CN102108333A - 一种流化床生物反应器 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物细胞培养设备，公开了一种流化床生物反应器，包括罐体(1)、导流管(2)、固定板(3)和设置于罐体(1)内的搅拌装置(4)，在搅拌装置(4)外设置与导流管(2)相接的多孔圆管(5)，所述多孔圆管(5)上设置多个通孔，与罐体(1)的底部连接。本发明所述流化床生物反应器将载体限制于固定板下，方便了上清液的提取和处理，而且更有效的利用了罐体体积；本发明所述流化床生物反应器结合流化床培养方式和固定床培养方式的优点，可实现长时间连续灌流培养，细胞生长环境均质，细胞密度达107/ml以上，放大潜能好，具有良好的工业应用前景。

Description

一种流化床生物反应器
技术领域
本发明涉及生物细胞培养设备，具体涉及一种流化床生物反应器。
背景技术
目前细胞培养方法有采用流化床生物反应器或者固定床生物反应器进行培养。固定床生物反应器是在反应器中装配固定的容器，中间装填载体，载体通常是直径2-6mm实体或多孔球或片状纤维。培养液循环通过固定床，依靠搅拌中产生的负压，使培养基不断流经填料，以进行营养成分和氧的传递。刚接种的细胞生长在载体的表面，随着细胞增殖，细胞开始充满载体间的空隙。
固定床生物反应器培养溶液流动速度较大，细胞在载体中高密度生长，可减少无血清培养时的蛋白用量，适用于增殖悬浮细胞。固定床培养方式，细胞培养密度高，且无机械损害，但是，由于采用上下两块板紧压载体，使得细胞的代谢产物及死细胞很难排出，而且由于培养载体堆积在一起，培养液不均匀的流动，造成沟流现象，导致营养分布不均匀，细胞的生长速度不一致。
流化床生物反应器包括罐体、控温部分、通气部分、进出料口、测量系统及其它附属系统，通过罐体内的搅拌装置产生向上的漩流，使支持细胞生长的培养液呈流态化，从而使内部装填的载体上下翻动，依附载体生长的大量细胞在悬浮状态生长，其罐体剖面图见图1。流化床生物反应器进行培养时，培养液的流动性好，细胞的生长条件均质，细胞生长一致，但容易使细胞和载体冲出，随着细胞的增多，搅拌的悬浮态变差，放大效应小，现有流化床的床层深度为2m左右，反应器放大一般采用增大横截面积，最大规模仅为1M3。
发明内容
本发明针对现有流化床生物反应器容易使细胞和载体冲出、放大效应受限的缺陷，提供一种新的流化床生物反应器。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种流化床生物反应器，包括罐体1、导流管2、固定板3和设置于罐体1内的搅拌装置4，在搅拌装置4外设置与导流管2相接的多孔圆管5，所述多孔圆管5上设置多个通孔，与罐体1的底部连接。
优选地，所述导流管2下端口径扩大。
优选地，所述多孔圆管5上的通孔孔径小于所用载体的直径。
优选地，所述搅拌装置4的搅拌桨叶41为平叶或螺旋桨形。
优选地，所述固定板3设置于罐体上部，为多孔材料制成，所述多孔材料优选为多孔不锈钢或多孔塑料，特别优选为ETFE聚四氟乙烯、聚乙烯或聚丙烯。
所述流化床生物反应器还包括控温部分、通气部分、进出料口、测量系统及其它附属系统。
利用本发明所述流化床生物反应器进行细胞培养时，优选地，固定板与罐体底部之间的载体填充量为固定板与罐体底部之间距离的1/2-2/3，上部至少留有1/3的空间。培养液经导流管形成旋流向下流动，再由底部的通孔冲出，形成旋流，向上流动，当向上流的速度高于载体的沉降速度时，载体处于悬浮状态，形成类似与流化床培养的培养方式，其工作状态图见图2；
改变搅拌装置的搅拌速度可以改变流体向上运动速度，当搅拌装置的旋转速度较低，流体速度低于冲出点，载体沉降下来，形成类似固定床培养的培养方式，其工作状态图见图3，载体与载体之间较为疏松，并且可观察到载体微小的晃动，这种晃动有助于均匀培养液，比现有的固定床培养方式优越。
