CN102108362A

CN102108362A - 一种优化的三苯甲烷还原酶基因及其表达和应用

Info

Publication number: CN102108362A
Application number: CN2009102006783A
Authority: CN
Inventors: 付晓燕; 姚泉洪; 彭日荷; 熊爱生; 赵伟; 田永生; 高峰; 朱波
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Baixin Bio-tech Co.,Ltd.
Priority date: 2009-12-24
Filing date: 2009-12-24
Publication date: 2011-06-29
Anticipated expiration: 2029-12-24
Also published as: CN102108362B

Abstract

本发明公开了一种优化的三苯甲烷还原酶基因及其表达和应用。将柠檬酸杆菌中的三苯甲烷还原酶基因经采用植物偏爱密码进行改造后，得到本发明的优化的到三苯甲烷还原酶基因，全长864bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO 2。将本发明优化的三苯甲烷还原酶基因构建到植物载体并进行农杆菌转化，转化的拟南芥植物能持续表达三苯甲烷还原酶，并促使植物参与结晶紫和孔雀石绿的降解，从而为植物修复三苯甲烷类染料污染提供了广阔的应用前景。

Description

一种优化的三苯甲烷还原酶基因及其表达和应用

技术领域

本发明属植物修复领域，具体涉及一种优化的三苯甲烷还原酶基因及其表达和应用。

背景技术

三苯甲烷类染料(Triphenylmethane dyes)是一类多苯环化合物，它是继偶氮类、蒽醌类染料之后使用的第三大染料，在纺织印染、食品、医药、造纸、化装品、皮革处理等工业及生物组织染色中被广泛地应用。此类染料及中间降解产物具有潜在的毒害和致突变作用，有很强的致畸、致癌、致突变作用。在生产、使用过程中产生大量废水，此类废水颜色深，生物降解难，严重污染环境。

三苯甲烷类染料化合物及中间代谢物随着生产、运输、使用等环节进入到环境中。据调查，目前全世界染料年产量约为8～9×10⁵吨，染料种类多达100000多种，在染料的使用过程中大约有10％～20％由于工艺效率问题被直接排放到污水处理系统或环境中，造成环境污染。三苯甲烷类染料本身以及在自然环境中降解中间产物对水生生物和人类产生毒害作用，如食品工业中常用于抑制真菌的龙胆紫被证实能抑制有丝分裂，而碱性绿的中间产物苯胺具有“三致作用”。

按照传统的染料分类标准，三苯甲烷类染料主要分为以下三大类：(1)碱性染料，如结晶紫、甲基紫、碱性品红、碱性艳蓝BO、碱性艳蓝B等；(2)酸性染料，如酸性紫4BNS、酸性湖蓝A、甲基蓝、酸性绿B等；(3)弱酸性染料，如柴林艳蓝6B、弱酸艳蓝FFR等。

治理多苯环化合物染料污染主要有物理修复、化学修复和生物修复。同其它有机污染物相比，多苯环化合物染料大多被排污到水域环境中且比较稳定。从废水处理角度，由于染料行业具有品种多、产量小、工艺流程长、产品更新快等特点，因而染料工业废水成分复杂，利用传统的物理化学方法很难去除。近年来，生物修复技术为三苯甲烷类染料的降解提供了新的途径。自20世纪70年代筛选出能降解结晶紫染料的细菌以来，人们一直在从各个角度研究微生物对三苯甲烷类的降解，包括高效降解微生物的筛选和分离、降解途径、生物反应器的设计以及环境修复等等。但是，相对于偶氮染料而言，关于三苯甲烷类染料生物降解文献报道还较少。因此，这为传统的生物处理工艺提出了严峻的挑战。

