CN102136042A

CN102136042A - Yap-tead蛋白复合物的三维结构及其应用

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Publication number: CN102136042A
Application number: CN2010101009344A
Authority: CN
Inventors: 徐彦辉; 李泽; 管坤良
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-01-26
Filing date: 2010-01-26
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2030-01-26
Also published as: CN102136042B

Abstract

本申请涉及药物筛选领域。本申请涉及YAP-TEAD蛋白复合物的三维结构及其在设计和筛选抑制YAP与TEAD结合、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的先导化合物，进而用于筛选治疗或预防癌症小分子化合物中的用途。

Description

YAP-TEAD蛋白复合物的三维结构及其应用

技术领域

本申请涉及药物筛选领域。本申请涉及YAP-TEAD蛋白复合物的三维结构及其在设计和筛选抑制YAP与TEAD结合、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的先导化合物，进而用于筛选治疗或预防癌症小分子化合物的用途。

背景技术

至2002年止，世界人口已经超过6,000,000,000，有1,090,000癌症新增病例，670,000人死于癌症，2,240,000名患者通过诊断治疗而存活下来。2002年的世界死亡人口数为55,000,000，其中31％死于心脏疾病，12-13％死于癌症，由此可见，癌症早已是世界第二大死亡原因。预计到2020年，世界人口将达到7,500,000,000，预计会有1,500,000,000癌症新增病例；1,200,000,000名患者将死于癌症。在2002年，世界范围发病率最高的，除皮肤癌外，肺癌(12.3％)、乳腺癌(10.4％)、结肠癌(9.4％)。和卵巢癌，它们是最常见的导致死亡的恶性肿瘤(1，2)。

1900年时，美国因患癌症死亡的人数率小于总死亡人数的4％，那时癌症排在死亡原因第六位；到1940年，癌症上升到死亡原因的第二位，死于癌症的人占总死亡人数的11％；在2003年，有556,902例癌症死亡病例，占总死亡人数的22.7％。从1999年的统计来看，年龄小于85岁的人死于癌症的可能性大于心血管类疾病；年龄大于85岁的人死于心脏疾病的可能性是死于癌症的4倍。

在2004年，前列腺癌、肺癌、结肠癌占男性癌症患者中56％，是男性患者中致死率较高的前三位；乳腺癌、肺癌和结肠癌占女性癌症患者的54％，是女性患者中致死率较高的前三位。

癌症研究经过半个世纪的突飞猛进，已成为一个丰富和复杂的知识体系，揭示出癌症是一种在基因水平发生变化的疾病：癌基因由于突变获得新功能：抑癌基因由于突变丧失功能。科学家已从动物和人类肿瘤细胞中鉴定出很多癌基因和抑癌基因。一系列证据表明，人类肿瘤发生是一个多步骤过程，每一步都可能蕴藏着基因突变—驱使人体正常细胞逐步转变成恶性肿瘤细胞。要完成这种恶性转变，细胞需要具备六种能力(2)：自给自足生长因子，对生长抑制因子不敏感，逃避凋亡，无限增殖，持续的血管发生，侵略组织和转移。

体内和体外培养的上皮细胞，待生长至细胞与细胞之间或细胞与基底之间相接触时，细胞会发生接触抑制，停止生长(5)。接触抑制使细胞会合后停止增值，但人类大部分肿瘤细胞能够抗拒接触抑制。虽然癌细胞与邻近的细胞和基底互相接触，但它们仍能继续分裂增殖。随着进一步恶化，分裂的癌细胞能够侵略到周围组织，继续无限生长，最终形成次级病灶。许多癌细胞系在体外培养都能抗拒接触抑制，在软琼脂上锚定非依赖性生长。丧失接触抑制和锚定非依赖性生长，是癌细胞体外培养的标志之一(6)。很多原癌基因突变能使细胞脱离接触抑制，或者使细胞接触抑制信号通路中断，细胞生长不受限制。

最初发现Hippo信号通路是调控果蝇器官大小的关键信号通路。后期进一步阐明，Hippo通路通过促进细胞凋亡和限制细胞增殖，调控组织器官的发育过程。果蝇中Hippo信号通路的早期研究工作为后续该通路在哺乳动物中的研究奠定了初步的基础。最新研究表明，在哺乳动物中Hippo信号通路能够调节细胞的接触性抑制，调控器官的大小和控制癌症的发生(7，8，9)。

二十世纪九十年代，筛选过度生长的果蝇遗传突变体，发现了Hippo信号通路中的第一个成员-Warts(Wts)(10)。直到2002年，Tapon et al发现第二个Hippo信号通路成员Salvador，Sav丧失功能导致cyclin E和抗凋亡因子dlAP1过度表达(11)。随后发现Wts上游激酶Hpo，Hpo与Sav结合，形成具有激酶活性的Hpo-Sav复合物(12)。到2005年，发现了可以增强Wts活性的辅助蛋白Mats(13)。Hpo，Sav，Wts和Mats是果蝇Hippo信号通路的核心成员。在哺乳动物中能找到各自的同源物Mst1/2，WW45，LATS1/2，Mob1。LATS1，MST2和Mob1能够功能性补偿果蝇中同源物的突变体。由此可见，在果蝇与哺乳动物中Hippo信号通路核心成员功能是高度保守的。

Hpo、Mst1和Mst2属于Sterile20(STE20)蛋白激酶家族成员，其N端包含一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能域，中间和C端预测是螺旋—螺旋功能域。C末端的螺旋—螺旋区域是SARAH功能域(14)。Sav和WW45含有两个WW功能域和一个C端的SARAH功能域。WW功能域可以识别PPXY基序。Mst1/2的C端SARAH功能域与WW45的SARAH相互作用(15)。Wts，Lats1和Lats2属于NDR蛋白激酶家族成员，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域靠近C端。激酶功能域的下游是S_TK_X区域，N端区域含有一个UBA(泛素相关)基序，参与泛素介导途径。Wts和Lats1/2含有几个PPXY基序，可以和WW功能域蛋白质相互作用。Mats和Mob1是含有一个Mob1功能域，参与蛋白质-蛋白质的相互作用。随后，研究人员用Wts筛选与之相互作用的蛋白质，鉴定出转录共激活因子Yorkie是果蝇中Wts-Mats复合物下游主要的底物。

随着全世界科学家对Hippo信号通路不断地深入研究，对Hippo信号通路的作用机制了解得更加清楚。细胞外配体通过与细胞膜蛋白Fat结合，将胞外信号，传递进细胞中。Fat是原钙粘素的亚家族的一个成员，可以与钙粘素发生相互作用，而钙粘素是一类介导细胞连接和桥粒连接的一类重要蛋白质(16)。在Fat下游，有两个膜相关蛋白质Merlin和Expanded(17，18)，它们通过细胞骨架和肌动蛋白将信号传递给下游的激酶复合物Hpo-Sav，激活后的Hpo，在支架蛋白Sav的协助下磷酸化Wts。被磷酸化的Wts与Mats结合可以磷酸化Yorkie。在正常生理状态下，Yorkie能够进入细胞核，与核内的转录因子相互结合，启动细胞周期调控蛋白cyclin E和细胞凋亡抑制物diap1基因转录。但是，被磷酸化的Yorkie能够与细胞骨架蛋白14-3-3蛋白相互作用，滞留在胞浆内，不能进入细胞核，不能启动基因转录。潘多佳小组通过研究果蝇发现，提高Yorkie蛋白水平使诱导生长基因的表达过量，并最终导致器官的过度生长。

目前，已在哺乳动物中，发现Yorkie的同源蛋白YAP。YAP有两种可变剪接体YAP1和YAP2，YAP1含有一个Tryptophan-Tryptophan(WW)功能域，YAP2含有两个WW功能域，一般情况，WW功能域能够与连续富含脯氨酸的基序(PPXY)相互作用，介导蛋白质复合物的形成。Yorkie含有一个WW功能域，C末端的TWL基序，能够与PDZ功能域相互作用，而N末端是脯氨酸富含区。Wts/Lats磷酸化YkiSer168(YAP Ser127)。磷酸化的Ser168能够参与形成一个与细胞支架蛋白结合的基序，最终滞留在胞浆。Yki上存在很多Wts磷酸化位点，由此可见，Wts通过磷酸化Yki阻止其进入细胞核发挥功能。

肿瘤发生过程很复杂，多重因素参与其中，主要原因之一是破坏细胞增殖和细胞凋亡之间的平衡。细胞增殖和凋亡的平衡，对于组织的生长，发育和正常发挥功能是极其重要的。如果组织凋亡过快，会导致器官衰竭，丧失功能；如果细胞无限制增殖，凋亡减缓，就会导致肿瘤发生。细胞信号通路在维持组织稳态中起到作用，适当地控制细胞增殖和凋亡是极其重要的。Hippo信号通路能通过控制细胞生长、分裂和凋亡，有效地调节组织细胞稳态，更重要的是，这条信号通路在哺乳动物中是非常保守的。

