CN102105489A - 人c组轮状病毒样颗粒的表达和组装及其应用 - Google Patents

Abstract

C组轮状病毒(Group C rotaviruses)是儿童和成人中急性肠胃炎的导致原因，与A组RV截然不同。然而，人C组轮状病毒不能在培养基中生长，导致缺乏用于检测和治疗GrpC RV疾病的工具。因此，GpC RV疾病负担还没有清楚确定。根据本发明的具体实施例，提供了分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，以及除了别的以外，它们的生产方法和在Grp C RV感染检测、诊断分析和免疫原性组合物中的用途。

Description

人C组轮状病毒样颗粒的表达和组装及其应用

对相关申请的参考

本申请要求2008年5月29日提交的序列号61/130,615的美国临时专利申请和2008年11月5号递交的序列号61/111,425的美国临时专利申请的优先权，两者的全部内容在这里通过参考纳入。

政府资助

本发明由美国政府机构-疾病控制和预防中心作出。

技术领域

本发明涉及C组轮状病毒(group C rotaviruses，GpC RV)和轮状病毒样颗粒(rotavirus-likeparticles)，生产免疫原性(immunogenic)轮状病毒样颗粒的方法，包括轮状病毒样颗粒的免疫原性组合物(immunogenic compositions)和使用包括轮状病毒样颗粒的免疫原性组合物激发免疫反应的方法，以及产生形成用于轮状病毒感染的诊断。

背景技术

轮状病毒(Rotaviruses)是基于内源衣壳蛋白VP6的截然不同的特征分为A至G组的各种病原体的组合。其中，GpC RV已被确定为人类的病原体并导致全世界小于3岁的儿童(8，13，15，25，26，29，30)、青少年和成人(2，15，20，21，25，26，30，32)中胃肠炎的暴发和散发病例。虽然一些研究已经报道在腹泻儿童中的低检出率(1，2，4，26，29)，血清流行病学(seroprevalence studies)研究表明GpC RV是在成人中具有高得多的发生率的普通病原体(4，6，10，20，27，31)。

低GpC RV检测的一个可能的原因是无法获得足够的诊断工具。虽然PCR是一种经常采用的技术，但是由于其衣壳蛋白的不稳定性和其RNA基因组的降解，用于诊断GpC RV它往往是不敏感的。对于许多涉及诊断来自肠胃炎的患者样本的检验科来说，它也不是一种容易采用的技术。如果可以得到一种更加实用经济的工具，像GpC RV特异性酶免疫分析(GpCRV-specific enzyme immunoassay，EIA)，就能够进行大量样本的检测以更好地评估GpC RV疾病负担。Cowden病毒株(Cowden strain)，一种原始猪GpC RV，的繁殖已经成功，并且针对该病毒的抗体已经用于GpC RV诊断(13，28，30，33，34)。然而，它们对人GpC RV的特异性和敏感性是有问题的。在研发一种用于人GpC RV的敏感的和特异的EIA中的进展受阻于其在培养基中不易生长。为了规避GpC RV不易生长问题的现有技术问题，使用杆状病毒系统将来自人GpC RV的VP6表达在昆虫细胞中，对该重组蛋白的抗体用于血清流行病学研究(6，11，31)。据我们所知，这些试剂还没有用于人类样本的病毒检测，它们对于GpC RV的特异性仍然是有问题的。

GpC RV是儿童和成人中急性肠胃炎的导致原因，与A组RV截然不同。人A组RV检测方法已经很好地确定并广泛可用的，而C组RV诊断只在少数参考实验室是可用的。由于天然的人GpC RV是不稳定的，不能在细胞培养基中生长，已经使用来自动物的C组RV的试剂用于诊断。然而，这些诊断工具对于人类病毒株可能是不足够敏感的或特异的。因此，用于人C组RV的敏感的和特异的检测方法不是现成可用的。因此，GpC RV疾病负担还没有清楚确定。

因此，存在对人特异性C组轮状病毒诊断的需要。还存在对使用在这样的诊断中和作为疫苗激发免疫反应的人C组RV样颗粒的需要。

发明内容

根据本发明的具体实施例，提供了分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，包括人轮状病毒C组VP6蛋白和人轮状病毒C组VP7蛋白。在进一步的具体实施例中，提供了分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，包括人轮状病毒C组VP6蛋白、人轮状病毒C组VP7蛋白和人轮状病毒C组VP2蛋白。根据某些具体实施例，本发明的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒是没有其它人轮状病毒C组蛋白例如VP1、VP3、VP4、NSP1、NSP2、NPS3、NSP4、NSP5、NSP6和NSP7。

根据本发明的具体实施例，提供了分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其包括包含SEQ ID No.32的氨基酸序列的人轮状病毒C组VP6蛋白。根据本发明的具体实施例，提供了分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其包括包含SEQ ID No.34的氨基酸序列的人轮状病毒C组VP7蛋白。在特定具体实施例中，根据本发明的具体实施例，提供了分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其包括包含SEQ ID No.32的氨基酸序列的人轮状病毒C组VP6蛋白和包含SEQ ID No.34的氨基酸序列的人轮状病毒C组VP7蛋白。

根据本发明的具体实施例，提供了分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其包括包含SEQ ID No.1的氨基酸序列的人轮状病毒C组VP2蛋白。在进一步的具体实施例中，根据本发明的具体实施例，提供了分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其包括包含SEQ ID No.32的氨基酸序列的人轮状病毒C组VP6蛋白、包含SEQ ID No.34的氨基酸序列的人轮状病毒C组VP7蛋白和包含SEQ ID No.1的氨基酸序列的人轮状病毒C组VP2蛋白。

根据本发明的具体实施例，提供了用于检测生物样本中人轮状病毒C组抗体的方法，其包括用许多分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒接触第一生物样本，和检测在存在第一生物样本中的抗人轮状病毒C组抗体和许多分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒之间的复合物的形成，以获得指示抗人轮状病毒C组抗体存在的第一信号。

根据本发明的具体实施例，提供了抗人轮状病毒C组疫苗，其包括和药学上可接受的载体混合的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒。

根据本发明的具体实施例，提供了输送货物部分至细胞的方法，其包括将货物部分导入由分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒限定的内部空间中和将分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒和细胞接触。

示例性的货物部分是标记、抗原、编码蛋白或肽的核酸序列和治疗剂。

根据本发明的具体实施例，提供了抗人轮状病毒C组抗体检测试剂盒，其包括分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒和至少一种辅助试剂。可选地，病毒样颗粒附着至固体基质。

根据本发明的具体实施例，提供了免疫原性组合物，其包括这里描述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒和药学上可接受的载体。可选地，发明的免疫原性组合物包括免疫佐剂。

根据本发明的具体实施例，提供了在人体中产生免疫反应的方法，包括对人施用包含发明的人轮状病毒C组病毒样颗粒的免疫原性组合物。可选地，发明的方法包括施用免疫原性组合物至粘膜表面。

根据本发明的具体实施例，提供了分离的多肽，包括下列一种氨基酸序列：a)具有与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)至少98％一致性的氨基酸序列；b)具有与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)至少99％一致性的氨基酸序列；c)SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)；或d)SEQ IDNO：32中所示的氨基酸序列(S1 VP6氨基酸序列)。根据本发明的具体实施例，提供了分离的核酸分子，包括编码分离的多肽的核苷酸序列，分离的多肽包括下列一种氨基酸序列：a)具有与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)至少98％一致性的氨基酸序列；b)具有与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)至少99％一致性的氨基酸序列；c)SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)；或d)SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列(S1 VP6氨基酸序列)。

根据本发明的具体实施例，提供了免疫原性组合物，其包括包含SEQ ID NOS：1-13的至少一种氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列是由抗体识别的抗原表位。可选地，这种免疫原性组合物还包括在这里描述的病毒样颗粒。

根据本发明的具体实施例，提供了对C组轮状病毒是特异的且不识别A组轮状病毒的抗体。在特定的具体实施例中，根据本发明的具体实施例的抗体对SEQ ID NOS：3-13的任意一种氨基酸序列是特异的且不识别A组轮状病毒。

根据本发明的具体实施例，提供了分离的多肽，其包括SEQ ID NO：3或8的至少一种氨基酸序列。根据本发明的具体实施例，提供了分离的核酸分子，包括编码分离的多肽的核苷酸序列，分离的多肽包括SEQ ID NO：3或8的至少一种氨基酸序列。

根据本发明的具体实施例，提供了包括分离的核酸分子的载体，核酸分子包括编码分离的多肽的核苷酸序列，分离的多肽包括SEQ ID NO：3或8的至少一种氨基酸序列。根据特定的具体实施例，提供了包括本发明的载体的分离的宿主细胞。

根据本发明的具体实施例，提供了用于形成人C组轮状病毒样颗粒的方法，包括构建包含核酸分子的第一载体，核酸分子包括编码人C组轮状病毒VP6衣壳蛋白的序列，其可操作地连接至启动所述蛋白在昆虫细胞中表达的启动子；构建包含核酸分子的第二载体，核酸分子包括编码人C组轮状病毒VP7衣壳蛋白的序列，其可操作地连接至启动所述蛋白在昆虫细胞中表达的启动子；在促进VP6衣壳蛋白和VP7衣壳蛋白表达并结合以形成人C组轮状病毒样颗粒的条件下，用所述第一和第二杆状病毒载体感染昆虫细胞培养物。在进一步的具体实施例中，用于形成人C组轮状病毒样颗粒的方法包括构建包含核酸分子的第三载体，核酸分子包括编码人C组轮状病毒VP2核心蛋白的序列，可操作地连接至启动所述蛋白在昆虫细胞中表达的启动子；和在促进VP6衣壳蛋白、VP7衣壳蛋白和VP2核心蛋白表达的条件下，用所述第一杆状病毒载体、第二杆状病毒载体和第三杆状病毒载体感染昆虫细胞培养物。

附图说明

图1A是显示处于不同培养基中的Sf9细胞中GpC RV VP6和VP7表达动力学的电泳凝胶图像；

图1B是显示处于不同培养基中的Hi5(B)细胞中GpC RV VP6和VP7表达动力学的电泳凝胶图像；

图2A是通过在用重组杆状病毒以MOI为1感染的Sf9细胞中表达的重组人轮状病毒CVP2、VP6和VP7自我组装形成的人GpC RV VLPs的电子显微图像；

图2B是通过在用重组杆状病毒以MOI为1.4感染的Sf9细胞中表达的重组人轮状病毒CVP6和VP7自我组装形成的人GpC RV VLPs的电子显微图像；

图3A是显示来自GpA RV YK-1和人轮状病毒GpC VLPs的主要病毒结构蛋白的考马斯亮蓝染色的图像；

图3B是显示来自GpA RV YK-1和人轮状病毒GpC VLPs的主要病毒结构蛋白比较的免疫印迹的图像；

图4A是显示用GpC特异性兔超免疫血清免疫染色的人GpC VLPs的免疫电子显微图像；

图4B是显示用GpA特异性兔超免疫血清免疫染色的人GpC VLPs的免疫电子显微图像；

图4C是显示用GpC特异性兔超免疫血清免疫染色的GpA RV的免疫电子显微图像；

图4D是显示用GpA特异性兔超免疫血清免疫染色的GpA RV的免疫电子显微图像；

图5是来自人病毒株ASP88的C组轮状蛋白VP2蛋白(SEQ ID NO：1)；来自“Bristol”人病毒株的C组轮状蛋白VP2蛋白(SEQ ID NO：16，Accession CAC 44890)和来自“Cowden”猪病毒株的C组轮状蛋白VP2蛋白(SEQ ID NO：17，Accession M74217)的氨基酸序列比较；

图6是编码用于发明的病毒株ASP88的人C组VP-2的序列(SEQ ID NO：18)；编码用于“Cowden”猪病毒株的人C组VP-2的序列(SEQ ID NO：44)和编码用于Bristol的人C组VP-2的序列(SEQ ID NO：19)的核苷酸序列比较；

图7是编码用于发明的病毒株S-1的人C组VP-6的序列(SEQ ID NO：18)与编码用于传统的病毒株Bristol的人C组VP-6的序列(SEQ ID NO：25，Accession CAA42504)；编码用于Jajeri的人C组VP-6的序列(SEQ ID NO：26，Accession AAK26534)；编码用于CMH004的人C组VP-6的序列(SEQ ID NO：27，Accession ABR31794)；编码用于V508(SEQ ID NO：28，Accession AAX13496)的人C组VP-6的序列；编码用于China的人C组VP-6的序列(SEQID NO：29，Accession BAB83829)；和编码用于BCN6的人C组VP-6的序列(SEQ ID NO：30，Accession CAJ41549)的核苷酸序列比较；

图8是编码用于发明的病毒株S-1的人C组VP-6的序列(SEQ ID NO：32)与编码用于传统的病毒株Bristol的人C组VP-6的序列(SEQ ID NO：35，Accession CAA42504)；编码用于Jajeri的人C组VP-6的序列(SEQ ID NO：36，Accession AAK26534)；编码用于CMH004的人C组VP-6的序列(SEQ ID NO：37，Accession ABR31794)；编码用于V508的人C组VP-6的序列(SEQ ID NO：38，Accession AAX13496)；编码用于China的人C组VP-6的序列(SEQ ID NO：39，Accession BAB83829)；和编码用于BCN6的人C组VP-6的序列(SEQID NO：40，Accession CAJ41549)的氨基酸序列比较；

图9是来自S-1病毒株的人轮状病毒VP6蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：46)，包括开放读码框、5’和3’非编码序列；和

图10是编码用于发明的病毒株S-1的人C组VP-6并包括5’和3’非编码序列的序列(SEQID NO：46)和编码用于Bristol VP6的人C组VP-6并包括5’和3’非编码序列的序列(SEQ IDNo.47)的核苷酸序列比较。

具体实施方式

C组轮状病毒(Group C rotavirus，GpC RV)是儿童和成人中急性肠胃炎的病原体。GpCRV的鉴定到目前只已经完成能在细胞培养基中生长的猪和牛病毒株。由于人GpC RVs是不稳定的，不能在细胞培养基中进行培养，因此，没有可用的试剂和灵敏的、特异性的检测方法。因此，还没有清楚确定GpC RV对腹泻疾病的影响。

这里证明的是主要的内和外人衣壳GpC蛋白VP6和VP7以及人GpC核心蛋白VP2的表达和人GpC VP6/7病毒样颗粒(VLPs)或人GpC VP2/6/7VLPs的自我组装。针对这些人GpCRVVLPs的抗体显示与相应的GpC而不是GpARV的高特异的反应性。

产生大量人GpC RV抗原材料例如人GpC RV蛋白和VLPs的能力和高质量抗体试剂的可得性提供了敏感和特异的诊断分析方法和提供了用于研究人体中GpC RV的流行病学和疾病负担的工具。

本发明具有许多用途，包括但不限于检测生物样本中人轮状病毒C抗体、诊断人轮状病毒C感染、确定以前或现在感染人轮状病毒C的个体、作为抗原用于产生抗体和用于形成预防或治疗与人轮状病毒C感染有关的疾病的治疗物。

依照本发明，可以使用本领域技术人员已知的各种技术和术语包括单不限于常规分子生物学、微生物学、免疫学和重组DNA技术和术语。这些技术和术语详细描述和/或定义在标准参考文献例如J.Sambrook and D.W.Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，3rd Ed.，2001；F.M.Ausubel et al.，Eds.，Short Protocols inMolecular Biology，Current Protocols，Wiley，2002；Wild，D.，The Immunoassay Handbook，3rd Ed.，Elsevier Science，2005；Gosling，J.P.，Immunoassays：A Practical Approach，Practical ApproachSeries，Oxford University Press，2005；和Harlow，E.and Lane，D.，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；F.Breitling and S.Dübel，RecombinantAntibodies，John Wiley & Sons，New York，1999；H.Zola，Monoclonal Antibodies：Preparation andUse of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives，Basics：From Background toBench，BIOS Scientific Publishers，2000；B.K.C.Lo，Antibody Engineering：Methods and Protocols，Methods in Molecular Biology，Humana Press，2003；Crowther，J.R.，The ELISA Guidebook(Methods in Molecular Biology)，Humana Press，2000；和在这里描述的其它参考文献。

