CN102121032A - 利用pRC/CMV-EGFP质粒创制转绿色荧光蛋白基因叉尾斗鱼方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用pRC/CMV-EGFP创制转绿色荧光蛋白基因叉尾斗鱼方法。是先构建带有绿色荧光蛋白基因的pRC/CMV-EGFP质粒，利用显微注射技术将这种质粒导入到叉尾斗鱼受精卵内，使绿色荧光蛋白基因导入到叉尾斗鱼基因组内，并得到稳定遗传和表达，从而创制成一种转基因叉尾斗鱼，这种转基因叉尾斗鱼既能够用于基因功能研究又提升了其观赏价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用pRC/CMV-EGFP质粒创制转基因叉尾斗鱼方法。
背景技术
pRC/CMV是一种具有CMV强启动子的真核表达载体，也是一种功能强大的转基因载体，具有CMV启动子，源于BGH的转录终止信号，SV40复制原点。以pRC/CMV为载体的转基因研究在人类医学和畜禽上的研究报道较多，在水产动物中也有过研究报道(如斑马鱼)，但在叉尾斗鱼上未见相关报道。叉尾斗鱼Macropodus opercularis(Linnaeus)属于鲈形目Perciformes攀鲈科Anabantidae，是一种广泛分布于我国南方及东南亚各国的内陆小型淡水观赏鱼，具有来源广、易于传代和饲养容易等优势。本发明将pRC/CMV真核表达载体及EGFP引入到叉尾斗鱼转基因技术中，利用pRC/CMV为载体，将绿色荧光蛋白基因整合到叉尾斗鱼基因组内，这一技术不仅能够提升叉尾斗鱼的观赏价值，达到育成具有特异性功能叉尾斗鱼新品种，而且还是首次将pRC/CMV-EGFP质粒导入叉尾斗鱼中，开辟和丰富了转基因水产动物的种类和方法，具有重要理论意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用pRC/CMV为载体，将绿色荧光蛋白基因整合到叉尾斗鱼基因组内，创制转基因叉尾斗鱼方法，是先构建含Amp抗性基因、PCMV启动子、绿色荧光蛋白标志基因和SV40的多聚腺苷酸识别序列的pRC/CMV-EGFP质粒，利用显微注射的转基因技术将这种质粒导入叉尾斗鱼基因组内，借助绿色荧光蛋白基因的作用筛选、创制成一种转基因叉尾斗鱼，这一转基因技术的建立不仅能够提升叉尾斗鱼的观赏价值，达到育成具有特异性功能的叉尾斗鱼新品种，而且还是首次以叉尾斗鱼作为实验材料进行转基因研究，拓宽了转基因水产动物的研究空间。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
(1)采用分子克隆技术和基因重组的方法，将具有CMV强启动子的PRC/CMV真核表达载体与EGFP连接构建获得带有绿色荧光标记基因的pRC/CMV-EGFP真核表达质粒，pRC/CMV-EGFP质粒包含Amp抗性基因、PCMV启动子、绿色荧光蛋白标志基因和SV40的多聚腺苷酸识别序列。
(2)采用显微注射转基因方法，将pRC/CMV-EGFP质粒导入叉尾斗鱼受精卵G0代，饲养至成鱼以交配续代G1代，在G1代的胚胎发育至仔鱼时期，通过选择荧光标志基因获得稳定遗传的转基因叉尾斗鱼。
所述的采用显微注射转基因方法的注射时间是产卵后1小时以内、处于单细胞时期的叉尾斗鱼受精卵，显微注射的pRC/CMV-EGFP质粒总浓度在40ng/μl～250ng/μl之间，质粒溶解在0.1mM～2mM含有1mM～8mM氯化钠的磷酸缓冲液中；每粒受精卵注射质粒的总体积在0.5nl～5nl之间。
转绿色荧光蛋白基因叉尾斗鱼的挑选和验证方法为：通过荧光体视显微镜筛选表达绿色荧光蛋白标志的转基因叉尾斗鱼，荧光体视显微镜的激发波长为460nm～490nm，发射波长为510nm～550nm。
本发明具有的有益效果是：
可以借助荧光标记基因筛选转基因叉尾斗鱼个体，这种转绿色荧光蛋白基因叉尾斗鱼能够提升叉尾斗鱼的观赏价值，达到育成具有特异性功能的叉尾斗鱼新品种。另外，开拓了叉尾斗鱼转基因技术研究，为拓宽转基因水产动物的研究空间打下基础。
附图说明
图1是pRC/CMV-EGFP质粒结构图。
图2是G1代鱼绿色荧光蛋白基因PCR检测结果一。
图3是G1代鱼绿色荧光蛋白基因PCR检测结果二。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
采用显微注射方法，将携带绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因的pRC/CMV-EGFP质粒(图1)的浓度调节为40ng/μl，质粒溶解在0.1mM含有8mM氯化钠的磷酸缓冲液中，然后在叉尾斗鱼产卵1小时内采用显微注射方法导入受精卵中，导入部位为受精卵动物极，导入总体积为5nl。从转基因实验的G1代叉尾斗鱼的胚胎发育时期开始，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)筛选获得稳定表达EGFP标志基因的转基因斗鱼，激发波长为460nm～490nm，发射波长为510nm～550nm。