有文献报道，结肠癌、肺癌、卵巢癌等高发肿瘤中已发现含有YAP基因的染色体区域(11q22)高度扩增。在这三种癌组织中发现YAP高表达和在细胞内分布的变化，这些发现说明，YAP表达量的增高和胞内分布的变化与结肠癌，肺癌和卵巢癌存在着某种联系。Anders小组，2008年发现肝肿大的恶化与大鼠肝脏中YAP的过度表达有关，失活YAP可以使肝脏恢复到正常大小，但是局部持续高表达YAP会导致恶性转化为肝癌。由此可见，YAP在肝癌的恶化过程中，起到了一定作用。

在上述三种癌组织中发现YAP在细胞质内分布的变化，这种变化下潜藏着YAP导致肿瘤恶性转变的机制。从果蝇的具体研究中发现，YAP核转移是激活转录的重要步骤。组织中YAP表达水平正常，说明Hippo信号通路对维持正常生理组织的平衡和修复是起到积极作用的。在正常结肠，肺和卵巢中，胞质内YAP表达水平和结肠腺癌，肺腺癌和卵巢癌中显著不同。恶化的细胞表达出过量的YAP，超过正常生理系统调控，导致YAP在胞质内异常积累。胞质内积累的YAP，不断的向核内转移；入核的YAP与转录因子结合，启动一些促分裂增殖基因的表达，致使癌细胞数量不断增加。

YAP作为Hippo信号通路下游核内作用因子在哺乳动物中高度保守，YAP不可能负责整个过程的每一步，它可以提供有利于细胞增值和抑制细胞凋亡的微环境，增加恶化前细胞基因组的不稳定，使肿瘤具备恶化需要的六个能力。YAP在细胞生长、分化、凋亡过程中的作用，说明它可以维持组织器官的稳态，如果一旦失调，便促使肿瘤细胞恶化。所以上述三种类型癌症中，YAP都有异常变化，可能是引发癌症的一个因素。转录激活因子YAP在各种细胞中普遍表达，癌症发生过程中Hippo信号通路发生改变，因此这个信号通路可能是针对这三种癌症的一个治疗靶点。

YAP/Yki是非DNA结合的转录共激活因子，能与多种转录因子相结合，如，转录增强因子TEF/TEAD(TEA功能域蛋白)，runt功能域转录因子，过氧化酶体增殖激活受体r(PPARr)，T-box转录因子V和其他各种转录因子。在众多转录因子中，YAP与TEF/TEAD的相互作用从果蝇到哺乳动物细胞都很保守，TEAD转录因子家族是YAP在细胞核中主要目标。YAP与TEF/TEAD蛋白相互作用，TEF/TEAD具备DNA结合能力，可以促进YAP定位在细胞核。

近期研究发现TEF/TEAD家族是进化上保守的，影响YAP生物学功能的关键转录因子。TEF/TEAD需要结合细胞专一性共激活因子，才能发挥转录激活作用。哺乳动物普遍能够表达中TEF/TEAD转录因子，在特定组织、特定发育阶段调控基因转录。TEAD家族中有四个成员TEAD1，TEAD2，TEAD3，TEAD4。TEAD家族成员在心脏、骨骼和平滑肌、胎盘和神经嵴中能够结合在含有MCAT(肌肉细胞中C，A，T位点)的启动子区域，大部分MCAT依赖性启动子是肌肉细胞专一性的。最近，R.Tsika小组发现TEAD在肌肉细胞中能够结合在富含A/T的启动子区。TEAD家族中各个成员有分工差别，TEAD1和TEAD3主要调控心脏的基因转录；而TEAD4参与骨骼肌的分化；TEAD2在胚胎发育早期是有活性的。TEAD在发育中很重要，很多组织至少需要表达一种TEAD蛋白，例如TEAD1敲除的小鼠在胚胎发育10-11天时，会死于心室壁异常薄；在神经嵴中MCAT位点是PAX3表达必需的。

TEAD家族成员广泛表达，但是只有在一部分细胞内才能作为转录激活因子(心脏、骨骼和平滑肌、胎盘和皮肤)。YAP结合位点位于TEAD的C末端，这个功能域在哺乳动物的TEAD家族其他三个成员和果蝇SD蛋白中都很保守。

线虫唯一一个TEF家族成员Egl-44，其C末端氨基酸序列不同于果蝇的Scalloped和哺乳动物的TEF/TEAD蛋白。恰恰线虫中也没有YAP/Yki的同源类似物，这是否预示着线虫发育时不需要其他因子激活Egl-44启动下游基因转录？

从发现TEAD蛋白至今已经四十年，TEAD的三维结构一直是未知，部分原因是无法拿到足够的蛋白或者是蛋白的性质不够稳定。在2005年，Veeraraghavan小组利用NMR解析出TEAD的DNA结合功能域三维结构。而我们关注癌基因YAP如何与转录因子TEAD结合，解析两者之间的作用位点三维结构，设计出能有效干扰YAP与TEAD上结合的小分子，抑制YAP与TEAD结合，阻遏下游促生长，抗凋亡基因的转录，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，进而达到减缓癌症恶化，治疗肿瘤的效果。

发明内容

本发明第一方面提供一种设计或筛选与TEAD蛋白结合的试剂的方法，所述方法包括产生TEAD蛋白的三维模型，所述模型包括TEAD蛋白的原子的结构坐标。

在一优选实施例中，所述三维模型包括选自TEAD蛋白残基F314、Y346、F350、K353、L354、L357、V366和/或F370的原子的原子结构坐标。

在一优选实施例中，所述三维模型包括选自TEAD蛋白残基V242、1247、L272、V391和/或Y406的原子的原子结构坐标。

在一优选实施例中，所述三维模型包括选自TEAD蛋白残基F314、Y346、F350、K353、L354、L357、V366和/或F370的原子的原子结构坐标，和选自TEAD蛋白残基V242、1247、L272、V391和/或Y406的原子的原子结构坐标。

在一优选实施例中，所述方法还包括产生YAP蛋白的三维模型，该模型包括YAP蛋白的原子的结构坐标。

在一优选实施例中，所述YAP蛋白的三维模型包括选自L65、L68和/或F69的原子的原子结构坐标。

在一优选实施例中，所述YAP蛋白的三维模型包括M86、R89、L91、S94、F95和/或F96的原子的原子结构坐标。

在一优选实施例中，所述YAP蛋白的三维模型包括选自L65、L68和/或F69的原子的原子结构坐标，和M86、R89、L91、S94、F95和/或F96的原子的原子结构坐标。

在一优选实施例中，所述方法还包括将候选试剂与所述TEAD蛋白的模型对接，获得与所述模型相匹配的候选试剂。

在一优选实施例中，所述方法还包括，将与所述模型相匹配的候选试剂与TEAD蛋白和YAP蛋白接触，检测其阻断YAP蛋白与TEAD蛋白结合的能力。

在一优选实施例中，所述方法还包括使用能够阻断YAP蛋白与TEAD蛋白结合的试剂进行细胞实验，检测其在细胞水平上阻断YAP蛋白与TEAD蛋白结合的能力。

本发明还涉及一种YAP与TEAD复合物的晶体，其中，该晶体含有YAP的第50-100位氨基酸，而TEAD包含第194-411位氨基酸。

在一优选实施例中，晶体中所述YAP的序列为其第50-100位氨基酸，所述TEAD的序列为其第194-411位氨基酸。

本发明还涉及所述复合物晶体在设计或筛选与TEAD蛋白结合的试剂中的用途。

本申请还包括实施例4所述的化合物1-10在制备用于治疗或预防TEAD介导的疾病用的药物中的用途。在优选实施方式中，所述疾病可选自结肠癌、肺癌和卵巢癌。

附图说明

图1A显示TEAD的不同构建与His-YAP(50-171)的pull-down实验结果；图1B显示YAP的不同构建与TEAD(194-411)形成复合物。

图2显示YAP_50-171-TEAD_194-411分子筛Superdex200纯化结果以及出峰位置的蛋白质样品电泳。

图3显示YAP_50-159-TEAD_194-411分子筛Superdex200纯化结果以及出峰位置的蛋白质样品电泳。

图4显示YAP_50-114-TEAD_194-411分子筛Superdex200纯化结果以及出峰位置的蛋白质样品电泳。

图5A显示YAP_50-171-TEAD_194-411复合物晶体照片；5B显示YAP_50-114-TEAD₁₉₄ _-411复合物晶体照片。

图6显示YAP_50-171-TEAD_194-411整体及旋转120度后三维结构图。

图7显示YAP在不同物种中的序列比对。

图8A显示YAP与TEAD结合的三个界面；8B显示YAP不同构建的Sumo融合蛋白与GST-TEAD的pull-down实验。

图9显示YAP-TEAD晶体结构中界面2。

图10显示YAP-TEAD晶体结构中界面3。

图11A显示野生型GST-TEAD与野生型和突变型His-YAP pull down实验；11B显示HEK293细胞中，以荧光素酶为报告基因，检测野生型TEAD与野生型和突变型YAP的结合；11C显示在293T细胞中，野生型Mcy-TEAD1与野生型和突变型Flag-YAP免疫共沉淀。

