CN102146365A - D-氨甲酰水解酶突变体 - Google Patents

D-氨甲酰水解酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及高稳定性尤其是热稳定性提高的D-氨甲酰水解酶突变体及其应用。

Description

D-氨甲酰水解酶突变体
技术领域
本发明属于酶学领域。具体地说，本发明涉及新的D-氨甲酰水解酶突变体。
背景技术
D-对羟基苯甘氨酸(D-p-hydroxyphenylglycine，D-HPG)做为侧链，是羟氨苄青霉素(即阿莫西林，Amoxycillin)、头孢羟氨苄(Cefadroxil)等多种半合成广谱β-内酰胺类抗生素、杀虫剂和甜味剂中间体的重要中间体，具有广泛的应用价值和重要的商业价值。
D-HPG可以通过化学水解、菌体转化及固定化酶等方法制备。化学水解法中涉及到有毒物质如HNO2的使用及消旋体手性拆分等工艺，因此反应总收率不高且能耗较大。菌体转化法呈现出转化反应进程缓慢与中间体氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(N-carbamoyl-D-hydroxyphenylglycine，NC-D-HPG)积累现象或者该法涉及到双菌分别发酵并两次转化，因而制备工艺复杂，成本也相对较高。D-HPG也可由D-海因酶(D-hydantoinase，DHase)和D-氨甲酰水解酶(D-carbamoylase，DCase)水解混旋型对羟基苯海因(D，L-HPH)而得到，酶法转化反应过程中化学合成的D，L-5-取代乙内酰脲在D-Hase催化下得到氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸，后者在DCase的催化下生成光学纯D-HPG，该方法得率及产品光学纯度高，且具有环境友好及成本低廉的优势。而固定化酶法又因为其稳定性突出，可重复回收利用等优点，受到越来越多的重视(Olivieri，Fascetti et al.1979；Olivieri，Fascetti et al.1981)。
而在固定化双酶法工艺中DCase的稳定性和可溶性不佳，成为固定化酶法制备D-HPG的制约因素。对此，研究人员为改善D-氨甲酰水解酶的稳定性做了大量的研究工作。Giuliano等将来源于Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291的D-氨甲酰水解酶的243，250，279位的半胱氨酸残基定点突变，发现243和279位突变为丙氨酸后，酶稳定性可以提高6倍(Giuliano et al.1995)。Kaneka公司以羟胺和亚硝酸钠对来源于Agrobacterium sp.KNK712的D-氨甲酰水解酶进行随机突变，获得热稳定性提高约5℃的突变体酶，测序结果为57位的组氨酸突变为酪氨酸；203位的脯氨酸突变为亮氨酸或丝氨酸(Ikenaka et al.1998a)。Kaneka公司还发现236位的缬氨酸突变为丙氨酸后，热稳定性可提高10℃(Ikenaka et al.1998b)。进一步对上述3个位点进行定点突变发现：57位的组氨酸变为亮氨酸；203位的脯氨酸突变为天冬酰胺，谷氨酸，丙氨酸，异亮氨酸，组氨酸或苏氨酸；236位的缬氨酸突变为苏氨酸或丝氨酸后，酶的热稳定性均可提高。三突变酶455M(H57Y、P203E、V236A)的热稳定性比野生型酶提高了19℃(Ikenaka et al.1999)。
本实验室从国内D-HPG工业转化菌株皮氏罗雷斯顿菌CGMCC1596(简称皮氏菌)中克隆并在E.coli中表达了DCase和DHase，通过易错PCR及DNA改组的方法获得了可溶性表达提高数倍的突变体DCase-M3(A18T/Y30N/K34E)(Jiang，S，Li等，″Directed evolution and structural analysis of N-carbamoyl-D-amino acidamidohydrolase provide insights into recombinant protein solubility in Escherichiacoli.″，Biochem J 402：429-37，2007)，这为固定化酶工艺制备D-HPG的工业化的实现进一步提供了帮助。在DCase可溶性表达得到提高的基础上，通过易错PCR，辅以高通量筛选体系获得的突变体F7(Q12L)的热稳定性提高了7℃左右，而比活力、酶动力学及高可溶性表达特点保持不变，使得固定化酶制备D-HPG具有更好的产业化前景(Hong YU等，″Improving the thermostability of N-carbamyl-D-amino acidamidohydrolase by error-prone PCR″，Appl.Microbiol.Biotechnol.DOI10.1007/s00253-008-1748-z，2009)。
发明内容
本发明通过随机突变、DNA改组、半理性设计等酶分子工程方法对皮氏罗雷斯顿菌CGMCC1596来源的DCase进行改造，获得了稳定性进一步提高的突变体，为固定化酶法制备D-HPG的产业化提供更有利支持。
具体地说，本发明提供了一种D-氨甲酰水解酶突变体，其特征在于，其中的突变包括D-氨甲酰水解酶第262位和第248位上的氨基酸取代，所述突变体具有D-氨甲酰水解酶活性，其热稳定性高于取代前。本文中，若非另外说明，所有的突变的定位都是基于与皮氏罗雷斯顿菌CGMCC 1596来源的DCase-M3序列(SEQ ID NO：26)的最大同源性比对(alignment)，DCase-M3的核酸编码序列如SEQ ID NO：25所示。实施方式之一中，本发明的D-氨甲酰水解酶突变体具有含突变的SEQ ID NO：26所示氨基酸序列，所述突变包括第262位和第248位上的突变。突变方式之一是氨基酸取代，例如，第262位氨基酸可以是丙氨酸或其保守性取代，第248位可以是谷氨酰胺或其保守性取代。
本发明的突变体还可以含有其它突变。例如，实施方式之一，本发明的突变体还含有第263位、第23位和第12位上的氨基酸取代，例如第263位可以是丝氨酸或其保守性取代、第23位可以是亮氨酸或其保守性取代，第12位可以是亮氨酸或其保守性取代。
更进一步，本发明的突变体还可以含有以下位点的突变：第31位、第207位、第242位、第271位、第273位，或它们的组合。例如，所述组合可以是：第31位和第207位，第271位和第273位，第242位和第207位，第31位和第242位，第242位和第273位。所述突变方式之一是氨基酸取代，例如，第31位可以是亮氨酸或其保守性取代，第207位可以是谷氨酸或其保守性取代，第242位可以是甘氨酸或其保守性取代，第271位可以是异亮氨酸、亮氨酸或它们的保守性取代，第273位可以是赖氨酸、精氨酸、脯氨酸或它们的保守性取代。
本发明所述D-氨甲酰水解酶及其突变体不限于特定的物种来源，可以源自例如罗雷斯顿菌(Ralstonia sp.)、根瘤菌(Ensifer sp.)、土壤杆菌(Agrobacterium sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)等。例如，本发明的突变体可以是源于皮氏罗雷斯顿菌CGMCC1596、土壤杆菌KNK712、放射土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)NRRLB11291或土壤杆菌IP I-671的D-氨甲酰水解酶的突变体。实施方式之一中，所述突变体源自皮氏罗雷斯顿菌CGMCC1596 D-氨甲酰水解酶的突变体M3(DCase-M3)，DCase-M3与来源于皮氏罗雷斯顿菌CGMCC1596、土壤杆菌KNK712、放射土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)NRRL B11291或土壤杆菌IP I-671的D-氨甲酰水解酶相比，同源性分别高达约99.0％、99.0％、96.3％或92.8％。
作为举例，本发明的突变体可具有选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24所示的氨基酸序列。
此外，本发明还提供一种核酸分子，其编码本发明的D-氨甲酰水解酶突变体，或与所述编码序列互补。例如，本发明的核酸分子或其互补序列的核苷酸序列可以选自：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23。
本发明还提供一种载体，其含有本发明的核酸分子。本发明还提供一种宿主细胞，其含有本发明核酸分子。实施方式之一中，所述宿主细胞是用本发明载体转化的。
本发明还提供一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，包括用D-海因酶和本发明的D-氨甲酰水解酶突变体水解混旋型对羟基苯海因。
