CN102115795A

CN102115795A - 一种hpiv病毒荧光定量pcr检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN102115795A
Application number: CN 200910247532
Authority: CN
Inventors: 何剑军; 夏懿; 吴大治; 韩倩; 沈维祥
Original assignee: Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2009-12-30
Filing date: 2009-12-30
Publication date: 2011-07-06

Abstract

本发明涉及一种HPIV病毒荧光定量PCR检测方法及试剂盒。本发明针对人类副流感病毒(HPIVs)基因序列保守片段设计了检测引物和探针，使用改进的一步法RT-PCR实时荧光扩增技术对HPIV病毒RNA进行定性和定量检测，操作简单，重复性好，具有较高的特异性和灵敏性。

Description

一种HPIV病毒荧光定量PCR检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种HPIV病毒荧光定量PCR检测方法及试剂盒，属于分子生物学领域。

背景技术

临床表现

人类副流感病毒(HPIVs)常常引起儿童下呼吸道感染的一种病毒，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒(RSV)。与RSV一样，人类副流感病毒可以造成反复发作的上呼吸道感染(如感冒和喉咙痛)。它也能造成严重的反复感染的下呼吸道疾病(如肺炎，支气管炎和细支气管炎)，特别是在老年人中和有免疫缺陷人群中。人类副流感病毒的四种亚型各有不同的临床和流行病学特征。I型和II型的最典型的临床特征是造成儿童喉气管支气管炎，I型是这种儿童喉气管支气管炎的主要原因，而II型次之。I型和II型均能造成其它的上呼吸道和下呼吸道疾病。III型经常导致肺炎和细支气管炎。IV型很难检出，可能是因为它很少导致严重的疾病。人类副流感病毒的潜伏期一般在1～7天左右。

病毒构造

人类副流感病毒是单链的RNA病毒。病毒表面含有溶合酶和红血球凝聚素-神经氨酸苷酶的醣蛋白刺。从血清学上人类副流感病毒可分为4型(I型到IV型)，其中IV型又分a和b两个亚型。病毒颗粒大小不一(平均直径大小在150纳米～300纳米之间)，形态各异。在外环境下不稳定，在物体表面存活几个小时，肥皂水就很容易使其失去活性。

流行病学特征

与感染者近距离密切接触或接触了污染物而传播的。但具有传染性的物质接触了人的眼睛、口腔或鼻子里的粘膜后就会发生感染，或通过吸入由于喷嚏和咳嗽产生的呼吸道分泌物的飞沫而感染。人类副流感病毒可以在这种悬浮状态下存活一个小时以上。人类副流感病毒无处不在，绝大部分人在儿童时代已受感染。血清学监测表示，5岁及以上儿童有90％～100％有抗人类副流感病毒III型的抗体，有大约75％有抗人类副流感病毒I型和II型的抗体。

诊断

有两种方法可以诊断人类副流感病毒的感染：1)通过组织培养：分离鉴定在细胞中的病毒或直接检测存在于呼吸道分泌物中的病毒，使用免疫荧光试验、PCR、酶联免疫反应测定等方法。2)适当时间收集的两份血清标本中IgG特异抗体的显著升高或检测单一血清标本中特异抗体IgM，而得出结论。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、简便的HPIV病毒荧光定量PCR检测方法及试剂盒。

为解决上述问题，根据GeneBank中的HPIV序列(HPU70948)为模板，设计了一对引物及特异性探针，检测长度为195bp的目标RNA，其引物探针序列分别为：

引物1：5`-ATGTGCTATCAAGACCAGGAAAC-3` (Seq No.1)

引物2：5`-CGTTTACTCTTTCGGTTGCTGT-3` (Seq No.2)

探针1：5`-ACTGGGTTCACTCTCGATTTTTGT-3` (Seq No.3)

或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。

设计的探针跨越了一段内含子，分别与其两端的外显子特异性匹配，这样可非常有效的避免基因组DNA对实验结果的影响，同时也省去了使用DNA酶对样本进行消化用以去除DNA干扰的步骤。

