CN102145036B - 一种中药冻干注射剂定性的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种中药组合物冻干注射剂中多种组分含量的测定方法，本发明中药冻干注射剂原料包括人参和淫羊藿，临床用于运动神经元疾病(肌萎缩侧索硬化症、进行性脊肌萎缩症、进行性延髓麻痹、原发性侧索硬化症)、进行性肌营养不良症、先天性肌病等疾病所致的肌肉萎缩及重症肌无力的治疗，本发明方法采用高效液相色谱法进行指纹图谱测定，用于产品定性质量控制。

Description

一种中药冻干注射剂定性的测定方法

技术领域

本发明涉及一种中药冻干注射剂定性的测定方法，属于药物制剂分析技术领域。

背景技术

中药冻干注射剂在质量标准上，要求控制的项目比较多，其中，指纹图谱的定性是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。目前，中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和高效毛细管电泳法(HPCE)等色谱法以及紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、质谱法(MS)、核磁共振法(NMR)和X-射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点；中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且积累较丰富的应用经验。因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。

CN1785223A公开了一种治疗肌肉萎缩及重症肌无力的药物及其制备方法，该专利公开了该药物的组方、制剂以及胶囊、片剂等制备方法；该专利还公开了该药物的药效学实验，证实该药物具有增强正常运动神经元活力，促进神经突起生长，又能保护兴奋性氨基酸毒性损伤运动神经元，减少细胞凋亡，在维持中枢神经系统功能，延缓病情发展，提高患者生存质量方面具有重要的临床应用价值；该专利还公开了其中人参提取物的制备方法，“取人参药材，用60-90％乙醇提取1-3次，第1次加药材8-12倍量溶剂提取1-2小时，第2次加6-10倍量溶剂提取1-2小时，第3次加6-10倍量溶剂提取0.5-1小时；合并上述提取液，趁热滤过，减压回收乙醇，并浓缩，放入不锈钢桶内，加纯水搅拌均匀，冷藏24-36h；将冷藏液取出，放至常温，板框过滤器过滤，用少量水洗涤板框，滤液加纯水稀释，备用；取人参浓缩药液通过处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱，并分别用pH值8-9的氨水、20％乙醇、80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液。将80％洗脱液加入纯水，配成50％醇溶液，通过中性氧化铝柱，收集洗脱液，再用少量50％乙醇洗涤柱子，合并洗脱液备用；取药液加入活性炭，回流加热，煮沸20min，趁热板框抽滤，收集滤液，浓缩，冷藏过夜；澄清板过滤，减压干燥，即得人参提取物。”该人参提取物即为人参总皂苷提取物；该专利还公开了淫羊藿提取物的提取方法，“取淫羊藿药材，加水煎煮提取2-5次，加水量为10-30倍，第一次提取时间定为0.5-2h，以后3次为0.5-1h；合并上述提取液，趁热滤过，减压浓缩，放入不锈钢桶内，加乙醇至药液含醇浓度为70％，冷藏；过滤，滤液回收乙醇并浓缩，加水搅拌均匀，冷藏，过滤，备用；取淫羊藿药液通过处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱，并分别用纯水、20％乙醇、50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液；洗脱液拌入适量硅藻土混匀，用无水乙醇提取2-5次，提取液合并，回收乙醇并浓缩，浓缩液加入丙酮，并搅拌均匀，冷藏，过滤，沉淀加丙酮再同前处理2次，合并3次滤液，回收溶剂，并浓缩，减压干燥，即得淫羊藿提取物。”该淫羊藿提取物即为淫羊藿总黄酮提取物。该专利未公开冻干注射剂制备及其质量控制的测定方法。

由CN1785223A公开的技术内容，可以看出，该中药组合物包括的原料包含淫羊藿总黄酮提取物和人参总皂苷提取物。

本专利申请即是在CN1785223A的基础上做了进一步的研发，在研制该中药组合物的冻干注射剂的基础上，制定了该中药冻干注射剂定性的鉴别的测定方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种中药冻干注射剂定性的测定方法。

