克培养基(60％的淡水鱼肉、30％猪内脏和10％的青蛙)置于培养箱内。培养箱体积0.14立方米，制作材料可使用金属、塑料、木材、水泥、复合材料等，形状为长方体或正方体，顶面设有一个可调节大小的通气孔。当培养基开始发酵后，将种蝇放入培养箱内产卵，并控制培养箱内氨气浓度在50～200ppm，一氧化碳浓度小于30ppm，氧气浓度20～21ppm，二氧化碳浓度3000～6000ppm，培养6个小时左右，卵开始孵化。

接着把通气孔孔径减小，增加氨气浓度至500～1000ppm，一氧化碳浓度降低小于10ppm，控制培养温度为30℃，继续培养100小时，得到幼虫。整个过程中，不再加入新鲜的培养基，当气体浓度超出上述范围，则将通气孔增大，调整到上述范围内。

后处理

首先把收集的蝇幼虫活体放置在60目尼龙筛网制成的无盖网箱内，用清水冲洗。30分钟冲洗一次，连续冲洗四次以上，此方法能将幼虫体内的污物彻底清洗干净，真空冷冻干燥干燥至含水量10％以下，粉碎。

对肿瘤细胞抑制活性

所有样品对肿瘤细胞的抑制活性均委托中科院上海药物研究所，检测方法采用磺酰罗丹明B(sulfordamine B.SCR)蛋白染色法，具体检测结果如下：

实施例2

将培养幼虫中的培养基换成70％的猪内脏和30％的青蛙，其它操作步骤如实施例1，对肿瘤细胞的抑制活性检测结果如下：

实施例3

将培养幼虫中的培养基换成30％的猪肉和30％淡水鱼肉及40％鸡肉，其它操作步骤如实施例1，对肿瘤细胞的抑制活性检测结果如下：

Claims (7)

1.一种抗肿瘤蝇幼虫的培养方法，包括：

将大头金蝇消毒后驯化两代以上，制得种蝇，培养基置于培养箱内发酵3～5小时后将种蝇放入培养箱内产卵，控制培养箱内氨气浓度为50～200ppm，卵孵化后，控制培养箱内温度为26～35℃，氨气浓度为500～1000ppm，继续培养24～120小时。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述的培养基为蛙、家禽肉、家禽内脏、家畜肉、家畜内脏和淡水鱼肉中至少一种。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述培养基重量百分比组成为：10～60％的淡水鱼肉、20～70％猪内脏和10～50％的青蛙；

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述培养基重量百分比组成为：30～70％的猪内脏和30～70％的青蛙。

5.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述培养基重量百分比组成为：30～70％的羊肉、10～50％淡水鱼肉及20～60％猪内脏。

6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：卵孵化前，培养箱内一氧化碳浓度低于30ppm，氧气浓度20～21ppm，二氧化碳浓度3000～6000ppm。

7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：卵孵化后，培养箱内一氧化碳浓度小于10ppm。