CN102114492A - 一种新型载体固定化微生物降解污染物的方法 - Google Patents

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崔丽
梁吉艳
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Abstract

本发明涉及一种新型载体固定化微生物降解污染物的方法，主要是利用固定化微生物来降解土壤中的多环芳烃，对有机污染土壤进行修复，通过对固定化载体形状的改变，从而提高其对污染物的降解率。成本低，而且无论是对真菌进行单株固定还是混合固定，中空十字花型的载体对污染物的降解效果都比较好，适于推广应用。

Description

一种新型载体固定化微生物降解污染物的方法
一、技术领域：
本发明涉及固定化微生物对于有机污染土壤的修复，具体的说是采用一种新型的载体形状来实现对多环芳烃（PAHs）的去除。
二、背景技术：
多环芳烃（PAHs）是指由两个或两个以上的高温获得的芳香环，以直链状、角状或串状排列组成的化合物，是有机物不全燃烧或高温裂解的副产品。因此，只要燃烧有机质，就有多环芳烃产生，燃烧温度决定了多环芳烃的混合组成。居民供暖化、内燃发动机和工业活动，如焦碳生产油的精练、铝生、非铁金属的熔炼等是多环芳烃的主要来源。多环芳烃在环境中的含量虽然微量但分布广泛，更由于一些多环芳烃中除含有致癌和致突变的成分外，还含有多种促进致癌的物质，对人体健康产生很大的威胁。
目前，对于已经被污染的生态环境，需要采用生物技术等手段进行修复。生物修复技术具有成本低、处理效果好以及对环境的二次污染小等优点，被认为最有发展前景。固定化微生物技术在生物修复技术中占有重要的地位，它是用化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域，使其保持活性并反复利用的方法，该技术具有微生物密度高、反应速度快、耐毒害能力强等优点。在难降解有机废水处理方面，固定化微生物技术研究已广泛开展，但对于有机污染土壤的修复很少见到报道。
三、发明内容：
1、发明目的：
本发明利用固定化微生物，来降解土壤中的多环芳烃，通过对固定化载体形状的改变，从而提高其对污染物的降解。
2、技术方案：
本发明是通过以下技术方案来实现的：
将土著真菌进行固定化包埋，采用的载体配比为：聚乙烯醇（PVA）为9.5%，海藻酸钠0.6%，活性炭5.5%，10ml菌液，余量为水。降解污染物的相关参数为：水土比3：1~4：1，接种量4.5~5.5%，固定化真菌在28~30℃下，摇床转数120~130r/min。真菌菌种为镰刀菌、木霉和黑曲霉。
一种新型载体固定化微生物降解污染物的方法，其特征在于：该方法按以下步骤进行：
（1）、将真菌菌种放入种子培养基进行微生物培养，待菌种长到对数生长期后，取出10ml菌液与载体充分混匀，载体质量配比为：聚乙烯醇（PVA）为9.5%，海藻酸钠0.6%，活性炭5.5%，余量为水；装入中空十字花型载体磨具内，在冰箱内-10～-15℃冷冻22～24小时得固定化载体，解冻后用质量分数10%的硫酸钠浸泡24小时，再用无菌水浸泡24小时后增殖3次，30℃下，摇床转数130r/min，每次更换增殖培养基，每次增殖的时间为24小时；
（2）、将上述解冻增殖后的固定化载体，按接种量为5%，在28~30℃条件下，接入泥浆培养基上以120~130r/min摇床，完成对污染物的降解。
所述真菌菌种为镰刀菌、木霉和黑曲霉。
将所述镰刀菌、木霉和黑曲霉分别与载体充分混匀。
将所述镰刀菌、木霉和黑曲霉两两混合及三株同时混合后，再与载体充分混匀。
种子培养基的质量配比为：2%葡萄糖，20%的土豆培养基，余量为水；
增殖培养基的质量配比为：2%葡萄糖，0.3%酵母膏，20%的土豆培养基，余量为水；
泥浆培养基的质量配比为：2%葡萄糖，20%的土豆培养基，水土比为3：1～4:1，余量为水。
固定化载体解冻后增殖3次，每次更换增殖培养基时，首先将载体从无菌水中取出后，放入增殖培养基中进行培养，24小时后，取出载体，再次放入新鲜的增殖培养基培养，24小时后再增殖一次，备用。
所述载体直径d为3cm，厚度h为0.3～0.5cm，中央通孔直径D为0.5～0.7cm。
载体的形状至关重要，传统的载体形状多为球型和片型，不适合对真菌的包埋。本发明采用的载体形状为中空十字花型，直径为3cm（具体形态见图1）真菌被固定化包埋后，对芘和苯并(a) 芘的降解效果比较显著。
真菌的特性是菌株大，菌丝长，好氧性强。而传统的球型和片型存在一定的无氧区，不利于真菌的生长。本发明所采用的中空十字花型，解决了死区的问题，同时也提高了载体与污染物的接触面积，有利于对污染物的降解。
3、优点及效果：
本发明具有如下优点：
1、成本低：采用聚乙烯醇和活性炭为载体，材料来源广，价格低廉，对生物不具有毒性。