图12A显示野生型His-TEAD与野生型和突变型GST-TEAD pull down实验；12B显示HEK293细胞中，以荧光素酶为报告基因，检测野生型YAP与野生型和突变型TEAD的结合；12C显示在293T细胞中，野生型Flag-YAP与野生型和突变型Myc-TEAD1免疫共沉淀。

具体实施方式

如本说明书中和权利要求中使用的，单数形式“一”、“一个”、“该”包括复数参考，除非内容明显说明。

文中使用了下列氨基酸缩写：

丙氨酸：Ala(A) 精氨酸：Arg(R)

天冬酰胺：Asn(N) 天冬氨酸：Asp(D)

半胱氨酸：Cys(C) 谷氨酰胺：Gln(Q)

谷氨酸：Glu(E) 甘氨酸：Gly(G)

组氨酸：His(H) 异亮氨酸：Ile(I)

亮氨酸：Leu(L) 赖氨酸：Lys(K)

甲硫氨酸：Met(M) 苯丙氨酸：Phe(F)

脯氨酸：Pro(P) 丝氨酸：Ser(S)

苏氨酸：Thr(T) 色氨酸：Trp(W)

酪氨酸：Tyr(Y) 缬氨酸：Val(V)

本发明人已克隆到人源的YAP2，TEAD1基因，利用基因工程的手段将基因构建到原核表达载体pET-15b、pGEX-6P-1，在大肠杆菌中能纯化到大量的可溶蛋白，通过pull-down实验确定癌基因YAP与转录因子TEAD的结合区域(图1)。在得到的几种复合物中，发明人选取TEAD(194-411)分别与YAP(50-171)，YAP(50-159)，YAP(50-114)作为候选蛋白质复合物，利用亲和层析，离子交换层析，分子排阻层析三步纯化方法，得到纯度至少为95％的性质稳定，均一的蛋白复合物(图2-4)经过结晶得到蛋白复合物晶体(图5左)。

通过Se-Met标记方法，纯化硒代蛋白复合物，进行结晶，得到晶体(图5右)，解析相位，进而解出整个蛋白质复合物的结构(图6)。通过进一步的分析发现，YAP和TEAD的结合主要发生在三个界面上，其中界面2和3对其结合有重要影响，尤其是界面3。TEAD中参与到界面2中的氨基酸包括F314、Y346、F350、K353、L354、L357、V366、F370；YAP中参与到界面2中的氨基酸包括L65、L68、F69；TEAD中参与到界面3中的氨基酸包括V242、I247、L272、V391和Y406；YAP中参与到界面3中的氨基酸：M86，R89，L91，S94，F95和F96；其空间结构坐标如表1-4所示。

因此，本申请筛选或设计与TEAD蛋白结合的试剂的方法可包括根据TEAD界面2和/或3中氨基酸的原子的原子空间结构筛选或设计试剂，确定所述试剂与所述界面之间的拟合。所述拟合包括计算所述界面的原子和试剂的原子之间的距离。或者可将所筛选或设计的试剂的三维模型与所述界面的三维模型对接，确定两者是否匹配。

或者以及，本申请筛选或设计与TEAD蛋白结合的试剂的方法可包括根据YAP界面2和/或界面3中的氨基酸的原子的原子空间结构筛选或设计试剂，使所筛选或设计的试剂具有与所述界面中的相关氨基酸具有相同或类似的原子空间结构。该方法还进一步包括将所筛选或设计的试剂与TEAD的空间模型对接，以检验两者之间的匹配程度。在一个具体实施例中，可根据具体使用的数据库或对接软件选择例如Numberof conformations、Final docked energy、estimated free energy of binding等参数作为评价对接结果的指标。

本文中，结构坐标是笛卡儿坐标，其描述了原子在三维空间中相对于分子或者分子复合体中其他原子的位置。使用例如，X-射线晶体学技术或者NMR技术可以得到结构坐标。额外的结构信息可以从光谱技术(例如，旋光色散(ORD)、圆二色性(CD))、同源性建模和计算方法(如包括来自分子机理或者来自动力学测定的数据的计算方法)得到。

各种软件程序允许对一组结构坐标进行图解表示以得到分子或者分子复合体(如结合TEAD的YAP)的坐标。通常，这种表示应该准确地反映(相对地和/或绝对地)结构坐标，或者来自结构坐标的信息，如部件之间的距离或者角度。该表示可以是二维图，如立体二维图，或者相互作用的二维展示(例如，可以展示分子或者分子复合体的不同面的计算机展示)，或者相互作用的立体三维展示。坐标可以用于指导分子或者分子复合体的物理三维表示的产生，如球棍模型或者通过快速设计原型制备的模型。通过数学操作，如通过求逆或者整数加入或者减去可以修饰结构坐标。同样地，结构坐标是相对的坐标，并且绝不受到表2的实际的x、y、z坐标的限制。

三维分子模型是分子或者分子复合体的表示。三维模型可以是分子结构的物理模型(例如，球棍模型)，或者分子结构的图解表示。图解表示可以包括例如，计算机显示器上呈现的图或者图形。当二维表示反映了三维信息，例如，通过使用透视、阴影或者通过用更接近观察者的部件遮断离观察者更远的部件，二维图解可以表示三维模型。优选地，图解表示准确地反映了结构坐标，或者从结构坐标得到的信息，如模型的部件之间的距离或角度。当三位模型包括多肽如YAP或TEAD时，该模型可以包括一种或多种不同水平的结构，如一级结构(氨基酸序列)、二级结构(例如，α-螺旋和β-折叠)、三级结构(总体折叠)和四级结构(寡聚化状态)。模型可以包括不同水平的细节。例如，模型可以包括蛋白的二级结构元件的相对位置，而没有指定原子的位置。更详细的模型可以包括原子的位置。

模型可以包括从结构坐标得到的特征和其他化学信息。例如，溶剂可接近的表面的形状可以从结构坐标、模型原子的范德瓦耳斯半径和溶剂(例如，水)的范德瓦耳斯半径得到。其他可以从结构坐标得到的特征包括但不限于，静电势、大分子结构内的空隙和口袋的位置和氢键和盐桥的位置。

模型可以包括分子结构中原子的结构坐标。结构坐标可以通过实验，例如，通过X-射线晶体学或者NMR光谱学测定，或者可以通过例如同源性建模产生。分子结构可以包括单个分子、分子的一部分、两个或更多个分子的复合体、一组分子或者其组合。在分子复合体模型中，分子可以通过共价或者非共价键结合，包括例如，氢键、疏水相互作用或者静电引力。分子复合体可以包括紧密结合的分子，如酶/抑制剂复合体，和松散结合的分子，如结晶化合物，其在晶体中存在有序溶剂分子或者离子。模型可以包括例如，结合于试剂的蛋白的复合体，例如，结合于抑制剂的酶的复合体。当模型包括结构坐标时，可以省略分子中某些原子的坐标。

保守替代是与所替代的氨基酸残基在功能上或者结构上等同的氨基酸替代。保守替代可以包括将一个残基用具有相似极性、立体排列或者属于与所替代的残基相同类别(例如，疏水的、酸性或者碱性的)的另一残基交换。保守替代包括关于与YAP相互作用的试剂的鉴定和设计，以及分子替代分析或者同源性建模方面，对YAP的三维结构无重要影响的替代。

试剂包括蛋白、多肽、肽、核酸(包括DNA或者RNA)、分子、化合物或者药物。

活性部位是分子或者分子复合体的区域，其可以与试剂(包括但不限于，蛋白，多肽，肽，核酸，包括DNA或者RNA，分子，化合物或者药物)相互作用或者结合。活性部位可以包括例如，试剂结合部位，以及与结合的实际部位相邻或最接近的附属结合部位，其可以在与特定试剂相互作用或者结合后影响活性。活性部位可以包括抑制剂结合部位。抑制剂可以以下述方式进行抑制，即通过直接干扰底物结合的实际部位(例如，通过与底物结合竞争)或者通过间接影响立体构象或者电荷电势，从而防止或者减小底物结合的实际部位处底物的结合。例如，活性部位可以是辅因子结合、底物结合(例如，将要磷酸化的底物)或者抑制剂结合的部位。活性部位可以包括别构剂结合的部位，或者磷酸化、糖基化、烷基化、酰化或者其他共价修饰的部位。

均方根偏差(rms偏差或者rmsd)是与平均值偏差的平方的算术平均值的平方根，且是一种表达与结构坐标的偏差或变差的方法。氨基酸残基的保守替代可以导致具有所述均方根偏差内的结构坐标的分子模型。具体地，由于保守替代而相互不同的多肽的两个分子模型可以具有所述rms偏差内(如小于1.5