一共注射了1338粒受精卵，G0代获得了215尾叉尾斗鱼，G1代中有14尾叉尾斗鱼为转基因鱼。在检出的G1代转基因叉尾斗鱼个体中，EGFP分别在尾部(3尾)、眼部(9尾)和腹部(2尾)表达。将上述转基因鱼中的4尾鱼(尾部1尾、眼部2尾和腹部1尾)，采用PCR技术进行实验，结果证实了EGFP标记基因已成功导入了叉尾斗鱼中(图2)。PCR上下游引物分别为：5′-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3′和5′-ATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGG-3′。在图2中，泳道4至7为为G1代转基因叉尾斗鱼阳性鱼，其中泳道4为尾部表达EGFP的转基因鱼、泳道5和6为眼部表达EGFP的转基因鱼、泳道7为腹部表达EGFP的转基因鱼；泳道2和3为非转基因叉尾斗鱼的阴性对照；泳道1为pRC/CMV-EGFP质粒阳性对照；Marker为分子标记，单位为bp，从上而下条带分子量为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，200bp，100bp。另外，对PCR扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的条带，用胶回收试剂盒(上海生工)纯化，与pMD18-T载体(TaKaRa)连接，16℃过夜，转化到HB101感受态细胞中，采用蓝白斑挑选阳性克隆，使用EcoR I、Hind III(TaKaRa)双酶切验证，阳性克隆送上海生物工程有限公司测序，测得序列长度为968bp，所得序列经Blast同源搜索确定为EGFP序列。
实施例2：
采用显微注射方法，将携带EGFP标志基因的pRC/CMV-EGFP质粒的浓度为250ng/μl，质粒溶解在2mM含有1mM氯化钠的磷酸缓冲液中，然后在叉尾斗鱼产卵1小时内导入受精卵中，导入总体积为0.5nl。从转基因实验G1代叉尾斗鱼的胚胎发育时期开始，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)筛选表达EGFP标志基因的转基因斗鱼，激发波长为460nm～490nm，发射波长为510nm～550nm。
转基因实验一共注射了1188粒受精卵，获得了220尾叉尾斗鱼，G1代中有13尾叉尾斗鱼为转基因鱼。在检出的G1代转基因叉尾斗鱼个体中，分别在尾部(2尾)、眼部(8尾)和肠道(3尾)具有绿色荧光表达。将上述转基因鱼中的4尾鱼(尾部1尾、眼部2尾和腹部1尾)，采用PCR技术进行实验，结果证实了EGFP标记基因已成功导入了叉尾斗鱼中(图3)。PCR上下游引物分别为：5′-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3′和5′-ATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGG-3′。在图3中，泳道1为非转基因的阴性对照。泳道2和3表示pRC/CMV-EGFP质粒阳性对照；泳道4至7为G1代4尾转基因叉尾斗鱼，其中泳道4为尾部表达EGFP的转基因鱼、泳道5和6为眼部表达EGFP的转基因鱼、泳道7为肠道表达EGFP的转基因鱼；Marker为分子标记，单位为bp，从上而下条带分子量为：
2000bp，1000bp，750bp，500bp，200bp，100bp。另外，对PCR扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的条带，用胶回收试剂盒(上海生工)纯化，与pMD18-T载体(TaKaRa)连接，16℃过夜，转化到HB101感受态细胞中，采用蓝白斑挑选阳性克隆，使用EcoR I、Hind III(TaKaRa)双酶切验证，阳性克隆送上海生物工程有限公司测序，测得序列长度为968bp，所得序列经Blast同源搜索确定为EGFP序列。
实施例3：
携带EGFP标记基因的pRC/CMV-EGFP质粒(图1)的浓度为150ng/μl，质粒溶解在0.6mM含有4mM氯化钠的磷酸缓冲液中，在叉尾斗鱼产卵1小时内显微注射导入受精卵中，导入部位为受精卵动物极，导入总体积为2nl。从转基因实验的G1叉尾斗鱼的胚胎发育时期开始，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)筛选表达EGFP标志基因的转基因斗鱼，激发波长为460nm～490nm，发射波长为510nm～550nm。
