CN102112615A - 植物表达构建体及其用途 - Google Patents
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Abstract
公开了在植物中表达感兴趣的分子的方法。一种方法包括在包含至少一种基于双粒病毒组的表达构建体的溶液中接触植物的根，以允许所述至少一种基于双粒病毒组的表达构建体被根吸收，所述表达构建体包含编码所述感兴趣的分子的多核苷酸，并且所述表达构建体还能够在植物宿主中系统无症状散布，由此在植物中表达感兴趣的分子。还公开了能够在宿主植物中系统无症状散布的表达构建体。
Description
发明的领域和背景
本发明在其某些实施方案中涉及能够在植物宿主中无症状地系统散布的双粒病毒组构建体。
可以为了各种目的对植物进行遗传改造，包括为了产生具有增强的病毒抗性的植物，为了开发耐受非生物胁迫的植物，为了商业上改良的植物以及为了出于制药目的和工业目的表达异源多肽。
目前用于将DNA递送到植物中的技术包括直接以及间接的方法。然而，这些递送方法中的每一种并非没有限制。直接的DNA递送系统诸如粒子轰击、碳化硅晶须技术和电穿孔往往导致多个转基因拷贝的整合并且被认为是受限的、不可预测的和暂时的。间接方法诸如农杆菌(Agrobacterium)常常导致多个拷贝的外源DNA与来自载体‘骨架’的不想要的序列一起整合到植物基因组中。
外源DNA整合到植物基因组中变成可遗传的性状产生许多风险。对作物有益的性状可以通过基因水平转移或通过与野生亲缘植物育种杂交为野生植物提供不想要的竞争性优势。同样，用农杆菌转化是复杂的过程，它需要消除由农杆菌在宿主组织中的生长和对转化的植物的选择所产生的假阳性。抗生素抗性作为转基因作物的开发中的标记物的使用也已经产生了有关通过抗生素抗性基因水平转移到土壤微生物而提高环境中抗生素抗性的担忧。科学家现在具有在开发作物植物作商业用途之前移除标记基因的手段，但是这些手段包括另外的成本和繁琐的程序。此外，几个植物物种或品种仍难以转化。
用改良的病毒感染植物比再生稳定转化的植物更简单且更快速，因为植物病毒小且易于操作，具有进入植物细胞的固有能力，并且将加倍产生高拷贝数的感兴趣基因。病毒载体已被改造用于递送遗传材料和在植物中表达重组蛋白。病毒表达系统被认为是瞬时表达系统，因为病毒载体不被整合到宿主的基因组中。然而，病毒载体仍有很多局限性。植物病毒载体具有在它们的植物宿主中引起疾病的潜力，它们拥有在田地中的植物之间自然散布的能力，并且在某些情况下，可以通过花粉或种子散布给下一代。病毒载体在植物中的系统散布上、在宿主范围、表达稳定性上以及在可以耐受的插入物大小上也受限。最后，像转基因植物一样，改良的病毒被分类为基因改造生物(GMO)并因此经受监管约束和道德约束。
属于联体病毒科(Geminiviridae)的病毒携带一个或两个环状单链(ss)DNA基因组并且是昆虫可传递的。菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)、甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)、玉米线条病毒属(Mastrevirus)和番茄伪曲顶病毒属(Topocuvirus)是此科中的属，它们根据基因组结构、昆虫传递性和宿主范围进行分类。菜豆金黄花叶病毒属携带单分体基因组或二分体基因组并且是白粉虱可传递的。另外提出了卫星DNA与单分体菜豆金黄花叶病毒的关联。
番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)是单分体菜豆金黄花叶病毒。它携带从基因间区(IR；也称为“共有区”)双向转录的六个重叠的开放阅读框(ORF)，所述基因间区充当病毒复制起点以及双向启动子。IR大约300bp长并且携带通用基序TAATATT/AC和复制酶相关蛋白(REP)的结合位点。在病毒方向表达了两个ORF(V1、V2)，并且在互补方向表达了四个ORF(C1到C4)。每种基因产物似乎参与多于一种功能。病毒ssDNA被传递给植物并且通过宿主机器转化成双链(ds)DNA(复制形式)。dsDNA复制并表达病毒的mRNA和蛋白。病毒基因不涉及这一复制阶段(dsDNA到dsDNA)。然而，当REP启动滚环复制(RCR)时，RCR中间产物可以充当dsDNA复制的模板，该dsDNA复制依赖于宿主基因活性。在接下来的复制阶段，众多的病毒dsDNA充当RCR的模板，产生子代ssDNA。ORF C1(也称为rep)对于启动RCR是必需的。然后使子代ssDNA分子壳体化，运输到其他组织或传递到其他植物。至少三种病毒基因产物与植物内的病毒移动有关：V2、外壳蛋白(CP)V1和C4。病毒基因V1、V2、C4和可能的C2与症状外观和疾病严重度有关。概括起来，病毒ORF中的五个在病毒DNA复制或表达中没有直接作用(一些具有辅助作用)，而第六个ORF(rep)只参与滚环期。然而，移动和病原性需要病毒基因产物的活性。
病毒卫星与RNA病毒的关联是证据充分的现象。不论壳体化卫星还是处于裸核酸形式的卫星，其复制依赖于辅助病毒。双粒病毒组相关的682个碱基长的DNA卫星首次由Dry等人在1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，7088-7093中报道。此卫星与澳洲型TYLCV相关联并且与辅助病毒没有序列同源性。然而，该卫星携带也存在于辅助病毒的IR中的两个基序：通用颈环基序和REP结合基序。从那以来已发现其他双粒病毒组相关卫星(Briddon等人.，2001，Virology 285，234-243；Mansoor等人，1999，Virology 259，190-199；Zhou等人，2003，J.Gen.Virol.84，237-247)。所有这些卫星DNA(一般称作DNAβ和DNA-1)是病毒DNA大小的大约一半，并且除了上述基序外还携带称为βC1的ORF。推测的βC1蛋白的作用还没有最终确定，但是它可能涉及移动、核定位和沉默抑制(Cui等人，2005，J.Virol.79，10764-10775)。在许多双粒病毒组感染的情况下，卫星决定症状严重度。双粒病毒组卫星通过由辅助病毒提供的因子被壳体化和复制。与特定病毒相关联的卫星可以也被其他双粒病毒组支持复制。
国际专利申请WO2007/141790教导了基于双粒病毒组的构建体，其中待表达的插入序列的侧翼是编码双粒病毒复制酶的非连续核酸序列。
发明概述
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了一种在植物中表达感兴趣的分子的方法，所述方法包括在包含至少一种基于双粒病毒组的表达构建体的溶液中接触植物的根以允许所述至少一种基于双粒病毒组的表达构建体被所述根吸收，所述表达构建体包含编码所述感兴趣的分子的多核苷酸，并且所述表达构建体还能够在植物宿主中系统无症状散布，由此在植物中表达感兴趣的分子。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了一种在植物中表达感兴趣的分子的方法，所述方法包括将感染至少一种基于双粒病毒组的表达构建体的第一植物的部分嫁接到第二植物的部分上，所述表达构建体包含编码所述感兴趣的分子的多核苷酸序列，并且所述基于双粒病毒组的表达构建体还能够在植物宿主中系统无症状散布，由此在植物中表达感兴趣的分子。
根据本发明的一些实施方案，所述基于双粒病毒组的表达构建体没有编码C2和C3编码序列的多核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方案，所述基于双粒病毒组的表达构建体包含编码所述感兴趣的分子的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列的侧翼是编码双粒病毒组复制酶的非连续核酸序列。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了能够在植物宿主中系统无症状散布的基于双粒病毒组的表达构建体，所述表达构建体没有编码C2和C3编码序列的多核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了一种在植物细胞中表达感兴趣的分子的方法，所述方法包括将本发明的核酸构建体引入植物组织中，异源多肽是所述感兴趣的分子，由此在植物细胞中表达感兴趣的分子。
根据本发明的一些实施方案，表达构建体包含：
(i)编码双粒病毒组基因间区(IR)的多核苷酸序列；
(ii)编码修饰的双粒病毒组外壳蛋白(CP)的多核苷酸序列；以及
(iii)编码修饰的双粒病毒组前外壳蛋白(precoat protein)(V2)的多核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方案，表达构建体还包含编码修饰的复制酶蛋白(C1)的多核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方案，所述修饰的复制酶蛋白如在SEQ ID NO：36中所列出。
根据本发明的一些实施方案，表达构建体还包含编码修饰的C4蛋白的多核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方案，表达构建体能够在原核细胞中复制。
根据本发明的一些实施方案，表达构建体不能通过昆虫载体在植物之间传递。
根据本发明的一些实施方案，表达构建体还包含异源多核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方案，所述异源多核苷酸大于1kb。