本发明所述中药冻干注射剂是由如下重量份比例的原料制成：

人参总皂苷提取物30-70  淫羊藿总黄酮提取物20-60。

本发明采用高效液相色谱法，测定本发明所述中药冻干注射剂的指纹图谱，用于本发明所述中药冻干注射剂的定性表征。本发明建立了所述中药冻干注射剂的指纹图谱测定方法，建立该中药指纹图谱将能较为全面地反映本发明所述中药冻干注射剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价，以确保其安全有效。

本发明测定方法中，液相色谱条件优选如下：

液相色谱条件：色谱柱为C18柱；流动相：A为水，B为乙腈；流速为1mL/min；梯度如下：0-23分钟，A为80％、23-40分钟，A由80％匀速降至65％、40-51分钟，A由65％匀速降至20％、51-62分钟，A由20％匀速降至0％、62-68分钟，A为0％、68-75分钟，A由0％匀速升至80％、75-85分钟，A为80％；检测器蒸发光检测器，气体压力为25psi，漂移管温度为75℃，加热级别66％；

供试品溶液的制备精密称取本发明中药冻干注射剂内容物0.50g，50％乙腈充分溶解，定容到25ml量瓶中，即得；

测定法分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明所述测定方法中色谱条件中：柱温优选为25℃；流动相流速优选为1mL/min；色谱柱优选为ES-C18柱。

本发明检测方法所检测的本发明所述中药冻干注射剂的原料重量比例优选为：

人参总皂苷提取物35  淫羊藿总黄酮提取物55。

还优选为：

人参总皂苷提取物65  淫羊藿总黄酮提取物25。

或者：

人参总皂苷提取物50  淫羊藿总黄酮提取物40。

为证实本发明方法可行性，发明人进行了如下的验证试验：

1、样品制备：

人参总皂苷提取物50克  淫羊藿总黄酮提取物40克

制备方法：

a、将800克羟丙基-β-环糊精加水4000ml溶解制成20％的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水750ml(5.33％)加热溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温80℃±1℃，动态搅拌包合，包合时间3小时，将人参总皂苷提取物加水100ml(50％)加热溶解，加入包合液中，继续包合1小时；

b、加水调节溶液总量至6000ml，用10％的氢氧化钠溶液调节PH到7.5，加入活性炭24克(即含活性炭0.4％)，煮沸10分钟，趁热用澄清板框过滤，滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；

c、105℃热压灭菌30分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至15ml西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-40℃预冻3小时；

d、按照预冻条件，在真空度为0.05Pa状态下，从-40℃至0℃升温升华28小时，再从0℃至30℃升温干燥4.5小时；

e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。

2、方法学验证

2.1仪器与试药Waters2695-2420型高效液相色谱仪(包括四元泵、在线脱气机、蒸发光检测器、柱温箱、100μl进样阀、化学工作站等，waters公司)。

人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd对照品；朝霍定A、朝霍定B、朝霍定C和淫羊藿苷对照品；乙腈(色谱纯)；水(超纯水)；其余试剂均为分析纯。

2.2色谱条件选择

2.2.1流动相的选择试验过程中，考察了多种流动相比例和组成，最终确定表1中的流动相条件，结果表明该条件的色谱峰分离效果好、保留时间适中。

表1乙腈-水系统梯度洗脱的时间、比例和流速

2.2.2检测器选择先后比较了多波长紫外检测器、PDA检测器、蒸发光检测器，由于人参皂苷类成分紫外响应值低且易受基线波动干扰，故选择采用蒸发光检测器，并将其参数设置为气体压力为25psi，漂移管为75℃，加热级别66％。

2.2.3气体压力和漂移管温度考察

先后考察了气体压力20psi、25psi和30psi，漂移管温度60℃、75℃和85℃，所得图谱见图1，比较可以看出在气体压力为25psi，漂移管为75℃时，各峰分离较好，而且基线平滑波动小，因此选择该条件作为成品指纹图谱蒸发光检测器的检测条件。

2.2.4柱温选择按上述流动相比例，考察20℃、25℃、30℃和35℃下的图谱，结果见图2。由色谱图可知，柱温对峰的分离及峰形影响不大，考虑实际分离情况和柱子使用寿命考虑，确定柱温为30℃。