生物修复通常是指利用各种生物(包括微生物，动物和植物)的特性，吸收、降解、转化环境中的污染物，使受污染的环境得到改善的治理技术。一般分为植物修复、动物修复和微生物修复三种类型。生物修复的基础是自然界中微生物对污染物的生物代谢作用，因此早期的生物修复主要指微生物修复。由于三苯甲烷类染料是多苯环的芳香化合物，难以被常规的微生物降解脱色，对此人们研究通过生物强化技术来促进其降解，主要体现在：(1)筛选高效的微生物或酶；(2)优化外界温度、pH值、底物浓度和营养物质等条件；(3)寻找对微生物代谢中难降解物有促进作用的共代谢物质，以刺激微生物生长或提高其活力。

人们通过筛选得到了一些能高效降解三苯甲烷类染料的微生物，主要有细菌和白腐菌。Yatome等筛选到菌种Pseudomonas seudomonallei 13NA对结晶紫和甲基紫能够进行降解褪色。早在1995年，Yesilada O等报道了白腐菌能快速降解结晶紫。一些研究也指出：白腐菌在有氧条件下降解多种人工合成的染料，最终将它们矿化成CO₂和H₂O，在环境中有益，因此，近年来越来越受到重视。到目前为止，三苯甲烷类染料还能通过酵母、海藻和真菌等降解。利用微生物修复具有很多优点，如成本低，只有物理化学处理的1/3左右；处理灵活，可以进行原地或异地处理。但微生物修复技术对环境条件的要求较苛刻，微生物生长受温度、氧气、水分、酸碱度和土壤的微生物环境影响，且微生物群落之间相互竞争。

随着近几年生物修复技术的发展，在染料污染治理上出现了新的途径。植物修复技术比其它物理、化学和生物等方法更受到社会的欢迎，它弥补了微生物修复技术的不足，该技术成本低，对环境扰动少，在清理土壤染料的同时，可同时清除污染土壤周围的水体中的污染物。有较高的美化环境价值，易为社会所接受，具有较大的应用前景。植物修复的类型主要有：植物固定(Phytostabilization)、根系降解(Rhizodegradation)、植物降解(Phytodegradation)、植物促进(Phytoaccumulation)、植物挥发(Phytovolatilization)、挥发转移(Evapotranspiration)、根系降解(Rhizodegradation)。植物修复可用于石油污染、炸药废物、燃料泄露、氯代溶剂、填埋渗滤液及各种有机物污染的治理。植物修复染料污染物的过程，也是土壤有机质含量和土壤肥力增加的过程，被植物修复过的干净土壤适合于多种农作物的生长；植物固化技术能使地表长期稳定，有利于生态环境改善和野生生物的繁衍，且维持固化的成本较低。

研究证明：植物降解环境中有机污染物的机制较为复杂，归纳起来大致有以下几种机制：1)植物对有机物的直接吸收和新陈代谢；2)植物根部释放降解土壤有机污染物的特殊酶；3)植物根际微生物群落的降解作用。据报道，水稻幼苗可通过根系吸收14C标记的甲烷，而玉米幼苗可通过根和叶吸收同位素标记的甲烷、乙烷、丙烷、戊烷。研究还表明：苯、甲苯、二甲苯均可随灌溉水进入植物体内，并加入到植物的新陈代谢过程中。早在20世纪70年代初期，人们就已经发现植物具有新陈代谢多氯联苯的功能，并鉴定出植物的新陈代谢产物，羟基氯联苯等等。另外，植物根部也能释放降解有机污染物的特殊酶。如腈水解酶、消化酶和漆酶、去卤代酶，它们分别降解4-氯苯腈、三硝基甲苯(TNT)、氯代溶剂(如三氯乙烯)。细胞色素P450、过加氧酶(peroxygenases)和过氧化物酶等也能降解异型生物质。与其它有机污染物相比，国内至今还没有利用植物降解不同类型染料污染物的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种优化的三苯甲烷还原酶基因及其表达和应用。利用基因工程技术培育高效安全修复三苯甲烷类染料污染的植物，将来自柠檬酸杆菌中的三苯甲烷还原酶基因转化到植物中，促使植物对其的降解，以提高植物对结晶紫和孔雀石绿的修复能力，为三苯甲烷类染料污染物的修复提供了广阔的应用前景。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：