上述方法中使用的探针，其5`端的荧光发光基团可为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridineorange或ROX中任意一种；3`端荧光淬灭基团可为DABCYL、DABSYL、Eclipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或MGB基团中的任意一种。

本发明提供的使用荧光RT-PCR技术定量检测HPIV RNA的方法是使用一步法RT-PCR的技术，使操作更为简便、快速。使用已知浓度的人工合成的RNA序列制作标准曲线，能对标本中的HPIV RNA进行定量分析。其人工合成的RNA序列如下：

人工合成的阳性RNA模板：

5-AUGUGCUAUCAAGACCAGGAAACAAUGAAUAGACUCACAAAAAUCGAGAGUGAACCCAGUCAUCAACAGCAACC

GAAAGAGUAAACG-3` (Seq No.4)

本发明提供的使用荧光RT-PCR技术定量检测HPIV RNA的方法形成的试剂盒组成包括：One step RT-PCR反应缓冲液、探针、混合酶、RNA提取液、校准品1、校准品2、校准品3、阳性对照品和阴性对照品。

其中，One step PCR反应组分包括：Tris-HCl(Ph 8.3)、KCl、dNTP、MgCl₂、引物1、引物2和探针1。混合酶的组成成份包括：AMV酶、RNase Inhibitor、BSA、DTT、Taq酶、UNG酶。另外，探针1的标记为FAM-BHQ1，探针2的标记为TET-BHQ1。

本发明提供的方法形成的试剂盒操作步骤如下：

PCR反应液的配制：按每人份One step RT-PCR反应缓冲液16ul、探针3ul和混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水(RNA阳性对照品直接取8ul)，使反应总体积为30ul，按如下程序进行一步法RT-PCR检测：反应管先在40℃反应10分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃45秒循环40次(60℃退火条件下采集FAM和JOE通道荧光)。

传统的RT-PCR使用两步法扩增，时间长，操作相对复杂，且因多了一个步骤而易发生污染，所以本发明提供的试剂盒采用一步法RT-PCR技术，将RT步骤与PCR步骤一步完成，无须开管进行二次加样，将少了污染的机会。由于反应体系中RT步骤是使用特异性引物进行延伸，与传统的随机引物法相比，逆转录需要的时间更短，通常可在1.5小时内完成全部RT-PCR反应，并且由于试剂盒使用热稳定性较强的AMV逆转录酶，可在50℃进行RT反应，产品的特异性非常高。

附图说明

图1为使用本发明试剂盒在ABI公司ABI7500荧光扩增仪上对3个校准品和3个临床样本的扩增曲线图。

具体实施方式

根据GeneBank中的HPIV相关序列(HPU70948)进行比对和分析，设计和制备引物与探针：

引物1：5`-ATGTGCTATCAAGACCAGGAAAC-3` (Seq No.1)

引物2：5`-CGTTTACTCTTTCGGTTGCTGT-3` (Seq No.2)

探针1：5`ACTGGGTTCACTCTCGATTTTTGT-3` (Seq No.3)

设计并制备人工合成RNA序列：

5-AUGUGCUAUCAAGACCAGGAAACAAUGAAUAGACUCACAAAAAUCGAGAGUGAACCCAGUCAUCAACAGCAACC

GAAAGAGUAAACG-3` (Seq No.4)

将该人工合成的RNA序列用DEPC处理过的水溶解并稀释成1E+6copies/ml、1E+5copies/ml和1E+4copies/ml，依次作为校准品1-3。

按如下配方配制One step RT-PCR反应缓冲液(终浓度)：50mM Tri s-HCl(Ph 8.3)、50mMKCl、300uM dNTP、3mM MgCl2、200nM引物1、200nM引物2和200nM探针1。

按如下配方配制探针(终浓度)：200nM探针1、200nM探针1和1E+4copies/ml内参阳模。

按如下配方配制混合酶(终浓度)：0.5U AMV酶、0.5U RNase Inhibitor、0.1mg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。