本发明所述流化床生物反应器可实现高密度细胞培养，细胞密度可达107/ml以上；本发明所述流化床生物反应器还可以进行长时间连续流培养，所述连续培养就是连续往培养罐里供给养分如新鲜培养液，同时输出上清液，从而实现连续培养。利用本发明所述流化床生物反应器进行细胞连续培养时，由于固定板和多孔圆管之间的阻隔，将载体限制其间，使得上清液的提取更为方便。
本发明所述流化床生物反应器以固定床培养方式为主，间歇而短暂地改变搅拌速度，使载体处于悬浮状态，形成类似于流化床培养方式，使罐体内细胞的营养物质、代谢产物均质化。其培养程序可设定为：固定床培养方式培养1-3小时，流化床培养方式培养1-3分钟，停止搅拌0.5-1分钟，再循环利用固定床培养方式进行细胞培养。
与现有的流化床生物反应器相比，本发明所述流化床生物反应器将载体限制于固定板下，方便了上清液的提取和处理，而且更有效的利用了罐体体积。利用本发明所述流化床生物反应器进行细胞培养，细胞密度可以达到达107/ml以上，而且可以实现连续培养，可以直接通入气体，放大潜能好。
附图说明
图1是现有流化床生物反应器罐体的剖面图；
图2是本发明所述流化床生物反应器工作状态1罐体剖面图(流化态)；
图3是本发明所述流化床生物反应器工作状态2罐体剖面图(固定态)。
附图标记：
1-罐体
2-导流管
3-固定板
4-搅拌装置
41-搅拌桨叶
42-搅拌轴
5-多孔圆管
6-载体
7-上清液。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：利用本发明所述流化床生物反应器进行Vero细胞培养
在流化床生物反应器(上海日泰10L型)加入片状聚酯载体，同时加入磷酸缓冲液(pH7.2)，123℃高压消毒60分钟，自然冷却过夜。第2天排空罐内磷酸缓冲液，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，接种Vero细胞，接种后罐内细胞密度达5x105/ml，开始细胞培养。
设定反应器细胞培养条件为温度37℃，pH 7.2，DO 50％进行细胞培养。启动搅拌装置，设定转速为80转/分，在该转速下，培养液速度低于冲出点，载体沉降下来，形成类似固定床培养的培养方式，其工作状态图见图3，载体与载体之间较为疏松，并且可观察到载体微小的晃动，在此状态培养1小时。
改变搅拌装置的搅拌速度为250转/分，培养液经导流管形成旋流向下流动，再由底部的通孔冲出，形成旋流，向上流动，载体处于悬浮状态，且上下翻动，形成流化床培养。如图2所示，在此状态培养2分钟。将搅拌装置转速调至0转/分，培养0.5分钟；再在搅拌装置转速调至80转/分，培养1小时，周而复始。以上循环程序可通过计算机设置。每天进行细胞采样，观察细胞生长形态，计算细胞密度。
接种后第2天开始连续灌流，每日灌注新鲜培养基7-21L，以达到充分补充营养物质的目的。所谓的连续灌流就是可以连续往培养罐里供给养分如营养液，同时输出上清液，即固定板上方的液体，由于固定板的阻隔，片状纤维载体限制在固定板之下，使得上清液的提取很方便，实现连续培养。
细胞培养密度计算结果如下：第1天1.4x106/ml，第2天3.4x106/ml，第3天8.4x106/ml，第4天17.2x106/ml.，第5天32.9x106/ml，第6天50.3x106/ml。
实施例2：利用本发明所述流化床生物反应器进行中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)的大量培养
在10L流化床生物反应器中加入300克国产片状聚酯载体，同时加入8L磷酸缓冲液(pH7.2)，123℃高压消毒60分钟，自然冷却过夜。第2天排空罐内磷酸缓冲液，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，接种CHO细胞，接种后罐内细胞密度达5x105/ml，开始细胞培养。