人轮状病毒C病毒样颗粒

根据本发明，提供了人轮状病毒C病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)。术语“病毒样颗粒”是指限定内部空间的衣壳。由衣壳限定的内部空间是“没有”完整的人轮状病毒C基因组，本发明的人轮状病毒C VLPs因此是不可复制的，并不能够导致人轮状病毒C相关疾病。

根据本发明的具体实施例，人轮状病毒C VLPs包括人轮状病毒C VP6和VP7蛋白。在本发明的进一步的具体实施例中，人轮状病毒C VLPs包括人轮状病毒C VP2、VP6和VP7蛋白。

编码人轮状病毒C蛋白VP2、VP6和VP7的基因已被确定和测序。

任何人C组RV VP6蛋白可以包括在本发明的人轮状病毒C VLPs中。可以包括在本发明的人轮状病毒C VLPs中的人C组RV VP6蛋白的例子包括来自人C组病毒株S-1VP6(SEQID NO：32)；Bristol病毒株(SEQ ID NO：35，Accession CAA42504)；Jajeri病毒株(SEQ ID NO：36，Accession AAK26534)；CMH004病毒株(SEQ ID NO：37，Accession ABR31794)；V508病毒株(SEQ ID NO：38，Accession AAX13496)；China病毒株(SEQ ID NO：39，AccessionBAB83829)；和BCN6病毒株(SEQ ID NO：40，Accession CAJ41549)的VP6蛋白。

可以包括在人GpC RV VLPs中的人C组RV VP6蛋白包括那些已知为NCBI登录号(Accession numbers)BAB83829、AAK26535、AAK26534、AAX13496、AAX13492、AAX13491、CAJ41551、CAJ41550、CAJ41549、AAW82662、AAW82661、ABD96606、ABD96605、ABD96604、AAA47340、AAA47339、CAA42504、AAX08120、ABR31794、YP_392512、P69481、P69483和P69482的蛋白。

任何人C组RV VP7蛋白可以包括在本发明的人轮状病毒C VLPs中。可以包括在本发明的人轮状病毒C VLPs中的人C组RV VP7蛋白的例子包括那些已知为NCBI登录号BAB83828、AAX16188、AAX16187、AAX16186、CAJ41554、CAJ41553、CAJ41552、AAW82659、AAD25388、BAA20340、BAA20339、AAQ93808、AAQ93807、AAA47352、BAF73591、BAF73590、BAF73589、BAF73588、BAF73587、BAD20702、BAD20701、BAD20700、BAD20699、AAK26533、AAK26530、ABR31795、BAC53881、BAC53880、BAC53879、BAC53878、BAC53877、BAC53876、BAC53875、BAC53874、ABE01860、ABE01859、ABE01858、AAF33400、AAF33399、AAF33398、AAF33397、AAF33396、AAF33395、AAF33394、AAF33393、AAF33392、AAF33391、AAF33390、AAF33389、BAA33952、P30216、ABO25864和2209225A的蛋白。

任何人C组RV VP2蛋白可以包括在本发明的人轮状病毒C VLPs中。可以包括在本发明的人轮状病毒C VLPs中的人C组RV VP2蛋白的例子包括人C组病毒株ASP88 VP2(SEQ IDNO：1)；和Bristol病毒株(SEQ ID NO：16，Accession CAB52753)的蛋白。

除了这些VP2、VP6和VP7氨基酸序列，术语VP2、VP6或VP7氨基酸序列包括变体。在特定的具体实施例中，包括在本发明的VLP组合物中的氨基酸序列，VP2，是ASP88 VP2(SEQ ID No.1)的变体。在进一步的具体实施例中，包括在本发明的VLP组合物中的氨基酸序列，VP6，是S-1 VP6(SEQ ID No.32)的变体。在进一步的具体实施例中，包括在本发明的VLP组合物的氨基酸序例，VP7，是S-1 VP7(SEQ ID No.34)的变体。

在另一方面，本发明提供了轮状病毒样颗粒，具有病毒株ASP88蛋白(SEQ ID NO：1)或其片段或变体的人C组RV的核心VP2结构蛋白。

在另一方面，本发明提供了轮状病毒样颗粒，包括VP6衣壳蛋白和VP7衣壳蛋白，或它们的片段或变体，条件是所述颗粒不包括(SEQ ID NO：16；Bristol)中所示的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了分离的多肽，包括选自下列氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列：a)具有与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)至少98％一致性的氨基酸序列；b)具有与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)至少99％一致性的氨基酸序列；c)SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)；或d)SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列(S1 VP6氨基酸序列)。

在另一方面，本发明提供了分离的核酸分子，包括编码在这里描述的发明的多肽的一种或更多种的核苷酸序列。在某些具体实施例中，本发明提供了编码VP2的分离的核酸分子，选自由下列核酸分子组成的组：a)编码具有与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)至少98％一致性的发明的多肽的分离的核酸分子；b)编码具有与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)至少99％一致性的发明的多肽的分离的核酸分子；c)编码SEQ ID NO：1(ASP88 VP2氨基酸序列)中所示的发明的多肽的分离的核酸分子；或d)编码SEQ ID NO：32(S-1 VP6氨基酸序列)中所示的发明的多肽的分离的核酸分子。

在另一方面，本发明提供了免疫原性组合物，包括含有至少一种下列氨基酸序列的多肽：

LETIIDKEVK ENKDSTKDEK LVVTEESNGD VTA(SEQ ID NO：2)，

LETIINKEVK ENKDSMKEDK LVVTEESNGD VTT(SEQ ID NO：3)，

TENVEEKEIK EAKEQVKDEK QVITEENVDS PKD(SEQ ID NO：4)，

KLTEIQESSA KTYNTLFRLF TP(SEQ ID NO：5)，

NYRNSRIKCQ TYNKLFRL(SEQ ID NO：6)，

LNVLEG MPDYIMLRDM AV(SEQ ID NO：7)，

LNVLEE MPDYIMLRDM AV(SEQ ID NO：8)，

LNVLDE MPDYVMLRDM AV(SEQ ID NO：9)，

AAHLQLE AITVQVESQF LAGISAAAAN EA(SEQ ID NO：10)，

LQCKLNH NSWQELVHGR NE(SEQ ID NO：11)，

LSACIVMNMH LVG(SEQ ID NO：12)，和

IPPDQMYRLR NRLRNIP(SEQ ID NO：13)；

其中，所述氨基酸序列是由抗体识别的抗原表位。

在另一方面，本发明提供了识别一种下列氨基酸的抗体制剂：

LETIIDKEVK ENKDSTKDEK LVVTEESNGD VTA(SEQ ID NO：2)，

LETIINKEVK ENKDSMKEDK LVVTEESNGD VTT(SEQ ID NO：3)，

TENVEEKEIK EAKEQVKDEK QVITEENVDS PKD(SEQ ID NO：4)，

KLTEIQESSA KTYNTLFRLF TP(SEQ ID NO：5)，

NYRNSRIKCQ TYNKLFRL(SEQ ID NO：6)，

LNVLEG MPDYIMLRDM AV(SEQ ID NO：7)，

LNVLEE MPDYIMLRDM AV(SEQ ID NO：8)，

LNVLDE MPDYVMLRDM AV(SEQ ID NO：9)，

AAHLQLE AITVQVESQF LAGISAAAAN EA(SEQ ID NO：10)，

LQCKLNH NSWQELVHGR NE(SEQ ID NO：11)，

LSACIVMNMH LVG(SEQ ID NO：12)，和

IPPDQMYRLR NRLRNIP(SEQ ID NO：13).

在另一方面，本发明提供了包括在这里描述的发明的核酸分子的载体。

在另一方面，本发明提供了包括在这里描述的发明的载体的一种或更多种的分离的宿主细胞。

发明的方法和组合物不限于具有在这里详细描述的氨基酸序列的VP蛋白和多肽。可以使用合适的变体例如来自其它病毒株或组的类似物。

如在这里所使用的，术语“变体”定义为或者是人轮状病毒C病毒的自然发生的遗传突变体或者是人轮状病毒C病毒的重组制备的变体，与对照人轮状病毒C VP2、VP6或VP7相比，每一个在其基因组中含有一个或更多个突变。术语“变体”也可指或者是特定肽的自然发生的变体或者是特定肽或蛋白的重组制备的变体，其中一个或更多个氨基酸残基已经通过氨基酸替换、增加或删除进行改变。

优选的是具有与SEQ ID No.1、SEQ ID No.32或SEQ ID No.34至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的人轮状病毒C蛋白。更优选的是具有与SEQ ID No.1、SEQ ID No.32或SEQ ID No.34一致性99％或更高的人轮状病毒C蛋白。

突变可以通过标准的分子生物学技术例如定点突变和PCR介导的突变引入。本领域技术人员将认识到可以引入一个或更多个氨基酸突变，而不改变人轮状病毒C VP2、VP6或VP7蛋白的功能特性。

本领域技术人员还认识到VP蛋白和多肽变体包括在这里详细列出的VP蛋白和多肽的氨基酸序列中保守氨基酸替换。可以在人轮状病毒C VP2、VP6或VP7蛋白中进行保守氨基酸替换以产生人轮状病毒C VP2、VP6或VP7变体。保守氨基酸替换是本领域已知的一种氨基酸代替另一种具有相似特性的氨基酸。例如，每种氨基酸可以描述为具有下列特征的一个或更多个：带正电的、带负电的、脂肪族的、芳香族的、极性的、疏水的和亲水的。保守替换是一种具有特定结构或功能特性的氨基酸替换另一种具有相同特性的氨基酸。酸性氨基酸包括天门冬氨酸(aspartate)、谷氨酸(glutamate)；碱性氨基酸包括组氨酸(histidine)、赖氨酸(lysine)、精氨酸(arginine)；脂肪族氨基酸包括异亮氨酸(isoleucine)、亮氨酸(leucine)和缬氨酸(valine)；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸(phenylalanine)、甘氨酸(glycine)、酪氨酸(tryosine)和色氨酸(tryptophan)；极性氨基酸包括天门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺(asparagine)、谷氨酰胺(glutamine)、精氨酸、丝氨酸(sercine)、苏氨酸(threonine)和酪氨酸；和疏水氨基酸包括丙氨酸(alanine)、半胱氨酸(cysteine)、苯丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸(methionine)、脯氨酸(proline)、缬氨酸和色氨酸；保守氨基酸替换包括在每个组中氨基酸之间的替换。氨基酸也可用相对大小描述，丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸，所有这些氨基酸通常被认为是小的。

人轮状病毒C VP2、VP6或VP7变体可以包括合成的氨基酸类似物、氨基酸衍生物和/或非标准氨基酸，示例性地包括但不限于α-氨基丁酸(alpha-aminobutyric acid)、瓜氨酸(citrulline)、刀豆氨酸(canavanine)、氰丙氨酸(cyanoalanine)、二氨基丁酸(diaminobutyricacid)、二氨基庚二酸(diaminopimelic acid)、二羟基-苯丙氨酸(dihydroxy-phenylalanine)、今可豆氨酸(djenkolic acid)、高精氨酸(homoarginine)、羟脯氨酸(hydroxyproline)、正亮氨酸(norleucine)、正缬氨酸(norvaline)、3-磷酸丝氨酸(3-phosphoserine)、高丝氨酸(homoserine)、5-羟基色氨酸(5-hydroxytryptophan)、1-甲基组氨酸(1-methylhistidine)、3-甲基组氨酸(3-methylhistidine)和鸟氨酸(ornithine)。

此外，本领域技术人员可理解，由于遗传密码的简并性，多个核酸将编码相同的蛋白。因此，编码VP蛋白和多肽的核酸或其变体的核酸不限于在这里详细描述的那些核酸。

具有与在这里详细描述的氨基酸序列95％、96％、97％、98％或99％同源性的VP蛋白和多肽变体在所描述的方法和组合物中是可操作的。具有与在这里详细描述的核苷酸序列95％、96％、97％、98％或99％同源性的核酸变体在所描述的方法和组合物中是可操作的。

“同源性(homology)”指在两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个多肽序列之间的序列相似性(sequence similarity)或，可选择地，序列一致性(sequence identity)。

术语“一致性百分率(percent identity)”和“％一致性(％identity)”，如应用于多核苷酸序列，指的是在使用标准算法比对的至少两个多核苷酸序列之间相同核苷酸匹配的百分率。这种算法可以以标准化的和可重复的方式在比较的序列中插入间隔(gap)，以优化两序列之间的比对，并因此实现两个序列的更有意义的比较。

多核苷酸序列之间的一致性百分率可以使用本领域已知的或这里描述的一个或更多个计算机算法或程序进行确定。例如，一致性百分率可以通过使用如整合进MEGALIGN版本3.12e序列对比程序中的CLUSTAL V算法的默认参数进行确定。这个程序是LASERGENE软件包，一套分子生物学分析程序(DNASTAR，Madison Wis.)，的部分。CLUSTAL V描述在Higgins，D.G.and P.M.Sharp(1989；CABIOS 5：151-153)和Higgins，D.G.et al.(1992；CABIOS8：189-191)中。对于多核苷酸序列的两两比对，默认的参数设置如下：Ktuple＝2，gap penalty＝5，window＝4，和“diagonals saved”＝4。“加权的(weighted)”残基量表选定为默认值。

可选择地，可以使用的一套常用的和免费可得的序列比较算法由美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)碱基局部对比检索工具(Basic LocalAlignment Search Tool，BLAST)(Altschul，S.F.et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)提供，其可从几种来源得到，包括美国国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，Md.)，和在互联网上可得的NCBI万维网站点。BLAST软件套件包括各种序列分析程序，包括用于对比已知的多核苷酸序列和来自各种数据库的其它多核苷酸序列的“Blastn，”。还可得到的是用于两个核苷酸序列的直接两两比较的称为“BLAST 2 Sequences”的工具。还可以在互联网上通过NCBI万维网站点交互式访问和使用“BLAST 2 Sequences”。“BLAST 2 Sequences”工具可以用于blastn和blastp(下面讨论)。BLAST程序通常用设置成默认设置的gap和其它参数进行使用。例如，要比较两个核苷酸序列，人们可以用设置成默认参数的“BLAST 2 Sequences”版本2.0.12(2000年4月21日)使用blastn。这种默认参数可以是，例如：Matrix：BLOSUM62；Reward for match：1；Penalty for mismatch：-2；Open Gap：5和Extension Gap：2 penalties；Gap xdrop-off：50；Expect：10；Word Size：11；Filter：on。

一致性百分率可以基于例如由特定SEQ ID号限定的整个限定序列的长度进行测定，或可以基于更短的长度进行测定，例如，基于来自更长的限定的序列的片段的长度，例如至少20、至少30、至少40、至少50、至少70、至少100或至少200个连续核苷酸的片段。这样的长度只是示例性的，可理解可以使用在这里，在表格、图或序列表中显示的序列支持的任何片段长度，以描述一种长度，一致性百分率可以基于该长度进行测定。

词语“一致性百分率”和“％一致性”，如应用于多肽序列，指的是在使用标准算法比对的至少两个多肽序列之间的相同残基匹配的百分率。多肽序列比对的方法是已知的。一些比对方法考虑保守氨基酸替换。这种保守替换，如在上面更详细解释的，通常在代替位点保持电荷和疏水性，从而保持多肽的结构(以及因此功能)。词语“相似性百分率(percent similarity)”和“％相似性(％similarity)”，如应用于多肽序列，指的是残基匹配的百分率，包括在使用标准算法比对的至少两个多肽序列之间的相同残基匹配和保存替换。相比之下，保守替换没有包括在多肽序列之间一致性百分率的计算中。