试剂盒组成为：

组成成分(20人份/盒) 体积

One step RT-PCR反应缓冲液 380μl

混合酶 60μl

校准品1 20μl

校准品2 20μl

校准品3 20μl

DEPC水 1ml

本发明提供的方法形成的试剂盒未提供mRNA提取试剂，用户可根据自身要求使用传统的酚-氯仿提取方法或购买商业化的RNA提取试剂盒。

检测步骤：

PCR反应液的配制：按每人份One step RT-PCR反应缓冲液19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入适量待检的RNA并补充DEPC水(RNA标准品直接取8ul)，使反应总体积为30ul。

按如下程序进行一步法RT-PCR检测：反应管先在42℃反应10分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃45秒循环40次(60℃退火条件下采集相应探针标记通道的荧光)。

结果分析与监控：

根据仪器分析的结果，在如下情况视实验有效：RNA标准品1-3的Ct值均<35，且呈JOE较好的线性(r＞0.9)。

直接读取仪器分析的定量值即为HPIV RNA的定量值。

SEQUENCE LISTING

<110>上海复星医学科技发展有限公司

上海复星医药(集团)股份有限公司

<120>一种HPIV病毒荧光定量PCR检测方法及试剂盒

<130>XQ00325617211

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgtgctatc aagaccagga aac 23

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cgtttactct ttcggttgct gt 22

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

actgggttca ctctcgattt ttgt 24

<210>4

<211>87

<212>RNA

<213>人工序列

<400>4

augugcuauc aagaccagga aacaaugaau agacucacaa aaaucgagag ugaacccagu 60

caucaacagc aaccgaaaga guaaacg 87

Claims

1.一种HPIV病毒荧光定量PCR检测方法及试剂盒，其特征在于包含一对特异性引物和一条特异性探针，扩增目标片段长度为195bp，引物和探针序列如下：

引物1：5`-ATGTGCTATCAAGACCAGGAAAC-3` (Seq No.1)

引物2：5`-CGTTTACTCTTTCGGTTGCTGT-3` (Seq No.2)

探针1：5`-ACTGGGTTCACTCTCGATTTTTGT-3` (Seq No.3)

人工合成的阳性RNA模板为：

5`-AUGUGCUAUCAAGACCAGGAAACAAUGAAUAGACUCACAAAAAUCGAGAGUGAACCCAGUCAUCAACAGCAACCGAAAGAGUAAACG-3`(Seq No.4)

2.根据权利要求1所述的方法及试剂盒，其特征在于标记探针5`端的荧光发光基团为可以FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、OregonGreen 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange或ROX中任意一种；3`端荧光淬灭基团为DABCYL、DABSYL、Ecl ipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或MGB基团中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的方法及试剂盒，其特征在于使用一步法RT-PCR荧光检测技术，对标本中的Human parainfluenza virus(HPIV)RNA进行定量分析。

4.根据权利要求1所述的方法及试剂盒，其特征在于，试剂盒组成包括：

组成成分(20人份/盒) 体积

One step RT-PCR反应缓冲液 380μl

校准品1 20μl

校准品2 20μl

校准品3 20μl

DEPC水 1ml

其中，One step PCR反应组分包括：Tris-HCl(Ph 8.3)、KCl、dNTP、MgCl₂、引物1、引物2和探针1。混合酶的组成成份包括：AMV酶、RNaseInhibitor、BSA、DTT、Taq酶、UNG酶。另外，探针1的5`端标记的发光基团为FAM，在3`端标记的淬灭基团为Eclipse。校准品为已知浓度的人工合成RNA阳性模板(Seq No.4)。

5.根据权利要求1所述的方法及试剂盒，其特征在于，操作步骤如下：PCR反应液的配制：按每人份One step RT-PCR反应缓冲液19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入适量提取好的总RNA并补充DEPC水(RNA阳性对照品直接取8ul)，使反应总体积为30ul。

按如下程序进行一步法RT-PCR检测：反应管先在50℃反应5分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃35秒循环40次(60℃退火条件下采集FAM通道荧光)。