一种优化的三苯甲烷还原酶基因(tmr)，是将柠檬酸杆菌中的三苯甲烷还原酶基因经采用植物偏爱密码进行改造后而制得，序列全长864bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO 2所示。

所述优化的三苯甲烷还原酶基因与原始基因的序列比对如图1所示。

在pYPX245植物表达的BamHI和SacI酶切位点之间插入三苯甲烷还原酶合成基因编码序列，从而构成pYPXtmr重组质粒载体。该表达载体还包括GUS报告基因和带内含子卡那霉素标记基因。

所述pYPXtmr植物表达载体的构建，包括以下步骤：

(1)优化的三苯甲烷还原酶基因的合成

具体合成方法参考：Ai-Sheng Xiong，Quan-Hong Yao，Ri-He Peng，Xian Li，Hui-Qin Fan，Zong-Ming Cheng and Yi Li，Nucleic Acid Research，2004，32(12)，98：1-10。

所述优化的三苯甲烷还原酶基因合成引物均为5’端至3’端，其中末端字母“Z”表示“正向”，“F”表示“反向”，具体如下：

P1 ATGGCTATCGCTGTCACTGGTGCTACTGGTCAACTCGGTGGTCTTGTCATCCAACACTTTGCT

P2 TTACGAACGATGGCAATGATCTGAGAGGCAGGGACCTTCTTCAGCAAAGTGTTGGATGACAAGA

P3 AGATCATTGCCATCGTTCGTAACGTCGAGAAAGCCTTCCACTCTTGCTGATCAAGGTGTCGAA

P4 CTGAAAGAGACTCAGGTTGATTGTAGTCACCATGACGAACTTCGACACCTTGATCAGCAAG

P5 AACCTGAGTCTCTTTCAGAAGGCTTTCGCTGGTGTCTCCAAGCTGCTCTTCATCTCTGGTCCTCA

P6 CGACGTTAGCATGTTGGACGATCAGCAGAGTGTATGTCGTAGTGAGGACCAGAGATGAAGAGCAG

P7 CGTCCAACATGCTAACGTCGTCAAGGCTGCTCGTGATGCTGGTGTCATAGCACATCGCTTACAC

P8 TGAGCAAGTGGAATGATGGATTCCTCAGCGAAAGCGTAACCAGTGTAAGCGATGTGCTATGACA

P9 CCATCATTCCACTTGCTCACGTTCCACCTTGCTACTGAGTACGCTATCCGTACTACCAACATTCC

P10 ACGAAGAAGTCAGTGTACAAAGCGTATACGAAGGAAGGTGTATGGAATGTTGGTAGTACGGATA

P11 TGTACACTGACTTCTTCGTCAACGAAGGTCTGCGTGCTTCCATCGAGTCTGGTGTCTATCG

P12 TCGAGTCTGGTGTCTATCGTCACCAATGCTGGTAGTGGTATCGTCAACTCCGTCACTCGTAAC

P13 TCAACTCCGTCACTCGTAACGAACTTGCTCTTGGCTGCTGCTACTGTTCTGACTGAGGAAGGTC

P14 CCAAGGTTGGTTGGAAGACCAGGTTGTAGGTCTTGTTCTCGTGACCTTCCTCAGTCAGAACA

P15 GGTCTTCCAACCAACCTTGGACCTTCGACGAACTTGCTCAGATCCTCTCTGAGGTCTCTGGC

P16 TTCTCTTCTTCGAAAGAGACAGGCTGATGGACGACCTATCTTGCCAGAGACCTCAGAGAGG