2.2.5色谱柱选择考察不同厂家，不同规格的色谱柱，分别为WatersSymmetry C18、Agilent Eclipse ZORBAX XDB C18和ES-C18，规格均为4.6mm×250mm，5μm，结果见图3。由色谱图可知，不同色谱柱对峰的分离及峰形存在差异，经比较，选择色谱柱型号为ES-C18(4.6mm×250mm，5μm)。

2.3参照物的选择及参照物溶液的制备

人参皂苷Rb1为人参中的主要成分之一，且它的相对峰面积比较大，易于辨认和购得，因此选择人参皂苷Rb1为本发明所述中药冻干注射剂成品色谱指纹图谱的参照物。精密称取人参皂苷Rb1对照品5.30mg置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.4供试品溶液制备方法考察先后考察了水、含水甲醇、含水乙腈为溶剂，其中以50％乙腈制备的样品，峰的分离、峰形及基线均良好。因此确定50％乙腈为溶剂。供试品溶液的制备方法为取本发明所述中药冻干注射剂内容物0.50g，精密称定，置25ml量瓶中，加50％乙腈溶解并稀释定容至刻度，摇匀，即得。

2.5精密度考察取本发明所述冻干注射剂内容物，按“供试品溶液制备方法考察”制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液，连续进样5次，每次进样10μl，按上述色谱条件检测，记录各色谱峰保留时间和积分面积，以人参皂苷Rb1峰为参照物峰，计算各共有指纹峰的相对保留时间(α)和大于总峰面积10％的共有指纹峰峰面积比值(RA)，结果见表2、3。

表2共有指纹峰的相对保留时间(α)精密度试验结果

表3共有指纹峰峰面积比值(RA)精密度试验结果

由表中可知，各共有指纹峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD均小于3％，表明方法精密度良好。

2.6重现性考察取本发明所述冻干注射剂内容物5份，按“供试品溶液制备方法考察”制备供试品溶液，分别精密吸取10μl，注入液相仪，按上述色谱条件检测，记录各色谱峰保留时间和积分面积，以人参皂苷Rb1峰为参照物峰，计算各共有指纹峰的相对保留时间(α)和大于总峰面积10％的共有指纹峰峰面积比值(RA)，结果见表4、5。

表4共有指纹峰的相对保留时间(α)重现性试验结果

表5共有指纹峰峰面积比值(RA)重现性试验结果

由表中可知，各共有指纹峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD均小于3％，表明方法重现性良好。

2.7稳定性考察取本发明所述冻干注射剂内容物，按“供试品溶液制备方法考察”制备供试品溶液，精密吸取10μl，分别在0、2、4、6、8和12小时注入液相色谱仪，按上述色谱条件检测，记录各色谱峰保留时间和积分面积，以人参皂苷Rb1峰为参照物峰，计算各共有指纹峰的相对保留时间(α)和大于总峰面积10％的共有指纹峰峰面积比值(RA)，结果见表6、7。

表6共有指纹峰的相对保留时间(α)稳定性试验结果

表7共有指纹峰峰面积比值(RA)稳定性试验结果

由表中可知，各共有指纹峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD均小于3％，表明方法重现性良好。

2.8相关性考察

精密称取人参总皂苷提取物中间体07080120.30mg、070802批20.30mg和070803批20.47mg用50％乙腈溶解并定容到10ml量瓶中，备用；精密称取淫羊藿总黄酮提取物070701批0.2059g、070702批0.2007g和070703批0.2030g，20％乙腈溶解并定容到50ml量瓶中，备用；称取人参药材细粉1g3份置50ml平底烧瓶中，分别加甲醇回流每次20ml，回流30分钟，共回流两次，置蒸发皿中水浴蒸干，再用10ml蒸馏水转移到分液漏斗中，水饱和正丁醇萃取3次，每次20ml，合并正丁醇萃取液约60ml，用2％NaOH洗涤2次，每次20ml，用水20ml洗2次，正丁醇层置蒸发皿中，在水浴上蒸干，用50％乙腈溶解到5ml量瓶中定容，备用；称取淫羊藿粉末0.2g3批置50ml三角瓶中，加入稀乙醇20ml，浸泡30分钟，超声提取60分钟，用稀乙醇补足重量，过滤，取续滤液，备用。按照本发明色谱条件将上述样品进行液相测定，所得相关性图谱，见图4。

