CN102127132A - 同时制备异戊酰螺旋霉素ⅱ和ⅲ的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时制备高纯度异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素III的方法，即以必特螺旋霉素为原料，采用高速逆流色谱方法分离得到异戊酰螺旋霉素II(纯度为90％以上)和异戊酰螺旋霉素III(纯度为96％以上)目标物。其中，高速逆流色谱的固定相和流动相均由正己烷、乙酸乙酯、甲醇或乙醇和水组成，且正己烷、乙酸乙酯、甲醇或乙醇和水的体积比为：(1.4～2.0)∶(0.1～0.4)∶1.0∶(0.8～1.7)。本发明具有高效、快速和样品无损失等优点，且是一种适合于规模化制备异戊酰螺旋霉素II和III的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时制备高纯度异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素II的方法，具体地说，涉及一种采用高速逆流色谱(High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC)由必特螺旋霉素(Bitespiramycin)原料中同时分离制备高纯度异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素III的方法。
背景技术
必特螺旋霉素(Bitespiramycin)是由转基因的螺旋霉素(Spiramycin，SPM)产生菌发酵得到的一种主要组分为异戊酰螺旋霉素I、II、III的多组分全新型抗生素，其结构见如式1所示：
式1中，R＝H(异戊酰螺旋霉素I)，R＝COCH3(异戊酰螺旋霉素II)，R＝COCH2CH3(异戊酰螺旋霉素III)。
由于4″位上异戊酰基侧链的存在，使得异戊酰螺旋霉素具有了与螺旋霉素(SPM)不同的理化性质，并且具有了更好的体内抗菌活性。获得必特螺旋霉素的主要活性组分，即异戊酰螺旋霉素I、II、III的高纯度样品对于深入必特螺旋霉素这一全新抗生素的药理学研究和严格其生产质量控制具有重要意义。
高速逆流色谱是一种基于液-液分配原理的新型分离技术，可以提供相当于上千理论塔板数的分离效果，为具有复杂组分、且组分间分子结构差异很小的必特螺旋霉素的主要组分的分离提供了手段。
近年来，有关采用高速逆流色谱(HSCCC)技术分离大环内酯类抗生素组分的研究主要集中于红霉素组分、螺旋霉素组分、他克莫斯和子囊霉素等组分的分离研究。例如，Hisao Oka等利用高速逆流色谱分离螺旋霉素组分，所用体系为正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(体积比)＝3∶6∶5∶5，得到的螺旋霉素I、II、III纯度分别98.2％、92.3％、97.4％(Hisao Oka，Ken-ichiHarada，Masanao Suzuki，et al.Separation of spiramycin components using high-speedcounter-current chromatography Journal of Chromatography A.2000，903：93-98)。其中，特定的溶剂系统及其溶剂配比是获得良好分离效果的关键之一。
目前尚未见采用高速逆流色谱分离制备高纯度必特螺旋霉素的主要组分的研究报道，国内外也尚未有高纯度的异戊酰螺旋霉素II和III的样品提供。酰化螺旋霉素虽然与螺旋霉素具有相似的母核，但不同的侧链基团使它们具有不同的理化性质，尤其是异戊酰螺旋霉素的C5侧链基团对其影响很大，可以作为分离螺旋霉素和异戊酰螺旋霉素的依据。但同时，螺旋霉素的分离方法也不能直接适用于异戊酰螺旋霉素中不同组分的分离。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种同时制备高纯度异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素III的方法，填补现有技术中的空白。
本发明所提供的同时制备高纯度异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素III的方法，其主要步骤是：以必特螺旋霉素(Bitespiramycin)为原料，采用高速逆流色谱(HSCCC)法从必特螺旋霉素中同时分离得到纯度大于90％异戊酰螺旋霉素II和纯度大于96％异戊酰螺旋霉素III样品；
其中，构成高速逆流色谱(HSCCC)的固定相和流动相的溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇或乙醇和水组成，且正己烷、乙酸乙酯、甲醇或乙醇和水的体积比为：(1.4～2.0)∶(0.1～0.4)∶1.0∶(0.8～1.7)。整个分离过程在常压和20～25℃条件下进行。
具体包括如下步骤：
(1)按上述比例配制溶剂体系构成固定相和流动相；
(2)将固定相泵入高速逆流色谱仪(HSCCC)内直至充满螺旋管；
(3)开启主机使螺旋管高速转动，同时泵入流动相；
(4)待螺旋管内建立动态平衡后，将必特螺旋霉素注入分离体系中；
(5)根据检测器谱图收集流出液，浓缩、干燥或冻干后获得异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素III；
其中所说的检测器是紫外检测器或蒸发光散射检测器，样品的干燥温度不高于50℃。
在本发明一个优选的技术方案中，所用高速逆流色谱(HSCCC)的固定相和流动相的溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水组成，且正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水的体积比为：2.0∶0.2∶1.0∶1.2、2.0∶0.2∶1.0∶1.4或2.0∶0.1∶1.0∶1.4；所获得的异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素III的纯度分别为94％和97％以上。
在本发明另一个优选的技术方案中，所用高速逆流色谱(HSCCC)的固定相和流动相的溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水组成，且正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为：1.4∶0.4∶1.0∶0.8、1.5∶0.3∶1.0∶1.7或1.6∶0.4∶1.0∶0.8；得到异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素III的纯度分别在90％和96％以上。