根据本发明的一些实施方案，所述异源多核苷酸大于5kb。
根据本发明的一些实施方案，所述异源多核苷酸包括操纵子。
根据本发明的一些实施方案，所述异源多核苷酸适于基因沉默。
根据本发明的一些实施方案，表达构建体包含细菌的多核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方案，修饰的双粒病毒组V2蛋白如在SEQ ID NO：6中所列出。
根据本发明的一些实施方案，修饰的双粒病毒组外壳蛋白包括如在SEQ ID NO：3中所列出的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案，修饰的双粒病毒组外壳蛋白包含在编码N端100个氨基酸的核苷酸中的突变或缺失。
根据本发明的一些实施方案，表达构建体包括如在SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所列出的多核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方案，异源多核苷酸编码选自由以下组成的组的多肽：报道分子、抗病毒分子、病毒部分、抗真菌分子、抗细菌分子、抗昆虫分子、抗除草剂分子、耐受生物胁迫或非生物胁迫的分子、药物分子、生长诱导分子以及生长抑制分子。
根据本发明的一些实施方案，双粒病毒组是菜豆金黄花叶病毒。
根据本发明的一些实施方案，双粒病毒组是番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)。
根据本发明的一些实施方案，表达构建体适于在选自由以下组成的组的植物宿主中表达：茄科(Solanaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、伞形科(Umbelliferae)、百合科(Liliacae)、禾本科(Gramineae，Poaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、芭蕉科(Musaceae)、葡萄科(Vitacea)以及十字花科(Cruciferae)。
根据本发明的一些实施方案，感兴趣的分子选自由以下组成的组：报道分子、抗病毒分子、病毒部分、抗真菌分子、抗细菌分子、抗昆虫分子、抗除草剂分子、耐受生物胁迫或非生物胁迫的分子、药物分子、生长诱导分子、在代谢途径中的基因的产物以及生长抑制分子。
根据本发明的一些实施方案，在代谢途径中的基因由操纵子编码。
根据本发明的一些实施方案，植物选自由以下组成的组：茄科、葫芦科、伞形科、百合科、禾本科(Gramineae，Poaceae)、蔷薇科、芭蕉科、葡萄科以及十字花科。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和/或科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实施方案的实施或试验中可使用与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料，但在下面描述了示例性方法和/或材料。在冲突的情况下，将以包括术语定义的本专利说明书为准。此外，材料、方法和实例仅是用作说明的而并非旨在一定限制。
附图简述
在此仅通过举例参考附图对本发明的一些实施方案进行描述。现在详细具体地参考这些图，强调所显示的具体图是通过举例的方式且出于说明讨论本发明的实施方案的目的。在这点上，与这些图一起的描述使得可以如何实施本发明的实施方案对于本领域技术人员而言是清楚的。
在附图中：
图1A-1C是构建体IR-V2-CP(图1A)、IR-V2-CP-GFP(图1B)和IR-GUS的示意图。
图2A-2F是显示IR-V2-CP-GFP在番茄植物中的复制和移动的图像。图2A：阴性对照-未处理的植物，图2B：只用IR-GFP处理的植物，图2C-2F：用IR-V2-CP-GFP处理的植物。
图3A-3B是显示另一卫星的反式复制和移动的IR-V2-CP需求的图像。图3A：IR-GUS与IR-V2-CP一起被注射到植物中。图3B：只用IR-GUS注射的对照植物。
图3C-3F是溴化乙锭染色的凝胶的照片。图3C：用TYLCV-CP引物对来自IR-V2-CP-GFP处理的植物的DNA进行的PCR分析。泳道2、4、6、8：阴性对照；从未处理的植物提取的DNA。泳道3、5、7、9：来自用IR-V2-CP-GFP注射的植物的远端叶子的DNA的分析。图3D：通过RT-PCR在用IR-V2-CP-GFP处理的植物中检测TYLCV-CP转录物。泳道2、4、6：用来自IR-V2-CP-GFP注射的多种植物的RNA模板进行RT-PCR。泳道3、5、7：用相同的RNA模板在没有反转录酶的情况下进行相同的反应。图3E：用GFP引物进行植物的PCR分析。泳道2、5：用IR-V2-CP-GFP注射植物。泳道3、4：从未处理的植物中提取DNA。图3F：在IR-V2-CP-GFP注射的植物中排除TYLCV的存在的PCR测定。用TYLCV CP的引物(产物应该出现在质粒处理和病毒感染的植物中)和用TYLCV C2的引物(产物应该只出现在TYLCV感染的植物中)进行PCR。泳道6：阴性对照；用来自未处理的植物的DNA进行PCR。在图3C-3F的最左侧泳道中显示了大小标准参照物。
图4是显示根状茎中的GUS的PCR分析结果的溴化乙锭染色的凝胶的照片，所述根状茎已经用携带IL-60-BS+IR-GUS的接穗嫁接。泳道1至泳道3：不同的嫁接的烟草植物。泳道4至泳道6：不同的嫁接的番茄植物。泳道7：阴性对照(无模板)。泳道8：大小标准参照物。
图5是显示根状茎中的PRN的PCR分析结果的溴化乙锭染色的凝胶的照片，所述根状茎已经用携带IL-60-BS+IR-PRN的接穗嫁接。泳道1至泳道3：不同的嫁接的烟草植物。泳道4至泳道6：不同的嫁接的番茄植物。泳道7-9：阴性对照(无模板)。泳道10：大小标准参照物。
图6是显示来自番茄植物的叶的GUS的PCR分析结果的溴化乙锭染色的凝胶的照片，IL-60-BS和IR-GUS已经通过根被转移到该番茄植物中。
本发明具体实施方案的描述
本发明在其某些实施方案中涉及能够在植物宿主中无症状系统散布的双粒病毒组构建体和使用该双粒病毒组构建体表达感兴趣的分子的方法。
在详细地解释本发明的至少一个实施方案之前，必须理解本发明不一定受限于应用到以下描述中所列出或通过实施例示例说明的细节。本发明能够具有其他实施方案或者能够以多种方式实施或执行。
番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)是单分体菜豆金黄花叶病毒。它携带从基因间区(IR；也称为“共有区”)双向转录的六个重叠的开放阅读框(ORF)，所述基因间区充当病毒复制起点以及双向启动子。IR大约300bp长并且携带通用基序TAATATT/AC[SEQ ID NO：9]和复制酶相关蛋白(REP)的结合位点。在病毒方向表达了两个ORF(V1、V2)，并且在互补方向表达了四个ORF(C1到C4)。
当分析TYLCV的基因的关联性时，发明人发现病毒方向(有意义的)基因V1和V2与病毒整合区(IR)一起对于病毒的dsDNA复制(dsDNA到dsDNA)、其在整个植物中的动员及其基因的表达是足够的。由于以下事实这是特别出人意料的：之前显示在C4中的突变导致系统散布的缺乏并降低番茄植物中的病毒水平，并且C4因此被认为与移动有关(Jupin等人(1994)Virology 204，82-90)。
然而，发明人发现没有功能性C1、C2、C3和C4的1486bp IR-V2-CP片段能够促进DNA复制和动员，但是排除了复制的滚环期。因此，这种片段阻止单链(ss)DNA的合成。所以，发生复制、动员和表达而没有引起疾病症状。
当将本发明付诸实施时，发明人显示这种构建体可以用于在植物中表达外源DNA(图2A-2F和图3C-3F)。发明人还显示这种构建体能够用于辅助另一种基于双粒病毒组的卫星的复制和移动(图3A-3B)。
此外，发明人发现能在植物宿主中系统无症状散布的基于双粒病毒组的表达载体能够通过植物的根被吸收到植物中(图5和图6)或通过嫁接从一个植物转移至另一个植物(图4)。
因此根据本发明的一个方面，提供了能够在植物宿主中系统无症状散布的基于双粒病毒组的表达构建体，所述表达构建体没有编码C2和C3编码序列的多核苷酸序列。
如本文所用，短语“系统的无症状散布”是指本发明的基于植物病毒的载体例如散布到不充当感染位点的叶中且不引起特征性双粒病毒组症状(诸如叶黄化、叶卷曲、植物生长的发育障碍或花或果实的发育的发育障碍)的能力。