2.9指纹图谱及各项技术参数通过对本发明中药冻干注射剂内容物10批，批号为20070903a(S1)、20070903b(S2)、20070904a(S3)、20080101(S4)、20080102(S5)、20080103(S6)、20080301(S7)、20080401(S8)、20080901(S9)、20081201(S10)的供试品溶液，按上述色谱条件进行测定分析，参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》制定指纹图谱及各项技术参数。采用国家药典委员会2004版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》进行相似度计算，结果见表5

表5本发明所述中药冻干注射剂10批样品指纹图谱相似度计算结果

由表中数据可知，10批样品的色谱图相似度都在0.9以上，表明在该条件下，本发明所述中药冻干注射剂10批样品(S1-S10)有较好的峰形和一致性。

共有指纹峰的指认：以本发明所述冻干注射剂内容物10批样品为研究对象，对10个共有指纹峰进行了研究。在相同的色谱条件下，分别测定了人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2和人参皂苷Rd，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷，保留时间均能与共有指纹峰相对应。因此10个共有指纹峰分别指认为1(人参皂苷Rg1)、2(人参皂苷Re)、3(朝藿定A)、4(朝藿定B)、5(朝藿定C)、6(淫羊藿苷)、7(人参皂苷Rb1)、8(人参皂苷Rc)、9(人参皂苷Rb2)、10(人参皂苷Rd)，见图5标示。

3、结论

由上述实验可见，该方法用于本发明所述冻干注射剂的定性质量控制灵敏、精密，且重现性和相关性较好，符合中药注射剂质量控制指导原则，可以用于本发明所述冻干注射剂的定性质量控制。

附图说明：

图1气体压力和漂移管温度选择色谱图

图2柱温选择色谱图

图3色谱柱选择色谱图

图4相关性图谱

图5共有指纹峰的指认色谱图

图6实施例1指纹图谱图

图7实施例2指纹图谱图

图8实施例3指纹图谱图

图9实施例4指纹图谱图

图10实施例5指纹图谱图

具体实施方式

下述实施例用于举例说明本发明中药冻干注射液的制备，但其不能对本发明的范围构成任何限制。

实施例1

原料重量比例：

人参总皂苷提取物50克  淫羊藿总黄酮提取物40克

制备方法：

a、将800克羟丙基-β-环糊精加水4000ml溶解制成20％的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水750ml(5.33％)加热溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精800溶液中，保温80℃±1℃，动态搅拌包合，包合时间3小时，将人参总皂苷提取物加水100ml(50％)加热溶解，加入包合液中，继续包合1小时；

b、加水调节溶液总量至6000ml，用10％的氢氧化钠溶液调节PH到7.5，加入活性炭24克(即含活性炭0.4％)，煮沸10分钟，趁热用澄清板框过滤，滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；

c、105℃热压灭菌30分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至15ml西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-40℃预冻3小时；

d、按照预冻条件，在真空度为0.05Pa状态下，从-40℃至0℃升温升华28小时，再从0℃至30℃升温干燥4.5小时；

e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。

检测方法：

液相色谱条件：色谱柱为ES-C18柱；柱温为25℃；流动相：A为水，B为乙腈；流动相流速为1mL/min；梯度如下：0-23分钟，A为80％、23-40分钟，A由80％匀速降至65％、40-51分钟，A由65％匀速降至20％、51-62分钟，A由20％匀速降至0％、62-68分钟，A为0％、68-75分钟，A由0％匀速升至80％、75-85分钟，A为80％；检测器为蒸发光检测器，气体压力为25psi，漂移管温度为75℃；