多肽序列之间一致性百分率可以通过使用如整合进MEGALIGN版本3.12e序列对比程序(描述在上面并参考上面)中的CLUSTAL V算法的默认参数进行确定。对于使用CLUSTALV进行的多肽序列的两两比对，默认的参数设置如下：Ktuple＝1，gap penalty＝3，window＝5，和“diagonals saved”＝5。PAM250矩阵选定为默认残基量表。

可选择地，可以使用NCBI BLAST软件套件，例如，对于两个多肽序列的两两比较，人们可以用设置成默认参数的“BLAST 2 Sequences”工具版本2.0.12(2000年4月21日)使用blastp。这种默认参数可以是，例如：Matrix：BLOSUM62；Open Gap：11和Extension Gap：1penalties；Gap x drop-off：50；Expect：10；Word Size：3；Filter：on。

一致性百分率可以基于例如由特定SEQ ID号限定的整个限定多肽序列的长度进行测定，或可以基于更短的长度进行测定，例如，基于来自更长的限定的多肽序列的片段的长度，例如至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段。这样的长度只是示例性的，可理解可以使用在这里，在表格、图或序列表中显示的序列支持的任何片段长度，以描述一种长度，一致性百分率可以基于该长度进行测定。

此外，蛋白和多肽和它们的变体的片段可以包括在本发明的方法和组合物中，只要该片段在影响相关的普通技术人员理解的生物活性方面是可操作的。因此，例如，片段包括VP2蛋白和多肽的片段；当在昆虫细胞培养物中和V6和VP7蛋白或多肽、或它们的变体或片段一起表达时，片段包含在病毒样颗粒中。因此，例如，片段包括VP6蛋白和多肽的片段；当在昆虫细胞培养物中和VP7蛋白或多肽、或其变体或片段一起表达时，片段包含在病毒样颗粒中。因此，例如，片段包括VP7蛋白和多肽的片段；当在昆虫细胞培养物中和VP6蛋白或多肽、或其变体或片段一起表达时，片段包含在病毒样颗粒中。片段还包括影响在这里描述的用于VP蛋白、多肽或变体的免疫应答的片段。

用于制备VLPs的方法

描述在在这里描述的组合物和方法中的VP2核心蛋白和VP6和VP7衣壳蛋白和多肽(VP蛋白和多肽)可以通过重组方法如这里描述的发明方法或在适当情况下通过本领域技术人员已知的适当的表达方法产生。编码VP蛋白和多肽的核酸序列是分离的，如通过在这里描述的核酸序列举例说明的。

根据本发明的具体实施例，采用重组核酸技术制备VLPs。VLPs产生包括将包括编码人轮状病毒C VP2、VP6和/或VP7的DNA序列的重组表达载体导入宿主细胞。

导入宿主细胞以产生人轮状病毒C VLPs的编码人轮状病毒C VP2、VP6或VP7的具体核酸序列是

可理解，由于遗传密码的简并性，可选择的核酸序列编码人轮状病毒C VP2、VP6或VP7及其变体，而且这种可选择的核酸可以包括在表达载体中并表达以产生本发明的人轮状病毒C VLPs。

在本发明的具体实施例中，核酸序列，其与编码人轮状病毒C VP6的SEQ ID No.31、SEQID NO：46或SEQ ID No.48是基本相同的，包含在表达载体中并表达以产生本发明的人轮状病毒C VLPs。在本发明的进一步的具体实施例中，核酸序列，其与编码人轮状病毒C VP7的SEQ ID No.33是基本相同的，包含在表达载体中并表达以产生本发明的人轮状病毒CVLPs。在本发明的进一步的具体实施例中，核酸序列，其与编码人轮状病毒C VP2的SEQ IDNo.18、SEQ ID No.42或SEQ ID No.43是基本相同的，包含在表达载体中并表达以产生本发明的人轮状病毒C VLPs。

与SEQ ID No.31或SEQ ID NO：46基本相同的核酸序列的特点是具有能够在高严谨杂交条件下与SEQ ID No.31、SEQ ID NO：46或SEQ ID No.48杂交的互补核酸序列。同样，与SEQ ID No.33、SEQ ID No.18、SEQ ID No.42或SEQ ID No.43基本相同的核酸序列的特点是具有能够在高严谨杂交条件下与SEQ ID No.33、SEQ ID No.18、SEQ ID No.42或SEQ IDNo.43分别杂交的互补核酸序列。

术语“核酸”是指处于包括单链、双链、寡核苷酸或多核苷酸的任何形式的具有两个以上核苷酸的RNA或DNA分子。术语“核苷酸序列“是指在寡核苷酸或多核苷酸中处于核酸单链形式的核苷酸顺序。

所谓“互补“是指核苷酸之间沃森-克里克碱基配对，特别是指核苷酸氢键通过胸腺嘧啶或尿嘧啶残基经两个氢键连接至腺嘌呤残基以及胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接而相互连接。通常，核酸序列包括描述为具有与特定的第二核苷酸序列“互补百分率(percentcomplementarity)”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以具有与特定的第二核苷酸序列80％、90％或100％互补性，表明序列的10个核苷酸的8个、9个或10个与特定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3′-TCGA-5′是与序列5′-AGCT-3′100％互补的。此外，核苷酸序列3′-TCGA-是与核苷酸序列5′-TTAGCTGG-3′的一个区域100％互补。

术语“杂交(hybridization)”和“杂交(hybridizes)”是指互补核酸的配对和结合。杂交在两核酸之间发生不同程度依赖于因素，例如，如本领域已知的核酸的互补程度、核酸的变性温度Tm和杂交条件的严谨性。术语“杂交条件的严谨性(stringency of hybridizationconditions)”是指温度、离子强度和关于特定的共同添加剂例如甲酰胺和Denhardt’s溶液的杂交介质组成的条件。与特定核酸有关的特定杂交条件的的确定是常规的，是本领域已知的，例如，如在J.Sambrook and D.W.Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press；3rd Ed.，2001；和F.M.Ausubel，Ed.，Short Protocols in MolecularBiology，Current Protocols；5th Ed.，2002中所描述的。高严谨杂交条件是那些只允许基本互补核酸杂交的条件。通常，具有大约85-100％互补性的核酸被认为是高度互补的，在高严谨条件下杂交。中度严谨条件通过具有中等互补性约50-84％互补性的核酸和那些具有高程度互补性的核酸杂交的条件进行举例说明。相比之下，低严谨杂交条件是那些具有低程度互补性的核酸杂交的条件。

术语“特异性杂交(specific hybridization)”和“特异地杂交(specifically hybridizes)”是指特定核酸与靶标核酸的杂交，而不是基本杂交至除靶标核酸之外的核酸。

杂交和洗涤条件的严谨性取决于几个因素，包括探针和靶标的Tm值和杂交和洗涤条件的离子强度，如本领域技术人员熟知的。实现期望的杂交严谨性的杂交和条件描述在，例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001；和Ausubel，F.et al.，(Eds.)，Short Protocols in Molecular Biology，Wiley，2002中。

高严谨杂交条件的例子是长度超过大约100个核苷酸的核酸在含有6X SSC、5XDenhardt’s溶液、30％甲酰胺和100微克/毫升变性鲑鱼精的溶液中在37℃过夜杂交，然后在0.1X SSC和0.1％SDS的溶液中60℃洗涤15分钟。SSC是0.15M NaCl/0.015M柠檬酸钠。Denhardt’s溶液是0.02％牛血清/0.02％FICOLL/0.02％聚乙烯吡咯烷酮。在高严谨条件下，SEQID No.31、SEQ ID No.33和SEQ ID No.18将杂交至基本相同靶标的互补链，而不是无关的序列。

术语“表达载体”是指将编码一个或更多个人轮状病毒C蛋白的DNA序列导入在其中DNA序列表达以产生该一个或更多个人轮状病毒C蛋白的宿主细胞的重组载体。

在特定的具体实施例中，编码一个或更多个人轮状病毒C蛋白的DNA序列包括编码该一个或更多个人轮状病毒C蛋白的开放读码框。

在进一步的具体实施例中，除了编码该一个或更多个人轮状病毒C蛋白的开放阅读框外，还存在5′非编码序列和/或3′非编码序列。优选地，其中存在5′非编码序列和/或3′非编码序列，与编码该一个或更多个人轮状病毒C蛋白的开放阅读框相连接，5′非编码序列，如果有的话，位于起始密码子的上游(5′)，3′非编码序列，如果有的话，位于终止密码子的下游(3′)。

在特定的具体实施例中，包括SEQ ID No.42或基本相同的核酸序列的表达载体表达以在含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP2和自我组装的VLPs。SEQ ID No.42包括编码来自病毒株Asp88的人轮状病毒C VP2的开放阅读框。可选地，来自病毒株Asp88的人轮状病毒C VP2的5′非编码序列和/或3′非编码序列包括在表达载体中。例如，可以包含5′非编码序列的1-36个核苷酸，与编码来自病毒株Asp88的人轮状病毒C VP2的核苷酸序列的5’端相连。在特定的具体实施例中，包括SEQ ID No.18或基本相同的核酸序列的表达载体表达以在含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP2和自我组装的VLPs。在进一步的具体实施例中，包括SEQ ID No.43或基本相同的核酸序列的表达载体表达以在含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP2和自我组装的VLPs。

在另外的具体实施例中，包括SEQ ID No.31、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48或基本相同的核酸序列的表达载体表达以在含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP6和自我组装的VLPs。

在另外的具体实施例中，包括SEQ ID No.33、SEQ ID No.45或基本相同的核酸序列的表达载体表达以在含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP7和自我组装的VLPs。

在进一步的具体实施例中，包括SEQ ID No.31、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48或基本相同的核酸序列和SEQ ID No.33、SEQ ID No.45或基本相同的核酸序列的表达载体表达以在含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP6、人轮状病毒C VP7和自我组装的VLPs。

在进一步的具体实施例中，包括SEQ ID No.31、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48或基本相同的核酸序列和SEQ ID No.33、SEQ ID No.45或基本相同的核酸序列和SEQ ID No.18、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43或基本相同的核酸序列的表达载体表达以在含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP6、人轮状病毒C VP7、人轮状病毒C VP2和自我组装的VLPs。

在进一步的具体实施例中，包括SEQ ID No.31、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48或基本相同的核酸序列的第一表达载体和包括SEQ ID No.33、SEQ ID No.45或基本相同的核酸序列的第二表达载体均表达以在含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP6、人轮状病毒CVP7和自我组装的VLPs。

在进一步的具体实施例中，包括SEQ ID No.31、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48或基本相同的核酸序列的第一表达载体和包括SEQ ID No.33、SEQ ID No.45或基本相同的核酸序列第二表达载体和包括SEQ ID No.18、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43或基本相同的核酸序列的第三表达载体均表达以在含有表达载体的细胞中产生人轮状病毒C VP6、人轮状病毒CVP7、人轮状病毒C VP2和自我组装的VLPs。

除了编码人轮状病毒C的一个或更多个DNA序列外，编码其它蛋白的一个或更多个DNA序列可以包括在表达载体中。例如，这些其它的蛋白包括非人轮状病毒C蛋白例如报告蛋白，包括但不限于β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白和抗生素抗性报告蛋白；以及抗原。

表达载体在本领域是已知的，包括质粒和病毒，例如，表达载体含有包括编码感兴趣多肽的片段的DNA分子，其中片段可操作地连接至一个或更多个提供用于编码感兴趣的蛋白的片段的转录的调控元件。这些调控元件包括单不限于启动子、终止子、增强子、复制子(origins of replication)和多聚腺苷酸信号(polyadenylation signals)。

在特定的具体实施例中，重组表达载体编码SEQ ID No.1的人轮状病毒C VP2、与SEQID No.1具有至少95％一致性的蛋白、SEQ ID No.42编码的蛋白或由与SEQ ID No.42基本相同的核酸序列编码的蛋白。

在特定的具体实施例中，重组表达载体编码SEQ ID No.32的人轮状病毒C VP6、与SEQID No.32具有至少95％一致性的蛋白、SEQ ID No.31编码的蛋白或由与SEQ ID No.31基本相同的核酸序列编码的蛋白。

在特定的具体实施例中，重组表达载体编码SEQ ID No.34的人轮状病毒C VP7、与SEQID No.34具有至少95％一致性的蛋白、SEQ ID No.33或SEQ ID No.45编码的蛋白或由与SEQ ID No.33或SEQ ID No.45基本相同的核酸序列编码的蛋白。

在进一步的具体实施例中，重组表达载体编码SEQ ID No.32的人轮状病毒C VP6、与SEQ ID No.32具有至少95％一致性的蛋白、SEQ ID No.31编码的蛋白或由与SEQ ID No.31基本相同的核酸序列编码的蛋白；和SEQ ID No.34的人轮状病毒C VP7、与SEQ ID No.34具有至少95％一致性的蛋白、SEQ ID No.33或SEQ ID No.45编码的蛋白或由与SEQ ID No.33或SEQ ID No.45基本相同的核酸序列编码的蛋白。

本发明的优选的表达载体是杆状病毒。

由重组表达载体编码的人轮状病毒C VP2、VP6和/或VP7的表达是通过将表达载体导入真核或原核宿主细胞表达系统如昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞或本领域知道的其它单或多细胞生物实现的。在优选的具体实施例中，使用了真核宿主细胞。宿主细胞可选地是原代细胞或永生化衍生细胞。永生化细胞是那些可以在体外保持至少5次复制传代的细胞。

含有重组表达载体的宿主细胞在人轮状病毒C蛋白产生的条件下维持。人轮状病毒C蛋白自我结合以在宿主细胞中产生本发明的VLPs。

本发明提供了含有根据本发明的核酸序列的宿主细胞。宿主细胞可以使用已知的例如描述在Celis，Julio，ed.，1994，Cell Biology Laboratory Handbook，Academic Press，N.Y.中的细胞培养技术进行培养和维持。可以由本领域技术人员选择和优化用于这些细胞的各种培养条件，包括关于特定营养物、氧气、张力、二氧化碳和减少的血清水平的培养基制剂。

本发明的优选细胞系是真核细胞系，优选是瞬时或稳定表达一个或更多个完整长度或部分人轮状病毒C蛋白的昆虫细胞系，如Sf9或Hi5。这种细胞可以通过转染(蛋白或核酸载体)、感染(病毒载体)或转导(病毒载体)形成。在本发明中使用的细胞系使用本领域技术人员熟知的已知的细胞培养技术进行克隆。这些细胞通过使用市售可得的培养基在适于增殖细胞的已知条件下进行培养和从单个细胞进行扩增。

在优选的具体实施例中，人轮状病毒C VLPs通过用编码人轮状病毒C蛋白的至少一个重组杆状病毒感染宿主细胞而产生。

可理解，单个杆状病毒可以编码或者单个人轮状病毒C蛋白或者多个人轮状病毒C蛋白。然后由此产生的感染细胞在来自各自的重组杆状病毒的编码的人轮状病毒C蛋白产生和自我组装以形成衣壳的条件下进行培养。然后由此产生的人轮状病毒C VLPs可选地和优选地得到分离。

在进一步的优选具体实施例中，重组杆状病毒编码至少SEQ ID No.32的人轮状病毒CVP6、与SEQ ID No.32具有至少95％一致性的蛋白、SEQ ID No.31编码的蛋白或由与SEQID No.31、SEQ ID NO：46或SEQ ID No.48基本相同的核酸序列编码的蛋白；和SEQ ID No.34的人轮状病毒C VP7、与SEQ ID No.34具有至少95％一致性的蛋白、SEQ ID No.33或SEQ ID No.45编码的蛋白或由与SEQ ID No.33或SEQ ID No.45基本相同的核酸序列编码的蛋白。