2、效果好：无论是对真菌进行单株固定还是混合固定，中空十字花型的载体对污染物的降解效果都比较好。单株球型载体对芘和苯并(a)芘的降解，在240小时降解率小于34.3%和15.4%；单株片型载体对芘和苯并(a)芘的降解率小于40.2%和21.6%。而本发明的中空十字花型的载体，单株载体对芘和苯并(a)芘的降解率240小时时大于63.8%和31.8%，降解率明显提高。
四、附图说明：
图1为本发明的中空十字花形载体结构示意图。
五、具体实施方式：
下面结合附图对本发明做进一步的说明：
一种新型载体固定化微生物降解污染物的方法，其特征在于：该方法按以下步骤进行：
（1）、将真菌菌种放入种子培养基进行微生物培养，待菌种长到对数生长期后，取出10ml菌液与载体充分混匀，载体质量配比为：聚乙烯醇（PVA）为9.5%，海藻酸钠0.6%，活性炭5.5%，余量为水；装入中空十字花型载体磨具内，在冰箱内-10～-15℃冷冻22～24小时得固定化载体，解冻后用10%的硫酸钠浸泡24小时，再用无菌水浸泡24小时后增殖3次，30℃下，摇床转数130r/min，每次更换增殖培养基，每次增殖的时间为24小时；
（2）、将上述解冻增殖后的固定化载体，按接种量为5%，在28~30℃条件下，接入泥浆培养基上以120~130r/min摇床，完成对污染物的降解。
所述真菌菌种为镰刀菌、木霉和黑曲霉。
将所述镰刀菌、木霉和黑曲霉分别与载体充分混匀。
还可以将所述镰刀菌、木霉和黑曲霉两两混合及三株同时混合后，再与载体充分混匀。
种子培养基的质量配比为：2%葡萄糖，20%的土豆培养基，余量为水；
增殖培养基的质量配比为：2%葡萄糖，0.3%酵母膏，20%的土豆培养基，余量为水；
泥浆培养基的质量配比为：2%葡萄糖，20%的土豆培养基，水土比为3：1～4:1，余量为水。
固定化载体解冻后增殖3次，每次更换增殖培养基时，首先将载体从无菌水中取出后，放入增殖培养基中进行培养，24小时后，取出载体，再次放入新鲜的增殖培养基培养，24小时后再增殖一次，备用。
所述载体直径d为3cm。
实施例1：
将镰刀菌、木霉、黑曲霉这3株真菌放入种子培养基进行微生物培养取出10ml菌液后，分别与载体充分混匀，载体质量配比为：聚乙烯醇（PVA）为9.5%，海藻酸钠0.6%，活性炭5.5%，余量为水；装入中空十字花型磨具内，在冰箱内-10℃冷冻22小时，载体直径为3cm。解冻后用质量分数10%的硫酸钠浸泡24小时，再用无菌水浸泡24小时后，增殖3次，30℃下，摇床转数130r/min，增殖的时间为24小时，每次更换增殖培养基时：首先将载体从无菌水中取出后，放入增殖培养基中进行培养，24小时后，取出载体，再次放入新鲜的增殖培养基培养，24小时后再增殖一次，备用。
种子培养基的质量配比为：2%葡萄糖，20%的土豆培养基，余量为水。
增殖培养基的质量配比为：2%葡萄糖，0.3%酵母膏，20%的土豆培养基，余量为水。
泥浆培养基的质量配比为：2%葡萄糖，20%的土豆培养基，水土比为3：1，余量为水。
将5%的固定化载体接入泥浆培养基上28℃下120r/min摇床，分别在0 h、48h、96h、168h和240h测其对芘和苯并(a)芘降解率，结果见表1、表2。
表1 固定化单菌对芘的降解率
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表2固定化单菌对苯并(a)芘的降解率
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实施例2：
基本操作与实施例1相同，不同之处在于，将镰刀菌、木霉、黑曲霉这3株真菌，两两混合及三株同时混合，装入中空十字花型磨具内，在冰箱内-15℃冷冻24小时。解冻后用质量分数10%的硫酸钠浸泡24小时，再用无菌水浸泡24小时后增殖3次， 30℃下，摇床转数130r/min，增殖的时间为24小时，每次更换增殖培养基时：首先将载体从无菌水中取出后，放入增殖培养基中进行培养，24小时后，取出载体，再次放入新鲜的增殖培养基培养，24小时后再增殖一次，备用。
种子培养基的配比为：2%葡萄糖，20%的土豆培养基，余量为水。
增殖培养基的配比为：2%葡萄糖，0.3%酵母膏，20%的土豆培养基，余量为水。
泥浆培养基的配比为：2%葡萄糖，20%的土豆培养基，水土比为4：1，余量为水。
将5%的固定化载体接入泥浆培养基上30℃下130r/min摇床，分别在0时、48h、96h、168h和240h测其对芘和苯并(a)芘降解率，结果见表3、表4。
表3  固定化混合菌对芘的降解率
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表4 固定化混合菌对苯并(a)芘的降解率
Figure DEST_PATH_IMAGE004
通过对真菌进行固定化包埋，使其降解污染物的能力大大提高，这为污染土壤的修复提供了一条新的途径。