供试品溶液的制备精密称取本发明中药冻干注射剂内容物0.50g，50％乙腈充分溶解，定容到25ml量瓶中，即得；

测定法分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，结果见图6。

实施例2

原料重量比例：

人参总皂苷提取物35克  淫羊藿总黄酮提取物55克

制备方法：

a、将900克羟丙基-β-环糊精加水3000ml溶解制成30％的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水1800ml(3.11％)溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温50±1℃，动态搅拌包合，包合时间8小时，将人参总皂苷提取物加水105ml(33.3％)加热溶解，加入包合液中，继续包合2小时；

b、加水调节溶液总量至6000ml，用20％的氢氧化钠溶液调节PH到6.2，加入活性炭6克(含活性炭0.1％)，煮沸10分钟，趁热用砂滤棒过滤，滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；

c、105℃热压灭菌15分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至10ml西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-20℃预冻5小时；

d、按照预冻条件，在真空度为0.5Pa状态下，从预冻温度至0℃升温升华35小时，再从0℃至30℃升温干燥8小时；

e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。

检测方法：

液相色谱条件：色谱柱为C18柱；流动相：A为水，B为乙腈；梯度如下：0-23分钟，A为80％、23-40分钟，A由80％匀速降至65％、40-51分钟，A由65％匀速降至20％、51-62分钟，A由20％匀速降至0％、62-68分钟，A为0％、68-75分钟，A由0％匀速升至80％、75-85分钟，A为80％；检测器为蒸发光检测器，气体压力为25psi，漂移管温度为75℃；

供试品溶液的制备精密称取本发明中药冻干注射剂内容物0.50g，50％乙腈充分溶解，定容到25ml量瓶中，即得；

测定法分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，结果见图7。

实施例3

原料重量比例：

人参总皂苷提取物65克  淫羊藿总黄酮提取物25克比例？

制备方法：

a、将650克羟丙基-β-环糊精加水4000溶解制成16.3％的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水250ml(10％)加热溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温90℃±1℃，动态搅拌包合，包合时间3小时，将人参总皂苷提取物加水130ml(50％)加热溶解，加入包合液中，继续包合1小时；

b、加水调节溶液总量至6000ml，用5％的氢氧化钠溶液调节PH到8.5，加入活性炭30克(含活性炭0.5％)，煮沸6分钟，趁热抽滤，滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；

c、105℃热压灭菌10分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-30℃预冻4.5小时；

d、按照预冻条件，在真空度为0.1Pa状态下，从预冻温度至0℃升温升华25小时，再从0℃至30℃升温干燥6小时；

e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。

检测方法：

液相色谱条件：色谱柱为色谱柱为ES-C18柱；柱温为室温；流动相：A为水，B为乙腈；流动相流速为0.81mL/min；梯度如下：0-23分钟，A为80％、23-40分钟，A由80％匀速降至65％、40-51分钟，A由65％匀速降至20％、51-62分钟，A由20％匀速降至0％、62-68分钟，A为0％、68-75分钟，A由0％匀速升至80％、75-85分钟，A为80％；检测器为蒸发光检测器，气体压力为25psi，漂移管温度为75℃；

供试品溶液的制备精密称取本发明中药冻干注射剂内容物0.50g，50％乙腈充分溶解，定容到25ml量瓶中，即得；

测定法分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，结果见图8。

实施例4

原料重量比例：

人参总皂苷提取物45克淫羊藿总黄酮提取物35克

制备方法：

a、将700克羟丙基-β-环糊精加水2800ml溶解制成25％的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水1000ml(3.5％)溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温60℃±1℃，动态搅拌包合，包合时间4小时，将人参总皂苷提取物加水150ml(30％)加热溶解，加入包合液中，继续包合1.5小时；

b、加水调节溶液总量至6000ml，用15％的氢氧化钠溶液调节PH到6，加入活性炭18克(含活性炭0.3％)，煮沸25分钟，趁热滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；

c、105℃热压灭菌20分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-25℃预冻4小时；

d、按照预冻条件，在真空度为0.45Pa状态下，从预冻温度至0℃升温升华30小时，再从0℃至30℃升温干燥6.5小时；

e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。

检测方法：

液相色谱条件：色谱柱为C18柱；柱温为35℃；流动相：A为水，B为乙腈；流动相流速为1.2mL/min；梯度如下：0-23分钟，A为80％、23-40分钟，A由80％匀速降至65％、40-51分钟，A由65％匀速降至20％、51-62分钟，A由20％匀速降至0％、62-68分钟，A为0％、68-75分钟，A由0％匀速升至80％、75-85分钟，A为80％；检测器为蒸发光检测器，气体压力为25psi，漂移管温度为75℃；