附图说明
图1：不同温度处理对初始酶M3和突变酶稳定性影响。在不同温度下处理15min残余酶活分析，残余酶活以最适反应温度下酶活的百分比计算表示。
图2.不同温度处理对出发酶E6和突变酶稳定性影响。在不同温度下处理15min残余酶活分析，残余酶活以最适反应温度下酶活的百分比计算表示。
图3.不同温度处理对出发酶B5和突变酶稳定性影响。在不同温度下处理15min残余酶活分析，残余酶活以最适反应温度下酶活的百分比计算表示。
图4.不同温度处理对出发酶B5和突变酶稳定性影响。在不同温度下处理15min残余酶活分析，残余酶活以最适反应温度下酶活的百分比计算表示。
图5.不同温度处理对出发酶B5、C18和突变酶稳定性影响。在不同温度下处理15min残余酶活分析，残余酶活以最适反应温度下酶活的百分比计算表示。
具体实施方式
本发明通过DNA改组方法(DNA shuffling)对随机突变后筛得的突变位点随机组合，通过高效筛选方法筛得热稳定性(以表观半残余酶活时处理温度Tm表征)比突变前的初始酶提高至少8℃的一组合突变。所述组合突变发生在第262位和第248位氨基酸残基。这些突变体的比酶活和可溶性与DCase-M3相比基本相同。由此可知，至少该两位点上的联合突变可显著提高DCase酶的稳定性，尤其是热稳定性。
本领域技术人员明白，就氨基酸序列或核苷酸序列而言，所述突变包括氨基酸或碱基的插入、取代、缺失或它们的组合。本发明实施方式之一中，DCase突变体氨基酸序列中的突变为氨基酸取代，即某一位点的氨基酸被改变为与野生型或模板中相应位点上原有氨基酸不同的氨基酸(本文中称为“取代氨基酸”)。本领域技术人员通过简单的试验和筛选，很容易确定合适的取代氨基酸。作为实施方式之一，取代氨基酸可选自一系列互为保守性取代的氨基酸。所为保守性取代即氨基酸之间的相互置换不至于影响所得蛋白质的活性。例如，就本发明而言，当突变位点上的某一取代氨基酸被保守性取代时，所得新的保守性取代突变体保留原突变体的酶活性、可溶性和热稳定性等特征。本领域技术人员借助现有技术手段，通过简单的试验和筛选，很容易确定这样的保守性取代。例如，保守性氨基酸取代可以考虑符合以下分组的类似氨基酸：
一.中性氨基酸
脂肪族氨基酸：甘氨酸(G)，丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)；
芳香族氨基酸：苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
含羟基氨基酸：丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；
含硫氨基酸：半胱氨酸(C)，胱氨酸，甲硫氨酸(M)；
亚氨基酸：脯氨酸(P)，羟脯氨酸；
二.酸性氨基酸 天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)，
及其酰胺(中性)：天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
三.碱性氨基酸：精氨酸(R)，赖氨酸(K)，组氨酸(H)。
进一步分析各来源DCase上与稳定性相关的位点，并通过DNA改组方法对这些位点再组合、再筛选，本发明获得了Tm比初始酶提高更多，例如提高10℃以上的组合突变，即第262、248、263、23和12位(263/262/248/23/12)氨基酸残基联合发生突变。作为实施方式之一，所述突变为氨基酸取代。这些突变体的比酶活和可溶性与DCase-M3相比基本相同。由此可知，某些位点例如上述位点的组合突变对于提高DCase酶稳定性尤其热稳定性而言可产生叠加、甚至协同效应。
然后，本发明通过酶结构共义性方法(structure guided consensus concept)对不同来源DCase氨基酸序列进行比对和DCase结构特点分析，通过半理性设计，获得了Tm进一步提高的组合突变，并发现以下位点与DCase的稳定性尤其热稳定性显著相关：第31位，第207位，第242位，第271位和第273位。并且，本发明还进一步发现，这些位点的组合能够进一步提高DCase酶的稳定性，尤其是热稳定性，这样的组合包括：第31位和第207位(31/207)，第271位和第273位(271/273)，第242位和第207位(242/207)，第31位和第242位(31/242)或第242位和第273位(242/273)。本发明发现，点突变的叠加亦即新的联合突变对于提高DCase酶稳定性尤其热稳定性而言可产生叠加、甚至协同效应。所述新的联合突变包括：263/262/248/23/12/31，263/262/248/23/12/207，263/262/248/23/12/242，263/262/248/23/12/271，263/262/248/23/12/273，263/262/248/23/12/31/207，263/262/248/23/12/271/273，263/262/248/23/12/242/207，263/262/248/23/12/31/242或263/262/248/23/12/242/273。这些组合突变能进一步提高酶的稳定性，例如将Tm提高约11-14℃或更多，甚至提高约17℃或更多。作为实施方式之一，所述突变为氨基酸取代。这些突变体的比酶活和可溶性与DCase-M3相比基本相同。
基于本申请公开的序列信息，本发明的酶突变体可以用化学合成或基因重组等方法来生产，这些都是本领域技术人员所熟悉的。例如，在采用重组法进行生产的实施方式中，可将本发明突变体的编码核酸克隆到合适的载体中，用所述载体转染或转化合适的宿主细胞，在适宜的条件下培养宿主细胞并诱导表达，然后用合适的已知方法由宿主细胞裂解物或培养液分离、纯化目标产物。
为此，本申请内容之一是提供编码本发明突变体的核酸分子。所述核酸分子可以是单链或双链DNA或RNA。本发明还包括编码链的互补链。此外，就编码同一突变体的核酸分子而言，可以包括多种基于简并密码子的变体。这些变体可能提供例如优化表达等有利特性。
本发明的另一项内容是包含本发明核酸分子的载体。所述载体可以是质粒、粘粒、噬菌体等基因工程常用载体。本发明实施方式之一中，所述载体是表达载体。载体可以以游离形式稳定存在于宿主中并自主表达，也可以整合到宿主的基因组内稳定遗传并表达。本领域技术人员完全能够根据转染/转化目的(例如是扩增、重组还是表达)自主选择合适的宿主和相宜的载体。
本发明的另一项内容是包含本发明核酸分子的宿主细胞，包括原核细胞或真核细胞，例如细菌(如大肠杆菌)或真菌(如酵母细胞)等。根据转染/转化目的(例如是扩增、重组还是表达)、回收、纯化等多种因素，选择合适的宿主细胞属于本领域技术人员的常规技能。
本发明的酶突变体可以用各种已知的蛋白质分离和纯化方法来回收，例如但不限于渗透压裂解、超声裂解、离心、盐析、和各种层析技术，例如分子筛层析、高效液相层析(HPLC)、亲和力层析、离子交换层析等等。
本发明D-氨甲酰水解酶突变体提供了热稳定性，比活力、酶动力学及高可溶性表达特点保持不变，与其适合用于通过固定化酶法制备D-HPG，从而提供显著的技术进步。
以下，通过实施例进一步说明本发明的各项特点和优点。需要说明是，以下实施例仅以阐释本发明为目的，不应将其理解为对本发明范围的任何限定。
实施例一：DCase-E6突变体的获得
皮氏罗雷斯顿菌CGMCC1596来源突变酶DCase-M3(A18T/Y30N/K34E)的可溶性表达水平显著提高，在其基础上又得到7个与稳定性相关的突变位点及相应的突变体：F7(Q12L)、C8(E22G/T262A)、F8(A36V)、B3(A36E)、C6(A164T)、A8(T263S)、E2(H248Q)(Hong YU等，Appl.Microbiol.Biotechnol.DOI10.1007/s00253-008-1748-z，2009和中国专利申请200810035067.3)。本发明以它们为模板进行DNA改组(DNA shuffling)(Crameri et al.，1998；Ness et al.，2002；Stemmer，1994)，通过热稳定性筛选获得高稳定性突变体。
具体地说，合成以下引物对：
pet_DC_M3_U GCTTTCAGAGTTCCGCGATCA       (SEQ ID NO：27)
pet_DC_M3_D TATGACACGTCAGATGATACTTGC    (SEQ ID NO：28)
用上述引物对扩增DCase突变体F7、C8、F8、B3、C6、A8、E2的基因。胶回收后用DNaseI酶切，跑2％琼脂糖凝胶，回收50-100bp的DNA片段。先无引物PCR扩增(94℃，30S；55℃，30S；72℃，1min；30个循环)，再用上述引物PCR扩增目的片段(94℃，30S；55℃，30S72℃，1min；15个循环)。胶回收目的基因大小(915bp)的片段。通过MegaprimerPCR(94℃，30S；55℃，30S；68℃，7min；18个循环)克隆至表达载体pET28-b(+)(购自NOVAGEN)。电转化到E.coli BL21(E3)(购自NOVAGEN)中，涂平板，建立突变库。