在进一步的可选择方案中，重组杆状病毒编码SEQ ID No.1的人轮状病毒C VP2、与SEQID No.1具有至少95％一致性的蛋白、SEQ ID No.42编码的蛋白或由与SEQ ID No.42基本相同的核酸序列编码的蛋白。

本领域已知的任何合适的杆状病毒在本发明方法中都是可操作的。优选地，杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa california nuclear polyhedrosis virus)。

用于采用杆状病毒感染细胞的方法是本领域已知的。宿主细胞感染之后，本发明方法在条件下培养宿主细胞以便产生的蛋白自我组装形成VLPs。

本发明的VLP可选地包括接触或结合至人轮状病毒C蛋白VP2、VP6或VP7的至少一个的非人轮状病毒C蛋白或肽。非人轮状病毒C蛋白或肽的结合通过例如包括编码VP2、VP6或VP7和非人轮状病毒C蛋白或肽的核酸序列的融合构建体的表达实现。因此，非人轮状病毒C蛋白或肽可选地是融合蛋白或肽，其中非人轮状病毒C蛋白是作为单个多肽链和人轮状病毒C结构蛋白一起合成的。

非人轮状病毒C蛋白可选地与谷胱甘肽硫转移酶(glutathione-S-transferase，GST)融合用于快速分离。人轮状病毒C蛋白也可选地与GST融合。

化学结合方法可选地用于结合VLP和非人轮状病毒C蛋白或肽，示例性地包括使用交联剂如碳二亚胺(carbodiimide)或戊二醛(glutaraldehyde)的反应。

在特定的具体实施例中，包括在VLP中的非人轮状病毒C蛋白或肽包括一个或更多个抗原表位，以便VLP用于提供一个或更多个抗原表位给对象的免疫系统以诱导抗体产生。

在进一步的可选择方案中，非人轮状病毒C蛋白或肽是靶标部分例如受体配体或受体。靶标部分包含在VLP中以将VLP导向靶标，例如特定的细胞类型。

在宿主细胞中产生的人轮状病毒C VLPs可选地是分离的。涉及人轮状病毒C VLPs的术语“分离的(isolated)”描述了人轮状病毒C VLP，其是从产生人轮状病毒C VLP的细胞分离的，并基本上没有不打算与人轮状病毒C VLP连接的宿主细胞组分。通常，人轮状病毒CVLPs从宿主细胞的整个细胞抽提物中分离。分离VLPs的许多方法是本领域已知的，并可应用于人轮状病毒C VLPs的分离，示例性地包括连续和不连续蔗糖梯度、氯化铯单和多密度梯度离心法、尺寸排阻色谱法(size-exclusion chromatography)、抗原捕获层析、亲和层析或其它本领域已知的合适的方法。用于分离本发明的人轮状病毒C VLPs的示例性的方法描述在Gillock，ET.et al，1997.J.Virol.，71：2857-2865中。

具有不同组合物的人轮状病毒C VLPs，也就是说，人轮状病毒C VLPs的不同类型可选地存在本发明的组合物中。例如，包括人轮状病毒C VP2的人轮状病毒C VLPs可选地包含在带有包括非人轮状病毒C蛋白或肽和/或含有货物部分的人轮状病毒C VLPs的抗原呈现人轮状病毒C VLPs的组合物中。

在一方面，本发明提供了制备人C组轮状病毒样颗粒的方法，包括：构建包括核酸分子的第一杆状病毒载体，核酸分子包括编码人C组RV VP6衣壳蛋白的序列，其可操作地连接至启动所述蛋白在昆虫细胞中表达的杆状病毒启动子；构建包括核酸分子的第二杆状病毒载体，核酸分子包括编码人C组RV VP7衣壳蛋白的序列，其可操作地连接至启动所述蛋白在昆虫细胞中表达的杆状病毒启动子；和用所述第一和第二杆状病毒载体在促进VP6和VP7衣壳蛋白表达的条件下感染昆虫细胞培养物。

在本发明的具体实施例中，该方法还包括构建包括核酸分子的第三杆状病毒载体，核酸分子包括编码人C组RV VP2衣壳蛋白的序列，其可操作地连接至启动所述蛋白在昆虫细胞中表达的杆状病毒启动子；和用所述第一、第二和第三杆状病毒载体在促进VP6、VP7和VP2衣壳蛋白表达的条件下感染昆虫细胞培养物。

在另一方面，本发明提供了由这里描述的发明方法制备的轮状病毒样颗粒。

含有在这里描述的VP蛋白的片段的病毒样颗粒可以由任何上面描述的用于制备人C组轮状病毒样颗粒的方法形成，并还包括：构建包括核酸分子的第三杆状病毒载体，核酸分子包括编码核心蛋白的序列，其可操作地连接至启动所述蛋白在昆虫细胞中表达的杆状病毒启动子；用所述第一、第二和第三杆状病毒载体在促进VP6和VP7衣壳蛋白和VP2核心蛋白表达的条件下感染昆虫细胞培养物。

在本发明的具体实施例中，核心蛋白是ASP 88病毒株的C组VP2蛋白。

通常从细胞培养物上清获得轮状病毒颗粒，用于包括在含有疫苗组分的免疫原性组合物。轮状病毒颗粒可以例如通过过滤和/或离心从细胞培养物上清分离。分离的轮状病毒颗粒可选择地进行冻干，例如用于以后在药学上可接受的载体中重悬浮。

药物组合物和方法

药物组合物和方法

根据本发明，提供了疫苗及用于它们的在对象中诱导主动免疫和保护免得人轮状病毒诱导的疾病的用途的方法。

在特定的具体实施例中，人轮状病毒C VLPs作为抗原进行施用用于预防或治疗人轮状病毒C感染，例如通过作为活性疫苗成分，或通过在宿主生物体中引发免疫反应。疫苗输送可以发生在人轮状病毒C感染宿主生物体或病人之前或之后。疫苗可选地包含一种或更多种佐剂、防腐剂或其它药学上可接受的载体。

在特定的具体实施例中，疫苗组合物包括与药学上可接受的载体混合的一种或更多种人轮状病毒C VLP。

术语“药学上可接受的载体”是指对对象基本无毒并对包括在疫苗组合物中的人轮状病毒C VLPs基本惰性的载体。药学上可接受的载体形态上是固体的、液体的或凝胶的并通常是无菌和无热原的。

本发明的免疫原性组合物可以是适于施用至对象的任何形式。

免疫原性组合物通过任何合适的施用途径包括口服和非肠道例如静脉的、皮内的、肌肉的、腹腔的、黏膜的、鼻的或皮下的施用途径进行施用。

例如，用于非肠道施用的免疫原性组合物可以制成包括轮状病毒和药学上可接受的载体的可注射液体制剂。合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇、甘油醇等等、它们的合适的混合物；植物油如橄榄油；以及可注射的有机脂例如油酸二酯。例如，通过使用包衣如卵磷脂，通过分散液情况下保持期望的颗粒大小，和/或通过使用表面活性剂，如十二烷基硫酸钠，可以保持适当的流动性。可选地包括稳定剂，例如，EDTA、EGTA和抗氧化剂。

用于施用或用于在施用前悬浮在液体中的固体制剂示例性地包括胶囊、片剂、粉剂和颗粒剂。在这种固体制剂中，轮状病毒颗粒混合至少一种载体，示例性地包括缓冲液例如，举例来说，柠檬酸钠或碱金属磷酸盐示例性地包括磷酸钠、磷酸钾和磷酸钙；填充物例如，举例来说，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；粘合剂例如，举例来说，羧甲基纤维素、藻酸盐(alignates)、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；保湿剂例如，举例来说，甘油；崩解剂例如，举例来说，琼脂-琼脂、碳酸钙、植物淀粉如马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些复合硅酸盐，和碳酸钠；溶液阻滞剂例如，举例来说，石蜡；吸收加速剂例如，举例来说，季铵化合物；润湿剂例如，举例来说，十六醇、甘油单硬脂酸酯和乙二醇；吸附剂例如，举例来说，高岭土和膨润土；润滑剂例如，举例来说，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇或十二烷基硫酸钠；防腐剂例如抗细菌剂和抗真菌剂，包括例如硫柳汞(thimerosal)、山梨酸、庆大霉素和苯酚；以及稳定剂例如，举例来说，EDTA、EGTA和抗氧化剂。

固体制剂可选地包含包衣例如肠溶衣。肠溶衣典型地是聚合材料。优选的肠溶衣材料具有是可生物蚀解的、逐步水解的和/或逐步水溶的聚合物的特征。涂覆到固体制剂的包衣材料的数量通常决定了摄取和药物释放之间的时间间隔。包衣涂覆成具有一厚度以便整个包衣不会溶解在与胃酸相关的pH低于3的胃肠液中，然而在小肠环境中在pH3以上溶解。预计表现出pH依赖的溶解性曲线的任何阴离子聚合物在本发明的实践中是容易使用作为肠溶衣的，以实现活性剂至下肠胃道的输送。具体的肠溶衣材料的选择取决于性能如对在胃中对崩解的抗性；在胃中对胃液和活性剂扩散的抗渗性；在目标肠道位置消散的能力；在存储期间物理和化学的稳定性；无毒性；和容易使用。

合适的肠溶衣材料示例性地包括纤维素聚合物如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、醋酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、偏苯三甲酸酯醋纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯和羧甲基纤维素钠；丙烯酸聚合物和共聚物，优选从丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸铵盐、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或乙烯形成；乙烯聚合物和共聚物如聚乙烯吡咯烷酮、聚醋酸乙烯酯、聚醋酸乙烯苯二甲酸酯、醋酸乙烯巴豆酸共聚物、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物；虫胶(shellac)；及其组合。特定的肠溶衣材料包括描述在例如美国专利US6136345中的丙烯酸聚合物和共聚物。

肠溶衣可选地包含增塑剂以防止允许胃液渗透进固体剂型的孔隙和裂缝形成。合适的增塑剂示例性地包括柠檬酸三乙酯(triethyl citrate，Citroflex 2)、醋精(triacetin，三乙酸甘油酯(glyceryl triacetate))、乙酰基柠檬酸三乙酯(acetyl triethyl citrate，Citroflec A2)、Carbowax400(聚乙二醇400)、邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate)、柠檬酸三丁酯、乙酰化单甘酯、甘油、脂肪酸酯、丙二醇和邻苯二甲酸二丁酯。特别地，由阴离子羧基丙烯酸聚合物组成的包衣通常包含约10％至25％重量的增塑剂，特别是邻苯二甲酸二丁酯、聚乙二醇、柠檬酸三乙酯和醋精。包衣还可以包含其它包衣赋形剂如防粘剂、消泡剂、润滑剂(如硬脂酸镁)和稳定剂(如羟丙基纤维素、酸或碱)，以溶解或分散包衣材料，并改善包衣性能和包被产品。

用于口服施用的液体剂型包括制成乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酏剂(elixir)的轮状病毒和药学上可接受的载体。本发明的疫苗组合物的液体剂型可以包括润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂或芳香剂。

关于用于制备剂型的惯常的成分、设备和方法的详细信息在Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，eds.H.A.Lieberman et al.，New York：Marcel Dekker，Inc.，1989；和L.V.Allen，Jr.et al.，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，8th Ed.，Philadelphia，PA：Lippincott，Williams & Wilkins，2004；A.R.Gennaro，Remington：The Science and Practice ofPharmacy，Lippincott Williams & Wilkins，20th ed.，2003；和J.G.Hardman et al.，Goodman &Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill Professional，10th ed.，2001中找到。

根据本发明的具体实施例，佐剂是可选地包括在病毒组合物中。佐剂是本领域已知的，示例性地包括弗氏佐剂、氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、皂角甙、右旋糖酐如DEAE-右旋糖酐、植物油如花生油、橄榄油、和/或维生素E醋酸酯(vitamin E acetate)、矿物油、细菌脂多糖、肽聚糖和蛋白多糖。

术语“对象”在这里使用用于指人。在本发明的特定的具体实施例中，术语对象也指非人类的动物，示例性地包括牛、马、绵羊、山羊、猪、狗、猫、鸟、家禽和啮齿动物。

本发明的疫苗组合物可以是适于施用至对象的任何形式。

疫苗组合物通过任何合适的施用途径包括口服和非肠道例如静脉的、皮内的、肌肉的、腹腔的、黏膜的、鼻的或皮下的施用途径进行施用。

词语“治疗有效量”是指有效诱发免疫反应并预防或改善人轮状病毒C-介导的疾病的迹象或症状的量。在对象中免疫反应的诱导可以由任何本领域已知的各种技术确定，示例性地包括检测抗人轮状病毒C抗体，测定抗人轮状病毒C抗体滴度和/或淋巴细胞增殖检测。在对象中，人轮状病毒C介导的疾病的迹象和症状可以进行监控以检测针对本发明的疫苗组合物的施用的免疫反应的诱导。

根据本发明的方法，在特定的具体实施例中，疫苗组合物的施用包括一次施用一份或更多份剂量的疫苗组合物至对象。可选择地，两份或更多份剂量的疫苗组合物在周-年的时间间隔进行施用。用于疫苗组合物剂量施用的合适的时刻表依赖于几个因素，例如，包括对象的年龄和健康状态、使用的疫苗组合物的类型和施用的途径。本领域技术人员能够容易确定施用至特定对象的剂量和施用时刻表。

人轮状病毒C VLPs的免疫原性通过任何本领域已知的各种分析进行测定。在一个特定的例子中，纯化的人轮状病毒C VLPs和佐剂或不和佐剂肌肉施用至小鼠。免疫原性通过测量在施用后在不同的时间获得的血液样本中免疫球蛋白滴度包括IgM、IgA和/或IgG进行检测。

中和抗体滴度是由本领域已知的中和分析方法测定的，例如那些通常描述在Kuby，J.，Immunology，3rd ed.W.H.Freeman and Co.，New York，N.Y.，1997中的方法。由于人轮状病毒C不是在培养基中生长，来自用人轮状病毒C VLPs注射的小鼠的血清分别在相同的孔中2倍连续稀释，并用胰蛋白酶激活的猪轮状病毒C孵育。激活的猪轮状病毒C或无血清MEM培养基在无小鼠血清存在下进行孵育并分别作为阳性和阴性对照。在补充胰蛋白酶的MEM培养基中的MA104细胞添加到每个孔中。在37℃孵育18小时后，细胞用福尔马林固定。在固定MA104细胞中的猪轮状病毒C抗原通过用HRP标记的抗人轮状病毒VLPs的兔IgG然后用四甲基联苯胺孵育细胞进行检测。血清中中和抗体滴度定义为相对于病毒对照，吸收值减少70％的最高稀释的倒数。

可选地，针对免疫原性人轮状病毒C VLPs的抗体施用至对象以预防或治疗有关人轮状病毒C介导的疾病。

可选地与针对免疫原性人轮状病毒C VLPs的疫苗组合物或抗体一起施用的其它治疗物包括抗病毒药物例如金刚烷胺(amantadine)、金刚烷乙胺(rimantadine)、更昔洛韦(gancyclovir)、阿昔洛韦(acyclovir)、利巴韦林(ribavirin)、喷昔洛韦(penciclovir)、奥塞米韦(oseltamivir)、膦甲酸钠齐多夫定(foscarnet zidovudine，AZT)、去羟肌苷(didanosine，ddI)、拉米夫定(lamivudine，3TC)、扎西他宾(zalcitabine，ddC)、司他夫定(stavudine，d4T)、奈韦拉平(nevirapine)、地拉夫定(delavirdine)、茚地那韦(indinavir)、利托那韦(ritonavir)、阿糖腺苷(vidarabine)、奈非那韦(nelfinavir)、沙奎那韦(saquinavir)、乐感清(relenza)、达菲(tamiflu)、普拉康纳利(pleconaril)、干扰素(interferons)；类固醇(steroids)和皮质类固醇(corticosteroids)如强的松(prednisone)、可的松(cortisone)、氟替卡松(fluticasone)和糖皮质激素(glucocorticoid)；抗生素(antibiotics)；止痛药(analgesics)；止泻药(antidiarrheals)，补液；或其它用于轮状病毒感染的治疗物。