P17 TCTCTTTCGAAGAAGAGAAGAACTTCCTTGTCAACGCTGGTGTTCCCTGAGCCATTCGCTGAG

P18 GAAGACCTCACCTTTGGAGATAGCGTCGTAGATAGCAGCAGTGATCTCAGCGAATGGCTCAGG

P19 CTCCAAAGGTGAGGTCTTCCAAGACCTCTGATGATCTTCAGAAGCTGATCGGTTCCTTGACTCC

P20 ATTACATCTTCAGGGCTTGTTTGACGGATCTCCTTCAGAGGAGTCAAGGAACCGATCAGCT

(2)pYPXtmr表达载体的构建

利用Bam HI和Sac I进行双酶切后，通过T4DNA连接酶将步骤(1)中得到的优化的三苯甲烷还原酶基因与含有双35S启动子的pYPX245植物表达载体连接。

(3)获得pYPXtmr表达载体

在上述步骤(2)之后，通过质粒纯化得到该表达载体。

所述优化的三苯甲烷还原酶还可促使结晶紫和孔雀石绿染料降解。

利用农杆菌将所述保含优化的三苯甲烷还原酶pYPX245植物表达载体转化到植物中的方法，包括以下步骤：

(1)载体的导入

农杆菌感受态细胞的制备-电击法导入载体-培养

(2)转化植物

a)农杆菌蘸花法转化将三苯甲烷还原酶基因转化到拟南芥中。具体方法参考：Plant J.1998，16，735-743。

b)农杆菌介导将三苯甲烷还原酶基因转化到水稻中。具体方法参考：刘巧全，植物生理学报，1998，24(3)，259-271。

c)农杆菌介导将三苯甲烷还原酶基因转化到烟草中。具体方法参考：美国发明专利US6,323,396。

通过上述方法转化的携带有优化的三苯甲烷还原酶基因的植物能持续表达三苯甲烷还原酶，并能促使植物参与结晶紫和孔雀石绿的降解，验证了转基因植物对三苯甲烷类染料的降解功能。从而可以为植物修复三苯甲烷类染料污染提供有益的帮助。含有本发明的优化的三苯甲烷还原酶基因的植物安全稳定，对植物生长没有不良影响，对环境污染小。

本发明的有益效果：

1)来自柠檬酸杆菌中的优化的三苯甲烷还原酶基因能够持续在植物中表达。比较了转三苯甲烷还原酶基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株对三苯甲烷类染料的耐受性。结果表明：野生型植株和转基因植株在存活率和表型上都有很大差异，转基因植物降解结晶紫为对植株无毒的隐性结晶紫，从而可以为植物修复三苯甲烷类染料污染提供有益的帮助。

2)含有优化的三苯甲烷还原酶基因的植物安全稳定，对植物生长没有不良影响，而且降解产物对植物没有影响，对环境污染很小。

附图说明

图1为本发明的优化的tmr基因与原始基因序列比对。

图2为本发明的优化的tmr基因植物表达载体的构建。

图3为不同转基因拟南芥植株株系过量表达三苯甲烷还原酶基因电泳图，其中：WT为野生型植株；1-2，5-8，6-3，7-4，9-1，12-3分别为不同转基因的植株株系。

图4为野生型拟南芥和转基因拟南芥对结晶紫(CV)和孔雀石绿(MG)的耐受能力比较及根长、叶重和茎重，其中：a为野生型和转基因拟南芥植株分别对CV和MG的耐受能力；b为根长；c为叶重；d为茎重。

图5为液相色谱-串联质谱分析三苯甲烷还原酶对结晶紫的降解产物，其中：a为液相图谱；b为液质图谱。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。

本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社。)