选取突变体库中的转化子接种到含200μl LB培养基的96孔深孔培养板中，含100μg/ml卡那霉素，37℃培养过夜，加入IPTG，使IPTG的终浓度为0.8mM，继续37℃培养4小时后将培养物转移到96孔细胞板取出。将96孔细胞板置于-70℃冷冻1h，55℃热激5min，68℃热处理15min，然后转移到96孔板显色。取4μl经过以上高温失活处理所得菌液或粗酶液加入到96孔显色反应液中(5g/L的NC-D-HPG，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.01％酚红，pH 5.8-6.0。)并置于37℃观察颜色变化，将颜色变化的突变子从对应的母板上检出。
挑取突变体单菌落接种到4毫升试管LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6的时候，进行IPTG诱导(终浓度0.8mM)。继续培养4小时后，8000rpm离心，收集菌体，菌体重悬于1ml的0.1M，pH8.0磷酸钠缓冲液中，超声波破碎(25×6秒)12000rpm离心30分钟。取上清做为稳定性分析的粗酶液。
酶热稳定性的评价
将以上所得粗酶液在不同的温度(50-82℃)保温15分钟后在50℃测定其剩余酶活。剩余酶活与初始酶活的比率为评价酶热稳定性的依据。
酶活测定
1％底物NC-D-HPG溶解到pH8.00.1M磷酸钠缓冲液。50μl酶液与400μl底物溶液混匀，50℃，120rpm转速条件下反应20分钟，加入等体积的10％盐酸终止酶促反应。反应液稀释10倍，12000rpm离心30分钟，取上清进行高效液相色谱(HPLC，Agilent Technologies 1100)分析，测定反应液中产物D-HPG的含量。1U酶活定义为每分钟产生1μmol D-HPG所需的酶量。其中，HPLC测定条件为：使用ZORBAXEclipseXDB-C8(4.6×150mm)柱子。以水∶甲醇∶1.29％乙酸＝85∶12∶3为流动相，流速为1.0ml/min，监测器波长设为230nm。
由此筛得一DCase突变体，其Tm(表观半残余酶活时处理温度)比初始酶(DCase-M3)提高8℃，比DNA Shuffling模版中稳定性较好的F7(Q12L)及A8(T263S)的Tm分别提高2℃和4℃(见图1)。与初始酶相比，该突变体的比酶活及可溶性基本相同。经测序，该突变体的氨基酸序列及其编码序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：1所示，将其标识为DCase-E6(T262A/H248Q)。
实施例二：DCase-B5突变体的获得
以实施例一所得DCase-E6的编码序列(SEQ ID NO：1)为模板通过定点诱变制造以下突变：Q23L、V40A、H58Y、G75S、C243A、C279A、A302C、A222C、M220L、M184L、M239L、M244L、M5L、M73L、N173A、P295C、F304C、Q12L、E22G、A36V、A164T或T263S。
然后，以所得各突变体的编码序列为模板，按照实施例一所述方法进行DNA改组和筛选。所不同的是，在转化子诱导表达后的高温失活处理为：-70℃冷冻1h、55℃热激5min、70℃热处理15min。由此，筛得另一DCase突变体，比初始酶(DCase-M3)提高10℃，比出发酶DCase-E6提高2℃(见图2)。与初始酶相比，该突变体的比酶活及可溶性基本相同。经测序，该突变体的氨基酸序列及其编码序列分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：3所示，将其标识为DCase-B5(T263S/T262A/H248Q/Q23L/Q12L)。
实施例三：基于酶结构共义性方法(structure guided consensus concept)的DCase-突变体半理性设计
以罗雷斯顿菌CGMCC1596的DCase氨基酸序列为调查模版通过PDB数据库进行蛋白序列比对(p-Blast)，各种来源的DCase序列同源性为34-99％。将氨基酸同源排比结果倒入数据库(http://coot.embl.de/Alignment/consensus.html)进行氨基酸共义性分析。设定共义数值70％，并根据调查结果及共义排比表确定DCase上各个位置氨基酸的共义性，确定氨基酸共义位点。以实施例二所得突变体DCase-B5为模板，在相应位点制造定点突变或半饱和突变(即采用兼并引物引入共义类氨基酸中任何一种构建成某位点的一小突变库)，构建突变库。
表1.定点突变位点及引物
Figure GSA00000031782100081
Figure GSA00000031782100091
表2.半饱和突变位点及兼并引物
Figure GSA00000031782100092
兼并碱基代码：R＝(A/g)、M＝(A/C)、W＝(A/T)、S＝(C/g)、Y＝(C/T)、K＝(g/T)、H＝(A/T/C)、B＝(g/T/C)、D＝(g/A/T)、V＝(A/C/g)、N＝(A/C/g/T)
※“-”之前为突变氨基酸；″f″：正向引物；“r”：反向引物；Common-f/r：公共突变引物
用引物表1所示Common-f和突变引物(Q207E-r、S224A-r、S231V-r、A234V-r、K290A-r、N242G-r、V274C-r、R283k-r、G235A-r)及Common-r和突变引物(M31L-f、F42L-f、Y69F-f、A180T-f、I192V-f、A189V-f、R187Q-f)分别PCR(94℃，30S；55℃，30S；72℃，1min；30个循环)扩增M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、M12、M13、M14、M15、M16的DCase突变体基因，胶回收DNA片段，MegaprimerPCR(94℃，30S；55℃，30；68℃，7min；18个循环)克隆至表达载体pET28-b(+)，电转化到E.coli BL21(E3)。构建得到各个突变体，并分析各个突变体的稳定性。
用表2所示引物Common-f和突变引物(H216s-r、L217p-r、S213h-r、L261p-r、E266s-r、T271i-r、A273c-r、H285o-r、Q294c-r、Q296-r、A232i-r)及Common-r和突变引物(A16p-f、T33c-f、T60---f、A86+-f、N93h-f、K134s-f、P141t-f、G194i-f、F170s-f、D163h-f)分别PCR(94℃，30S；55℃，30S；72℃，1min；30个循环)扩增C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21的DCase突变体基因，胶回收DNA片段，MegaprimerPCR(94℃，30S；55℃，30；68℃，7min；18个循环)克隆至表达载体pET28-b(+)，电转化到E.coli BL21(E3)，构建一系列的半饱和突变库，每个突变库包括一系列的突变体。
将突变体库中的转化子用牙签接种到含200μl LB培养基的96孔深孔培养板中，含100μg/ml卡那霉素，37℃培养过夜，加入IPTG，使IPTG的终浓度为0.8mM，继续37℃培养4小时后将培养物转移到96孔细胞板取出。将96孔细胞板置于-70℃冷冻1h，55℃热激5min，72℃热处理15min，转移到96孔板显色。取4μl经过高温失活处理的粗酶液加入到96孔显色反应液中(5g/L的NC-D-HPG，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.01％酚红，pH 5.8-6.0。)并置于37℃观察颜色变化，将颜色变化的突变子从对应的母板上检出。
突变体单菌落接种到4毫升试管LB培养基中，37度培养至OD600＝0.6的时候，进行IPTG诱导(终浓度0.8mM)。继续培养4小时后，8000rpm离心，收集菌体，菌体重悬于1ml的0.1M，pH8.0磷酸钠缓冲液中，超声波破碎(25×6秒)12000rpm离心30分钟。取上清做为稳定性分析的粗酶液。
粗酶液或纯化的酶液在不同的温度(50-82℃)保温15分钟后在50℃测定其剩余酶活。剩余酶活与初始酶活的比率为评价酶热稳定性的依据。
酶活测定