供试品溶液的制备精密称取本发明中药冻干注射剂内容物0.50g，50％乙腈充分溶解，定容到25ml量瓶中，即得；

测定法分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，结果见图9。

实施例5

原料重量比例：

人参总皂苷提取物60  淫羊藿总黄酮提取物50  羟丙基-β-环糊精700

制备方法：

a、将羟丙基-β-环糊精加水4000ml溶解制成17.5％的溶液，将淫羊藿总黄酮提取物加水1500(3.33％)溶解，分次缓慢加入羟丙基-β-环糊精溶液中，保温85℃，动态搅拌包合，包合时间8小时，将人参总皂苷提取物加水150ml(40％)溶解，加入包合液中，继续包合1小时；

b、加水调节溶液总量至6000ml，用8％的氢氧化钠溶液调节PH到7.5，加入活性炭24克(含活性炭0.4％)，煮沸10分钟，趁热滤除活性炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，用水定容至6000ml；

c、105℃热压灭菌30分钟，取出，放至常温，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装至西林瓶，每支6ml，半压塞，置冻干机中，-35℃预冻3.5小时；

d、按照预冻条件，在真空度为0.05Pa状态下，从预冻温度至0℃升温升华35小时，再从0℃至30℃升温干燥8小时；

e、在升华和干燥的真空状态下压塞，出箱，压铝盖，灯检，包装。

检测方法：

液相色谱条件：色谱柱为ES-C18柱；柱温为20℃；流动相：A为水，B为乙腈；流动相流速为1.1mL/min；梯度如下：0-23分钟，A为80％、23-40分钟，A由80％匀速降至65％、40-51分钟，A由65％匀速降至20％、51-62分钟，A由20％匀速降至0％、62-68分钟，A为0％、68-75分钟，A由0％匀速升至80％、75-85分钟，A为80％；检测器为蒸发光检测器，气体压力为25psi，漂移管温度为75℃；

供试品溶液的制备精密称取本发明中药冻干注射剂内容物0.50g，50％乙腈充分溶解，定容到25ml量瓶中，即得；

测定法分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，结果见图10。

Claims (6)

1.一种中药冻干注射剂定性的测定方法，该中药冻干注射剂是由30-70重量份的人参总皂苷提取物和20-60重量份的淫羊藿总黄酮提取物制成，其特征在于该方法采用高效液相色谱法测定其指纹图谱，色谱条件为：

液相色谱条件：色谱柱为C18柱；流动相：A为水，B为乙腈；梯度如下：0-23分钟，A为80％、23-40分钟，A由80％匀速降至65％、40-51分钟，A由65％匀速降至20％、51-62分钟，A由20％匀速降至0％、62-68分钟，A为0％、68-75分钟，A由0％匀速升至80％、75-85分钟，A为80％；检测器为蒸发光检测器，气体压力为25psi，漂移管温度为75℃，加热级别66％；

供试品溶液的制备 精密称取本发明中药冻干注射剂内容物0.50g，50％乙腈充分溶解，定容到25ml量瓶中，即得；

测定法 分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述色谱条件的柱温为25℃；流动相流速为1mL/min；色谱柱为ES-C18柱。

3.根据权利要求1和2任一项所述的测定方法，其特征在于所述中药冻干注射剂原料的重量比例如下：

人参总皂苷提取物35    淫羊藿总黄酮提取物55。

4.根据权利要求1和2任一项所述的测定方法，其特征在于所述中药冻干注射剂原料的重量比例如下：

人参总皂苷提取物65    淫羊藿总黄酮提取物25。

5.根据权利要求1和2任一项所述的测定方法，其特征在于所述中药冻干注射剂原料的重量比例如下：

人参总皂苷提取物50    淫羊藿总黄酮提取物40。

6.根据权利要求1和2任一项所述的测定方法，其特征在于液相色谱条件中的色谱柱为ES-C18柱。

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