一共注射了971粒受精卵，获得了219尾叉尾斗鱼，G1代中有14尾叉尾斗鱼为转基因鱼。在检出的G1代转基因叉尾斗鱼个体中，EGFP有在尾部(2尾)、眼部(11尾)和肠道(1尾)表达的个体。采用PCR技术也证实了EGFP标记基因的成功转入。转基因叉尾斗鱼饲养再至成鱼交配产卵续代。
综上所述，利用pRC/CMV-EGFP质粒已获得能够稳定遗传和表达EGFP荧光标记基因的转基因叉尾斗鱼，证明具有CMV强启动子的PRC/CMV真核表达载体可以作为叉尾斗鱼的一个转基因载体。
Claims (3)
1.一种利用pRC/CMV-EGFP质粒创制转绿色荧光蛋白基因叉尾斗鱼方法，该方法的步骤如下：
(1)采用分子克隆技术和基因重组的方法，将具有CMV强启动子的PRC/CMV真核表达载体与EGFP连接构建获得带有绿色荧光标记基因的pRC/CMV-EGFP真核表达质粒，pRC/CMV-EGFP质粒包含Amp抗性基因、PCMV启动子、绿色荧光蛋白标志基因和SV40的多聚腺苷酸识别序列；
(2)采用显微注射转基因方法，将pRC/CMV-EGFP质粒导入叉尾斗鱼受精卵G0代，饲养至成鱼以交配续代G1代，在G1代的胚胎发育至仔鱼时期，通过选择荧光标志基因获得稳定遗传的转基因叉尾斗鱼。
2.根据权利要求1所述的一种利用pRC/CMV-EGFP质粒创制转绿色荧光蛋白基因叉尾斗鱼方法，其特征在于：所述的采用显微注射转基因方法的注射时间是产卵后1小时以内、处于单细胞时期的叉尾斗鱼受精卵，显微注射的pRC/CMV-EGFP质粒总浓度在40ng/μl～250ng/μl之间，质粒溶解在0.1mM～2mM含有1mM～8mM氯化钠的磷酸缓冲液中；每粒受精卵注射质粒的总体积在0.5nl～5nl之间。
3.根据权利要求1所述的一种利用pRC/CMV-EGFP质粒创制转绿色荧光蛋白基因叉尾斗鱼方法，其特征在于：转绿色荧光蛋白基因叉尾斗鱼的挑选和验证方法为：通过荧光体视显微镜筛选表达绿色荧光蛋白标志的转基因叉尾斗鱼，荧光体视显微镜的激发波长为460nm～490nm，发射波长为510nm～550nm。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105063088A (zh) * | 2015-08-01 | 2015-11-18 | 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 | 一种生态安全型转基因荧光观赏鱼的研制方法 |
| CN106719435A (zh) * | 2016-11-24 | 2017-05-31 | 南京师范大学 | 一种携带增强型绿色荧光蛋白标记的转基因家兔及其构建方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN1322840A (zh) * | 2001-06-20 | 2001-11-21 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种腺相关病毒载体及其制备方法和用途 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 《Mar. Biotechnol.》 19991231 Yutaka Takeuchi, et al Green Fluorescent Protein As a Cell-Labeling Tool and a Reporter of Gene Expression in Transgenic Rainbow Trout , * |
| 《中国优秀硕士论文全文数据库》 20041231 刘洋 外源基因表达载体的构建以及向斑马鱼和鲈鱼胚胎的转移 , * |
| 《自然科学进展》 20040131 茅卫锋 虹鳟鱼组蛋白H3的分子克隆及在稀有鮔鲫中的表达活性分析 , * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105063088A (zh) * | 2015-08-01 | 2015-11-18 | 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 | 一种生态安全型转基因荧光观赏鱼的研制方法 |
| CN106719435A (zh) * | 2016-11-24 | 2017-05-31 | 南京师范大学 | 一种携带增强型绿色荧光蛋白标记的转基因家兔及其构建方法 |
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