易感宿主物种的实例包括戟叶鹅绒藤(Cynanchum acutum)、曼陀罗(Datura stramonium)、沙漠莨菪(Hyoscyamus desertorum)、兵豆(Lens culinaris)、番茄(Lycopersicon esculentum)、醋栗番茄(Lycopersicon pimpinellifolium)、锦葵Malva nicaensis、小花锦葵(Malva parviflora)、本氏烟(Nicotiana benthamiana)、心叶烟(Nicotiana glutinosa)、普通烟(Nicotiana tabacum)、菜豆(Phaseolus vulgaris)和苦苣菜(Sonchus oleraceus)，以及不易感宿主物种诸如秋葵(Abelmoschus esculentus)、蜀葵(Althaea rosea)、反枝苋(Amaranthus retroflexus)、落花生(Arachis hypogaea)、滨藜属(Atriplex)、甜菜(Beta vulgaris)、牛角瓜Calotropis aegyptia、马槟榔Capparis aegyptia、苋色藜(Chenopodium amaranticolor)、黄瓜(Cucumis sativus)、千日红(Gomphrena globosa)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、扶桑(Hibiscus rosa-sinensis)、克里特花葵.(Lavatera cretica)、忍冬属(Lonicera)、枸杞属(Lycium)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、胶苦瓜(Momordica balsamina)、欧洲夹竹桃(Nerium oleander)、黄花烟草(Nicotiana rustica)、浆果木犀草(Ochradenus baccatus)、洋酸浆(Physalis floridana)、豌豆(Pisum sativum)、蓝茉莉(Plumbago capensis)、木贼状蓼(Polygonum equisetiforme)、马齿苋(Portulaca oleracea)、实心牧豆树(Prosopis farcta)、蓖麻(Ricinus communis)、黄水茄(Solanum incanum)、红果龙葵(Solanum villosum)、柽柳属(Tamarix)、蒺藜属(Tribulus)、蚕豆(Vicia faba)、催眠睡茄(Withania somnifera)、欧洲苍耳(Xanthium strumarium)和百日菊(Zinnia elegans)。
另外的易感和不易感的宿主在http://pheneDOTcpmcDOTcolumbiaDOTedu/ICTVdB/29030000.htm中列出。
可以用于本发明的优选的双粒病毒组包括番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)以及其他菜豆金黄花叶病毒(参见，pheneDOTcpmcDOTcolumbia.edu/ICTVdB/29030000.htm)。将理解尽管本文利用的一些术语是指由TYLCV编码的基因，但本领域普通技术人员将不只能够鉴定和利用其他双粒病毒组物种和菌株的基因直向同源物。
如提到的那样，本发明的核酸构建体没有功能性C1、C2、C3和C4的编码序列。根据一个实施方案，构建体没有C2和C3编码序列。
根据一个实施方案，本发明的核酸构建体包含C1和C4基因的修饰。这些修饰可能是保守的或非保守的。
根据本发明的这方面的一个实施方案，在C1和C4基因的修饰使得由C1和C4基因编码的蛋白是无功能的。因此，修饰可以是截短、点突变、移码突变、部分缺失或完全缺失。
因此，本发明考虑了这样的构建体：其包含截短的C1序列(SEQ ID NO：36)和截短的C4序列(SEQ ID NO：38)并且完全没有C2和C3。
根据本发明的这方面的另一个实施方案，本发明的核酸构建体包含V1基因(编码外壳蛋白(CP))和/或V2(编码前外壳蛋白)基因的修饰。
例如，已将与病毒在植物中的移动和系统散布有关的CP的部分定位于CP的C端部分(Noris.等人(1998)J.Virol.72，10050-10057)。因此，本发明考虑在某些情况下改变CP的N端部分。在本发明的示例性实施方案中，TYLCV的60个核苷酸(对应于552-612位)可以被缺失，从而引起20个氨基酸(27位至46位)从天然的病毒CP中移除。得到的CP仍将携带二分体核定位信号(NLS；氨基酸1-20)，尽管可能是三分体NLS的第三部分(在41-43位的KRR)将被移除。
根据一个实施方案，CP的序列如在SEQ ID NO：34中所列出。
可替代地或另外，可以通过单碱基缺失在V2基因中引入点突变。例如，可以在天然TYLCV-DNA的640位引入单碱基缺失，引起可能正确的移码-例如通过添加G至天然病毒DNA的744位。由于得到的移码，位于天然CP的56位和91位之间的一段氨基酸序列将变得不同，与IR-V2-CP的相应的一段序列(926位到1031位)没有明显的相似性。然而，除了那点之外，TYLCV和IR-V2-CP的CP序列将几乎相同。由于氨基酸56至91的改变，迄今被测试的所有双粒病毒组所携带的保守序列GCEGPCKVQS(SEQ ID NO：33)(Kirthi等人(2003)Arch.Virol.148，2369-2380)将从IR-V2-CP中失去。在许多病毒(但不是TYLCV)中，这种序列是连接至单链(ss)DNA(显然为了壳体化)所需的锌指基序的部分，所述连接对于载体而言是多余的特性。
在CP的N端缺失通常导致在重叠的ORF V2(“前外壳”)的C端的缺失。因此，例如，本发明考虑了包含在SEQ ID NO：37中所列出的V2基因、编码在SEQ ID NO：6中列出的多肽序列的构建体。
将理解为了本发明的表达构建体被表达，表达构建体通常包含IR区。这个区域除了其他之外还充当双向启动子。
IR来源的序列可以包括例如由TYLCV(GenBank登录号X15656)的同等的(coordinate)1-314或62-314所限定的核苷酸区域。例如，IR来源的序列可以在SEQ ID NO：35中列出。
本发明还考虑了IR区的修饰。通常，这些修饰不影响启动子区域或IR在植物中的延长时间(例如，长于1个月、3个月、6个月、1年或甚至经过植物的整个生命期)内指导在植物中表达的能力。
可以被靶向修饰的IR区的一个实例是复制相关蛋白结合结构域(Akbar Behjatnia等人Nucleic Acids Research，1998，第26卷，4期，925-931)。
前述变化都与卸甲(disarmed)dsDNA构建体一致，所述卸甲dsDNA构建体能够通过吸引宿主机器到其复制起点来复制(dsDNA到dsDNA)并保留其可动性，但是没有产生子代病毒ssDNA的能力。
本发明的示例性构建体在SEQ ID NO：11中列出，该构建体只包含IR区、V2基因和CP基因(参见图1A)。将理解该构建体还可以包含不编码功能性多肽的另外的序列。因此，本发明另外的示例性构建体如在SEQ ID NO：10中列出。
如在以下实施例部分中进一步详述的那样，可以使用普通技术人员公知的分子技术诸如PCR完成上述构建体。
优选地，本发明的核酸构建体携带一个或多个多核苷酸插入物以便为本发明的核酸构建体提供另外的特征。这样的插入物可以是几个核苷酸至几千个核苷酸长。这种插入物可以包括完整的真核或原核表达载体、多接头插入物或具有生物活性的分子。在任何情况下，应该注意本发明的核酸构建体可以携带使最终的双粒病毒组增加20-100％并且超过野生型基因组的双粒病毒组多达200％的插入物，并且本发明的核酸构建体还能够有效地在整个宿主植物散布。插入物可以编码可替代的或另外的功能，包括，例如：细菌复制、抗生素抗性、亲和纯化标签以及类似功能。
本发明的核酸构建体的一个优选的用途是感兴趣的多核苷酸或多肽的植物表达。编码感兴趣的分子的多核苷酸可以被插入到本文描述的表达构建体中，因此其中该构建体的IR区充当启动子-参见例如图1B。可替代地，编码感兴趣的分子的多核苷酸可以被插入在只包含IR序列的其他构建体(即可反式激活的表达载体)上。这种构成可能对于能够下调基因表达的dsRNA的表达而言特别有用。因为IR区作为双向启动子起作用，所以IR区两边的侧翼可以都是编码RNA分子的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列在表达后能够杂交形成dsRNA。这种构成在本文以下和通过引用并入本文的WO2007/141790中更详细地描述。
可反式激活的表达载体与本发明的构建体一起共施用将导致感兴趣分子的表达(参见例如图3A-3B)。可替代地，反式激活可能受逐步引入本发明的构建体和可反式激活的表达载体影响。
本领域普通技术人员熟悉这样的核酸或蛋白：其表达受本发明的表达载体控制是有利的。此外，熟练技术人员熟悉这样的基因：通过表达例如适合的双链RNA或反义RNA阻遏或缺失所述基因将导致期望的作用。
以下示例说明了在本发明的表达载体的控制下表达具有有利作用的核酸序列。
表达的多核苷酸序列可以编码这样的分子：所述分子将保护植物免受非生物胁迫因素，诸如干旱、热或寒冷。实例包括来自短角床杜父鱼(Myoxocephalus Scorpius)(WO 00/00512)、多刺床杜父鱼(Myoxocephalus octodecemspinosus)的防冻多肽；拟南芥转录激活子CBF1；谷氨酸脱氢酶(WO 97/12983、WO 98/11240)；钙依赖性蛋白激酶基因(WO 98/26045)；钙依赖磷酸酶(WO 99/05902)；来自酵母的酪蛋白激酶(WO 02/052012)，法尼基转移酶(WO 99/06580；Pei Z M等人(1998)Science 282：287-290))，铁蛋白(Deak M等人(1999)Nature Biotechnology 17：192-196)；草酸氧化酶(WO 99/04013；Dunwell J M(1998)Biotechn Genet Eng Rev 15：1-32)；DREBlA因子(“脱水应答元件B 1A”；Kasuga M等人(1999)Nature Biotech 17：276-286)；甘露醇或海藻糖合成的基因，诸如海藻糖-磷酸合酶或海藻糖-磷酸磷酸酶(WO 97/42326)或通过抑制诸如海藻糖酶的基因(WO 97/50561)。