1％底物NC-D-HPG溶解到pH8.00.1M磷酸钠缓冲液。50μl酶液与400μl底物溶液混匀，50℃，120rpm转速条件下反应20分钟，加入等体积的10％盐酸终止酶促反应。反应液稀释10倍，12000rpm离心30分钟，取上清进行高效液相色谱(HPLC，Agilent Technologies 1100)分析，测定反应液中产物D-HPG的含量。1U酶活定义为每分钟产生1μmol D-HPG所需的酶量。HPLC测定条件：使用ZORBAXEclipseXDB-C8(4.6×150mm)柱子。以水∶甲醇∶1.29％乙酸＝85∶12∶3为流动相，流速为1.0ml/min，监测器波长设为230nm。
结果筛得以下突变体：
表3.罗雷斯顿菌CGMCC1596来源DCase突变体及其Tm
Figure GSA00000031782100111
其中，C17和C18的Tm比出发酶B5分别提高2℃和4℃，比初始酶M3分别提高12℃和14℃。同时，与初始酶DCase-M3相比，这些突变体的比酶活和可溶性基本相同。
实施例四：突变位点的叠加
将实施例三中由氨基酸序列共义方法得到的突变位点(M31L、Q207E、N242G、T271I、A273K)进行组合和新的取代，分析这些组合突变对热稳定性的影响。
合成以下引物：
Figure GSA00000031782100112
以实施例三中所得各突变体作为模板，用引物对ml分别和模板DCase M8、DCaseM13、DCase C17及DCase C18，引物对m8分别和模板DCase M1、DCase M13、DCaseC17及DCase C18，引物对m13分别和模板DCase M8、DCase M1、DCase C17及DCaseC18，引物对c17分别和模板DCase M8、DCase M13、DCase m1及DCase C18，引物对c18分别和模板DCase M8、DCase M13、DCase C17及DCase M1，引物对c17c18分别和模板DCase M8、DCase M13及DCase M1进行PCR(94℃，30S；55℃，30S；72℃，1min；30个循环扩增，胶回收DNA片段，MegaprimerPCR(94℃，30S；55℃，30；68℃，7min；18个循环)克隆至表达载体pET28-b(+)，电转化到E.coliBL21(E3)，构建一系列的饱和突变库，每个突变库包括一系列的突变体。
将突变体库中的转化子用牙签接种到含200μl LB培养基的96孔深孔培养板中，含100μg/ml卡那霉素，37℃培养过夜，加入IPTG，使IPTG的终浓度为0.8mM，继续37℃培养4小时后将培养物转移到96孔细胞板取出。将96孔细胞板置于-70℃冷冻1h，55℃热激5min，72℃热处理15min，转移到96孔板显色。取4μl经过高温失活处理的粗酶液加入到96孔显色反应液中(5g/L的NC-D-HPG，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.01％酚红，pH 5.8-6.0。)并置于37℃观察颜色变化，将颜色变化的突变子从对应的母板上检出。
突变体单菌落接种到4毫升试管LB培养基中，37度培养至OD600＝0.6的时候，进行IPTG诱导(终浓度0.8mM)。继续培养4小时后，8000rpm离心，收集菌体，菌体重悬于1ml的0.1M，pH8.0磷酸钠缓冲液中，超声波破碎(25×6秒)12000rpm离心30分钟。取上清做为稳定性分析的粗酶液。
粗酶液或纯化的酶液在不同的温度(50-82℃)保温15分钟后在50℃测定其剩余酶活。剩余酶活与初始酶活的比率为评价酶热稳定性的依据。
酶活测定
1％底物NC-D-HPG溶解到pH8.00.1M磷酸钠缓冲液。50μl酶液与400μl底物溶液混匀，50℃，120rpm转速条件下反应20分钟，加入等体积的10％盐酸终止酶促反应。反应液稀释10倍，12000rpm离心30分钟，取上清进行高效液相色谱(HPLC，Agilent Technologies 1100)分析，测定反应液中产物D-HPG的含量。1U酶活定义为每分钟产生1μmol D-HPG所需的酶量。HPLC测定条件：使用ZORBAXEclipseXDB-C8(4.6×150mm)柱子。以水∶甲醇∶1.29％乙酸＝85∶12∶3为流动相，流速为1.0ml/min，监测器波长设为230nm。
结果筛得以下突变体：
表4.罗雷斯顿菌CGMCC1596来源DCase突变体及其Tm
Figure GSA00000031782100121
其中突变组合N242G/A273P即突变体a9h(T263S/T262A/H248Q/Q23L/Q12L/N242G/A273P)的Tm比出发酶C18(T263S/T262A/H248Q/Q23L/Q12L/A273K)提高3℃，比初始酶M3提高17℃。
基于以上所述，本领域技术人员不难发现可对本发明进行多种改动和修改而不悖离本发明的核心和主旨。应当明白，此类显而易见的改动和修改皆属于权利要求所限定的本发明范围之内。此外，本发明通过对参考文献的援引将其中完整纳入，作为本发明说明书的实际公开内容。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心
<120>D-氨甲酰水解酶突变体
<130>096834
<160>26
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>912
<212>DNA
<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
<400>1
atgacacgtc agatgatact tgcagtggga caacaaggtc cgatcgcgcg cacggagaca  60
cgcgaacagg tcgtcgttcg tcttctcaac atgctgacgg aagccgcgag ccggggcgcg  120
aatttcattg tcttccccga actcgcgctt acgaccttct tcccgcgctg gcatttcacc  180
gacgaggccg agctcgatag cttctatgag accgaaatgc ccggcccggt ggtccgtcca  240
ctctttgaga aggccgcgga actcgggatc ggcttcaatc tgggctacgc tgaactcgtc  300
gtcgaaggcg gcgtcaagcg tcgcttcaac acgtccattt tggtggataa gtcaggcaag  360
atcgtcggca agtatcgtaa gatccatttg ccgggccaca aggagtacga ggcctaccgg  420
ccgttccagc atctcgaaaa gcgttatttc gagccgggcg atctcggctt cccggtctat  480
gacgtcgacg ccgcgaaaat ggggatgttc atctgcaacg atcgccgctg gcctgaagcc  540
tggcgggtga tgggcctcag gggcgccgag atcatctgcg gcggctacaa cacgccgacc  600
cacaatcccc ctgttcccca gcacgaccac ctgacgtcct tccaccatct cctatcgatg  660
caggccgggt cttatcagaa cggggcctgg tccgcggccg cgggcaaggt gggcatggag  720
gagaactgca tgctgctcgg ccagtcctgc atcgtggcgc cgaccgggga aatcgtcgct  780
ctcgctacga cgctggaaga cgaggtgatc accgccgccg tcgatctcga tcgctgccgg  840
gaactgcgtg aacacatctt caacttcaag cagcatcgtc agccccagca ctatggtctg  900
atcgcggaac tc                                                      912
<210>2
<211>304
<212>PRT
<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
<400>2
Met Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Ala
1               5                   10                  15
Arg Thr Glu Thr Arg Glu Gln Val Val Val Arg Leu Leu Asn Met Leu
            20                  25                  30
Thr Glu Ala Ala Ser Arg Gly Ala Asn Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu
        35                  40                  45
Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr Asp Glu Ala Glu
    50                  55                  60
Leu Asp Ser Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Val Val Arg Pro
65                  70                  75                  80
Leu Phe Glu Lys Ala Ala Glu Leu Gly Ile Gly Phe Asn Leu Gly Tyr
                85                  90                  95
Ala Glu Leu Val Val Glu Gly Gly Val Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser
            100                 105                 110
Ile Leu Val Asp Lys Ser Gly Lys Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile
        115                 120                 125
His Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His
    130                 135                 140
Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr
145                 150                 155                 160
Asp Val Asp Ala Ala Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg
                165                 170                 175
Trp Pro Glu Ala Trp Arg Val Met Gly Leu Arg Gly Ala Glu Ile Ile
            180                 185                 190
Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Pro Val Pro Gln His
        195                 200                 205
Asp His Leu Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser
    210                 215                 220
Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Met Glu
225                 230                 235                 240
Glu Asn Cys Met Leu Leu Gly Gln Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly
                245                 250                 255
Glu Ile Val Ala Leu Ala Thr Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala
            260                 265                 270
Ala Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His Ile Phe Asn
        275                 280                 285
Phe Lys Gln His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu Ile Ala Glu Leu
    290                 295                 300
<210>3
<211>912
<212>DNA
<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
<400>3
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cgcgaactgg tcgtcgttcg tcttctcaac atgctgacgg aagccgcgag ccggggcgcg    120
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gacgaggccg agctcgatag cttctatgag accgaaatgc ccggcccggt ggtccgtcca    240
ctctttgaga aggccgcgga actcgggatc ggcttcaatc tgggctacgc tgaactcgtc    300
gtcgaaggcg gcgtcaagcg tcgcttcaac acgtccattt tggtggataa gtcaggcaag    360
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ccgttccagc atctcgaaaa gcgttatttc gagccgggcg atctcggctt cccggtctat    480
gacgtcgacg ccgcgaaaat ggggatgttc atctgcaacg atcgccgctg gcctgaagcc    540
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cacaatcccc ctgttcccca gcacgaccac ctgacgtcct tccaccatct cctatcgatg    660
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gagaactgca tgctgctcgg ccaatcctgc atcgtggcgc cgaccgggga aatcgtcgct    780
ctcgcttcga cgctggaaga cgaggtgatc accgccgccg tcgatctcga tcgctgccgg    840
gaactgcgtg aacacatctt caacttcaag cagcatcgtc agccccagca ctatggtctg    900
atcgcggaac tc                                                        912
<210>4
<211>304
<212>PRT
<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
<400>4
Met Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Leu Gly Pro Ile Ala
1               5                   10                  15
Arg Thr Glu Thr Arg Glu Leu Val Val Val Arg Leu Leu Asn Met Leu
            20                  25                  30
Thr Glu Ala Ala Ser Arg Gly Ala Asn Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu
        35                  40                  45
Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr Asp Glu Ala Glu