本发明还提供了药物试剂盒，包含一个或更多个容器，含有一种或更多种本发明的药物组合物的成分。可选地，和此类容器一起的可以是采用管理药品或生物制品制造、使用或销售的政府部门规定的形式的通知书，该通知书反映了管理药品或生物制品制造、使用或销售的政府部门的批准。

在优选的具体实施例中，该试剂盒包含对人轮状病毒C VP2、人轮状病毒C VP6、人轮状病毒C VP7、SEQ ID NO：1的多肽、抗原表位或其变体、SEQ ID NO：32的多肽、抗原表位或其变体、SEQ ID NO：34的多肽、抗原表位或其变体、或任何人轮状病毒C抗原表位、本发明的多肽或蛋白、或本发明的核酸分子具有特异性的抗体，单独或与佐剂、抗病毒药物、抗生素、止痛药、支气管扩张剂(bronchodilators)或其它药学上可接受的赋形剂联合。本发明还包括试剂盒，包括含有本发明的药物组合物的容器和使用说明。

还提供了用于检测人轮状病毒C感染的诊断试剂盒，其包含人轮状病毒C VLPs作为用于检测人轮状病毒C抗体的试剂。进一步可理解，诊断试剂盒可选地包括辅助试剂例如缓冲液、溶剂、可检测标记和其它必要的本领域所知的用于检测生物样本中抗体的试剂。

抗人轮状病毒抗体的检测

根据本发明的方法的具体实施例，人轮状病毒C VLPs用于检测生物样品中抗人轮状病毒C抗体。

术语“生物样本”是指从生物有机体、组织、细胞、细胞培养液或任何适于模仿生物条件的介质，或从环境获得的样本。非限制的例子包括，唾液(saliva)、牙龈分泌物(gingivalsecretions)、脑脊髓液(cerebrospinal fluid)、胃肠液(gastrointestinal fluid)、粘膜(mucous)、泌尿生殖器分泌物(urogenital secretions)、滑液(synovial fluid)、血液、血清、血浆、尿液、囊液(cystic fluid)、淋巴液(lymph fluid)、腹水(ascites)、胸腔积液(pleural effusion)、组织间液(interstitial fluid)、细胞内液(intracellular fluid)、眼液(ocular fluids)、精液(seminalfluid)、乳腺分泌物(mammary secretions)、玻璃体液(vitreal fluid)、粪便(feces)和鼻腔分泌物(nasal secretions)。可以使用环境样本如污水或水样本。在优选的具体实施例中，样本是血清、血浆或全血。

根据本发明，检测生物样本中抗人轮状病毒C抗体的方法包括用重组人轮状病毒C VLPs接触生物样本和检测生物样本中存在的抗人轮状病毒C抗体和人轮状病毒C VLPs之间复合物的形成。生物样本中存在的抗人轮状病毒C抗体和人轮状病毒C VLPs之间复合物的形成表明对象充分接触人轮状病毒C从而激活对象的免疫系统以产生抗人轮状病毒C抗体。复合物的形成明确表明抗人轮状病毒C抗体的存在，因为其它肠道病毒抗体，尤其是抗人轮状病毒A抗体，不与人轮状病毒C VLPs形成复合物。

在优选的具体实施例中，人轮状病毒C VLPs用于检测生物样品中抗人轮状病毒C抗体以诊断对象中目前和最近人轮状病毒C的感染。

在进一步的优选具体实施例中，在人轮状病毒C感染敏感生物体中，特别在人体对象中，人轮状病毒C VLPs用在评估过去或现在接触人轮状病毒C抗原的个体的免疫状态。

检测生物样本中存在的抗人轮状病毒C抗体和人轮状病毒C VLPs之间复合物的形成可以通过任何本领域已知的各种方法实现。示例性地包括检测连接至人轮状病毒C VLPs或连接至抗人轮状病毒C抗体的标签。术语“标签(label)”或“标记的(labeled)”是指可以用于定性或定量检测连接至标签的物质的任何组合物。合适的标签包括荧光基团、放射性同位素、发色团、生物发光部分、酶、磁粒、电子致密颗粒等等。术语“标签(label)”或“连接有标签的(labeled)”意图包括通过偶联(即物理连接)可检测的物质至人轮状病毒C VLPs或抗体直接标记人轮状病毒C VLPs或抗体，以及通过与另一直接标记的试剂相互作用间接标记人轮状病毒C VLPs或抗体。一抗间接标记的例子包括用荧光标记的二抗检测一抗。

使用在复合物形成检测中的标签依赖于使用的检测方法。这种检测方法结合在特定分析设计中，示例性地包括ELISA、western blot、免疫沉淀方法、免疫细胞化学方法、免疫荧光分析方法、液相色谱法、流式细胞仪检测方法、其它本领域已知的检测方法或者它们的组合。

在一具体实施例中，使用ELISA检测生物样品中人轮状病毒C抗体的存在。

在用于人轮状病毒C抗体的ELISA的设计中，人轮状病毒C VLPs包被在支持物例如微量滴定板、珠子、载玻片、硅片或其它固体支持物如硝酸纤维素膜或PVDF膜上。生物样本和支持物上的人轮状病毒C VLPs一起孵育，针对人轮状病毒C的抗体和人轮状病毒C VLPs之间复合物的存在通过标准ELISA操作程序进行检测。例如，人轮状病毒C VLPs和人轮状病毒C抗体之间的复合物通过标记的二抗和抗人轮状病毒C抗体反应及检测标签进行检测。

用于人轮状病毒C抗体的ELISA的另一例子是夹心ELISA。夹心ELISA的一个具体实施例包括将结合抗体沉积在固体支持物上。结合抗体可选地是识别人轮状病毒C VLPs的非竞争抗体。结合抗体与人轮状病毒C VLPs孵育。洗涤复合物以去除任何未结合材料，使用了可检测的标签，例如荧光标记的针对人轮状病毒C VLPs的抗体。检出可检测的标签，如果存在，说明抗人轮状病毒C抗体在生物样本中存在。

ELISA分析方法的进一步细节大体上在Crowther，J.R.，The ELISA Guidebook(Methods inMolecular Biology)，Humana Press，2000；和Wild，D.，The Immunoassay Handbook，3rd Edition，Elsevier Science，2005中找到。

提供了人轮状病毒C抗体检测试剂盒，包括一种或更多种人轮状病毒C VLPs和辅助试剂，用于使用在检测生物样本中抗人轮状病毒C抗体中。辅助试剂是任何信号产生系统材料，用于在任何合适的检测方法例如ELISA、western blot、免疫沉淀方法、免疫细胞化学方法、免疫荧光分析方法、质谱分析方法或本领域已知的其它检测方法中检测抗人轮状病毒C抗体和人轮状病毒C VLP之间的复合物。

可选地，根据本发明的具体实施例，抗人轮状病毒C抗体检测试剂盒包括附着至固体基质的人轮状病毒C VLPs。合适的固体基质包括但不限于微量滴定板、芯片、管子、膜如尼龙膜或硝酸纤维素膜、以及颗粒如珠子。将含有蛋白的物质附着至固体基质是本领域已知的，包括但不限于吸附。

在优选的具体实施例中，本发明的人轮状病毒C抗体检测试剂盒示例性地包括一种或更多种人轮状病毒C VLPs；和一种或更多种辅助试剂例如高结合微量滴定板或其它支持物、封闭剂、洗涤缓冲液例如磷酸盐缓冲液、标记的抗免疫球蛋白抗体、以及配套的检测试剂、棉签或其它样品采集设备、对照试剂例如标记的非竞争或未标记试剂、对照核苷酸序列和相关的引物和探针、和用于检测的其它材料和试剂。该试剂盒可选地包括印刷的或处于电子可获取形式的说明书和/或客户支持联系信息。

在信号产生系统或其它中的抗免疫球蛋白抗体可选地用荧光、生物素、过氧化物酶、或其它酶或非酶检测标签进行标记。可理解，信号产生系统可以采用来自相同或不同有机体的未标记的一抗和标记的二抗。进一步可理解，非抗体信号产生系统同样是可操作的。

进一步可理解，试剂盒可选地包括辅助试剂例如缓冲液、溶剂、可检测标签和其它必要的且本领域知道的用于检测生物样本中抗体的试剂。

含有货物的VLPs

可选地，VLP在由VLP限定的内部空间中含有货物。在特定的具体实施例中，货物部分是输送至对象或细胞的物质。示例性的货物部分包括抗原、不是完整人轮状病毒基因组的核酸和治疗剂。

特别提供了输送遗传信息的方法，遗传物质封装在人轮状病毒C衣壳蛋白中，然后导入宿主细胞中。遗传物质可选地是DNA或RNA，或其修改体。遗传信息可选地来自人轮状病毒C或其它病毒或非病毒有机体，或者是合成的。

通过包括将货物导入宿主细胞以便在货物存在下产生人轮状病毒C VLPs从而在内部空间包括货物的各种方法的任意一种，从而货物纳入到由人轮状病毒C VLP限定的内部空间中。可替换地或另外地，通过将产生的人轮状病毒C VLPs和货物孵育以便货物例如通过扩散进入内部空间，从而货物纳入到内部空间中。

VLP抗体

人轮状病毒C VLPs用作抗原用于生产针对人轮状病毒C的单克隆或多克隆抗体，用于临床使用例如治疗、分析或诊断；或实验室研究。

在优选的具体实施例中，在体内(例如，用于保护或治疗目的或用于提供诊断抗体)和在体外(例如，通过噬菌体展示技术或其它适合用于产生合成抗体的技术)，使用人轮状病毒C VLPs用于激发针对包括在人轮状病毒C VLPs中的VP2、VP6、VP7或任何抗原的人轮状病毒C特异性抗体或T细胞反应。

如在这里所使用的，术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”涉及单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、人源性化抗体、嵌合抗体、camelized抗体、单域抗体、单链Fvs(single-chain Fvs，scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(disulfide-linkedFvs，sdFv)、抗独特型(anti-idiotypic，anti-Id)抗体(包括，例如，针对本发明的抗体的anti-Id抗体)、以及上述任意的抗原表位结合片段。尤其，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子是任何类型的(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别的(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的。

如在这里所使用的，术语“抗体片段”定义为免疫特异结合人轮状病毒C病毒、人轮状病毒C病毒或人轮状病毒C VLP的任何抗原表位的抗体的片段。抗体片段可以通过任何本领域技术人员已知的技术产生。例如，Fab和F(ab′)2片段可以通过用酶如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab′)2片段)实现免疫球蛋白分子的蛋白水解断裂而产生。F(ab′)2片段含有完整的轻链，和重链的可变区、CH1区和铰链区。抗体片段也可以通过重组DNA技术产生。抗体片段可以是抗体的一个或更多个互补决定区(complementaritydetermining regions，CDRs)。

根据本发明，提供了人轮状病毒C特异性抗体，其特异性结合人轮状病毒C且不特异性结合其它轮状病毒类型例如轮状病毒A、B、D、E、F和G。

表达针对本发明的人轮状病毒C VLPs的单克隆抗体的杂交瘤细胞株特异性结合人轮状病毒C且不特异性结合其它轮状病毒类型例如轮状病毒A、B、D、E、F和G。

通过任何本领域已知的方法获得的针对人轮状病毒C VLPs的抗体可选地通过本领域已知的用于免疫球蛋白分子纯化的任何方法进行纯化，例如，通过离子交换层析法、亲和层析，特别是通过对特异抗原的亲和力或大小排阻层析；离心法；不同溶解度法；或通过任何其它用于蛋白纯化的标准技术。同样可理解，发明抗体或其片段可以融合到本领域已知的异源多肽序列以利于纯化。

对于某些用途，包括在人体内使用抗体和体外检测分析，优选使用嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体是一种其中抗体的不同部分来源于不同动物物种的分子，例如具有来自鼠单克隆抗体的可变区和来自人免疫球蛋白的恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的(Morrison，1985，Science，229：1202；U.S.Pat.Nos.5,807,715；4,816,567；和4,816,397)。人源化抗体是来自非人类物种的抗体分子，其结合具有来自非人类物种的一个或更多个互补决定区(CDRs)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的期望抗原。通常，人框架区中的框架残基用来自CDR供体抗体的对应残基取代以改变，优选改善，抗原结合。这些框架取代由本领域已知的方法确定，如通过对CDR和框架残基之间的相互作用建模以确定对于抗原结合重要的框架残基以及序列比较以确定在特定位置上的不寻常的框架残基(U.S.Pat.No.5,585,089；Riechmann et al.，1988，Nature 332：323)。抗体可以用本领域已知的各种技术进行人源化，包括，例如，CDR移植(CDR-grafting)(PCT公布文本WO 91/09967；U.S.Pat.Nos.5,225,539；5,530,101和5,585,089)、镶饰或重塑(veneering or resurfacing)(Studnicka et al.，1994，Protein Engineering 7(6)：805 814；Roguska et al.，1994，PNAS.91：969 973)，和链替换(chainshuffling)(U.S.Pat.No.5,565,332)。

完全人抗体对于人类患者的治疗是特别期望的。人抗体可以通过本领域已知的各种方法制备，包括上面描述的使用来自人免疫球蛋白序列的抗体库的噬菌体展示方法。(U.S.Pat.Nos.4,444,887和4,716.111)。

人抗体容易通过使用不能表达有功能的内源免疫球蛋白但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行制备。

发明抗体可选地融合或结合至可用于体外免疫分析与纯化方法例如亲和层析的异源多肽。(PCT公布号WO 93/21232；U.S.Pat.No.5,474,981)。

发明抗体可选地附着至固体支持物，这对于本发明的多肽或其片段、衍生物、类似物或变体、或具有与本发明的多肽相似酶活性的相似分子的免疫分析或纯化是特别有用的。这种固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

用于人轮状病毒C的分析

在本发明的具体实施例中，本发明的抗人轮状病毒C VLP抗体用于检测生物样本中的人轮状病毒C。

本发明的用于生物样本中人轮状病毒C的检测包括用抗人轮状病毒C抗体接触生物样本和检测在抗人轮状病毒C抗体和在生物样本中的人轮状病毒C之间的复合物的形成。复合物的形成表明生物样本取自的对象目前由人轮状病毒C感染。复合物的形成特异性表明人轮状病毒C的存在，因为其它轮状病毒类型例如轮状病毒A、B、D、E、F和G不和本发明的抗人轮状病毒C抗体形成复合物。

在特定的具体实施例中，该方法进一步涉及从对象获得生物样本、将能够检测样本中人轮状病毒C核酸存在的化合物或试剂接触样本，以确定样本中人轮状病毒C的存在。

在进一步的具体实施例中，检测对照样本是否存在人轮状病毒C和/或人轮状病毒C抗体，结果与测试样本对比以确定人轮状病毒C或抗人轮状病毒C抗体的存在或量上的差异。

在另一方面，本发明提供了用于确定人或动物接触C组轮状病毒的方法包括：在促进所述生物样本中的抗体结合所述轮状病毒样颗粒的条件下将在这里描述的发明的轮状病毒样颗粒接触所述人或动物的生物样本；并检测生物样本中的抗体与所述轮状病毒样颗粒的结合。为了确定人或动物接触C组轮状病毒的目的，生物样本通常是血液和/或粪便；然而，生物样品还包括来自其它组织的样本；如肠道活检。