表达的多核苷酸序列可以是食品和饲料行业中使用的代谢酶。实例包括植酸酶(GenBank登录号：A19451)和纤维素酶。
表达的多核苷酸序列可以通过直接攻击病原体、打开宿主防御或通过导致某些代谢产物或蛋白的积累而赋予对病毒、真菌、昆虫、线虫和疾病的抗性。实例包括葡萄糖异硫氰酸盐(防御食草动物)；几丁质酶或葡聚糖酶、以及破坏寄生虫细胞壁的其他酶；核糖体失活蛋白(RIPS)以及当植物被微生物或在化学上被例如水杨酸、茉莉酸或乙烯伤害或攻击时所诱导的植物抵抗反应和胁迫反应的其他蛋白；或来自非植物来源的溶菌酶，诸如例如T4溶菌酶，或来自多种哺乳动物的溶菌酶，杀虫蛋白诸如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素、α-淀粉酶抑制剂或蛋白酶抑制剂(豇豆胰蛋白酶抑制剂)；凝集素诸如麦胚凝集素；siRNA；反义RNA；RNA酶或核酶。其他实例是编码哈茨木霉(Trichoderma harzianum)chit42内切几丁质酶(GenBank登录号：S78423)或来自高粱(Sorghum bicolor)的N-羟基化多功能细胞色素P-450(CYP79)蛋白(GenBank登录号：U32624)或其功能等同物的核酸。
作为保护免于害虫(Rask L等人(2000)Plant Mol Biol 42：93-113；Menard R等人(1999)Phytochemistry 52：29-35)、苏云金芽孢杆菌内毒素的表达(Vaeck等人(1987)Nature 328：33-37)或保护免受真菌、例如来自豆类的几丁质酶的表达攻击(Broglie等人(1991)Science 254：1194-1197)的葡萄糖异硫氰酸盐的积累是有利的。通过表达雪花莲(Galanthus nivalis)凝集素可以实现对害虫的抵抗，所述害虫诸如例如在水稻植物中的水稻害虫褐飞虱(Nilaparvata lugens)(Rao等人(1998)Plant J 15(4)：469-77)。
编码鳞翅目特异性苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的合成的cryIA(b)基因和cryIA(c)基因的表达可以造成在多种植物中对昆虫的抵抗(Goyal R K等人(2000)Crop Protection 19(5)：307-312)。
适合于病原体防御的其他基因包括“多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白”(PGIP)、奇异果甜蛋白、转化酶和抗微生物肽诸如乳铁蛋白(Lee T J等人(2002)J Amer Soc Horticult Sci 127(2)：158-164)。
表达的多核苷酸序列可以造成化学物质诸如生育酚、生育三烯酚或类胡萝卜素的积累。这种多核苷酸的一个实例是八氢番茄红素去饱和酶。编码洋水仙(Narcissus pseudonarcissus)八氢番茄红素去饱和酶(GenBank登录号：X78815)或其功能等同物的核酸是优选的。
表达的多核苷酸序列可用于生产营养制品，诸如例如，多不饱和脂肪酸(花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸)，实例包括脂肪酸延长酶和/或去饱和酶；或用于生产具有提高的营养价值的蛋白，诸如具有高含量必需氨基酸的蛋白(例如巴西坚果的高蛋氨酸2S白蛋白基因)。编码以下蛋白的多核苷酸序列是优选的：巴西栗高蛋氨酸2S白蛋白(GenBank登录号：AB044391)、小立碗藓(Physcomitrella patens)δ6-酰基-脂质去饱和酶(GenBank登录号：AJ222980；Girke等人(1998)Plant J 15：39-48)、高山被孢霉(Mortierella alpina)δ6-去饱和酶(Sakuradani等人1999 Gene 238：445-453)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)δ5-去饱和酶(Michaelson等人1998，FEBS Letters 439：215-218)、秀丽隐杆线虫A5-脂肪酸去饱和酶(des-5)(GenBank登录号：AF078796)、高山被孢霉δ5-去饱和酶(Michaelson等人JBC 273：19055-19059)、秀丽隐杆线虫δ6-延长酶(Beaudoin等人2000，PNAS 97：6421-6426)、小立碗藓δ6-延长酶(Zank等人2000，Biochemical Society Transactions 28：654-657)或这些蛋白的功能等同物。
表达的多核苷酸序列可用于生产工业目的(例如酶，诸如脂肪酶)或用作药物制剂(诸如，例如由Hood E E，Jilka J M(1999)Curr Opin Biotechnol 10(4)：382-6；Ma J K，Vine N D(1999)Curr Top Microbiol Immunol 236：275-92所述的抗体、凝血因子、干扰素、淋巴因子、菌落刺激因子、纤溶酶原激活剂、激素或疫苗)的高质量蛋白和酶。例如，有可能在转基因玉米植物中大规模生产来自鸡卵白的重组抗生物素蛋白和细菌P-葡萄糖醛酸酶(GUS)(Hood等人(1999)Adv Exp Med Biol 464：127-47.综述)。
表达的多核苷酸序列可用于获得在正常包含较少储存蛋白或储存脂质的细胞中提高的耐储存性，目的是提高这些物质的产量。实例包括乙酰辅酶A羧化酶。优选的多核苷酸序列是编码紫花苜蓿乙酰辅酶A羧化酶(accase)(GenBank登录号：L25042)或其功能等同物的那些。
可表达的多核苷酸的其他实例包括乙型肝炎表面抗原[Kumar GBS等人，PLANTA 222(3)：484-493，2005]、除草剂抗性[Duke，SO，Pest Management Science 61：211-218，2005]、干扰素[Edelbaum，O.等人，J.Interferon Res.12：449-453，1992]、T7-RNA聚合酶[Zeitoune等人，Plant Science 141：59-65.，1997]。
可以被本发明的表达载体表达的多核苷酸序列的其他实例在例如Dunwell J M，Transgenic approaches to crop improvement(改良作物的转基因方法)，J Exp Bot.2000；51页487-96中被提及。
本发明的表达载体还可以用于减少(抑制)靶基因的转录和/或翻译。因此，本发明的表达载体可以表达造成PTGS(转录后基因沉默)或TGS(转录沉默)作用并因此造成内源基因的表达减少的核酸。这种减少可以通过例如反义RNA的表达(EP-A1 0 458 367；EP-A1 0 140 308；van der Krol A R等人(1988)BioTechniques 6(10)：658-676；de Lange P等人(1995)Curr Top Microbiol Immunol 197：57-75，除了别的以外)或双链RNA的表达来实现，所述反义RNA和双链RNA各自具有与待抑制的内源靶基因的同源性。同样，适合的有义RNA的表达可以通过称为共抑制(EP-A1 0 465 572)的方式造成内源基因表达的减少。通过RNA干扰(RNAi)减少靶基因的基因表达的双链小干扰RNA(siRNA)的表达是特别优选的。WO 99/32619和WO 99/53050描述了使用具有双链结构的RNA抑制单个靶基因的方法，其中靶基因和RNA双链体区域具有至少部分同一性(还参见：Montgomery M K等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95：15502-15507；Sharp P A(1999)Genes & Development 13(2)：139-141；Fire A等人(1998)Nature 391：806-11)。
下面示例说明了这样的应用：其中基因表达的减少可以使用本发明的表达载体进行。
延迟的果实成熟或改良的成熟表型(延长成熟，稍后衰老)可以通过例如减少选自由以下组成的组的基因的基因表达来实现：多聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶、β-(1，4)葡聚糖酶(纤维素酶)、β-半乳聚糖酶(β-半乳糖苷酶)；或乙烯生物合成的基因，诸如1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶、腺苷甲硫氨酸水解酶(SAM酶)、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶；类胡萝卜素生物合成的基因，诸如，例如，前八氢番茄红素生物合成或八氢番茄红素生物合成的基因，例如八氢番茄红素去饱和酶和O-甲基转移酶；酰基载体蛋白(ACP)；延伸因子；生长素诱导基因；半胱氨酸(硫醇)蛋白酶；淀粉磷酸化酶；丙酮酸脱羧酶；查耳酮还原酶；蛋白激酶；生长素相关基因；蔗糖转运蛋白；分生组织模式基因。其他有利的基因被描述在例如WO 91/16440、WO 91/05865、WO 91/16426、WO 92/17596、WO 93/07275或WO 92/04456中。用于防止细胞降解以及植物和果实(例如番茄)的烂软的多聚半乳糖醛酸酶的表达减少是特别优选的。核酸序列诸如番茄多聚半乳糖醛酸酶基因(GenBank登录号：x14074)或其同系物的核酸序列优选地用于此目的。