小于1.0

或者小于0.5

)的主链原子坐标。多肽的主链原子包括α碳(Cα或者CA)原子、羰基碳(C)原子、羰基氧(O)原子，和酰胺氮(N)原子。

可使用计算机显示器显示YAP或TEAD的三维模型，例如，它们的活性部位的图。该模型可以包括结合于TEAD的试剂，或者可以将试剂的三维模型重叠在YAP的三维模型上。试剂可以是TEAD的抑制剂。模型中的试剂可以是已知的化合物、新的化学结构或者化学结构的片段。可检查TEAD/试剂复合体的所得三维模型。例如，通过改变以前存在的TEAD/试剂复合体模型，可以产生TEAD/试剂复合体的三维模型。需要试剂密切拟合活性部位。换句话说，试剂可以具有互补于活性部位的形状的形状。在试剂的原子和TEAD的原子之间存在优选的距离，或者距离范围。长于优选距离的距离可以与试剂和TEAD(例如，TEAD的活性部位)间的弱相互作用有关。短于优选距离的距离可以与排斥力有关，所述排斥力削弱了试剂和TEAD之间的相互作用。当原子之间的距离太短时，可以发生空间冲突。当两个原子的位置不合理地接近在一起时，例如，当两个原子通过小于它们的范德瓦耳斯半径之和的距离分开时，发生空间冲突。如果存在空间冲突，那么可以调整试剂相对于TEAD的位置(例如，试剂的刚体平移或者旋转)，直到空间冲突减小。可以调节试剂或者试剂附近的TEAD的构象，以减小空间冲突。通过改变试剂的结构，例如，将庞大的基团，如芳香族环改变成较小的基团，如甲基或者羟基，或者将刚性基团改变成可以适应不产生空间冲突的构象的柔性基团，也可以除去空间冲突。静电力也可以影响试剂和活性部位之间的相互作用。例如，静电性质可以与减弱试剂和TEAD之间的相互作用的排斥力有关。通过改变试剂的电荷，例如，通过用中性基团置换带正电荷的基团，可以减轻静电排斥。

影响试剂和TEAD之间的结合强度的力也可以在TEAD/试剂模型中评估。这些力可以包括但不限于，氢键、静电力、疏水相互作用、范德瓦耳斯相互作用、偶极-偶极相互作用、π-堆积力和阳离子-π相互作用。用户可以肉眼评估这些力，例如，通过注意以适于氢键的距离和角度排列的氢键供体/受体对。基于该评估，用户可以改变模型以发现TEAD和试剂之间更有利的相互作用。改变模型可以包括改变TEAD的三维结构而不改变它的化学结构，例如，通过改变氨基酸侧链构象或者主链双面夹角。改变模型可以包括改变试剂的位置或者构象，如上所述。改变模型还可以包括改变试剂的化学结构，例如，通过替代、添加或者除去基团来改变。例如，如果TEAD上的氢键供体位于该试剂上的氢键供体附近，那么用户可以用氢键受体置换试剂上的氢键供体。

试剂和TEAD的相对位置或者它们的构象可以被调节，以发现特定试剂与TEAD的最优化的结合几何形状。最优化的结合几何形状的特征是例如，有利的氢键距离和角度、最大的静电引力、最小的静电排斥、疏水部分与水性环境隔离和不存在空间冲突。最优化的几何形状可以具有TEAD/试剂复合体的可能的几何形状家族的最低的计算能量。例如，通过分子力学或者分子动力学计算可以确定最优化的几何形状。

可以产生具有不同结合的试剂的TEAD/试剂的一系列模型(例如，二维模型、三维模型)。可以为该系列中TEAD/试剂复合体的每个模型计算得分。该得分可以描述例如，TEAD和试剂之间相互作用的预期强度。得分可以反映上述影响结合强度的因素之一。得分可以为反应超过一种因素的合计得分。不同的试剂可以根据它们的得分分类。

可以通过机器(例如，计算机)以自动化方式进行试剂设计中的步骤。例如，TEAD活性部位的模型以及一系列候选试剂的模型可以在机器中编程。机器可以发现每种候选试剂对TEAD活性部位的最优化的结合几何形状，并计算得分来确定该系列中的哪些试剂可能与TEAD最强地相互作用。

可以设计和/或实施软件系统来促进这些步骤。用于产生此类三维模型或者进行必要的拟合分析的软件系统(例如，计算机程序)包括，但不限于：Accelrys，Inc.(SanDiego，CA)的MCSS、Ludi、QUANTA、Insight II、Cerius2、CHARMm和Modeler；TRIPOS，Inc.(St.Louis，MO)的SYBYL、Unity、FleXX和LEAPFROG；AUTODOCK(Scripps Research Institute，La Jolla，CA)；GRID(Oxford University，Oxford，英国)；DOCK(University of Caiifornia，San Francisco，CA)；和Flo+和Flo99(Thistlesoft，Morris Township，NJ)。其他有用的程序包括Openeye ScientificSoftware(Santa Fe，NM)的ROCS、ZAP、FRED、Vida和Szybki；Schrodinger，LLC(Portland，OR)的Maestro、Macromodel和Glide；MOE(Chemical ComputingGroup，Montreal，Quebec)；Allegrow(Boston De Novo，Boston，MA)、CNS(Brunger等人，Acta Crystall.Sect.D 54：905-921，1997)和GOLD(Jones等人，J.Mol.Biol.245：43-53，1995)。使用MOLSCRIPT、RASTER3D或PYMOL(Kraulis，J.Appl.Crystallogr.24：946-950，1991；Bacon和Anderson，J.Mol.Graph.6：219-220，1998；DeLano，The PYMOL Molecular Graphics System(2002)DeLanoScientific，San Carlos，CA)，结构坐标还可以用于显示TEAD的三维结构。

试剂可以通过筛选合适的数据库来选择，可以通过结合合适的软件程序分析空的TEAD活性部位的立体构型和电荷电势来从头设计，或者可以用TEAD的已知的抑制剂的特征来设计。该方法可以用于设计或者选择TEAD抑制剂。可以设计和/或实施软件系统来促进数据库搜索，和/或试剂筛选和设计。

一旦已经设计或者鉴定了试剂，就可以得到或者合成该试剂并进一步评估它对TEAD活性的影响。例如，通过将所鉴定的试剂与TEAD接触并测量该试剂对抑制YAP与TEAD之间的结合的影响，可以评估该试剂。一种评估试剂的方法可以包括在体外或者体内进行的活性测定。

可采用常规的细胞实验进行体外实验。所使用的细胞可包括任何表达YAP和TEAD的细胞，包括但不限于卵巢癌细胞系A2780、CHO、结肠癌细胞系Caco2、肺癌细胞系3LL、H1299、WI38等。通常，可在培养细胞加入10-30ug/ml的待筛选化合物到细胞培养基中，分别培养24h，48h，72h后，测定IC₅₀。更进一步的，可实施动物实验，以进一步验证所述试剂抑制YAP和TEAD结合的能力。

本申请还包括一种方法，该方法包括通过晶体复合体的三维结构进行推理性药物设计或筛选来获得试剂，其中，该复合体含有YAP和TEAD多肽，然后检测试剂抑制YAP和TEAD结合的能力。

各种分子分析和推理性药物设计技术进一步公开在例如美国专利5,834,228、5,939,528和5,856,116，以及PCT申请号PCT/US98/16879、公开的WO 99/09148中，将它们的内容引入本文作为参考。

本申请也包括一种组合物，该组合物含有YAP和TEAD蛋白复合体的晶体。在一个实施例中，该复合体是TEAD(194-411)与YAP(50-171)、YAP(50-159)或YAP(50-114)形成的复合体，可根据美国国立生物信息技术中心蛋白质数据库确定上述氨基酸编号。

本申请还包括一种制备用于治疗或预防TEAD介导的疾病用的药剂的方法，该方法包括提供本申请的提供TEAD蛋白的三维模型，根据该模型设计或筛选与TEAD蛋白结合的试剂，制备所述试剂，和测试所述试剂治疗或与否TEAD介导的疾病的效力，其中能够治疗或与否TEAD介导的疾病的试剂为治疗或预防TEAD介导的疾病用的药剂。

本申请也包括采用本申请方法筛选或设计得到的试剂及所述试剂在制备用于治疗或预防TEAD介导的疾病用的药剂中的用途。转录因子TEAD控制多种癌基因的表达，筛选得到的试剂可以用于治疗或预防结肠癌、肺癌和卵巢癌等。

本申请也包括一种药物组合物，该组合物含有依本申请方法筛选或设计得到的试剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。在一优选实施例中，所述药物组合物含有本申请实施例4筛选得到的化合物1-10。

以下将以实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，而非限制性的。实施例中所提到的试剂，除非另有说明，否则都是市场上可购得的常规试剂。

实施例1

将YAP(50-171)PCR产物(从细胞中抽取YAP的mRNA反转录成cDNA，以YAPcDNA为模板，55℃退火，30个循环而获得)、pET-Duet2(Novagen公司)用BamHI/RcoRI酶切；将TEAD(194-411)PCR产物(从细胞中抽取TEAD的mRNA反转录成cDNA，以TEAD cDNA为模板，55℃退火，30个循环)、pRSF-Duet(Novagen公司)用Ndel/Sall在37℃双酶切4h，回收后分别在室温连接。鉴定正确后，将pET-Duet2-YAP(50-171)，pRSF-TEAD(194-411)转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中，各涂布在新鲜的带有氨卞青霉素和卡那霉素抗性的LB平板培养基上。待长出单克隆后，挑取单克隆到含有抗生素(氨卞青霉素和卡那霉素)的100ml LB液体培养基中，在37℃过夜培养，然后分别将过夜培养物以1∶100的比例分别转入1L LB×4和1L LB×8液体培养基进行扩增培养。待菌浓度达到OD₆₀₀＝0.4时，把培养基降到15℃，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度0.1mM。在此温度下继续培养约16小时后，离心收集菌体(4000rpm，15min)。