    50                  55                  60
Leu Asp Ser Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Val Val Arg Pro
65                  70                  75                  80
Leu Phe Glu Lys Ala Ala Glu Leu Gly Ile Gly Phe Asn Leu Gly Tyr
                85                  90                  95
Ala Glu Leu Val Val Glu Gly Gly Val Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser
            100                 105                 110
Ile Leu Val Asp Lys Ser Gly Lys Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile
        115                 120                 125
His Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His
    130                 135                 140
Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr
145                 150                 155                 160
Asp Val Asp Ala Ala Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg
                165                 170                 175
Trp Pro Glu Ala Trp Arg Val Met Gly Leu Arg Gly Ala Glu Ile Ile
            180                 185                 190
Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Pro Val Pro Gln His
        195                 200                 205
Asp His Leu Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser
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Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Met Glu
225                 230                 235                 240
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                245                 250                 255
Glu Ile Val Ala Leu Ala Ser Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala
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Ala Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His Ile Phe Asn
        275                 280                 285
Phe Lys Gln His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu Ile Ala Glu Leu
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<210>5
<211>912
<212>DNA
<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
<400>5
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gacgtcgacg ccgcgaaaat ggggatgttc atctgcaacg atcgccgctg gcctgaagcc    540
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ctcgcttcga cgctggaaga cgaggtgatc accgccgccg tcgatctcga tcgctgccgg    840
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<212>PRT
<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
<400>6
Met Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Leu Gly Pro Ile Ala
1               5                   10                  15
Arg Thr Glu Thr Arg Glu Leu Val Val Val Arg Leu Leu Asn Leu Leu
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        35                  40                  45
Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr Asp Glu Ala Glu
    50                  55                  60
Leu Asp Ser Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Val Val Arg Pro
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                85                  90                  95
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<210>7
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<212>DNA
<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
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<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
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<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
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<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
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<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
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<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
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<210>16
<211>304
<212>PRT