Claims (7)

1.一种新型载体固定化微生物降解污染物的方法，其特征在于：该方法按以下步骤进行：
（1）、将真菌菌种放入种子培养基进行微生物培养，待菌种长到对数生长期后，取出10ml菌液与载体充分混匀，载体质量配比为：聚乙烯醇（PVA）为9.5%，海藻酸钠0.6%，活性炭5.5%，余量为水；装入中空十字花型载体磨具内，在冰箱内-10～-15℃冷冻22～24小时得固定化载体，解冻后用10%的硫酸钠浸泡24小时，再用无菌水浸泡24小时后增殖3次，30℃下，摇床转数130r/min，每次更换增殖培养基，每次增殖的时间为24小时；
（2）、将上述解冻增殖后的固定化载体，按接种量为5%，在28～30℃条件下，接入泥浆培养基上以120～130r/min摇床，完成对污染物的降解。
2.根据权利要求1所述的一种新型载体固定化微生物降解污染物的方法，其特征在于：所述真菌菌种为镰刀菌、木霉和黑曲霉。
3.根据权利要求1或2所述的一种新型载体固定化微生物降解污染物的方法，其特征在于：将所述镰刀菌、木霉和黑曲霉分别与载体充分混匀。
4.根据权利要求1或2所述的一种新型载体固定化微生物降解污染物的方法，其特征在于：将所述镰刀菌、木霉和黑曲霉两两混合及三株同时混合后，再与载体充分混匀。
5.根据权利要求1或2所述的一种新型载体固定化微生物降解污染物的方法，其特征在于：
种子培养基的质量配比为：2%葡萄糖，20%的土豆培养基，余量为水；
增殖培养基的质量配比为：2%葡萄糖，0.3%酵母膏，20%的土豆培养基，余量为水；
泥浆培养基的质量配比为：2%葡萄糖，20%的土豆培养基，水土比为3：1～4:1，余量为水。
6.根据权利要求1或2所述的一种新型载体固定化微生物降解污染物的方法，其特征在于：固定化载体解冻后增殖3次，每次更换增殖培养基时，首先将载体从无菌水中取出后，放入增殖培养基中进行培养，24小时后，取出载体，再次放入新鲜的增殖培养基培养，24小时后再增殖一次，备用。
7.根据权利要求1或2所述的一种新型载体固定化微生物降解污染物的方法，其特征在于：所述载体直径d为3cm，厚度h为0.3～0.5cm，中央通孔直径D为0.5～0.7cm。
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