本发明还包括用于检测测试样本中人轮状病毒C存在的试剂盒。例如，试剂盒包括抗人轮状病毒C抗体和可选地包括试剂如标记二抗或能够检测与人轮状病毒C的复合物中的抗体并在某些具体实施例中用于测定样本中的滴度的试剂。

发明组合物和方法的具体实施例阐明在下面的例子中。这些例子提供用于说明目的，并不认为是对发明组合物和方法的范围的限制。

实例1

杆状病毒重组体的克隆和构建。来自人C组RV病毒株S-1的片段5，编码VP6，通过使用BMJ44(5’-AGC-CAC-ATA-GTT-CAC-ATT-TC-3’)(SEQ ID NO：14)和BMJ141(5’-ATC-TCA-TTC-ACA-ATG-GAT-G-3’)(SEQ ID NO：15)(28)用RT-PCR进行扩增。来自病毒株S-1的片段8，编码VP7，通过使用引物BMJ13(5’-AGC-CAC-ATG-ATC-TTG-TTT-3’)(SEQ ID NO：20)和BMJ14(5’-GGC-ATT-TAA-AAA-AGA-AGA-3’)(SEQ ID NO：21)(13，28)用RT-PCR进行扩增。来自病毒株ASP88的片段2，编码VP2，通过使用BMJ197(5’-TCG-AGG-ACA-AAT-CGT-CCA-AG-3’)(SEQ ID NO：22)和BMJ180(5’-AGC-CAC-AGA-GTT-TGA-GGT-C-3’)(SEQ ID NO：23)用RT-PCR进行扩增。表达S-1VP7的重组杆状病毒的克隆和构建先前已经描述(14)。片段2和5的DNA片段克隆进载体pVL1393并用Bac-N-Blue转染试剂盒(Gibco，Grand Island，NY)进行转染。杆状病毒构建体在草地贪夜蛾9(Spodoptera frugiperda 9，Sf9)细胞培养物中扩增2代，蚀斑纯化，然后在Sf9细胞中在无血清HyQ SFX-Insect培养基(Hyclone，Logan，UT)中再扩增2代。

图5提供了用于来自上面描述的病毒株ASP88的VP2(SEQ ID NO：1)；称为“Bristol”的人C组VP2病毒株具有的蛋白(SEQ ID NO：16)，其具有NCBI Accession CAC 44890，version CAC 44890.1 GI：15027005；以及称为“Cowden”的猪VP2(SEQ ID NO：17)的氨基酸序列比对。

图6是编码用于发明的病毒株ASP88的人C组VP-2的序列(SEQ ID NO：18)，Cowden猪病毒株的人C组VP-2的序列(SEQ ID No.44)和Bristol的人C组VP-2的序列(SEQ ID NO：19，Accession AJ303139)的核苷酸序列比对。起始密码子和终止密码子下划线划出。

图7是编码用于发明的病毒株S-1的人C组VP-6的序列相对于传统病毒株Bristol的序列(SEQ ID NO：25，Accession CAA42504)；Jajeri的序列(SEQ ID NO：26，AccessionAAK26534)；CMH004的序列(SEQ ID NO：27，Accession ABR31794)；V508的序列(SEQID NO：28，Accession AAX13496)；China的序列(SEQ ID NO：29，Accession BAB83829)；和BCN6的序列(SEQ ID NO：30，Accession CAJ41549)的核苷酸序列比对。注意到图7提供了本领域标准格式的序列比较，其中“·(dot)”表明与参照序列的一致性。在图7中，参照序列是共有序列(consensus sequence)(SEQ ID No.41)。

图8是编码用于发明的病毒株S-1的人C组VP-6(SEQ ID NO：32)的序列相对于传统病毒株Bristol的序列(SEQ ID NO：34，Accession CAA42504)；Jajeri的序列(SEQ ID NO：35，Accession AAK26534)；CMH004的序列(SEQ ID NO：36，Accession ABR31794)；V508的序列(SEQ ID NO：37，Accession AAX13496)；China的序列(SEQ ID NO：38，AccessionBAB83829)；和BCN6的序列(SEQ ID NO：39，Accession CAJ41549)的氨基酸序列比对。注意到图8提供了本领域标准格式的序列比较，其中“·(dot)”表明与参照序列的一致性。在图8中，参照序列是共有序列(consensus sequence)(SEQ ID No.24)。

表I C组轮状病毒的VP2基因的比较

核苷酸和氨基酸同源性

表I显示了C组轮状蛋白的VP2基因的比较结果。使用MEGA version 4程序用于含有从核苷酸37-2688的单个ODF的VP2基因的序列分析。结果表明编码Asp88 VP2的核苷酸序列与编码Bristol VP2的核苷酸序列具有97.2％同源性，编码Asp88 VP2的核苷酸序列与编码Cowden(猪)VP2的核苷酸序列具有83.2％同源性，编码Bristol VP2的核苷酸序列与编码Cowden VP2的核苷酸序列具有82.9％同源性。另外，Asp88 VP2的氨基酸序列与Bristol VP2的氨基酸序列具有98.5％，Asp88 VP2的氨基酸序列与Cowden(猪)VP2的氨基酸序列具有92.8％，Bristol VP2的氨基酸序列与Cowden VP2的氨基酸序列具有92.6％。C组轮状病毒Bristol病毒株的登录号是AJ303139。²Cowden VP2序列是重新测序的。³Bristol序列在Chen，Z.et al，2002中找到。

实例2

细胞和重复感染。Sf9或High Five(Hi5)昆虫细胞在EX-CELL 420或405培养基(Sigma，Lenexa，KS)或HyQ SFX-INSECT培养基中在摇瓶中在27℃生长和维持。Sf9和Hi5细胞每3或4天分别以1×10⁶cells/ml和5×10⁵cells/ml浓度传代培养。固定的重复感染通过将在HyQ或EX-CELL 420中的Sf9细胞和在HyQ或EX-CELL 405中的Hi5细胞以3×10⁵cells/ml浓度接种至T150烧瓶中。以感染复数(multiplicity of infection，MOI)为1加入杆状病毒构建体(rVP2，rVP6和rVP7)。不使用蛋白酶抑制剂进行感染，感染的培养物在第5天收集。大规模VLP生产通过将在EX-CELL 420中的Sf9细胞以1×10⁶cells/ml浓度接种到fernbach烧瓶中在悬浮培养基中进行。一天后杆状病毒重组体以MOI为1.4加入并在第4天收集。

实例3

Western blot。用12％分离和5％堆积凝胶使用Laemmli不连续缓冲系统进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(16)。样本在上样之前和10％的β-巯基乙醇(β-mecaptoethanol)在97℃加热5分钟，然后电泳。蛋白在转移缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，10％甲醇)中转移到PVDF膜。用PBS-T中的10％blotto(用于未纯化GpC RV蛋白)在室温封闭1-2小时或PBS-T中的15％blotto(用于纯化GpC RV蛋白)在4℃过夜封闭后，膜和针对Cowden的猪超免疫血清(1∶2,000)在PBS-T中的5％blotto中4℃过夜孵育或和针对人GpC VLPs的兔超免疫血清(1∶20,000)在PBS-T中的10％blotto中孵育1小时。膜在PBS-T中洗涤，与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)羊抗猪(1∶142,000)(KPL，Gaithersburg，MD)在5％blotto中孵育或与HRP-羊抗兔(1∶20,000)(Pierce，Rockford，IL)在10％blotto中孵育。GpC RV蛋白用Supersignal West Femto最大敏感底物试剂盒(SupersignalWest Femto Maximum Sensitivity Substrate Kit，Pierce，Rockford，IL)可视化，通过将膜曝光至胶片，并用医用洗片机SRX-101A(Konica Minolta，Jakarta，Indonesia)进行处理。

实例4

VLPs纯化。在J2-MC离心机中用JA-14电机在4℃以15,344xg离心30分钟，离心两次使感染细胞培养物澄清。澄清上清通过超过35％蔗糖衬垫进行分层，并在Optima L-80XP超高速离心机(Beckman Coulter，Fullerton，CA)中用SW32Ti电机在107,000xg(4℃)离心2小时。沉淀团重悬浮在TNC缓冲液(10mM Tris pH 7.4，140mM NaCl，5mM CaCl2)中，在微量离心机中再次变得澄清，并接着用等体积Vertrel(Miller-Stephenson，Danbury，CT)处理两次。样品在Allegra X-12R台式离心机(Beckman Coulter，Fullerton，CA)中用SX4750A电机以2,095xg(4℃)离心10分钟。水层覆盖在CsCl溶液(1.2738g/ml)上，用SW32Ti电机在111,000xg(4℃)离心17-18小时。收集含有VLPs的部分，稀释在TNC中，在SW32Ti电机中在107,000xg(4℃)离心1小时沉淀出。颗粒重悬浮在补加10％山梨醇的Hanks平衡盐溶液中(Gibco，Grand Island，NY)。

实例5

电子显微镜检查和免疫电镜术。GPC RV VLPs用修正的如前描述的电子显微镜检查(EM)和免疫电镜术(IEM)(19)进行检查。简单地说，在水(pH 6.95)中1％钼酸铵-1％海藻糖用于在吸附至镍-聚乙烯醇缩甲醛-碳(nickel formvar-carbon)覆膜格栅(grids)的样本上提供阴性对照。在用于标本之前，每个格栅用在水中的1％阿利新蓝8GX(alcian blue 8GX)进行预处理以增强亲水性并提供阳离子电荷至薄膜表面。通过将1μl纯化的GpC RV VLPs或GpARV RRV和1μl针对GpA或GpC RV的以1∶500稀释的抗体混合并用于镍-聚乙烯醇缩甲醛-碳包被的格栅进行IEM。在孵育0.5-1小时后，格栅用滤纸吸干，用补加0.4％乙酰化牛血清白蛋白(acetylated bovine serum albumin，BSA)(Aurion，Hatfield，Pennsylvania)的0.1M Tris缓冲液洗涤，和偶联至6nm胶体金的羊抗兔二抗(1∶20)孵育30分钟。格栅用无牛血清白蛋白的Tris缓冲液和去离子水洗涤两次，吸干，用钼酸铵-海藻糖染色，在120KV加速电压下在FEI Technai BioTwin透射电子显微镜(FEI Technai BioTwin transmission electron microscope)中观察。图像用2K x 2K AMT数码相机进行数字拍摄。

实例6

针对GpC VLPs的抗血清的生产。在免疫之前通过抗原捕获EIA对兔子(Covance，Denver，Pennsylvania)进行了筛选以检测GpA和C RV抗体的存在。兔CD94，其检测GpA和C抗原阴性，选择用于抗体生产。CD94用形成在弗氏完全佐剂(Freud’s complete adjuvant)中的50μg GpC VLPs进行皮下注射。用弗氏不完全佐剂(Freud’s incomplete adjuvant)形成的随后的剂量在先前注射后3周施用。总共施用5次注射。第一次抽血在第二次剂量后10天，所有随后的抽血安排在前次抽血后3周。所有抽血检测GpC RV抗体阳性并合并在一起。

实例7

酶免疫测定(EIAs)。96孔板用(1∶100)稀释在包被缓冲液中的100μl来自GPA RRV感染的MA104培养物上清或在重组杆状病毒感染的Sf9细胞中的GPC VLPs进行包被，在37℃孵育过夜。板用PBS-T洗涤，然后用150μl 5％ blotto在37℃封闭1小时。板进行洗涤，然后用100μl在稀释剂(在PBS中1％blotto，0.5％聚氧乙烯醚W1)中连续稀释的来自兔CD94、CD8和8807A的超免疫血清在37℃孵育2小时。兔CD8是用GpA RV RRV免疫的，而兔8807A是用GpARV自然免疫的，还用GpC RV Cowden进行免疫。板进行洗涤，然后用(1∶3,000)稀释在稀释剂中的HRP羊抗兔IgG(KPL，Gaithersburg，MD)在37℃孵育1小时。板用PBS-T洗涤6次，然后与100μl四甲基联苯胺(tetramethyl benzidine，TMB)反应10分钟。反应用100μl 1N HCl终止，在Abs450读板。抗体滴度定义为给出纯光密度(optical density，OD)值(病毒的OD减去blotto的OD)在0.1以上的血清的最高稀释的倒数。

实例8

在Sf9和Hi5细胞中GpC RV蛋白合成的动力学。在EX-CELL或HyQ培养基中的Sf9和Hi5细胞用GpC RV VP2、VP6和VP7杆状病毒重组体以MOI为1进行感染，感染的培养物在第3、4和5天收集。使感染的培养物澄清并用Cowden特异性猪超免疫血清通过Westernblot进行分析以确定分泌到上清中的蛋白的表达曲线。图1A和图1B是显示在不同培养基中在Sf9细胞，图1A，或Hi5细胞，图1B中GpC RV VP6和VP7的表达动力学的电泳胶。在图1A和1B中，泳道1，Cowden病毒株；泳道2-5，在0，3-5dpi收集的在HyQ中感染的培养物；泳道6-9，在0，3-5dpi收集的在EX-CELL中感染的培养物。GpC RV VP6和VP7标示在右边。分子量标记54kDa和37.5kDa用箭头指示在左边。

GpC RV VP6和VP7的表达随时间增加，在Sf9和Hi5细胞中最高水平在感染后4或5天(days post infection，dpi)可见。EX-CELL培养基的使用在两种细胞中均导致更高的轮状病毒蛋白产量。与在HyQ培养基中相比，更高的蛋白表达在EX-CELL培养基中实现，蛋白表达的相似水平在Sf9和Hi5细胞中观察到。细胞系Sf9和EX-CELL 420使用在在这里描述的GpC RV蛋白生产的进一步的实例中。用所使用的血清，人GpC RV VP2是不可检测的。

实例9

GpC RV VLPs的自我组装和鉴定。用rVP2，rVP6和rVP7以MOI为1重复感染Sf9细胞导致完整的具有典型轮状病毒的结构秩序的GpC RV VLPs的形成。

图2A是显示从用编码轮状病毒C VP2、VP6和VP7的重组杆状病毒以MOI为1感染的在EX-CELL 420培养基中的Sf9细胞的培养物纯化的VLPs的电子显微图像。图2B是显示从用编码轮状病毒C VP6和VP7的重组杆状病毒以MOI为1.4感染的在EX-CELL 420培养基中的Sf9细胞的培养物纯化的VLPs的电子显微图像。显示在图2A和2B中的VLPs用5％钼酸铵-1％海藻糖染色。在图2A和2B中的线段表示100nm。

Sf9细胞也用所有三种重组病毒以不同MOIs(0.1，0.2，1和2each)重复感染以优化用于VLP生产的条件。上清的EM分析表明在以较高的MOIs为1和2进行的重复感染时更好的VLP形成。要确定是否VP2对于VLP形成是必要的，重复感染用和不用rVP2进行，并用EM进行分析。由于没有rVP2时，证明了健全的VLP形成，所以进行所有后续实验不包括该重组体。

纯化的VP6/7VLPs的生化组合物和抗原性与GpA RV病毒株YK-1通过SDS-PAGE和Western blot方法进行比较。通过SDS-PAGE和Western blot方法比较来自GpA RV YK-1和GpC VLPs的主要结构病毒蛋白的图像分别显示在图3A和3B中。

来自纯化的YK-1(泳道1)和VLPs(泳道2)的蛋白在12％的SDS-PAGE进行分离，用考马斯亮蓝染色，图3A，或通过Western blot分析，图3B。对于western blot，蛋白转移到聚偏氟乙烯膜，用针对GpC VLPs的兔超免疫血清孵育。GpC RV VP6和VP7标示在右边。箭头表示分子量标记54kDa和37.5kDa。

如在GpA YK-1中可见，人GpC重组蛋白VP6和VP7在相似的分子量处迁移并以相似比例存在，表明在组装的VLPs中合适的摩尔比，显示在图3A中。用人GpC VLP特异性抗体进行的Western blot表明这些人轮状病毒C VLPs是抗原性的且是质量良好的，显示在图3B中。