实施例1

按照植物偏爱密码重新合成优化的三苯甲烷还原酶基因

我们按照植物偏爱密码重新合成优化的三苯甲烷还原酶基因，并将新合成的基因序列与原始基因序列进行了比对(图1)。优化的三苯甲烷还原酶基因合成引物如下：

P1 ATGGCTATCGCTGTCACTGGTGCTACTGGTCAACTCGGTGGTCTTGTCATCCAACACTTTGCT

P2 TTACGAACGATGGCAATGATCTGAGAGGCAGGGACCTTCTTCAGCAAAGTGTTGGATGACAAGA

P3 AGATCATTGCCATCGTTCGTAACGTCGAGAAAGCCTTCCACTCTTGCTGATCAAGGTGTCGAA

P4 CTGAAAGAGACTCAGGTTGATTGTAGTCACCATGACGAACTTCGACACCTTGATCAGCAAG

P5 AACCTGAGTCTCTTTCAGAAGGCTTTCGCTGGTGTCTCCAAGCTGCTCTTCATCTCTGGTCCTCA

P6 CGACGTTAGCATGTTGGACGATCAGCAGAGTGTATGTCGTAGTGAGGACCAGAGATGAAGAGCAG

P7 CGTCCAACATGCTAACGTCGTCAAGGCTGCTCGTGATGCTGGTGCATAGCACATCGCTTACAC

P8 TGAGCAAGTGGAATGATGGATTCCTCAGCGAAAGCGTAACCAGTGTAAGCGATGTGCTATGACA

P9 CCATCATTCCACTTGCTCACGTTCCACCTTGCTACTGAGTACGCTATCCGTACTACCAACATTCC

P10 ACGAAGAAGTCAGTGTACAAAGCGTATACGAAGGAAGGTGTATGGAATGTTGGTAGTACGGATA

P11 TGTACACTGACTTCTTCGTCAACGAAGGTCTGCGTGCTTCCATCGAGTCTGGTGTCTATCG

P12 TCGAGTCTGGTGTCTATCGTCACCAATGCTGGTAGTGGTATCGTCAACTCCGTCACTCGTAAC

P13 TCAACTCCGTCACTCGTAACGAACTTGCTCTTGGCTGCTGCTACTGTTCTGACTGAGGAAGGTC

P14 CCAAGGTTGGTTGGAAGACCAGGTTGTAGGTCTTGTTCTCGTGACCTTCCTCAGTCAGAACA

P15 GGTCTTCCAACCAACCTTGGACCTTCGACGAACTTGCTCAGATCCTCTCTGAGGTCTCTGGC

P16 TTCTCTTCTTCGAAAGAGACAGGCTGATGGACGACCTATCTTGCCAGAGACCTCAGAGAGG

P17 TCTCTTTCGAAGAAGAGAAGAACTTCCTTGTCAACGCTGGTGTTCCCTGAGCCATTCGCTGAG

P18 GAAGACCTCACCTTTGGAGATAGCGTCGTAGATAGCAGCAGTGATCTCAGCGAATGGCTCAGG

P19 CTCCAAAGGTGAGGTCTTCCAAGACCTCTGATGATCTTCAGAAGCTGATCGGTTCCTTGACTCC

P20 ATTACATCTTCAGGGCTTGTTTGACGGATCTCCTTCAGAGGAGTCAAGGAACCGATCAGCT

采取连续延伸PCR方法，共设计20条引物用于本发明基因的合成。

在50μL反应体系中，内侧引物(P2-P19)的添加量为10ng，外侧引物(P1，P20)添加量为100ng，扩增条件为：94℃预热10min；94℃，30s，54℃，30s，72℃，60s，35个循环；最后72℃延伸10min。使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司日本)扩增目的基因。PCR结束后，1％(W/V)琼脂糖胶电泳后回收，取10μl回收产物直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4℃连接过夜，高效转化大肠杆菌DH5α感受态中。

实施例2

优化的三苯甲烷还原酶基因植物表达载体构建

将来自柠檬酸杆菌的三苯甲烷还原酶按照植物偏爱密码进行改造，利用基因合成方法(熊2004，核酸研究)将这个基因重新合成。

分别用BamHI和SacI进行双酶切，回收DNA片段，通过T4DNA连接酶将优化的三苯甲烷还原酶基因与含有双35S启动子的pYPX245质粒连接，纯化，酶切鉴定和序列测定获得含有三苯甲烷还原酶基因的重组质粒载体pYPXtmr(图2)。该表达载体还包含GUS报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因。