设定反应器细胞培养条件为温度37℃，pH 7.2，DO 50％进行细胞培养。启动搅拌装置，设定转速为80转/分，在该转速下，培养液速度低于冲出点，形成类似固定床的培养方式，但是可观察到载体微小的晃动，这种晃动有助于均匀培养液，在此状态培养1小时。
改变搅拌装置的搅拌速度为260转/分，流体向上运动速度改变，载体处于悬浮状态，形成流化床培养，在此状态培养2分钟。再将搅拌装置转速调至0转/分，培养0.5分钟。再将搅拌装置转速调至80转/分，培养1小时，周而复始。以上循环程序可通过计算机设置。每天进行细胞采样，观察细胞生长形态，计算细胞密度。
接种后第2天开始连续灌流，每日灌注新鲜培养基7-21L，以达到充分补充营养物质的目的。所谓的连续灌流就是可以连续往培养罐里供给养分如营养液，同时输出上清液，即固定板上方的液体。由于固定板的阻隔，片状纤维载体限制在固定板之下，使得上清液的提取很方便，实现连续培养。
细胞培养密度计算结果如下：第1天1.4x106/ml，第2天3.4x106/ml，第3天8.4x106/ml，第4天17.2x106/ml.，第5天32.9x106/ml，第6天50.3x106/ml。
实施例3：利用本发明所述流化床生物反应器进行293细胞的大量培养
在10L流化床生物反应器中加入300克国产片状聚酯载体，同时加入8L磷酸缓冲液(pH7.2)，123℃高压消毒60分钟，自然冷却过夜。第2天排空罐内磷酸缓冲液，加入高糖的DMEM培养基，接种293细胞，接种后罐内细胞密度达5x105/ml，开始细胞培养。
设定反应器细胞培养条件为温度37℃，pH 7.2，DO 50％进行细胞培养，启动搅拌装置，设定转速为80转/分，在该转速下，流体速度低于冲出点，形成类似固定床的培养方式，但是可观察到载体微小的晃动，这种晃动有助于均匀培养液，在此状态培养1小时。
改变搅拌装置的搅拌速度为260转/分，流体向上运动速度改变，载体处于悬浮状态，形成流化床培养，在此状态培养2分钟。再将搅拌装置转速调至0转/分，培养0.5分钟。再在搅拌装置转速调至80转/分，培养1小时，周而复始。以上循环程序可通过计算机设置。每天进行细胞采样，观察细胞生长形态，计算细胞密度。
接种后第2天开始连续灌流，每日灌注新鲜培养基7-21L，以达到充分补充营养物质的目的。所谓的连续灌流就是可以连续往培养罐里供给养分如营养液，同时输出上清液，即固定板上方的液体，由于固定板的阻隔，片状纤维载体限制在固定板之下，使得上清液的提取很方便，实现连续培养。
细胞培养密度计算结果如下：第1天1.4x106/ml，第2天3.4x106/ml，第3天8.4x106/ml，第4天17.2x106/ml.，第5天32.9x106/ml，第6天50.3x106/ml。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种流化床生物反应器，包括罐体(1)、导流管(2)、固定板(3)和设置于罐体(1)内的搅拌装置(4)，其特征在于，在搅拌装置(4)外设置与导流管(2)相接的多孔圆管(5)，所述多孔圆管(5)上设置多个通孔，与罐体(1)的底部连接。
2.根据权利要求1所述的流化床生物反应器，其特征在于，所述导流管(2)下端口径扩大。
3.根据权利要求1所述的流化床生物反应器，其特征在于，所述多孔圆管(5)的通孔孔径小于所用载体的直径。
4.根据权利要求1所述的流化床生物反应器，其特征在于，所述搅拌装置(4)的搅拌桨叶(41)为平叶或螺旋桨形。
5.根据权利要求1所述的流化床生物反应器，其特征在于，所述固定板(3)设置于罐体上部。
6.根据权利要求1所述的流化床生物反应器，其特征在于，所述固定板(3)为多孔材料制成。
7.根据权利要求6所述的流化床生物反应器，其特征在于，所述固定板(3)由多孔不锈钢或多孔塑料制成。
8.根据权利要求6所述的流化床生物反应器，其特征在于，所述多孔材料为ETFE、聚乙烯或聚丙烯。
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