<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
<400>16
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1               5                   10                  15
Arg Thr Glu Thr Arg Glu Leu Val Val Val Arg Leu Leu Asn Leu Leu
            20                  25                  30
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        35                  40                  45
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Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Met Glu
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<210>17
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<212>DNA
<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
<400>17
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<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
<400>18
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<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
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<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
<400>20
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<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
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Ile Leu Val Asp Lys Ser Gly Lys Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile
        115                 120                 125
His Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His
    130                 135                 140
Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr
145                 150                 155                 160
Asp Val Asp Ala Ala Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg
                165                 170                 175
Trp Pro Glu Ala Trp Arg Val Met Gly Leu Arg Gly Ala Glu Ile Ile
            180                 185                 190
Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Pro Val Pro Gln His
        195                 200                 205
Asp His Leu Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser
    210                 215                 220
Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Met Glu
225                 230                 235                 240
Glu Gly Cys Met Leu Leu Gly Gln Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly
                245                 250                 255
Glu Ile Val Ala Leu Ala Ser Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala
            260                 265                 270
Lys Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His Ile Phe Asn
        275                 280                 285
Phe Lys Gln His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu Ile Ala Glu Leu
     290                 295                 300
<210>25
<211>912
<212>DNA
<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
<400>25
atgacacgtc agatgatact tgcagtggga caacaaggtc cgatcgcgcg cacggagaca    60
cgcgaacagg tcgtcgttcg tcttctcaac atgctgacgg aagccgcgag ccggggcgcg    120
aatttcattg tcttccccga actcgcgctt acgaccttct tcccgcgctg gcatttcacc    180
gacgaggccg agctcgatag cttctatgag accgaaatgc ccggcccggt ggtccgtcca    240
ctctttgaga aggccgcgga actcgggatc ggcttcaatc tgggctacgc tgaactcgtc    300
gtcgaaggcg gcgtcaagcg tcgcttcaac acgtccattt tggtggataa gtcaggcaag    360
atcgtcggca agtatcgtaa gatccatttg ccgggccaca aggagtacga ggcctaccgg    420
ccgttccagc atctcgaaaa gcgttatttc gagccgggcg atctcggctt cccggtctat    480
gacgtcgacg ccgcgaaaat ggggatgttc atctgcaacg atcgccgctg gcctgaagcc    540
tggcgggtga tgggcctcag gggcgccgag atcatctgcg gcggctacaa cacgccgacc    600
cacaatcccc ctgttcccca gcacgaccac ctgacgtcct tccaccatct cctatcgatg    660
caggccgggt cttatcagaa cggggcctgg tccgcggccg cgggcaaggt gggcatggag    720
gagaactgca tgctgctcgg ccactcctgc atcgtggcgc cgaccgggga aatcgtcgct    780
ctcactacga cgctggaaga cgaggtgatc accgccgccg tcgatctcga tcgctgccgg    840