实例10

GpC RV抗体的抗原反应。针对纯化的人轮状蛋白C VLPs生产兔多克隆抗体。在免疫之前，兔CD94没有针对GpA或C RV的抗体，在接种后对GpC RV形成高抗体滴度(表II)。在对照中，兔CD8，用RRV免疫，对GpA RV产生强阳性反应，而兔8807A，其用GpA RV自然感染和用GpC RV Cowden病毒株免疫，对GpA和GpC RV抗原具有相似的抗体滴度。来自兔CD94的超免疫血清用于增强只采用猪超免疫血清的EIA(8)。这个试验证明特异性检测GpC RV抗原(VLPs和Cowden)，而不与其它对照样本例如MA104、Sf9 cells和GpA RVRRV反应。

表II针对GpA和C轮状病毒的超免疫血清中的抗体滴度

人GpC RV VLPs进一步通过使用针对GpA和C RV的兔超免疫血清用免疫电镜检测它们的抗原特性来进行鉴定。

图4A显示用GpC特异性兔超免疫血清免疫染色的GpC RV VLPs。图4B显示用GpA特异性兔超免疫血清免疫染色的GpC RV VLPs。图4C显示用GpC特异性兔超免疫血清免疫染色的GpA RV。图4D显示用GpA特异性兔超免疫血清免疫染色的GpA RV。GpC RV VLPs用GpC特异性兔超免疫血清特异性标记，GpA RVs用GpA特异性兔超免疫血清大量包被。在图4A、4B、4C和4D中的线段表示100nm。

GpC RV抗体与人GpC VLPs但不与GpA RV，RRV特异性反应。相应地，GpA抗体表现出与RRV而不与GpC VLPs的特异反应性。这些结果表明RV抗原与抗体之间的组特异性相互作用的发生并确认GPA和GpC RV试剂的交叉反应性不存在。

[来自人病毒株Asp88的VP2-氨基酸序列](SEQ ID NO：1)

MISRNRRRNNQQKDIGKEKQLETIIDKEVKENKDSTKEDKLVVTEESNGDVTAVKEQSN

NINLQKNDLVKEVMNIQNQTLNTVVAENKVEIEEIVKKYIPSYNTDSLIVKKLTEIQESSA

KTYNTLFRLFTPVKSYLYDINGEKKLSTRWYWKLLKDDLPAGDYSVRQFFLSLYLNVLE

GMPDYIMLRDMAVDNPYSAEAGKIVDGKSKEILVELYQDQMTEGYIRRYMSELRHKIS

GETNTAKYPAILHPVDNELNQYFLEHQLIQPLTTRNIAELIPTQLYHDPNYVFNIDAAFLT

NSRFVPPYLTQDRIGLHDGFESIWDSKTHADYVSARRFIPDLTELVDAEKQIKEMAAHLQ

LEAITVQVESQFLAGISAAAANEAFKFIIGSVLSTRTIAVEFITSNYMSLASCMYLMTIMPS

EIFLRESLVAMRLAIINTLIYPALGLAQMHYQAGEVRTPFELAEMRVANRSIRQWLHHC

NTLQFGRQITEGIIHLRFTNDIMTGRIVNLFSTMLVALSSQPFATYPLDYKRSVQRALQLL

SNRTAQIADLTRLIVYNYTTLSACIVMNMHLVGTLTVERIQATSLTSLMMLISNKTVIPEP

SSLFSYFSSNINFLTNYNEQIDNVVAEIMAAYRLNLYQQKMLMLVTRFVSRLYIFDAPKI

PPDQMYRLRNRLRNIPVERRRADVFRIIMNNRDLIEKTSERICQGVLLSYTPMPLTYVED

VGLTNVINDTNNFQIINIEEIEKTGDYSAITNALLRDTPIILKGAIPYVTNSSVIDVLSKVDT

TVFASIVKDRDISKLKPIKFIINSDSSEYYLVHNNKWTPTTTTAVYKARSQQFDIQHSVSM

LESNLFFVVYNDLFKYIKTTTVLPINAVSYDGARIMQET

[来自人病毒株Asp88的VP2-核苷酸序列](SEQ ID NO：18)

TCGAGGACAAATCGTCCAAGATGATAAGCAGAAACAGGCGCAGAAATAAC

CAACAAAAAGATATAGGAAAAGAGAAACAATTAGAGACTATAATTGACAA

AGAAGTAAAGGAAAACAAAGATTCTACAAAAGAAGATAAGCTAGTAGTTA

CGGAAGAAAGTAATGGTGACGTCACAGCTGTTAAAGAACAATCGAATAAT

ATTAATTTACAAAAGAATGATTTGGTTAAAGAAGTCATGAATATACAGAA

TCAAACATTAAATACAGTAGTTGCTGAGAATAAAGTTGAAATAGAAGAAA

TAGTTAAAAAATACATTCCCTCATATAATACTGACAGCCTTATTGTTAAA

AAGTTAACTGAAATCCAGGAATCAAGTGCTAAAACATATAATACATTATT

CAGATTATTTACTCCAGTTAAAAGTTATTTATATGACATAAATGGTGAGA

AAAAATTATCGACTAGATGGTATTGGAAATTGCTCAAAGATGATTTACCT

GCTGGTGATTACTCAGTTAGACAATTCTTCCTGTCACTATATTTAAATGT

TTTAGAGGGAATGCCCGATTACATAATGCTTCGTGATATGGCAGTGGATA

ACCCATATTCAGCAGAAGCAGGTAAAATCGTAGATGGAAAGTCTAAAGAA

ATTTTAGTTGAACTATATCAAGACCAAATGACAGAAGGGTATATTAGAAG

ATATATGTCTGAATTAAGACATAAAATATCTGGAGAAACAAATACTGCAA

AATATCCAGCTATTCTACATCCCGTGGATAATGAGCTTAATCAATACTTT

CTTGAGCATCAGTTAATTCAACCATTAACTACAAGAAATATTGCAGAATT

GATTCCAACTCAATTATATCATGATCCAAATTACGTTTTTAATATTGATG

CAGCCTTTTTAACAAATTCAAGATTTGTTCCACCATACTTAACACAGGAT

AGGATTGGATTACATGATGGATTCGAATCAATATGGGATTCAAAAACCCA

TGCTGATTACGTTTCAGCTAGAAGATTTATACCTGATTTAACTGAACTGG

TAGATGCTGAAAAGCAAATAAAAGAAATGGCTGCACATTTACAACTAGAG

GCTATTACAGTACAGGTTGAATCACAATTTTTAGCGGGAATTAGTGCTGC

TGCAGCTAATGAAGCGTTCAAATTTATAATTGGCTCAGTTTTATCTACCA

GAACAATAGCTGTAGAATTCATAACCTCAAACTATATGTCGTTAGCATCA

TGTATGTATTTAATGACTATTATGCCATCAGAGATTTTCTTGAGAGAATC

ATTAGTTGCTATGCGATTAGCAATAATAAATACCCTTATTTATCCAGCTC

TAGGTTTAGCGCAAATGCATTATCAAGCAGGTGAAGTGAGGACCCCATTC

GAATTAGCTGAGATGCGAGTAGCTAATAGATCTATTAGACAATGGTTACA

TCATTGTAATACACTTCAATTTGGTAGACAGATAACGGAAGGGATAATTC

ATCTACGATTTACTAATGATATCATGACAGGTAGGATAGTGAACTTATTT

TCAACAATGCTAGTAGCTTTATCATCTCAGCCATTCGCTACATATCCTTT

AGACTATAAAAGATCTGTACAAAGAGCATTACAACTTTTATCAAATAGAA

CAGCCCAAATAGCAGATTTAACCAGATTAATAGTATACAATTATACTACA

TTATCTGCATGTATAGTCATGAATATGCATTTAGTAGGAACTCTTACTGT

TGAACGTATACAGGCCACTTCTCTAACTTCTTTAATGATGTTAATTTCTA

ATAAGACAGTTATTCCAGAACCATCGTCTCTTTTTTCATATTTCTCTAGT

AACATTAATTTTCTTACAAATTATAATGAGCAAATTGATAATGTGGTAGC

AGAAATAATGGCCGCATATAGATTGAATTTATATCAACAGAAAATGTTGA

TGCTCGTTACCAGGTTTGTGTCAAGGTTGTACATATTTGATGCTCCTAAA

ATACCGCCAGATCAGATGTATAGATTAAGAAACCGATTAAGAAATATTCC

AGTTGAAAGAAGAAGAGCTGATGTGTTCAGAATTATTATGAATAATAGAG

ATTTAATCGAAAAAACATCAGAACGTATATGTCAGGGTGTGTTGTTATCT

TATACACCAATGCCTTTAACTTACGTTGAAGATGTCGGGTTAACAAATGT

AATTAATGACACTAATAACTTCCAAATAATTAATATAGAAGAAATTGAGA

AGACCGGTGACTATTCAGCCATAACGAATGCATTACTTCGGGATACTCCA

ATTATATTGAAAGGTGCGATTCCATATGTTACTAACTCATCAGTAATTGA

TGTTTTATCTAAAGTGGACACCACAGTGTTCGCAAGCATCGTAAAAGATA

GGGATATTTCAAAGTTAAAACCAATAAAATTCATAATTAATTCAGATTCA

TCCGAATATTATTTAGTACACAATAATAAATGGACACCAACAACAACTAC

AGCAGTATATAAAGCTAGATCTCAGCAATTTGATATACAACATTCAGTAT

CAATGCTAGAGTCAAACTTATTTTTTGTGGTATATAATGATTTATTTAAA

TACATTAAAACCACTACAGTTCTGCCGATAAATGCTGTCTCTTATGATGG

TGCAAGAATTATGCAAGAAACATAAATGATTGTATAGTATCATCTTGTAA

CGACCTCAAACTCTGTGGCT

[来自人病毒株Asp88的VP2开放读码框-核苷酸序列](SEQ ID NO：42)

ATGATAAGCAGAAACAGGCGCAGAAATAAC

CAACAAAAAGATATAGGAAAAGAGAAACAATTAGAGACTATAATTGACAA

AGAAGTAAAGGAAAACAAAGATTCTACAAAAGAAGATAAGCTAGTAGTTA

CGGAAGAAAGTAATGGTGACGTCACAGCTGTTAAAGAACAATCGAATAAT

ATTAATTTACAAAAGAATGATTTGGTTAAAGAAGTCATGAATATACAGAA

TCAAACATTAAATACAGTAGTTGCTGAGAATAAAGTTGAAATAGAAGAAA

TAGTTAAAAAATACATTCCCTCATATAATACTGACAGCCTTATTGTTAAA

AAGTTAACTGAAATCCAGGAATCAAGTGCTAAAACATATAATACATTATT

CAGATTATTTACTCCAGTTAAAAGTTATTTATATGACATAAATGGTGAGA

AAAAATTATCGACTAGATGGTATTGGAAATTGCTCAAAGATGATTTACCT

GCTGGTGATTACTCAGTTAGACAATTCTTCCTGTCACTATATTTAAATGT

TTTAGAGGGAATGCCCGATTACATAATGCTTCGTGATATGGCAGTGGATA

ACCCATATTCAGCAGAAGCAGGTAAAATCGTAGATGGAAAGTCTAAAGAA

ATTTTAGTTGAACTATATCAAGACCAAATGACAGAAGGGTATATTAGAAG

ATATATGTCTGAATTAAGACATAAAATATCTGGAGAAACAAATACTGCAA

AATATCCAGCTATTCTACATCCCGTGGATAATGAGCTTAATCAATACTTT

CTTGAGCATCAGTTAATTCAACCATTAACTACAAGAAATATTGCAGAATT

GATTCCAACTCAATTATATCATGATCCAAATTACGTTTTTAATATTGATG

CAGCCTTTTTAACAAATTCAAGATTTGTTCCACCATACTTAACACAGGAT

AGGATTGGATTACATGATGGATTCGAATCAATATGGGATTCAAAAACCCA

TGCTGATTACGTTTCAGCTAGAAGATTTATACCTGATTTAACTGAACTGG

TAGATGCTGAAAAGCAAATAAAAGAAATGGCTGCACATTTACAACTAGAG

GCTATTACAGTACAGGTTGAATCACAATTTTTAGCGGGAATTAGTGCTGC

TGCAGCTAATGAAGCGTTCAAATTTATAATTGGCTCAGTTTTATCTACCA

GAACAATAGCTGTAGAATTCATAACCTCAAACTATATGTCGTTAGCATCA

TGTATGTATTTAATGACTATTATGCCATCAGAGATTTTCTTGAGAGAATC

ATTAGTTGCTATGCGATTAGCAATAATAAATACCCTTATTTATCCAGCTC

TAGGTTTAGCGCAAATGCATTATCAAGCAGGTGAAGTGAGGACCCCATTC

GAATTAGCTGAGATGCGAGTAGCTAATAGATCTATTAGACAATGGTTACA

TCATTGTAATACACTTCAATTTGGTAGACAGATAACGGAAGGGATAATTC

ATCTACGATTTACTAATGATATCATGACAGGTAGGATAGTGAACTTATTT

TCAACAATGCTAGTAGCTTTATCATCTCAGCCATTCGCTACATATCCTTT

AGACTATAAAAGATCTGTACAAAGAGCATTACAACTTTTATCAAATAGAA

CAGCCCAAATAGCAGATTTAACCAGATTAATAGTATACAATTATACTACA

TTATCTGCATGTATAGTCATGAATATGCATTTAGTAGGAACTCTTACTGT

TGAACGTATACAGGCCACTTCTCTAACTTCTTTAATGATGTTAATTTCTA

ATAAGACAGTTATTCCAGAACCATCGTCTCTTTTTTCATATTTCTCTAGT

AACATTAATTTTCTTACAAATTATAATGAGCAAATTGATAATGTGGTAGC

AGAAATAATGGCCGCATATAGATTGAATTTATATCAACAGAAAATGTTGA

TGCTCGTTACCAGGTTTGTGTCAAGGTTGTACATATTTGATGCTCCTAAA

ATACCGCCAGATCAGATGTATAGATTAAGAAACCGATTAAGAAATATTCC

AGTTGAAAGAAGAAGAGCTGATGTGTTCAGAATTATTATGAATAATAGAG

ATTTAATCGAAAAAACATCAGAACGTATATGTCAGGGTGTGTTGTTATCT

TATACACCAATGCCTTTAACTTACGTTGAAGATGTCGGGTTAACAAATGT

AATTAATGACACTAATAACTTCCAAATAATTAATATAGAAGAAATTGAGA

AGACCGGTGACTATTCAGCCATAACGAATGCATTACTTCGGGATACTCCA

ATTATATTGAAAGGTGCGATTCCATATGTTACTAACTCATCAGTAATTGA

TGTTTTATCTAAAGTGGACACCACAGTGTTCGCAAGCATCGTAAAAGATA

GGGATATTTCAAAGTTAAAACCAATAAAATTCATAATTAATTCAGATTCA

TCCGAATATTATTTAGTACACAATAATAAATGGACACCAACAACAACTAC

AGCAGTATATAAAGCTAGATCTCAGCAATTTGATATACAACATTCAGTAT

CAATGCTAGAGTCAAACTTATTTTTTGTGGTATATAATGATTTATTTAAA

TACATTAAAACCACTACAGTTCTGCCGATAAATGCTGTCTCTTATGATGG

TGCAAGAATTATGCAAGAAACATAA

来自人病毒株Asp88的VP2-包括36个5’非编码碱基的核苷酸序列(SEQ ID NO：43)