将两种菌体混合，12L LB培养菌体用500ml裂解液(25mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，10mM咪唑)重悬后，加入终浓度为10ug/ml DNase(Sigma公司)。高压破碎(1500bar)，高速离心(12000rpm，4℃，25min)后，弃去沉淀。上清加入到平衡好的Ni²⁺柱(GE Healthcare)中，反复上样2-3遍，用裂解液洗至流出的液体基本检测不到蛋白(用G₂₅₀检测)即杂蛋白洗干净了，再用洗涤液(25mM Tris-HClpH8.0，150mM NaCl，25mM咪唑)洗至无杂蛋白流出。15％SDS-PAGE电泳并用考马斯亮蓝染色检测。

取2ml浓度为0.5mg/ml TEV蛋白酶(上海，启发)，加入终浓度为5-7mM的β-巯基乙醇，然后将2ml酶液加入到挂有复合物的Ni²⁺柱中，酶切过夜。

酶切好的YAP-TEAD复合物用含有低浓度咪唑的低盐缓冲液(20mM Tris-HClpH8.0，50mM NaCl，25mM咪唑)洗脱，洗脱一次后将洗脱液重新挂柱。再用低浓度咪唑的低盐缓冲液洗脱5-10个柱体积，收集流出液，用低盐缓冲液稀释两倍，采用预装的高分辨Source Q阴离子交换柱(GE Healthcare)，利用AKTA purifier(GEHealthcare)的快速层析系统，以15ml/min流速上样。从低盐缓冲液(20mM Tris-HClpH8.0)，到高盐缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl)连续梯度洗脱，出现蛋白峰，在出峰位置取样，15％SDS-PAGE电泳并用考马斯亮蓝染色检测。

将离子交换柱纯化的蛋白收集浓缩至500ul，高速离心后取上清，用Superdex200分子筛(GE Healthcare)预装柱纯化，用10mM Tris-HCl pH8.0，50mM NaCl，3mM DTT(二巯基苏糖醇)缓冲液以0.5ml/min流速洗脱。合并分子筛层析中出峰位置的收集液，浓缩至20mg/ml，分装成每管50ul-100ul，置于-80℃冻存备用。结果见图2。

取新鲜纯化的YAP(50-171)TEAD(194-411)蛋白复合物，用Hampton Research公司生产的晶体试剂盒Crystallization screening Kitl、II；Saltl、II；PEGIONI、II等共432个条件，采用气相扩散法中的悬滴法于4℃进行初步筛选。发现在Salt的第27号条件(2.0M甲酸钠，0.1M醋酸钠pH4.6)长出三棱锥晶体(图5)。

晶体的初步衍射分析在光源为Bruker的Cu靶旋转阳极X射线发生器上进行。电压45kV，电流60mA，波长1.5418

采取在低温冷冻条件下收集数据，应用Oxfordcryosystem维持100K的低温条件，本体复合物晶体防冻液为含有30％甘油，2.0M甲酸钠，0.1M醋酸钠pH4.6的缓冲液。样品用尼龙环捞出，在防冻液中浸泡2-3s，迅速移动到100K的氮气流中。把从室内X-关机上挑选出的衍射好的晶体储存在液氮中。

初步收集的数据用HKL2000软件包(HKL Research，Inc.)进行处理，YAP-TEAD蛋白晶体属于P212121空间群，晶胞参数为a＝44.6，b＝110.5，c＝165.7α＝β＝γ＝90°，硒代YAP-TEAD蛋白晶体也属于P2₁2₁2₁空间群，晶胞参数为a＝44.9，b＝107.8，c＝167.4，α＝β＝γ＝90°。

晶体的数据收集与统计

蛋白 YAP-TEAD Se-YAP-TEAD

Beamline SSRF-17U SSRF-17U

波长

0.97869(refine) 0.97916(peak)

辨析率

50.0-2.80 25.0-2.90

(2.90-2.80)^a (3.0-2.90)

空间群 P2₁2₁2₁ P2₁2₁2₁

晶胞参数

a＝44.6，b＝110.5， a＝44.9，

c＝165.7 b＝107.8，

c＝167.4

完整性(％) 97.9(83.6) 99.1(100)

R_merge(％) 6.3(35.4) 10.3(52.7)

I/σ(I) 44.3(3.91) 35.02(8.53)

Unique reflections 20593 18403

Redundancy 13.8(10.1) 31.9(33.7)

Structure refinement statistics

Resolution range

50.0-2.80(2.90-2.80)

R_work/R_free(％)^b 20.98/26.71

Deviation from identity

Bonds，

0.004

Angles，() 0.923

Average B factor，

66.08

Ramachandran plot statistics^c

Most favored regions(％) 85.8

Allowed regions(％) 12.9

Generously allowed regions(％) 1.3

a：括号数值代表最高分辨率的壳层 b：R_work＝∑||F_obs|-|F_calc||/∑|F_obs||F_obs和F_calc分别为观察和计算得到的结构因子；R_free＝∑_Test||F_obs|-|F_calc||/∑_Tast|F_obs|，“Test″是从所有衍射点中随机选取5％的点所组成的数据子集 c：.采用PROCHEK计算，数值代表核心区，允许区，宽泛允许区的氨基酸百分数

通过Se-Met标记方法，纯化硒代蛋白的复合物，结晶硒代蛋白质复合物的晶体，解析相位，进而解出整个蛋白质复合物的结构(图6)。

发现YAP_50-171-TEAD_194-411复合物晶体结构中YAP只含有50-100这段氨基酸序列，而TEAD包含了194-411所有的氨基酸。经过对结合区域的序列比对，我们发现与TEAD结合的YAP中的氨基酸序列(AGHQIVHVRGDSETDLEALFNAVMNPKTANVPQTVPMRLRKLPDSFFKPPE)，与YAP结合的TEAD中的氨基酸在进化上相当保守(图7)。特别是对应于YAP与TEAD结合的三个界面上(界面1、2、3)的氨基酸，在不同物种中完全一致。从进化角度分析这些物种，YAP与TEAD分别在结构上和功能上有高度保守性，YAP-TEAD复合物也必将存在于这些物种中发挥重要的生物学功能。

实施例2

为了判断这个三个界面在结构中的重要性，构建了含有不同界面的Sumo融合蛋白，Sumo-YAP50-100、Sumo-YAP61-100、Sumo-YAP86-100。

以pET-Duet2-YAP为模板，用引物在55℃分别扩增编码50-100aa，61-100aa，86-100aa的核苷酸序列，用BamHI、XhoI(Takara公司)双酶切连入pET Sumo载体(Invitrogen)中，经测序正确，表达纯化融合蛋白。

GST pull-down实验：取30ul结合了GST-TEAD(194-411)的GlutathioneSepharose(GE Healthcare)与不同的过量Sumo融合蛋白孵育，在25mM Tris-HClpH8.0，150mM NaCl缓冲液体系下于4℃孵育1小时。然后用300ul缓冲液25mMTris-HCl pH8.0，150mM NaCl，洗涤珠子三次，离心去掉上清，加入40ul2×SDS上样缓冲液，99℃煮5min，12％Tricine Gel电泳并用考马斯亮蓝染色检测，缺失了50-61这段残基，YAP与TEAD仍有较强的结合。我们确定，界面1(50-61)在YAP与TEAD结合中并不是必需的，在当缺失了界面1和2(50-85)时，YAP和TEAD仍存在微弱的结合，但是与单独缺失1时相比，结合强度有明显减弱，但单独的界面3已能够与TEAD形成复合物。由此判断，界面1不是YAP与TEAD结合必需的，界面2在YAP与TEAD结合中起重要作用，界面3对YAP与TEAD结合贡献最大。见图8。

晶体结构中YAP(61-73)是一段α螺旋，它与TEAD中的α3和α4相互作用，形成了一个三螺旋簇(图9)。它们之间的相互作用主要依赖与疏水侧链的相互作用：YAP中的L65、L68、L69和TEAD中的F314、Y346、F350、K353、L354、L357、V366、F370。其中YAP中的三个氨基酸形成了一个保守的LXXLF基序，这种基序是典型的能够与疏水口袋结合的模型。特别是L65与Y346、F350和K353；L68与F314、F350和F370；F69与F350、K353、L354、L357和V366，这三个YAP上的残基之间也存在相互作用，形成了一个紧凑的疏水区。为判断YAP与TEAD上疏水氨基酸的重要性，我们选择一些单一氨基酸突变：YAP上的L68A和F69A，TEAD上的Y346A，F350A，L354A和V366A，发现没有严重影响YAP与TEAD的相互作用。推测界面2处的相互作用主要依赖于二级结构，而一个氨基酸的改变并没有对蛋白的二级结构产生影响。