针对非生物胁迫因素(热、寒冷、干旱、湿度升高、污染物、UV辐射)的改善的保护。减少与胁迫反应有关的基因的表达是优选的。
编码储存蛋白(本文以下称SP)的基因的基因表达的减少具有众多优点，诸如，例如，减少过敏的潜力或有关其他代谢产物的组成或数量(诸如，例如，油或淀粉的含量)的改变。
可以通过减少对特定病原体的生长、生存、某些发育阶段(例如蛹化)或增殖必要的基因的基因表达来实现对植物病原体和疾病的抵抗，所述植物病原体诸如蜘蛛、真菌、昆虫、线虫、原生动物、病毒、细菌。这种减少可以造成上述步骤的完全抑制或上述步骤的延迟。它们可以采用例如使得病原体的穿透成为可能的植物基因形式，但是也可以是同源病原体基因。以转基因方式表达的核酸序列(例如双链RNA)优选针对病原体的基因。起作用的抗病原剂在这种情况下可以是以转基因方式表达的核酸序列本身(例如双链RNA)，但也可以是转基因表达盒或转基因生物。处于转基因生物形式的植物本身可以包含这些剂并且将它们以例如胃毒形式传递到病原体上。多种病原体的多种必需基因是熟练技术人员已知的(例如，对于线虫抗性WO 93/10251、WO 94/17194)。
病毒抗性可以例如通过减少病毒外壳蛋白、病毒复制酶、病毒蛋白酶以及类似物的表达来实现。大量植物病毒和适合的靶基因是熟练技术人员已知的。
不期望的、引起过敏的或有毒的植物组分诸如例如葡萄糖异硫氰酸盐或patatin的减少。描述了适合的靶基因(除了其他之外，在WO 97/16559中)。优选用于减少引起过敏的蛋白的靶基因被例如Tada Y等人(1996)FEBS Lett 391(3)：341-345或Nakamura R(1996)Biosci Biotechnol Biochem 60(8)：1215-1221描述。
延迟的衰老征兆。除其他之外，适合的靶是肉桂酰辅酶A：NADPH还原酶或肉桂酰-醇脱氢酶。描述了其他适合的靶基因(除了其他之外，在WO 95/07993中)。
通过减少例如多酚氧化酶(WO 94/03607)以及类似酶来减少对例如马铃薯的损伤的易感性。
通过减少苏氨酸生物合成，例如通过减少苏氨酸合酶的表达来增加蛋氨酸含量(Zeh M等人(2001)Plant Physiol 127(3)：792-802)。
将理解本发明的核酸构建体还可以表达显示期望活性(即，生物活性)的上述分子的同系物。这些同系物可以与上述任何表达的序列例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，使用Wisconsin序列分析包的BestFit软件利用Smith和Waterman算法确定，在该算法中，空位权重等于50，长度权重等于3，平均匹配等于10，并且平均错配等于-9。
因此，本发明提供了基于双粒病毒组的核酸构建体，该核酸构建体系统散布于整个宿主植物系统并且还没有在其中诱导症状。
概括起来，可以为了任何目的利用本发明的核酸构建体。使用的实例包括以下方面：
(i)为了各种目的进行的蛋白(以上提供的具体实例)的植物表达，所述目的包括植物改良、生物制药等等；
(ii)核酸分子(例如，siRNA，以上提供的具体实例)的植物表达；
(iii)产生检测病毒感染的指示植物-携带包含与IR区相连的报道分子(例如，荧光团)的构建体的植物将在被双粒病毒组感染时表达该报道分子；以及
(iv)产生抗感染的植物-携带包含与例如IR区相连的抗病毒或抗植物分子的构建体的植物将在被双粒病毒组感染时表达这种分子；这种“免疫性”或自杀方案将只在植物被感染时有效；因为本发明的核酸构建体优选是瞬时的并且不被稳定地整合到宿主植物的基因组中，所以这种性状既不会被该植物的子代遗传也不会在植物的商业产品中持续存在。
还可以利用本发明的核酸构建体来稳定地或优选瞬时地转化植物细胞。在稳定转化中，本发明的核酸分子被整合到植物基因组中，并且像这样的话它代表稳定且遗传的性状。在瞬时转化中，核酸分子被转化的细胞表达但不整合到基因组中，并且像这样的话代表瞬时性状。
存在将外源基因引入单子叶植物和双子叶植物中的多种方法(Potrykus，I.(1991).Annu Rev Plant Physiol Plant Mol 42，205-225；Shimamoto，K.等人(1989).Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts(从转化的原生质体中再生能育的转基因水稻植物).Nature(1989)338，274-276)。
外源DNA稳定整合到植物基因组DNA中的主要方法包括两个主要途径：
(i)农杆菌介导的基因转移。参见：Klee，H.J.等人.(1987).Annu Rev Plant Physiol 38，467-486；Klee，H.J.和Rogers，S.G.(1989).Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants(植物的细胞培养和体细胞遗传学)，第6卷，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes(植物核基因的分子生物学)，第2-25页，J.Schell和L.K.Vasil，编，Academic Publishers，San Diego，Cal.；和Gatenby，A.A.(1989).Regulation and Expression of Plant Genes in Microorganisms(植物基因在微生物中的调节和表达)，第93-112页，Plant Biotechnology，S.Kung和C.J.Arntzen，编，Butterworth Publishers，Boston，Mass。
(ii)直接的DNA摄取。参见，例如：Paszkowski，J.等人(1989).Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants(植物的细胞培养和体细胞遗传学)，第6卷，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes(植物核基因的分子生物学)，第52-68页，J.Schell和L.K.Vasil，编，Academic Publishers，San Diego，Cal.；和Toriyama，K.等人(1988).Bio/Technol 6，1072-1074(DNA直接摄入到原生质体中的方法)。还参见：Zhang等人(1988).Plant Cell Rep 7，379-384；和Fromm，M.E.等人(1986).Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation(在通过电穿孔转移基因后玉米的稳定转化).Nature 319，791-793(由植物细胞的短暂电击引起的DNA摄取)。还参见：Klein等人(1988).Bio/Technology 6，559-563；McCabe，D.E.等人(1988).Stable transformation of soybean(Glycine max)by particle acceleration(通过粒子加速稳定转化大豆(甘氨酸最大)).Bio/Technology 6，923-926；和Sanford，J.C.(1990).Biolistic plant transformation(生物射弹植物转化).Physiol Plant 79，206-209(通过粒子轰击将DNA注射到植物细胞或植物组织中)。还参见：Neuhaus，J.M.等人(1987).Theor Appl Genet 75，30-36；以及Neuhaus，J.M.和Spangenberg，G.C.(1990).Physiol Plant 79，213-217(微量移液器系统的使用)。参见美国专利第5,464,765号(细胞培养物、胚或愈伤组织的玻璃纤维转化或碳化硅晶须转化)。还参见：DeWet，J.M.J.等人(1985).″Exogenous gene transfer in maize(Zea mays)using DNA-treated pollen(使用DNA处理的花粉在玉米(Zea mays)中转移外源基因)，″Experimental Manipulation of Ovule Tissue，G.P.Chapman等人，编，Longman，New York-London，第197-209页；和Ohta，Y.(1986).High-Efficiency Genetic Transformation of Maize by a Mixture of Pollen and Exogenous DNA(通过花粉和外源DNA的混合物对玉米进行高效基因转化).Proc Natl Acad Sci USA 83，715-719(用萌发的花粉直接孵育DNA)。
农杆菌介导的系统包括质粒载体的使用，所述质粒载体包含整合到植物基因组DNA中的限定的DNA区段。培养植物组织的方法根据植物物种和农杆菌递送系统而变化。广泛使用的方法是叶盘程序，可以用提供启动全株分化的良好来源的任何组织外植体来进行该程序(Horsch，R.B.等人(1988).″Leaf disc transformation(叶盘转化).″Plant Molecular Biology Manual A5，1-9，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht)。补充方法采用农杆菌递送系统与真空渗入的联合。农杆菌系统在转基因双子叶植物的制造中特别有用。