gaactgcgtg aacacatctt caacttcaag cagcatcgtc agccccagca ctatggtctg    900
atcgcggaac tc                                                        912
<210>26
<211>304
<212>PRT
<213>皮氏罗雷斯顿菌(Ralstonia pickettii)
<400>26
Met Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Ala
1               5                   10                  15
Arg Thr Glu Thr Arg Glu Gln Val Val Val Arg Leu Leu Asn Met Leu
            20                  25                  30
Thr Glu Ala Ala Ser Arg Gly Ala Asn Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu
        35                  40                  45
Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr Asp Glu Ala Glu
    50                  55                  60
Leu Asp Ser Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Val Val Arg Pro
65                  70                  75                  80
Leu Phe Glu Lys Ala Ala Glu Leu Gly Ile Gly Phe Asn Leu Gly Tyr
                85                  90                  95
Ala Glu Leu Val Val Glu Gly Gly Val Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser
            100                 105                 110
Ile Leu Val Asp Lys Ser Gly Lys Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile
        115                 120                 125
His Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His
    130                 135                 140
Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr
145                 150                 155                 160
Asp Val Asp Ala Ala Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg
                165                 170                 175
Trp Pro Glu Ala Trp Arg Val Met Gly Leu Arg Gly Ala Glu Ile Ile
            180                 185                 190
Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Pro Val Pro Gln His
        195                 200                 205
Asp His Leu Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser
    210                 215                 220
Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Met Glu
225                 230                 235                 240
Glu Asn Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly
                245                 250                 255
Glu Ile Val Ala Leu Thr Thr Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala
            260                 265                 270
Ala Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His Ile Phe Asn
        275                 280                 285
Phe Lys Gln His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu Ile Ala Glu Leu
    290                 295                 300

Claims (14)

1.一种D-氨甲酰水解酶突变体，其特征在于，所含突变包括D-氨甲酰水解酶的第262位和第248位上的氨基酸被取代，且所述突变体具有D-氨甲酰水解酶活性，其热稳定性高于取代前。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，第262位氨基酸是丙氨酸或其保守性取代，第248位是谷氨酰胺或其保守性取代。
3.如权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，还含有第263位、第23位和第12位上的氨基酸取代。
4.如权利要求3所述的突变体，其特征在于，第263位是丝氨酸或其保守性取代、第23位是亮氨酸或其保守性取代，第12位是亮氨酸或其保守性取代。
5.如权利要求3所述的突变体，其特征在于，还含有以下位点的取代：第31位、第207位、第242位、第271位、第273位，或它们的组合。
6.如权利要求5所述的突变体，其特征在于，所述组合是：第31位和第207位，第271位和第273位，第242位和第207位，第31位和第242位，第242位和第273位。
7.如权利要求5或6所述的突变体，其特征在于，第31位是亮氨酸或其保守性取代第207位是谷氨酸或其保守性取代，第242位是甘氨酸或其保守性取代，第271位是异亮氨酸、亮氨酸或它们的保守性取代，第273位是赖氨酸、精氨酸、脯氨酸或它们的保守性取代。
8.如权利要求1-7中任一项所述的突变体，其特征在于，它是源于皮氏罗雷斯顿菌CGMCC1596、土壤杆菌KNK712、放射土壤杆菌NRRL B11291或土壤杆菌IPI-671的D-氨甲酰水解酶的突变体。
9.如权利要求1-8中任一项所述的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24所示。
10.一种核酸分子，其编码权利要求1-9中任一项所述的D-氨甲酰水解酶突变体，或与编码权利要求1-9中任一项所述的D-氨甲酰水解酶突变体的核酸分子互补。
11.如权利要求10所述的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23所示，或者是SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23所示序列的互补序列。
12.一种载体，含有权利要求10或11所述的核酸分子。
13.一种宿主细胞，含有权利要求10或11所述的核酸分子。
14.一种生产D-对羟基苯甘氨酸的方法，包括用D-海因酶和权利要求1-9中任一项所述的D-氨甲酰水解酶突变体水解混旋型对羟基苯海因。
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