在界面3中，主要分布着一些碱性和疏水氨基酸(图10)，根据这些氨基酸的在结构中的分布，我们选择界面3中的氨基酸突变，考察它们对于结合的重要性：M86A、R89A、L91A、S94A、F95A、F96A。

S94A和F96A能够减弱YAP和TEAD的相互作用，M86A、R89A、L91A、F95A显著地破坏YAP和TEAD的结合能力(图11)。

与此同时，我们对TEAD中位于界面2，界面3的氨基酸进行了突变分析，发现TEAD中单独氨基酸突变(图12)，除Y406外，对于YAP-TEAD的结合影响不大。TEAD中Y406能够与YAP中S94能形成氢键，因此，Y406与S94形成的氢键对YAP与TEAD的相互作用是至关重要的。

通过晶体结构，生化实验，细胞实验分析，我们判断3在结构中起到主要作用。针对YAP与TEAD结合的界面3的三维结构，特别是能结合氨基酸M86A、R89A、L91A、F95A的口袋设计小分子能够有效的抑制YAP与TEAD的结合。

通过分析，得出参与到界面2和3的TEAD和YAP的氨基酸及其相应的原子结构坐标。

表1：TEAD中参与到界面2中氨基酸Phe314、Tyr346、Phe350、Lys353、Leu354、Leu357、Val366、Phe370的原子的原子结构坐标。