实施例3

农杆菌培养和植物转化

农杆菌菌株为根癌农杆菌EHA105，LBA4404，GV3101菌株。质粒经电击法导人农杆菌中。挑取单菌到25ml YEB培养基(50mg/L利福平)培养过夜，取5ml菌液转接到100ml YEB培养基(50mg/L利福平)，培养至OD600＝0.7-0.8，菌液冰上放置10分钟，5000rpm离心10min，4℃，收集菌体，加入100ml无菌双蒸水清洗两次。加入4ml10％甘油悬浮菌体，转到50ml离心管。5500rpm离心10min，4℃。收集菌体，加入500μl 10％甘油悬浮菌体，转到1.5ml离心管。取70μl感受态细胞，加入1μl重组质粒载体pYPXtmr。用去头的黄枪头混匀，转到0.1cm电击杯中。电击参数：200Ω，1.7KV，2.5F，电击后立即加入800μl SOC培养液。培养1小时后，取100μl涂抗性板筛选转化子，28℃培养。

1.拟南芥粘花法转化

含目的质粒的农杆菌菌株单菌落接菌在5毫升含对应抗生素的LB培养基中28℃培养2天。将5毫升菌液转到500毫升的液体LB培养基中28℃培养16-24小时(OD＝1.5-2.0).液体可以在4℃保存30天。室温下离心收集菌体，4000g离心10分钟。用等体积5％的新鲜蔗糖溶液悬浮。加入0.02％的Silwet-77混匀后转移到烧杯中。每个菌株用300毫升转化，转2-3钵。将拟南芥倒置后浸入菌液中10秒钟。莲座和花序都要侵染。侵染后将转化植株菌液空干燥3-5秒，用保鲜膜将转化植株罩住，以保持湿润环境，水平放置22℃下避光培养16-24小时，转化后不要放置在高温和强光下。揭开保鲜膜直立培养，隔7天后再转化，总共转化2-3次。拟南芥苗生长过程中保持一定湿度，再生长1个月后收种子。利用50μg/mL潮霉素进行转化植株筛选，并利用RT-PCR检测了不同株系过量表达三苯甲烷还原酶基因情况(图3)。

2.烟草转化

挑选较饱满的种子，用75wt％的酒精清洗1分钟，次氯酸钠加1滴土温灭菌10分钟，种子铺在MS0培养基上，28度培养待发芽。将烟草幼叶剪成1cm²，放入MSO+NAA1(1ug/ml)+BA2(4ug/ml)的培养基中，22度培养1天。农杆菌培养OD0.8-1.0后离心5000g离心8分钟，无菌水清洗一次，等体积MS培养液悬浮侵染8分钟后，吸干放置在MSO+NAA1+BA2的培养基中，22度黑暗共培养3天。然后转入筛选培养基MSO+IAA1(0.1ug/ml)+ZT(2ug/ml)+Cb(500ug/ml)+Km(50ug/ml)培养2-3周，再转入分化培养基MSO+IAA1(0.1ug/ml)+ZT(2ug/ml)+Cb(500ug/ml)+Km(100ug/ml)培养2-3周，最后转入生根培养基1/2MS+IAA1(0.1ug/ml)培养，可生根形成阳性苗。自然光温下炼苗3-5天移载到育苗钵中，成活后移栽到温室中。

3.水稻转化

N6培养基为基本培养基，去壳的种子，授粉后12-15天的幼胚，经表面消毒后接种到N₆D₂培养基中诱导愈伤组织(N₆培养基，水解乳蛋白500mg/L，蔗糖30g/L，2，4-D 2mg/L，植物凝胶2.5g/L，pH5.8)；培养4-7天后取愈伤组织进行转化。农杆菌培养OD0.8-1.0后离心5000g离心8分钟，DDH₂O清洗一次，等体积MS培养液悬浮侵染8分钟后，吸干放置在MSO+NAA1+BA2的培养基中，22度共培养3天。然后转入筛选培养基(加入头孢Cb(500ug/ml)和潮霉素HAT(50ug/ml)，转化后的愈伤在含有和的抗性培养基上培养3～4代，转入分化培养基中(2mg/L KT)；幼芽长至2mm转移到生根培养基(1/2MS+0.5mg/L IBA)。以上培养基中分别加入500mg/L酶水解乳蛋白(CH)，0～700mg/L谷氨酰胺或精氨酸，蔗糖30～80g/L，琼脂6g，pH 5.8。继代周期为25d。将淡黄色的胚性愈伤组织转入分化培养基中，30d左右分化出芽。光照强度1500～2000lx，12～14h/d。