存在多种将DNA直接转移到植物细胞中的方法。在电穿孔中，将原生质体短暂暴露于强电场中，打开微孔允许DNA进入。在显微注射中，使用微量移液器将DNA机械地直接注射到细胞中。在微粒轰击中，将DNA吸附到微弹(诸如硫酸镁晶体或钨粒子)上，并且以物理方式使微弹加速进入细胞或植物组织中。其他的直接DNA转移技术包括玻璃晶须或碳化硅晶须(参见，例如，Dunwell，Methods Mol Biol.1999；111：375-82)。
在稳定转化后就发生植物繁殖。最常见的植物繁殖方法是通过种子。然而由于杂合性，通过种子繁殖再生的缺点是缺乏均一性，因为种子是由植物根据孟德尔法则支配的遗传变异产生的。换言之，每个种子在遗传上是不同的并且各自将生长出其特定的性状。因此，优选的是实现使得再生的植物具有与亲本转基因植物相同的性状和特征的再生。再生转化的植物的优选方法是通过微繁殖(micropropagation)，微繁殖提供了转化的植物的快速、一致的再现。
微繁殖是由所选的亲本植物或栽培品种切离的单组织样品生长第二代植物的方法。该方法允许具有优选的组织且表达融合蛋白的植物的大量再现。新产生的植物在遗传上与原始植物相同或者具有原始植物的全部特征。微繁殖允许在短时间内大量产生品质植物材料并提供保存原始转基因植物或转化植物的特征的所选栽培品种的快速增殖。这种植物克隆方法的优点包括植物增殖的速度以及所产生的植物的品质和均一性。
微繁殖是多阶段程序，该程序需要在阶段间改变培养基或生长条件。微繁殖过程包括四个基本阶段：阶段一，起始组织培养；阶段二，组织培养物增殖；阶段三，分化和植物形成；以及阶段四，温室培养和强化。在阶段一过程中，建立组织培养物并证明无污染物。在阶段二过程中，增殖起始培养物直到产生足够数目的组织样品以满足生产目标。在阶段三过程中，新生长的组织样品被分割并长成单个小植株。在阶段四，转化的小植株被转移到温室强化，其中植物对光的耐受性逐渐提高使得它们能够继续在自然环境中生长。
本发明也考虑了例如叶细胞、分生组织细胞或整株植物的瞬时转化。
可以通过上述任何DNA直接转移方法或通过机械的或载体介导的病毒感染，使用本发明的植物病毒来源的质粒进行瞬时转化。
如所述的那样，也可以通过将包含本发明的构建体的一株植物的部分嫁接到另一株植物的部分上将该构建体转化到植物中。可替代地，可以通过将植物的根浸泡到包含本发明的构建体的溶液中将该构建体转化到植物中。
因此，根据本发明的另一个方面，提供了一种在植物中表达感兴趣的分子的方法，所述方法包括在包含至少一种基于双粒病毒组的表达构建体的溶液中接触植物的根以允许所述至少一种基于双粒病毒组的表达构建体被所述根吸收，所述表达构建体包含编码所述感兴趣的分子的多核苷酸，并且所述表达构建体还能够在植物宿主中系统无症状散布，由此在植物中表达感兴趣的分子。
根据本发明的又另一个方面，提供了一种在植物中表达感兴趣的分子的方法，所述方法包括将感染至少一种基于双粒病毒组的表达构建体的第一种植物的部分嫁接到第二种植物的部分上，所述表达构建体包含编码所述感兴趣的分子的多核苷酸序列，并且所述基于双粒病毒组的表达构建体还能够在植物宿主中系统无症状散布，由此在植物中表达感兴趣的分子。
如本文所用的术语“嫁接”是指将植物的部分连接在一起以使得它们结合在一起并且汁液可以流动，从而形成能够生长和发育的新植物。嫁接物因此由两部分组成：(i)下部是本文所称的根状茎并且基本上由根系统和茎的一部分组成，以及(ii)上部，产生植物的地上部分的接穗或嫁接物。将理解单个嫁接物可以包含同一株植物的两部分，或者可替代地单个嫁接物可以包含两株不同植物的部分。
优选地，第一株植物和第二株植物对于嫁接是相容的。
如本文所用术语“相容的”是指嫁接的根状茎和植物组织一起生长和存活的能力。众所周知，相容的根状茎和植物组织嫁接物不必来自同一植物物种。例如，可以将番茄接穗嫁接到茄子根状茎上。可以使用标准方法制备转基因根状茎。
可以使用本领域已知的标准材料和方法完成嫁接(参见，例如，Black等人(2003)；Fernandez-Garcia等人(2004)；Edelstein等人(2004)；参见万维网：wwwdotparamount-seedsdotcom/Paramountonline/graftingdothtm；参见万维网：wwwdotagnetdotorg/library/article/eb480dothtml)。
可以根据本发明这方面嫁接的示例性植物包括双子叶植物，诸如，例如：豌豆、苜蓿、番茄、绿番茄(tomatillo)、甜瓜、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝、扁豆、大豆、烟草、马铃薯、蕃薯、萝卜、卷心菜、油菜、苹果树、葡萄、棉花、向日葵、柑桔(包括橙子、桔子、金桔、柠檬、青柠、葡萄柚、红橘、桔柚、枸橼和柚)、胡椒、豆和莴苣。在本发明范围内的植物也包括针叶树。
可用于制备抗病原体的转基因根状茎的番茄根状茎的实例包括但不限于“PG3”和“Beaufort”。可用于提供本发明的接穗的番茄栽培品种的实例包括但不限于：“Monroe”、“Belle”、“Summer Set”、“Match”、“Trust”、“Better Boy”、“Celebrity”、“Grace”、“Heinz 1439”、“Roma”、“Rugers”、“Ultra Girl”、“2710”、“BHN 665”、“STM 0227”、“STM 5206”、“Boy oh Boy”、“Jubilation”、“Sunchief”和“Fabulous”。
考虑的可以从一株植物嫁接到另一株植物或被植物根全部吸收的基于双粒病毒组的表达载体是本文以上描述的那些表达载体以及另外在国际专利申请WO2007/141790中描述的那些表达载体。
术语“包含”、“包含了”、“包括”、“包括了”、“具有”和它们的同根词表示“包括但不限于”。
术语“由…组成”表示“包括且限于”。
术语“基本上由…组成”表示该组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但条件是所述另外的成分、步骤和/或部分没有实质改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征和新颖特征。
如本文所用术语“方法”是指完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者所已知或者容易从已知的方式、手段、技术和程序发展的那些方式、手段、技术和程序。
应理解为了清楚而在不同的实施方案背景下描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中联合提供。相反，为了简略而在单个实施方案背景下描述的本发明的多个特征也可以单独提供或在任何适宜的亚组合中提供或当适合时在本发明的任何其他描述的实施方案中提供。在多个实施方案的背景下描述的某些特征不被认为是这些实施方案的必要特征，除非实施方案没有这些要素不能实行。
在本文以上描绘和在下面权利要求书部分中要求保护的本发明的多个实施方案和方面将在以下实施例中找到实验支持。
实施例
现在参考以下实施例，以下实施例与上面的描述一起以非限制性方式说明本发明的一些实施方案。现在参考以下实施例，以下实施例与上面的描述一起以非限制性方式说明本发明。
一般来说，本文所用的命名法和本发明中利用的实验室程序包括分子技术、生物化学技术、微生物技术和重组DNA技术。这些技术在文献中被透彻地解释。参见，例如，″Molecular Cloning：A laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)″Sambrook等人，(1989)；″Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术)″I-III卷Ausubel，R.M.，编(1994)；Ausubel等人，″Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术)″，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆实验指南)″，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等人，″Recombinant DNA(重组DNA)″，Scientific American Books，New York；Birren等人(编)″Genome Analysis：A Laboratory Manual Series(基因组分析：实验室手册系列)″，1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；在美国专利第4,666,828号；4,683,202号；4,801,531号；5,192,659号和5,272,057号中列出的方法；″Cell Biology：A Laboratory Handbook(细胞生物学：实验室手册)″，I-III卷Cellis，J.E.，编(1994)；Freshney的″Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique(动物细胞的培养-基本技术手册)″，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，第三版；″Current Protocols in Immunology(现代免疫学实验技术)″I-III卷Coligan J.E.