Phe314

# 名称 res 链 res# X Y Z OCC B

原子 872 N PHE A 314 -5.992 1.1743 0.556 1.00 64.94 N

原子 873 CA PHE A 314 -6.172 0.9743 1.988 1.00 67.16 C

原子 874 CB PHE A 314 -4.972 0.2443 2.600 1.00 66.88 C

原子 875 CG PHE A 314 -4.721 -1.1103 2.008 1.00 65.48 C

原子 876 CD1 PHE A 314 -5.548 -2.1773 2.313 1.00 65.56 C

原子 877 CE1 PHE A 314 -5.322 -3.4243 1.766 1.00 70.47 C

原子 878 CZ PHE A 314 -4.257 -3.6203 0.904 1.00 71.69 C

原子 879 CE2 PHE A 314 -3.423 -2.5643 0.592 1.00 70.87 C

原子 880 CD2 PHE A 314 -3.657 -1.3163 1.145 1.00 68.06 C

原子 881 C PHE A 314 -6.382 2.3053 2.692 1.00 66.96 C

原子 882 O PHE A 314 -5.837 2.5393 3.766 1.00 71.51 O

Tyr346

原子 1144 N TYR A 346 1.092 4.491 17.940 1.00 69.80 N

原子 1145 CA TYR A 346 0.428 3.637 18.920 1.00 70.35 C

原子 1146 CB TYR A 346 0.220 4.399 20.228 1.00 78.74 C

原子 1147 CG TYR A 346 -0.287 3.550 21.374 1.00 78.75 C

原子 1148 CD1 TYR A 346 0.597 2.935 22.250 1.00 82.23 C

原子 1149 CE1 TYR A 346 0.141 2.162 23.305 1.00 82.13 C

原子 1150 CZ TYR A 346 -1.213 1.998 23.495 1.00 77.09 C

原子 1151 OH TYR A 346 -1.662 1.230 24.543 1.00 81.45 O

原子 1152 CE2 TYR A 346 -2.114 2.599 22.640 1.00 73.50 C

原子 1153 CD2 TYR A 346 -1.649 3.371 21.587 1.00 76.89 C

原子 1154 C TYR A 346 -0.911 3.125 18.403 1.00 69.90 C

原子 1155 O TYR A 346 -1.187 1.928 18.443 1.00 69.76 O

Phe350

原子 1180 N PHE A 350 -1.707 -0.585 17.117 1.00 67.26 N

原子 1181 CA PHE A 350 -2.720 -1.176 17.978 1.00 63.08 C

原子 1182 CB PHE A 350 -3.415 -0.122 18.834 1.00 68.46 C

原子 1183 CG PHE A 350 -4.568 -0.667 19.636 1.00 69.41 C

原子 1184 CD1 PHE A 350 -4.364 -1.663 20.578 1.00 66.25 C

原子 1185 CE1 PHE A 350 -5.419 -2.172 21.312 1.00 64.73 C

原子 1186 CZ PHE A 350 -6.692 -1.686 21.111 1.00 70.15 C

原子 1187 CE2 PHE A 350 -6.910 -0.692 20.174 1.00 67.02 C

原子 1188 CD2 PHE A 350 -5.853 -0.189 19.444 1.00 64.45 C

原子 1189 C PHE A 350 -3.742 -1.885 17.103 1.00 67.70 C

原子 1190 O PHE A 350 -4.113 -3.033 17.351 1.00 64.84 O

Lys353

原子 1209 N LYS A 353 -2.010 -5.091 15.802 1.00 75.73 N

原子 1210 CA LYS A 353 -2.049 -6.101 16.857 1.00 75.28 C

原子 1211 CB LYS A 353 -1.526 -5.527 18.177 1.00 65.79 C

原子 1212 CG LYS A 353 -0.011 -5.549 18.316 1.00 64.77 C

原子 1213 CD LYS A 353 0.396 -5.631 19.780 1.00 79.01 C

原子 1214 CE LYS A 353 1.644 -6.490 19.966 1.00 88.84 C

原子 1215 NZ LYS A 353 1.687 -7.140 21.312 1.00 86.82 N

原子 1216 C LYS A 353 -3.453 -6.667 17.049 1.00 75.39 C

原子 1217 O LYS A 353 -3.628 -7.869 17.247 1.00 77.36 O

Leu354

原子 1218 N LEU A 354 -4.451 -5.793 16.989 1.00 73.02 N

原子 1219 CA LEU A 354 -5.838 -6.222 17.086 1.00 71.11 C

原子 1220 CB LEU A 354 -6.786 -5.030 16.970 1.00 69.76 C

原子 1221 CG LEU A 354 -7.179 -4.344 18.275 1.00 71.31 C

原子 1222 CD1 LEU A 354 -8.398 -3.468 18.052 1.00 70.58 C

原子 1223 CD2 LEU A 354 -7.461 -5.379 19.348 1.00 70.21 C

原子 1224 C LEU A 354 -6.183 -7.240 16.013 1.00 75.85 C

原子 1225 O LEU A 354 -6.672 -8.324 16.316 1.00 81.18 O

Leu357

原子 1245 N LEU A 357 -5.362 -10.978 15.473 1.00 86.20 N

原子 1246 CA LEU A 357 -6.015 -11.799 16.483 1.00 84.83 C

原子 1247 CB LEU A 357 -6.693 -10.901 17.519 1.00 85.35 C

原子 1248 CG LEU A 357 -6.567 -11.286 18.992 1.00 87.30 C

原子 1249 CD1 LEU A 357 -5.107 -11.445 19.363 1.00 85.01 C

原子 1250 CD2 LEU A 357 -7.231 -10.239 19.873 1.00 80.32 C

原子 1251 C LEU A 357 -7.048 -12.704 15.818 1.00 90.27 C

原子 1252 O LEU A 357 -7.741 -12.280 14.892 1.00 94.05 O

Val366

原子 1320 N VAL A 366 -9.623 -7.219 24.797 1.00 64.13 N

原子 1321C A VAL A 366 -8.515 -6.293 24.992 1.00 68.98 C

原子 1322 CB VAL A 366 -7.416 -6.451 23.915 1.00 62.14 C

原子 1323 CG1 VAL A 366 -7.174 -7.919 23.619 1.00 64.64 C

原子 1324 CG2 VAL A 366 -7.794 -5.710 22.651 1.00 71.34 C

原子 1325 C VAL A 366 -9.038 -4.861 25.005 1.00 64.84 C

原子 1326 O VAL A 366 -8.498 -3.994 25.690 1.00 63.74 O

Phe370

原子 1352 N PHE A 370 -9.339 -0.254 27.181 1.00 61.57 N

原子 1353 CA PHE A 370 -8.933 0.767 26.226 1.00 60.04 C

原子 1354 CB PHE A 370 -8.664 0.147 24.854 1.00 58.61 C

原子 1355 CG PHE A 370 -8.380 1.156 23.780 1.00 62.18 C

原子 1356 CD1 PHE A 370 -7.110 1.691 23.633 1.00 62.25 C

原子 1357 CE1 PHE A 370 -6.842 2.620 22.645 1.00 56.48 C

原子 1358 CZ PHE A 370 -7.848 3.024 21.790 1.00 55.03 C

原子 1359 CE2 PHE A 370 -9.118 2.498 21.923 1.00 57.52 C

原子 1360 CD2 PHE A 370 -9.380 1.569 22.912 1.00 62.68 C

原子 1361 C PHE A 370 -10.008 1.830 26.105 1.00 59.14 C

原子 1362 O PHE A 370 -11.190 1.518 25.956 1.00 59.21 O

表2：YAP中参与到界面2中的氨基酸Leu65、Leu68、Phe69的原子的原子结构坐标

Leu65

原子 1805 N LEU B 65 1.447 -0.968 25.186 1.00 88.36 N

原子 1806 CA LEU B 65 0.637 -1.539 24.123 1.00 85.27 C

原子 1807 CB LEU B 65 1.260 -1.240 22.760 1.00 86.90 C

原子 1808 CG LEU B 65 0.320 -1.062 21.564 1.00 75.66 C

原子 1809 CD1 LEU B 65 1.133 -0.962 20.286 1.00 77.18 C

原子 1810 CD2 LEU B 65 -0.693 -2.188 21.466 1.00 67.83 C

原子 1811 C LEU B 65 0.551 -3.043 24.335 1.00 83.06 C

原子 1812 O LEU B 65 -0.534 -3.619 24.384 1.00 79.95 O

Leu68

原子 1827 N LEU B 68 -1.447 -4.242 27.138 1.008 1.11 N

原子 1828 CA LEU B 68 -2.883 -4.235 26.917 1.007 8.66 C

原子 1829 CB LEU B 68 -3.235 -3.133 25.918 1.007 8.20 C

原子 1830 CG LEU B 68 -4.629 -2.511 25.915 1.007 4.66 C

原子 1831 CD1 LEU B 68 -5.008 -2.000 27.293 1.006 9.30 C

原子 1832 CD2 LEU B 68 -4.661 -1.383 24.902 1.007 1.10 C

原子 1833 C LEU B 68 -3.315 -5.590 26.374 1.007 9.33 C

原子 1834 O LEU B 68 -4.457 -6.011 26.557 1.007 4.57 O

F69

原子 1835 N PHE B 69 -2.384 -6.274 25.716 1.00 83.56 N

原子 1836 CA PHE B 69 -2.682 -7.543 25.062 1.00 81.85 C

原子 1837 CB PHE B 69 -1.925 -7.660 23.737 1.00 84.52 C

原子 1838 CG PHE B 69 -2.627 -7.003 22.590 1.00 76.24 C

原子 1839 CD1 PHE B 69 -3.608 -7.680 21.888 1.00 71.57 C

原子 1840 CE1 PHE B 69 -4.266 -7.077 20.839 1.00 67.64 C

原子 1841 CZ PHE B 69 -3.951 -5.783 20.487 1.00 70.56 C

原子 1842 CE2 PHE B 69 -2.978 -5.096 21.183 1.00 67.86 C

原子 1843 CD2 PHE B 69 -2.323 -5.704 22.228 1.00 68.16 C

原子 1844 C PHE B 69 -2.401 -8.762 25.928 1.00 87.98 C

原子 1845 O PHE B 69 -3.255 -9.636 26.065 1.00 91.21 O

表3：TEAD中参与到界面3中的氨基酸Val242、Ile247、Leu272、Val391和Tyr406的原子的原子结构坐标

Val242

原子 313 N VAL A 242 -26.008 8.404 31.109 1.00 55.05 N

原子 314 CA VAL A 242 -25.199 7.479 31.896 1.00 48.23 C

原子 315 CB VAL A 242 -24.163 6.748 31.023 1.00 49.75 C

原子 316 CG1 VAL A 242 -23.195 5.954 31.890 1.00 47.03 C

原子 317 CG2 VAL A 242 -24.864 5.844 30.024 1.00 46.83 C

原子 318 C VAL A 242 -24.488 8.187 33.047 1.00 50.57 C

原子 319 O VAL A 242 -23.939 9.272 32.878 1.00 53.98 O

Ile247

原子 356 N ILE A 247 -17.818 5.275 35.126 1.00 46.31 N

原子 357 CA ILE A 247 -16.818 5.329 34.070 1.00 45.14 C

原子 358 CB ILE A 247 -17.424 5.992 32.803 1.00 47.54 C

原子 359 CG1 ILE A 247 -17.831 4.921 31.798 1.00 44.76 C

原子 360 CD ILE A 247 -19.046 4.141 32.204 1.00 52.95 C

原子 361 CG2 ILE A 247 -16.472 6.992 32.169 1.00 48.83 C

原子 362 C ILE A 247 -15.526 6.032 34.493 1.00 48.76 C

原子 363 O ILE A 247 -14.475 5.822 33.893 1.00 52.71 O

Leu272

原子 559 N LEU A 272 -20.821 10.344 26.566 1.00 41.45 N

原子 560 CA LEU A 272 -20.200 9.033 26.500 1.00 43.14 C

原子 561 CB LEU A 272 -20.675 8.153 27.660 1.00 41.82 C

原子 562 CG LEU A 272 -19.833 6.964 28.136 1.00 37.75 C

原子 563 CD1 LEU A 272 -20.739 5.939 28.785 1.00 49.36 C

原子 564 CD2 LEU A 272 -19.052 6.314 27.027 1.00 38.46 C

原子 565 C LEU A 272 -20.631 8.414 25.185 1.00 44.71 C

原子 566 O LEU A 272 -21.822 8.371 24.877 1.00 43.83 O

Val391

原子 1515 N VAL A 391 -15.711 4.507 24.386 1.00 44.72 N