从获得的抗性植株中取一部分叶子，侵入含有X-GLUC的染色液中，筛选叶片变蓝的转基因植株进行分子检测，提取叶片总DNA，参照《分子克隆》的方法，以tmrZ和tmrF为引物对对转基因植株进行PCR检测，扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25个循环。从分子水平上证明目的基因是否导入。

实施例4

优化的三苯甲烷还原酶基因转化植物后对染料的降解分析

将转基因拟南芥自交纯合3代，获得3个纯合转化株系(tmr-1、-5、-7)的种子。直接铺种到含有4mg/L结晶紫或孔雀石绿的MS培养基中培养，观察植物的萌发、根长和表型情况。转基因植物在含有结晶紫或孔雀石绿的平板上，种子的发芽率比非转基因植物提高3.0倍。转基因植物在含有结晶紫或孔雀石绿的平板上，转基因植株根长比野生型植株提高近100％倍，野生型植株根长生长受抑制，几乎不再生长(图4)。

实施例5

液相色谱-串联质谱分析优化的三苯甲烷还原酶对结晶紫的降解产物

称取液体培养的拟南芥样品5.00g于50mL离心管内，加入1.5mL 20％的盐酸羟胺溶液、2.5mL 1.0mol/L的对-甲苯磺酸溶液、5.0mL乙酸盐缓冲溶液，用匀浆机以10000r/min的速度均质30s，加入10mL乙腈剧烈震摇30s。加入5g酸性氧化铝，再次震荡30s。3000r/min离心10min。把上清液转移至装有10mL水和2mL二甘醇的100mL离心管中。然后在50mL离心管中加入10mL乙腈，重复上述操作，合并乙腈层。在离心管中加入15mL二氯甲烷，振荡10s，3000r/min离心10min，将二氯甲烷层转移至100mL的梨形瓶中，再用5mL乙腈、10mL二氯甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲烷层于100mL梨形瓶中。45℃旋转蒸发至约1mL，用2.5mL乙腈溶解残渣。将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上，将梨形瓶中的溶液转移到柱上，再用乙腈洗涤瓶两次，每次2.5mL，把洗涤液依次通过柱，控制流速不超过0.6mL/min，收集全部流出液，45℃旋转蒸发至近干，残液准确用0.5mL乙腈溶解，过0.45μm滤膜，滤液供液质色谱测定，测定结果如图5所示。

附：本发明所涉及的核苷酸/氨基酸序列表：

<110>上海市农业科学院

<120>一种优化的三苯甲烷还原酶基因及其表达和应用

<160>3

<210>SEQ ID NO 1

<211>864

<212>DNA

<213>柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)