本发明所提供的同时制备高纯度异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素III的方法具有高效、快速、简洁和样品无损失等优点，且是一种适合于规模化制备异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素III的方法。
附图说明
图1为由实施例1所得的高速逆流色谱分离图；
其中：1-异戊酰螺旋霉素II，2-异戊酰螺旋霉素III。
图2为由实施例1所得的异戊酰螺旋霉素II(纯度为95.8％)、异戊酰螺旋霉素III(纯度为98.4％)及其原料(必特螺旋霉素)的高效液相色谱(HPLC)图谱；
其中：A-原料，B-异戊酰螺旋霉素II，C-异戊酰螺旋霉素III。
图3为由实施例2所得的高速逆流色谱分离图；
其中：1-异戊酰螺旋霉素II，2-异戊酰螺旋霉素III。
图4为由实施例2所得的异戊酰螺旋霉素II(纯度为95.8％)、异戊酰螺旋霉素III(纯度为98.4％)及其原料(必特螺旋霉素)的高效液相色谱(HPLC)图谱；
其中：A-原料，B-异戊酰螺旋霉素II，C-异戊酰螺旋霉素III。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，但所举的实施例并不限制本发明的保护范围。
所用300-B半制备型高速逆流色谱仪由上海同田生化技术有限公司提供，所用必特螺旋霉素(原料)由上海同联药业有限公司提供，经高效液相色谱分析，原料中异戊酰螺旋霉素I、II和III的含量分别为12.7％、31.0％、31.8％。
在下列实施例中，除特别说明外，所有操作在常压和20℃～25℃条件下进行，且所指含量均为高效液相色谱分析所得。
实施例1
按正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水体积比为2∶0.2∶1∶1.4配制溶剂体系，分液后，以上相作为固定相，下相作为流动相，分别置于超声波清洗器中超声脱气30min。将固定相泵入高速逆流色谱仪中直至液体充满螺旋管。设定螺旋管转速为900rpm，开启主机，同时向高速逆流色谱仪中泵入流动相，流速为2ml/min。待流出液由固定相变为流动相，即建立了动态平衡后，将100mg原料溶于20ml流动相中，由进样阀进样，分离开始。200min时将流动相流速变为3ml/min。在整个分离过程中，根据紫外检测器谱图收集流出液，检测谱图见图1。将收集得到1、2峰的洗脱液浓缩、在低于50℃条件下干燥。经高效液相色谱分析，两峰对应的物质分别为异戊酰螺旋霉素II和III，其纯度分别为95.8％、98.4％，收率均超过30％。
用高分辨率电子轰击质谱对获得的异戊酰螺旋霉素II、III进行结构鉴定分析，碎片离子m/z 229.14和m/z 867.52验证了异戊酰螺旋霉素II的特征结构；而碎片离子m/z 229.14和m/z881.54验证了异戊酰螺旋霉素III的特征结构。
实施例2
按正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体积比为1.8∶0.4∶1∶0.8配制溶剂体系，分液后，以上相作为固定相，下相作为流动相，分别置于超声波清洗器中超声脱气30min。将固定相泵入高速逆流色谱仪中直至液体充满螺旋管。设定螺旋管转速为900rpm，开启主机，同时向高速逆流色谱仪中泵入流动相，流速为2ml/min。待流出液由固定相变为流动相，即建立了动态平衡后，将100mg原料溶于20ml流动相中，由进样阀进样，分离开始，根据紫外检测器谱图收集流出液，检测谱图见图3。将收集得到1、2峰的洗脱液浓缩、在低于50℃条件下干燥。经高效液相色谱分析，两峰对应的物质分别为异戊酰螺旋霉素II和III，其纯度分别为91.6％、96.1％，收率均超过30％。
用高分辨率电子轰击质谱对获得的异戊酰螺旋霉素II、III进行结构鉴定分析，碎片离子m/z 229.14和m/z 867.52验证了异戊酰螺旋霉素II的特征结构；而碎片离子m/z 229.14和rn/z881.54验证了异戊酰螺旋霉素III的特征结构。
Claims (4)
1.一种同时制备高纯度异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素III的方法，其主要步骤是：以必特螺旋霉素为原料，采用高速逆流色谱法从必特螺旋霉素原料中分离得到目标物；
其中，配制高速逆流色谱的固定相和流动相的溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇或乙醇和水组成，且正己烷、乙酸乙酯、甲醇或乙醇和水的体积比为：(1.4～2.0)∶(0.1～0.4)∶1.0∶(0.8～1.7)；
所制得的异戊酰螺旋霉素II的纯度为90％以上，所制得的异戊酰螺旋霉素III的纯度为96％以上。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中形成所用高速逆流色谱的固定相和流动相的溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水组成，且正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水的体积比为：2.0∶0.2∶1.0∶1.2、2.0∶0.2∶1.0∶1.4或2.0∶0.1∶1.0∶1.4。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中形成所用高速逆流色谱的固定相和流动相的溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水组成，且正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为：1.4∶0.4∶1.0∶0.8、1.5∶0.3∶1.0∶1.7或1.6∶0.4∶1.0∶0.8。
4.如权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
(1)按权利要求1～3中任意一项所述溶剂比例配制构成高速逆流色谱的固定相和流动相；
(2)将固定相泵入高速逆流色谱仪内直至充满螺旋管；
(3)开启主机使螺旋管高速转动，同时泵入流动相；
(4)待螺旋管内建立动态平衡后，将必特螺旋霉素注入分离体系中；
(5)根据检测器谱图收集流出液，浓缩、干燥或冻干后获得异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素III；
其中所说的检测器是紫外检测器或蒸发光散射检测器，干燥温度不高于50℃。
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