原子 1516 CA VAL A 391 -15.508 3.091 24.656 1.00 46.49 C

原子 1517 CB VAL A 391 -16.475 2.615 25.755 1.00 45.01 C

原子 1518 CG1 VAL A 391 -16.390 1.112 25.953 1.00 52.77 C

原子 1519 CG2 VAL A 391 -16.177 3.344 27.049 1.00 45.51 C

原子 1520 C VAL A 391 -15.715 2.318 23.349 1.00 48.40 C

原子 1521 O VAL A 391 -16.477 2.755 22.486 1.00 46.84 O

Tyr406

原子 1634 N TYR A 406 -24.477 8.622 24.587 1.00 46.73 N

原子 1635 CA TYR A 406 -25.171 8.884 25.835 1.00 43.71 C

原子 1636 CB TYR A 406 -24.915 7.764 26.848 1.00 47.50 C

原子 1637 CG TYR A 406 -25.111 6.364 26.315 1.00 38.98 C

原子 1638 CD1 TYR A 406 -26.327 5.713 26.448 1.00 39.54 C

原子 1639 CE1 TYR A 406 -26.502 4.426 25.964 1.00 40.48 C

原子 1640 CZ TYR A 406 -25.451 3.784 25.344 1.00 43.47 C

原子 1641 OH TYR A 406 -25.612 2.511 24.858 1.00 48.15 O

原子 1642 CE2 TYR A 406 -24.236 4.412 25.206 1.00 41.23 C

原子 1643 CD2 TYR A 406 -24.072 5.691 25.692 1.00 38.96 C

原子 1644 C TYR A 406 -24.660 10.188 26.404 1.00 44.93 C

原子 1645 O TYR A 406 -23.486 10.517 26.254 1.00 45.81 O

表4：YAP中参与到界面3中的氨基酸Met86、Arg89、Leu91、Ser94、Phe95和Phe96的原子的原子结构坐标

Met86

原子 1962 N MET B 86 -17.094 -3.803 31.825 1.00 63.52 N

原子 1963 CA MET B 86 -18.239 -2.957 31.478 1.00 59.35 C

原子 1964 CB MET B 86 -18.036 -2.301 30.111 1.00 59.07 C

原子 1965 CG MET B 86 -16.769 -1.473 29.992 1.00 60.09 C

原子 1966 SD MET B 86 -16.759 -0.020 31.055 1.00 63.02 S

原子 1967 CE MET B 86 -18.217 0.836 30.491 1.00 56.50 C

原子 1968 C MET B 86 -19.563 -3.720 31.490 1.00 55.72 C

原子 1969 O MET B 86 -20.602 -3.178 31.866 1.00 54.75 O

Arg89

原子 1989 N ARG B 89 -21.098 -3.622 34.948 1.00 49.25 N

原子 1990 CA ARG B 89 -21.403 -2.314 35.519 1.00 47.67 C

原子 1991 CB ARG B 89 -20.371 -1.287 35.037 1.00 41.31 C

原子 1992 CG ARG B 89 -18.943 -1.754 35.339 1.00 46.76 C

原子 1993 CD ARG B 89 -17.908 -1.219 34.383 1.00 48.30 C

原子 1994 NE ARG B 89 -17.341 0.047 34.824 1.00 48.09 N

原子 1995 CZ ARG B 89 -16.059 0.226 35.118 1.00 50.07 C

原子 1996 NH1 ARG B 89 -15.204 -0.70 35.012 1.00 51.28 N

原子 1997 NH2 ARG B 89 -15.631 1.415 35.511 1.00 41.81 N

原子 1998 C ARG B 89 -22.848 -1.892 35.227 1.00 43.52 C

原子 1999 O ARG B 89 -23.552 -2.549 34.465 1.00 51.46 O

Leu91

原子 2009 N LEU B 91 -24.993 -0.107 33.323 1.00 50.61 N

原子 2010 CA LEU B 91 -25.071 0.620 32.066 1.00 45.84 C

原子 2011 CB LEU B 91 -23.837 0.327 31.212 1.00 44.03 C

原子 2012 CG LEU B 91 -22.493 0.691 31.852 1.00 42.10 C

原子 2013 CD1 LEU B 91 -21.354 0.072 31.087 1.00 45.47 C

原子 2014 CD2 LEU B 91 -22.312 2.198 31.955 1.00 42.58 C

原子 2015 C LEU B 91 -26.343 0.239 31.321 1.00 52.70 C

原子 2016 O LEU B 91 -26.867 -0.861 31.506 1.00 55.04 O

Ser94

原子 2032 N SER B 94 -28.580 -1.014 25.931 1.00 56.89 N

原子 2033 CA SER B 94 -28.136 -0.590 24.606 1.00 54.19 C

原子 2034 CB SER B 94 -28.660 0.812 24.294 1.00 49.56 C

原子 2035 OG SER B 94 -28.232 1.748 25.268 1.00 48.88 O

原子 2036 C SER B 94 -26.619 -0.613 24.462 1.00 54.18 C

原子 2037 O SER B 94 -26.095 -0.845 23.374 1.00 62.04 O

Phe95

原子 2038 N PHE B 95 -25.920 -0.376 25.565 1.00 48.57 N

原子 2039 CA PHE B 95 -24.464 -0.286 25.561 1.00 49.25 C

原子 2040 CB PHE B 95 -23.959 -0.027 26.985 1.00 49.41 C

原子 2041 CG PHE B 95 -22.595 0.602 27.052 1.00 43.88 C

原子 2042 CD1 PHE B 95 -21.453 -0.174 26.961 1.00 46.39 C

原子 2043 CE1 PHE B 95 -20.200 0.395 27.035 1.00 42.87 C

原子 2044 CZ PHE B 95 -20.073 1.754 27.206 1.00 43.37 C

原子 2045 CE2 PHE B 95 -21.206 2.545 27.303 1.00 42.80 C

原子 2046 CD2 PHE B 95 -22.458 1.969 27.231 1.00 40.19 C

原子 2047 C PHE B 95 -23.809 -1.543 25.000 1.00 48.77 C

原子 2048 O PHE B 95 -22.629 -1.530 24.656 1.00 45.74 O

Phe96

原子 2049 N PHE B 96 -24.579 -2.622 24.901 1.00 50.78 N

原子 2050 CA PHE B 96 -24.014 -3.925 24.570 1.00 52.70 C

原子 2051 CB PHE B 96 -24.103 -4.851 25.782 1.00 56.36 C

原子 2052 CG PHE B 96 -23.514 -4.261 27.029 1.00 54.56 C

原子 2053 CD1 PHE B 96 -22.140 -4.171 27.184 1.00 53.71 C

原子 2054 CE1 PHE B 96 -21.592 -3.621 28.326 1.00 54.09 C

原子 2055 CZ PHE B 96 -22.420 -3.154 29.333 1.00 59.55 C

原子 2056 CE2 PHE B 96 -23.792 -3.238 29.191 1.00 57.75 C

原子 2057 CD2 PHE B 96 -24.332 -3.786 28.041 1.00 56.41 C

原子 2058 C PHE B 96 -24.661 -4.567 23.348 1.00 59.30 C

原子 2059 O PHE B 96 -24.108 -5.499 22.760 1.00 57.78 O

上述表格中，第二列：原子数；第三列：原子名称；第四列：残基名称；第五列：链；第六列：残基数；第七，八，九列：原子坐标；第十列：占有率；第十一列：B因子；第十二列：原子符号。

实施例3：化合物初筛

基于YAP-TEAD复合物晶体中的界面3结构，我们选用了Autodock3.0软件，将其并行化运行来进行化合物的筛选。Autodock3.0是Scripps的Olson科研小组开发的分子对接软件包，Autodock采用模拟退火和遗传算法来寻找受体和配体最佳的结合位置，用半经验的自由能计算方法来评价受体和配体之间的匹配情况。

采用的的数据库为Maybridge，是由英国Maybridge Chemical Company免费提供的有机化学品数据库，现有版本包括大约6万个化合物的信息。化合物大多为杂环类，且95％以上符合Lipinski four rules(标准为：1、少于五个氢键给予体；2、分子量小于500，3、脂水分配系数LogP小于5；4、少于10个氢键接受体)。

采用Autodock方法从Maybridge数据库中进行筛选，选择了Number ofconformations，Final Docked Energy，Estimated Free energy of Binding等参数作为评价对接结果的指标，筛选到综合效果最好的的化合物100个，下表中列出了部分化合物的筛选结果。已经购买了其中的50个进行生物学实验。购买化合物的选择标准：Lipinski four rules，化合物的多样性；化合物结构的代表性；是否有现货供应。

ID	In Dock energy(kcal/mol)	Run	Cluster	ID	In Dock energy(kcal/mol)	Run	Cluster
								1	-17.98	12	1	20	-14.75	16	2
2	-17.92	10	2	21	-14.72	3	4
								3	-16.75	8	2	22	-14.70	5	4
4	-16.44	2	4	23	-14.64	7	1
								5	-16.24	3	1	24	-14.59	8	3
6	-16.1	3	1	25	-14.55	10	4
								7	-15.73	5	5	26	-14.52	9	5
8	-15.52	6	2	27	-14.43	15	6
								9	-15.18	7	3	28	-14.4	17	12
10	-15.11	3	1	29	-14.39	4	3
								11	-15.06	2	3	30	-14.35	20	2
12	-15.03	2	2	31	-14.32	12	3
								13	-15	1	1	32	-14.29	8	4
14	-14.95	2	3	33	-14.24	9	1
								15	-14.92	8	4	34	-14.24	6	2
16	-14.88	4	5	35	-14.2	11	4
								17	-14.85	5	1	36	-14.19	7	2
18	-14.81	16	2	37	-14.18	12	3
								19	-14.79	5	2	38	-14.1	15	2

表中的化合物是根据Number of conformations、Final Docked Energy、Estimated Free energy of Binding这些参数筛选出的结果。

实施例4：化合物在体外抑制YAP与TEAD结合实验

为了验证化合物与TEAD的结合能力，同时基于方便实验操作，我们采用了pulldown方法进行化合物的初步筛选，从50个化合物中选出能抑制YAP与TEAD结合的化合物，用ITC(等温滴定量热法)测试化合物与蛋白质的结合能力。化合物的作用浓度选定为300ug/ml，100ug/ml，30ug/ml，10ug/ml，3ug/ml，1ug/ml。先将待测化合物与TEAD孵育1-2h，过分子筛除去游离的小分子化合物，然后用野生型YAP进行等温滴定量热法滴定。在高浓度时有较多的化合物能够抑制YAP与TEAD的结合；随着化合物浓度的降低，有抑制的化合物浓度降低，有抑制作用的化合物数量明显减少，在30ug/ml时，有抑制作用的化合物为30种；在10ug/ml浓度时只有15种化合物有抑制作用。下述化合物1-10是在30μg/ml有抑制作用的化合物：

总之，在四种常见致死率较高的恶性肿瘤细胞中，原癌基因YAP高表达，或在核内聚集，与转录因子相结合，起动下游基因转录。本申请第一次解析出了YAP-TEAD复合物的晶体结构；比较出YAP、TEAD在相互作用区域有非常高的保守性；阐述了YAP与TEAD的结合机制；确定出重要的结合位点。针对重要的结合位点，我们已设计并筛选出有机小分子化合物或多肽类似物，与YAP竞争性结合TEAD。干扰转录复合物的形成，阻遏下游促增殖、抗凋亡的基因转录。

参考文献

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Claims

1.设计或筛选与TEAD蛋白结合的试剂的方法，其特征在于，所述方法包括产生TEAD蛋白的三维模型，所述模型包括TEAD蛋白的原子的结构坐标。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三维模型包括选自TEAD蛋白残基F314、Y346、F350、K353、L354、L357、V366和F370的原子的原子结构坐标。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述三维模型包括选自TEAD蛋白残基V242、1247、L272、V391和Y406的原子的原子结构坐标。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括产生YAP蛋白的三维模型，该模型包括YAP蛋白的原子的结构坐标。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述YAP蛋白的三维模型包括选自L65、L68和F69的原子的原子结构坐标。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述YAP蛋白的三维模型包括M86、R89、L91、S94、F95和F96的原子的原子结构坐标。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将候选试剂与所述TEAD蛋白的模型对接，获得与所述模型相匹配的候选试剂。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，将与所述模型相匹配的候选试剂与TEAD蛋白和YAP蛋白接触，检测其阻断YAP蛋白与TEAD蛋白的结合能力。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用能够阻断YAP蛋白与TEAD蛋白结合的试剂进行细胞实验，检测其在细胞水平上阻断YAP蛋白与TEAD蛋白结合的能力。

10.一种YAP与TEAD的复合物晶体，其中，该晶体含有YAP的第50-100位氨基酸，而TEAD包含第194-411位氨基酸。