<400>1

atggctatcg ctgtcactgg tgctactggt caactcggtg gtcttgtcat ccaacacttg 60

ctgaagaagg tccctgcctc tcagatcatt gccatcgttc gtaacgtcga gaaagcctcc 120

actcttgctg atcaaggtgt cgaagttcgt catggtgact acaatcaacc tgagtctctt 180

cagaaggctt tcgctggtgt ctccaagctg ctcttcatct ctggtcctca ctacgacaac 240

actctgctga tcgtccaaca tgctaacgtc gtcaaggctg ctcgtgatgc tggtgtcaag 300

cacatcgctt acactggtta cgctttcgct gaggaatcca tcattccact tgctcacgtc 360

caccttgcta ctgagtacgc tatccgtact accaacattc catacacctt ccttcgtaac 420

gctttgtaca ctgacttctt cgtcaacgaa ggtctgcgtg cttccatcga gtctggtgct 480

atcgtcacca atgctggtag tggtatcgtc aactccgtca ctcgtaacga acttgctctg 540

gctgctgcta ctgttctgac tgaggaaggt cacgagaaca agacctacaa cctggtctcc 600

aaccaacctt ggaccttcga cgaacttgct cagatcctct ctgaggtctc tggcaagaag 660

gtcgtccatc agcctgtctc tttcgaagaa gagaagaact tccttgtcaa cgctggtgtc 720

cctgagccat tcgctgagat cactgctgct atctacgacg ctatctccaa aggtgaggct 780

tccaagacct ctgatgatct tcagaagctg atcggttcct tgactcctct gaaggagacc 840

gtcaaacaag ccctgaagat gtaa 864

<210>2

<211>287

<212>PRT

<213>柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)

<400>2

Met Ala Ile Ala Val Thr Gly Ala Thr Gly Gln Leu Gly Gly Leu Val

1 5 10 15

Ile Gln His Leu Leu Lys Lys Val Pro Ala Ser Gln Ile Ile Ala Ile

20 25 30

Val Arg Asn Val Glu Lys Ala Ser Thr Leu Ala Asp Gln Gly Val Glu

35 40 45

Val Arg His Gly Asp Tyr Asn Gln Pro Glu Ser Leu Gln Lys Ala Phe

50 55 60

Ala Gly Val Ser Lys Leu Leu Phe Ile Ser Gly Pro His Tyr Asp Asn

65 70 75

Thr Leu Leu Ile Val Gln His Ala Asn Val Val Lys Ala Ala Arg Asp

80 85 90 95

Ala Gly Val Lys His Ile Ala Tyr Thr Gly Tyr Ala Phe Ala Glu Glu

100 105 110

Ser Ile Ile Pro Leu Ala His Val His Leu Ala Thr Glu Tyr Ala Ile

115 120 125

Arg Thr Thr Asn Ile Pro Tyr Thr Phe Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Thr

130 135 140

Asp Phe Phe Val Asn Glu Gly Leu Arg Ala Ser Ile Glu Ser Gly Ala

145 150 155

Ile Val Thr Asn Ala Gly Ser Gly Ile Val Asn Ser Val Thr Arg Asn

160 165 170 175

Glu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Thr Val Leu Thr Glu Glu Gly His Glu

180 185 190

Asn Lys Thr Tyr Asn Leu Val Ser Asn Gln Pro Trp Thr Phe Asp Glu

195 200 205

Leu Ala Gln Ile Leu Ser Glu Val Ser Gly Lys Lys Val Val His Gln

210 215 220

Pro Val Ser Phe Glu Glu Glu Lys Asn Phe Leu Val Asn Ala Gly Val

225 230 235

Pro Glu Pro Phe Ala Glu Ile Thr Ala Ala Ile Tyr Asp Ala Ile Ser

240 245 250 255

Lys Gly Glu Ala Ser Lys Thr Ser Asp Asp Leu Gln Lys Leu Ile Gly

260 265 270

Ser Leu Thr Pro Leu Lys Glu Thr Val Lys Gln Ala Leu Lys Met＊＊＊

275 280 285

Claims

1.一种优化的三苯甲烷还原酶基因，其特征在于，它将柠檬酸杆菌中的三苯甲烷还原酶基因经采用植物偏爱密码进行改造后制备而成的，该基因序列全长864bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1。

2.根据权利要求1所述的优化的三苯甲烷还原酶基因，其特征在于，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO 2。

3.包含权利要求1所述的优化的三苯甲烷还原酶基因的植物表达载体。

4.根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于，为pYPXtmr植物表达载体。

5.根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于，在所述植物表达载体的BamHI和SacI酶切位点之间插入三苯甲烷还原酶合成基因编码序列。

6.根据权利要求3所述的植物表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)权利要求1所述的优化的三苯甲烷还原酶基因的合成；

(2)pYPXtmr表达载体的构建；

(3)获得pYPXtmr表达载体。

7.权利要求1所述的优化的三苯甲烷还原酶在促使降解结晶紫和孔雀石绿染料中的应用。