，编(1994)；Stites等人(编)，″Basic and Clinical Immunology(基础与临床免疫学)″(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编)，″Selected Methods in Cellular Immunology(细胞免疫学选择方法)″，W.H.Freeman和Co.，New York(1980)；可用的免疫测定法广泛描述于专利文献和科学文献中，参见，例如，美国专利第3,791,932号；3,839,153号；3,850,752号；3,850,578号；3,853,987号；3,867,517号；3,879,262号；3,901,654号；3,935,074号；3,984,533号；3,996,345号；4,034,074号；4,098,876号；4,879,219号；5,011,771号和5,281,521号；″Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)″Gait，M.J.，编(1984)；″Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)″Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编(1985)；″Transcription and Translation(转录和翻译)″Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编(1984)；″Animal Cell Culture(动物细胞培养)″Freshney，R.I.，编(1986)；″Immobilized Cells and Enzymes(固定化细胞和酶)″IRL Press，(1986)；″A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆实验指南)″Perbal，B.，(1984)和″Methods in Enzymology(酶学方法)″1-317卷，Academic Press；″PCR Protocols：A Guide To Methods And Applications(PCR实验技术：方法及应用指南)″，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，″Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual(蛋白质纯化和表征的策略-实验室课程手册)″CSHL Press(1996)；所有这些文献均通过引用并入本文，就仿佛完全在本文列出一样。在本文件通篇提供了其他一般性参考文献。其中的程序被认为是本领域公知的并且是为了读者便利而提供。其中包含的所有信息通过引用并入本文。
方法和材料
TYLCV的克隆-如在Navot，N.，等人[Virology 185，151-161(1991)]中所述那样产生TYLCV的以色列菌株的2.8全长基因组克隆(SEQ ID NO：4 GenBank登录号X15656)。
IL-60的构建-通过对天然TYLCV病毒载体(SEQ ID NO：4)作出以下改变构建本发明的IL-60载体(SEQ ID NO：2)：
(i)编码外壳蛋白TYLCV-CP的N端附近20个氨基酸(SEQ ID NO：5的编号27至46)的60个核苷酸的一段序列(SEQ ID NO：1的编号552至612)的缺失。缺失是通过与Livneh，O.等人[Euphytica 62：97-102(1992)]一致的反向PCR使用以下引物进行：从缺失片段的末端向外的引物[倒转的正向引物(非磷酸化的)：OH-acaggcccatagaccgaaagccca；SEQ ID NO：14，倒转的反向引物(磷酸化的)：P-tgggctgtcgaagttcagcct；SEQ ID NO：15]。用SacI剪切自连接的PCR产物以产生单个(线性)产物，这证实制备了环状形式(非连接的、线性PCR产物在剪切时会产生两个片段)。
(ii)PCR获得在640位(TYLCV的640位)的T的缺失和在下面744位的G的添加，由此产生编码天然TYLCV-CP蛋白(SEQ ID NO：5)的56-91位的TYLCV序列(SEQ ID NO：4)的移码。以2步实现移码，第一步目的是缺失T而第二步目的是添加G。目的是在640位缺失T的第一步包括两个PCR步骤，起始PCR和嵌套PCR。用TaqI切割起始PCR产物，并且连接位于2个TaqI限制性位点之间的突变(失去T)的嵌套PCR产物取代切下的片段。起始PCR扩增了侧翼有TaqI限制性位点并且具有两个中间TaqI限制性位点的439bp产物，[正向引物：ggctgaacttcgacagcccatacagca
gctgctg(SEQ ID NO：20)，BcefI识别位点用粗体加重，TaqI限制性位点有下划线，反向引物：gcggt
ctcattatatcgaacatatt(SEQ ID NO：21)，BmrI识别位点用粗体加重，TaqI限制性位点有下划线]。嵌套PCR扩增了侧翼是在正向末端的相同TaqI限制性位点(使用相同的正向引物-SEQ ID NO：20)和在反向末端的另一个中间TaqI限制性位点的产物。反向引物也具有失去的对应的T[嵌套反向引物：ggct
acattctgtat↑ttctg(SEQ ID NO：22)，TaqI识别位点用粗体加重，箭头代表缺失的T的位置]。用TaqI切割起始PCR产物并且在凝胶上电泳，获得3个条带(来自2个侧翼TaqI限制性位点和2个中间TaqI限制性位点)。位于嵌套PCR引物之间的上游片段被除去。从凝胶中提取剩余2个条带并将其连接至嵌套PCR的突变PCR产物以获得期望的序列(具有失去的T的BcfI到TaqI)。目的是在744位添加G的第二步包括用包含BstDSI(正向引物)和MaeIII(反向引物)限制性位点的引物进行的起始PCR[正向引物：ctgatgttcc
atgtgaaggcccat(SEQ ID NO：23)，BstDSI识别位点用粗体加重；反向引物：ccacga
atcactaacaac
aacaatac(SEQ ID NO：24)，MaeIII识别位点用粗体加重，添加的G(在反向互补物中为C)也用粗体加重]，获得包含附加的G的PCR产物。用BstDSI和MaeIII剪切PCR产物和第一步的产物(具有失去的T的BcfI到TaqI)，并且通过连接用包括添加的G的PCR产物取代剪切产物。最后，用BceFI和BmrI剪切IL-60，片段被移除并且用上述步骤中获得的序列(具有失去的T和添加的G的BcfI到BmrI)取代。iii)由本文上述TYLCV CP的缺失引起的天然TYLCV V2(“前外壳”-SEQ ID NO：6)的C端45个氨基酸的缺失。
IL-60-BS的构建-通过将线性化的(Sac I)Bluescript II-KS+质粒(Stratagene，La Jolla，CA，USA)连接到IL-60质粒(SEQ ID NO：2)的2443位，间断在N端内的93位的rep(滚环复制)蛋白(SEQ ID NO：7)来构建本发明的IL-60-BS载体(SEQ ID NO：1)。编码C4(症状表达)的基因也被BS插入间断。
IR-GUS-pD的构建-通过使用正向引物933：atacttggacacctaatggc(SEQ ID NO：29)和反向引物934：agtcacgggcccttacaa(SEQ ID NO：30)扩增IR区、前外壳ORF和外壳蛋白ORF-(TYLCV的61至473位；登录号X15656)5′UTR的一部分构建IR-GUS-pD载体(SEQ ID NO：13)。该片段称为“IR-区”。将IR区T/A克隆到质粒pDRFVE中产生称为IR-pD的质粒(SEQ ID NO：12)。用SacI和SalI将GUS的编码序列(GenBank登录号M14641的碱基1466至3274)(SEQ ID NO：31)从携带GUS的质粒切下并将其插入到携带上述IR区的SalI/SacI剪切的pDRIVE中。
IR-PRN-pD的构建-通过在IR-GUS-pD中放入荧光假单胞菌(P.fluorescence)的整个PRN操纵子(作为携带所有4个基因的单片段)(对应于GenBank登录号U74493的碱基424-6165；SEQ ID NO：32)取代GUS来构建IR-PRN-pD载体。
IR-V2-CP、IR-V2-CP-GFP、IL-60和IR-GUS-pD的繁殖及其向植物的施用-用上述构建体转化大肠杆菌细胞并且在氨比西林选择下繁殖；使用标准程序提取构建体。没有通过农杆菌介导而直接将IR-V2-CP施用到植物中。通过皮下针对受体植物的茎或叶柄刺孔。将毛细管插入得到的孔中并且将大约2微克DNA(在100μl的5mM Tris-HCl；pH 8.5中)移液到毛细管中直到被植物完全吸收。
RT-PCR分析：根据标准程序进行RT-PCR分析(Sambrook和Russel，2001)。用于分析IR-V2-CP-GFP的表达的引物被列在表1中。
表1
为了检测GUS使用的引物如下：正向引物：ATTGATCAGCGTTGGTGGGA(SEQ ID NO：25)；反向引物：TGCGGTCGCGAGTGAAGATC(SEQ ID NO：26)。
为了检测PRN使用的引物如下：正向引物：GCGAACGAACACGATAGCAA(SEQ ID NO：27)；反向引物：CGTCAATGAGGGCGTGAAT(SEQ ID NO：28)。
通过嫁接将质粒递送给植物-如本文上面所述将IL-60-BS和IR-GUS(或IR-PRN)注射到烟草和番茄植物中。将其中GUS(或PRN)已复制并散布(通过PCR指示)的植物留出用于下面的嫁接实验。
将其中存在IR-GUS或IR-PRN的烟草和番茄植物的接穗分别嫁接在未处理的烟草和番茄植物上(根状茎)。嫁接后一个月对根状茎的GUS和PRN进行PCR分析。从远离嫁接点至少3片叶的叶中提取DNA。
通过浸泡将质粒递送给植物-稍微修剪籽苗或幼小植株(番茄、烟草、葡萄藤)的根。将根浸泡在溶解于水中的各2-5μg的IL-60-BS和IR-GUS中。将小植株保持在溶液中直到所有液体被全部吸收。然后添加另一体积的水，并且在水也被全部吸收后将小植株种植在花盆中。通过PCR在上部叶中定期测试GUS的复制和散布。
实施例1
IR和有义病毒基因(V1和V2)对于人工卫星在植物组织中的稳定、移动和散布是足够的
激活携带IR的卫星以复制、移动和被辅助病毒或被突变的卸甲载体IL-60-BS表达(参见通过引用并入本文的WO2007/141790)。现在下面的实施例显示在IR调节下的单独TYLCV的有义转录基因足以自我复制、移动和表达。这个基因组区段也能够反式促进携带IR卫星的复制、移动和表达。
在IR-V2-CP构建体中将GFP融合到CP的3′端(图1A和1B)。对远离注射点的叶进行分析(图2A-F)。在注射到番茄植物中后，主要在韧皮部伴胞的细胞核中观察到GFP荧光(图2C-2D)。也在细胞周缘观察到GFP荧光，暗示跨胞间连丝的移动(图2A、2E)以及在叶肉细胞(图2A、2F)中移动。
PCR分析表明在处理的植物中TYLCV CP和GFP序列以及TYLCV转录物的存在(图3C-3E)。不存在其他TYLCV序列(图3F)表明植物不含TYLCV。这些结果表明IR-V2-CP-GFP靠自身复制和移动。GFP存在于伴胞的细胞核中、在细胞周缘以及明显跨胞间连丝。
IR-V2-CP构建体可以反式诱导另一种DNA的复制和移动，提供携带IR的DNA。如在图3A-3B中所示，在IR-V2-CP的存在下人工卫星IR-GUS(图1C)被动员并且表达GUS。
实施例2
通过嫁接将IL-60-BS递送给植物
结果显示在图4和图5中。具体而言，这些图显示IR-GUS(图4)和IR-PRN(图5)都从接穗转移至根状茎，在根状茎它们复制并散布。
实施例3
通过穿过根递送IL-60-BS
图6展示IR-GUS通过根转移并且在植物中复制和散布。当其他IR载体(IR-GFP和IR-PRN)被通过包括番茄、烟草、葡萄藤和长春花在内的其他植物的根转移时取得相同的结果(数据未显示)。
尽管已结合本发明的具体实施方案对本发明进行描述，显然许多替代物、变更和变化将对本领域技术人员是清楚的。因此，意在包括落在所附权利要求的精神和广阔范围内的所有这些替代物、变更和变化。
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此均通过引用整体并入到本说明书中，其程度就仿佛每一篇单独的出版物、专利或专利申请都被具体地且单独地指出通过引用并入本文一样。此外，在本说明书中任何参考文献的引用或确认不应被解释为承认此参考文献可作为本发明的现有技术。在使用分节标题方面，它们不应该被解释为一定是限制的。
Claims (31)
1.一种在植物中表达感兴趣的分子的方法，所述方法包括在包含至少一种基于双粒病毒组的表达构建体的溶液中接触植物的根以允许所述至少一种基于双粒病毒组的表达构建体被所述根吸收，所述表达构建体包含编码所述感兴趣的分子的多核苷酸，并且所述表达构建体还能够在植物宿主中系统无症状散布，由此在植物中表达感兴趣的分子。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述基于双粒病毒组的表达构建体没有编码C2和C3编码序列的多核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述基于双粒病毒组的表达构建体包含编码所述感兴趣的分子的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列的侧翼是编码双粒病毒组复制酶的非连续核酸序列。
4.一种在植物中表达感兴趣的分子的方法，所述方法包括将感染至少一种基于双粒病毒组的表达构建体的第一植物的部分嫁接到第二植物的部分上，所述表达构建体包含编码所述感兴趣的分子的多核苷酸序列，并且所述基于双粒病毒组的表达构建体还能够在植物宿主中系统无症状散布，由此在植物中表达感兴趣的分子。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述基于双粒病毒组的表达构建体没有编码C2和C3编码序列的多核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述基于双粒病毒组的表达构建体包含编码所述感兴趣的分子的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列的侧翼是编码双粒病毒组复制酶的非连续核酸序列。
7.一种基于双粒病毒组的表达构建体，所述表达构建体能够在植物宿主中系统无症状散布，所述表达构建体没有编码C2和C3编码序列的多核苷酸序列。
8.如权利要求7所述的表达构建体，所述表达构建体包含：
(i)编码双粒病毒组基因间区(IR)的多核苷酸序列；
(ii)编码修饰的双粒病毒组外壳蛋白(CP)的多核苷酸序列；以及
(iii)编码修饰的双粒病毒组前外壳蛋白(V2)的多核苷酸序列。
9.如权利要求8所述的表达构建体，所述表达构建体还包含编码修饰的复制酶蛋白(C1)的多核苷酸序列。
10.如权利要求9所述的表达构建体，其中所述修饰的复制酶蛋白如在SEQ ID NO：36中所列出。
11.如权利要求8所述的表达构建体，所述表达构建体还包含编码修饰的C4的多核苷酸序列。
12.如权利要求7所述的表达构建体，所述表达构建体能够在原核细胞中复制。
13.如权利要求7所述的表达构建体，所述表达构建体能够通过昆虫载体在植物之间传递。
14.如权利要求7所述的表达构建体，所述表达构建体还包含异源多核苷酸序列。
15.如权利要求14所述的表达构建体，其中所述异源多核苷酸大于1kb。
16.如权利要求14所述的表达构建体，其中所述异源多核苷酸大于5kb。
17.如权利要求14所述的表达构建体，其中所述异源多核苷酸包括操纵子。
18.如权利要求14所述的表达构建体，其中所述异源多核苷酸适于基因沉默。
19.如权利要求7所述的表达构建体，所述表达构建体还包含细菌多核苷酸序列。
20.如权利要求8所述的表达构建体，其中所述修饰的双粒病毒组V2蛋白如在SEQ ID NO：6中所列出。
21.如权利要求8所述的表达构建体，其中所述修饰的双粒病毒组外壳蛋白包括如在SEQ ID NO：3中所列出的氨基酸序列。
22.如权利要求8所述的表达构建体，其中所述修饰的双粒病毒组外壳蛋白包含在编码N端100个氨基酸的核苷酸中的突变或缺失。
23.如权利要求8所述的表达构建体，所述表达构建体包括如在SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所列出的多核苷酸序列。
24.如权利要求14所述的表达构建体，其中所述异源多核苷酸编码选自由以下组成的组的多肽：报道分子、抗病毒分子、病毒部分、抗真菌分子、抗细菌分子、抗昆虫分子、抗除草剂分子、耐受生物胁迫或非生物胁迫的分子、药物分子、生长诱导分子以及生长抑制分子。
25.如权利要求7所述的表达构建体，其中所述双粒病毒组是菜豆金黄花叶病毒。
26.如权利要求7所述的表达构建体，其中所述双粒病毒组是番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)。
27.如权利要求7所述表达构建体，其中所述表达构建体适于在选自由以下组成的组的植物宿主中表达：茄科(Solanaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、伞形科(Umbelliferae)、百合科(Liliacae)、禾本科(Gramineae，Poaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、芭蕉科(Musaceae)、葡萄科(Vitacea)以及十字花科(Cruciferae)。
28.一种在植物细胞中表达感兴趣的分子的方法，所述方法包括将权利要求14所述的核酸构建体引入植物组织中，所述异源多肽是所述感兴趣的分子，由此在植物细胞中表达感兴趣的分子。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述感兴趣的分子选自由以下组成的组：报道分子、抗病毒分子、病毒部分、抗真菌分子、抗细菌分子、抗昆虫分子、抗除草剂分子、耐受生物胁迫或非生物胁迫的分子、药物分子、生长诱导分子、在代谢途径中的基因的产物以及生长抑制分子。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述在代谢途径中的基因由操纵子编码。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述植物选自由以下组成的组：茄科、葫芦科、伞形科、百合科、禾本科(Gramineae，Poaceae)、蔷薇科、芭蕉科、葡萄科以及十字花科。
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