GGCTTAAAAAGATCAG

TCGAGGACAAATCGTCCAAGATGATAAGCAGAAACAGGCGCAGAAATAAC

CAACAAAAAGATATAGGAAAAGAGAAACAATTAGAGACTATAATTGACAA

AGAAGTAAAGGAAAACAAAGATTCTACAAAAGAAGATAAGCTAGTAGTTA

CGGAAGAAAGTAATGGTGACGTCACAGCTGTTAAAGAACAATCGAATAAT

ATTAATTTACAAAAGAATGATTTGGTTAAAGAAGTCATGAATATACAGAA

TCAAACATTAAATACAGTAGTTGCTGAGAATAAAGTTGAAATAGAAGAAA

TAGTTAAAAAATACATTCCCTCATATAATACTGACAGCCTTATTGTTAAA

AAGTTAACTGAAATCCAGGAATCAAGTGCTAAAACATATAATACATTATT

CAGATTATTTACTCCAGTTAAAAGTTATTTATATGACATAAATGGTGAGA

AAAAATTATCGACTAGATGGTATTGGAAATTGCTCAAAGATGATTTACCT

GCTGGTGATTACTCAGTTAGACAATTCTTCCTGTCACTATATTTAAATGT

TTTAGAGGGAATGCCCGATTACATAATGCTTCGTGATATGGCAGTGGATA

ACCCATATTCAGCAGAAGCAGGTAAAATCGTAGATGGAAAGTCTAAAGAA

ATTTTAGTTGAACTATATCAAGACCAAATGACAGAAGGGTATATTAGAAG

ATATATGTCTGAATTAAGACATAAAATATCTGGAGAAACAAATACTGCAA

AATATCCAGCTATTCTACATCCCGTGGATAATGAGCTTAATCAATACTTT

CTTGAGCATCAGTTAATTCAACCATTAACTACAAGAAATATTGCAGAATT

GATTCCAACTCAATTATATCATGATCCAAATTACGTTTTTAATATTGATG

CAGCCTTTTTAACAAATTCAAGATTTGTTCCACCATACTTAACACAGGAT

AGGATTGGATTACATGATGGATTCGAATCAATATGGGATTCAAAAACCCA

TGCTGATTACGTTTCAGCTAGAAGATTTATACCTGATTTAACTGAACTGG

TAGATGCTGAAAAGCAAATAAAAGAAATGGCTGCACATTTACAACTAGAG

GCTATTACAGTACAGGTTGAATCACAATTTTTAGCGGGAATTAGTGCTGC

TGCAGCTAATGAAGCGTTCAAATTTATAATTGGCTCAGTTTTATCTACCA

GAACAATAGCTGTAGAATTCATAACCTCAAACTATATGTCGTTAGCATCA

TGTATGTATTTAATGACTATTATGCCATCAGAGATTTTCTTGAGAGAATC

ATTAGTTGCTATGCGATTAGCAATAATAAATACCCTTATTTATCCAGCTC

TAGGTTTAGCGCAAATGCATTATCAAGCAGGTGAAGTGAGGACCCCATTC

GAATTAGCTGAGATGCGAGTAGCTAATAGATCTATTAGACAATGGTTACA

TCATTGTAATACACTTCAATTTGGTAGACAGATAACGGAAGGGATAATTC

ATCTACGATTTACTAATGATATCATGACAGGTAGGATAGTGAACTTATTT

TCAACAATGCTAGTAGCTTTATCATCTCAGCCATTCGCTACATATCCTTT

AGACTATAAAAGATCTGTACAAAGAGCATTACAACTTTTATCAAATAGAA

CAGCCCAAATAGCAGATTTAACCAGATTAATAGTATACAATTATACTACA

TTATCTGCATGTATAGTCATGAATATGCATTTAGTAGGAACTCTTACTGT

TGAACGTATACAGGCCACTTCTCTAACTTCTTTAATGATGTTAATTTCTA

ATAAGACAGTTATTCCAGAACCATCGTCTCTTTTTTCATATTTCTCTAGT

AACATTAATTTTCTTACAAATTATAATGAGCAAATTGATAATGTGGTAGC

AGAAATAATGGCCGCATATAGATTGAATTTATATCAACAGAAAATGTTGA

TGCTCGTTACCAGGTTTGTGTCAAGGTTGTACATATTTGATGCTCCTAAA

ATACCGCCAGATCAGATGTATAGATTAAGAAACCGATTAAGAAATATTCC

AGTTGAAAGAAGAAGAGCTGATGTGTTCAGAATTATTATGAATAATAGAG

ATTTAATCGAAAAAACATCAGAACGTATATGTCAGGGTGTGTTGTTATCT

TATACACCAATGCCTTTAACTTACGTTGAAGATGTCGGGTTAACAAATGT

AATTAATGACACTAATAACTTCCAAATAATTAATATAGAAGAAATTGAGA

AGACCGGTGACTATTCAGCCATAACGAATGCATTACTTCGGGATACTCCA

ATTATATTGAAAGGTGCGATTCCATATGTTACTAACTCATCAGTAATTGA

TGTTTTATCTAAAGTGGACACCACAGTGTTCGCAAGCATCGTAAAAGATA

GGGATATTTCAAAGTTAAAACCAATAAAATTCATAATTAATTCAGATTCA

TCCGAATATTATTTAGTACACAATAATAAATGGACACCAACAACAACTAC

AGCAGTATATAAAGCTAGATCTCAGCAATTTGATATACAACATTCAGTAT

CAATGCTAGAGTCAAACTTATTTTTTGTGGTATATAATGATTTATTTAAA

TACATTAAAACCACTACAGTTCTGCCGATAAATGCTGTCTCTTATGATGG

TGCAAGAATTATGCAAGAAACATAAATGATTGTATAGTATCATCTTGTAA

CGACCTCAAACTCTGTGGCT

[来自人病毒株S-1的VP6-核苷酸序列](SEQ ID NO：31)

*    20     *    40     *    60     *    80

ATGGATGTACTTTTTTCTATAGCGAAAACCGTGTCAGATCTTAAAGAGAAAGTTGTAGTTGGAACAATTTATACTAATGT

*    100    *    120    *    140    *    160

AGAAGATGTTGTACAACAGACGAATGAATTGATTAGAACTTTGAATGGAAATATTTTTCATACTGGTGGCATTGGAACAC

*1    80    *    200    *    220    *    240

AGCCTCAGAAAGAGTGGAATTTTCAGCTCCCACAATTGGGTACCACTTTATTAAATTTAGATGATAATTATGTTCAATCA

*    260    *    280    *    300    *    320

ACTAGAGGCATAATTGATTTTTTATCATCTTTTATAGAAGCTGTATGTGATGATGAAATTGTTAGAGAAGCTTCAAGAAA

*    340    *    360    *    380    *    400

TGGTATGCAACCTCAATCACCAGCTCTTATATTATTATCTTCATCAAAATTTAAAACAATTAATTTTAATAATAGTTCTC

*    420    *    440    *    460    *    480

AATCTATCAAAAATTGGAATGCTCAATCAAGACGTGAGAATCCTGTATATGAGTACAAAAATCCAATGTTGTTTGAATAT

*    500    *    520    *    540    *    560

AAAAATTCTTATATTTTACAACGCGCAAATCCACAATTTGGAAGCGTCATGGGTTTAAGATATTATACAACAAGTAATAT

*    580    *    600    *    620    *    640

TTGTCAAATTGCAGCATTTGATTCCACCCTAGCTGAAAATGCACCAAATAATACGCAACGCTTCGTTTATAATGGCAGAC

*    660    *    680    *    700    *    720

TAAAAAGACCCATATCAAATGTTTTAATGAAAATAGAAGCTGGTGCTCCAAATATAAGCAACCCAACTATTTTACCTGAT

*    740    *    760    *    780    *    800

CCTAATAATCAAACAACTTGGCTTTTTAATCCGGTACAATTAATGAATGGAACATTTACCATTGAATTCTATAATAATGG

*    820    *    840    *    860    *    880

TCAACTAATTGATATGGTTCGAAATATGGGAATAGTTACTGTAAGAACTTTTGATTCTTATAGAATAACAATTGACATGA

*    900    *    920    *    940    *    960

TTAGACCAGCTGCTATGACTCAATACGTTCAACGAATTTTTCCACAAGGTGGACCTTATCATTTTCAGGCTACATATATG

*    980    *    1000   *    1020   *    1040

TTAACATTAAGTATATTAGATGCTACCACAGAGTCCGTTCTATGTGATTCTCATTCAGTAGAATATTCAATAGTAGCAAA

*    1060   *    1080   *    1100   *    1120

CGTCAGAAGAGATTCAGCAATGCCAGCTGGAACTGTTTTTCAACCGGGATTTCCATGGGAACACACACTATCCAATTACA

*    1140   *    1160   *    1180

CTGTTGCTCAAGAAGATAATTTAGAAAGATTATTGTTAATCGCATCTGTGAAGAGAATGGTAATG

[来自人病毒株S-1的VP6-氨基酸序列](SEQ ID NO：32)

MDVLF SIAKTVSDLKEKVVVGTIYTNVEDVVQQTNELIRTLNGNIFHTGG[50]

IGTQPQKEWNFQLPQLGTTLLNLDDNYVQSTRGIIDFLSSFIEAVCDDEI[100]

VREASRNGMQPQSPALILLSSSKFKTINFNNSSQSIKNWNAQSRRENPVY[150]

EYKNPMLFEYKNSYILQRANPQFGSVMGLRYYTTSNICQIAAFDSTLAEN[200]

APNNTQRFVYNGRLKRPISNVLMKIEAGAPNISNPTILPDPNNQTTWLFN[250]

PVQLMNGTFTIEFYNNGQLIDMVRNMGIVTVRTFDSYRITIDMIRPAAMT[300]

QYVQRIFPQGGPYHGQATYMLTLSILDATTESVLCDSHSVEYSIVANVRR[350]

DSAMPAGTVFQPGFPWEHTLSNYTVAQEDNLERLLLIASVKRMVM[395]

[来自人病毒株S-1的VP7-核苷酸序列](SEQ ID NO：33)

＞gi|1314237|gb|U20995.1|RGU20995 Human rotavirus group C isolate S-1 outer capsid

glycoprotein(VP7)gene，complete cds

GGCATTTAAAAAAGAAGAAGCTGTCTGACAAACTGGTCTTCTTTTTAAATGGTTTGTACAACATTGTAC

A

CTGTTTGCGCCATTCTCTTCATTCTTTTCATTTATATATTATTATTTAGAAAAATGTTCCACCTAATAAC

TGATACTTTAATAGTGATGCTTATTTTATCTAATTGTGTAGAGTGGTCACAAGGTCAGATGTTTATTGA

T

GATATACATTATAATGGTAACGTTGAGACTATCATAAATTCTACTGATCCTTTTAATGTTGAATCTTTA

T

GTATTTATTTTCCAAATGCAGTTGTAGGATCACAGGGACCAGGTAAATCCGATGGACATTTGAATGAT

GG

TAATTATGCACAGACTATCGCCACTTTGTTTGAAACAAAAGGATTCCCAAAAGGTTCAATAATAATTA

AA

ACATATACACAGACATCAGACTTTATAAATTCAGTAGAAATGACATGCTCTTATAATATAGTTATCATT

C

CTGATAGCCCAAATGATTCAGAATCTATTGAACAGATAGCAGAATGGATTTTAAATGTTTGGAGATGT

GA

TGACATGAATTTGGAAATTTATACTTATGAACAAATTGGAATAAACAATTTATGGGCTGCATTTGGTA

GT

GACTGTGATATATCTGTCTGTCCATTAGATACTACAAGTAATGGAATCGGATGTTCACCAGCTAGTACA

G

AAACTTATGAAGTTGTATCAAATGACACCCAATTGGCCTTAATTAATGTTGTGGATAATGTTAGACATA

G

AATACAGATGAACACTGCTCAATGTAAATTGAAAAATTGTATTAAGGGTGAAGCTCGACTGAATACTG

CA

CTAATAAGAATTTCAACATCATCAAGTTTTGATAATTCATTGTCACCATTAAATAACGGCCAAACAAC

AA

GATCGTTTAAAATAAATGCAAAGAAATGGTGGACTATATTTTATACAATAATTGATTATATTAATACA

AT

TGTACAATCAATGACTCCCAGACATCGGGCGATTTATCCAGAAGGGTGGATGTTGAGGTATGCGTAAA

CA

AGATCATGTGGCT

[来自人病毒株S-1的VP7-开放读码框的核苷酸序列]

(SEQ ID NO：45)

ATGGTTTGTACAACATTGTACA

CTGTTTGCGCCATTCTCTTCATTCTTTTCATTTATATATTATTATTTAGAAAAATGTTCCACCTAATAAC

TGATACTTTAATAGTGATGCTTATTTTATCTAATTGTGTAGAGTGGTCACAAGGTCAGATGTTTATTGA

T

GATATACATTATAATGGTAACGTTGAGACTATCATAAATTCTACTGATCCTTTTAATGTTGAATCTTTA

T

GTATTTATTTTCCAAATGCAGTTGTAGGATCACAGGGACCAGGTAAATCCGATGGACATTTGAATGAT

GG

TAATTATGCACAGACTATCGCCACTTTGTTTGAAACAAAAGGATTCCCAAAAGGTTCAATAATAATTA

AA

ACATATACACAGACATCAGACTTTATAAATTCAGTAGAAATGACATGCTCTTATAATATAGTTATCATT

C

CTGATAGCCCAAATGATTCAGAATCTATTGAACAGATAGCAGAATGGATTTTAAATGTTTGGAGATGT

GA

TGACATGAATTTGGAAATTTATACTTATGAACAAATTGGAATAAACAATTTATGGGCTGCATTTGGTA

GT

GACTGTGATATATCTGTCTGTCCATTAGATACTACAAGTAATGGAATCGGATGTTCACCAGCTAGTACA

G

AAACTTATGAAGTTGTATCAAATGACACCCAATTGGCCTTAATTAATGTTGTGGATAATGTTAGACATA

G

AATACAGATGAACACTGCTCAATGTAAATTGAAAAATTGTATTAAGGGTGAAGCTCGACTGAATACTG

CA

CTAATAAGAATTTCAACATCATCAAGTTTTGATAATTCATTGTCACCATTAAATAACGGCCAAACAAC

AA

GATCGTTTAAAATAAATGCAAAGAAATGGTGGACTATATTTTATACAATAATTGATTATATTAATACA

AT

TGTACAATCAATGACTCCCAGACATCGGGCGATTTATCCAGAAGGGTGGATGTTGAGGTATGCGTAA

[来自人病毒株S-1的VP7-氨基酸序列](SEQ ID NO：34)

MVCTTLYTVCAILFILFIYILLFRKMFHLITDTLIVMLILSNCVEWSQGQMFIDDIHYNG

NVETIINSTDPFNVESLCIYFPNAVVGSQGPGKSDGHLNDGNYAQTIATLFETKGFPKGS

IIIKTYTQTSDFINSVEMTCSYNIVIIPDSPNDSESIEQIAEWILNVWRCDDMNLEIYTY

EQIGINNLWAAFGSDCDISVCPLDTTSNGIGCSPASTETYEVVSNDTQLALINVVDNVRH

RIQMNTAQCKLKNCIKGEARLNTALIRISTSSSFDNSLSPLNNGQTTRSFKINAKKWWTI

FYTIIDYINTIVQSMTPRHRAIYPEGWMLRYA

[来自人病毒株S-1的VP6-包括5’和3’非编码的核苷酸序列；ORF的起始和终止密码子用下划线划出](SEQ ID NO：48)

GGCATTTAAAATCTCATTCACAATCGATCTACTTTTTTCTATAGCGAAAACCGTCTCAGATCTTAAAGAGAAAGTTGTAG

TTGGAACAATTTATACTAATGTAGAAGATGTTGTACAACAGACGAATGAATTGATTAGAACTTTGAATGGAAATATTTTT

CATACTGGTGGCATTGGAACACAGCCTCAGAAAGAGTGGAATTTTCAGCTCCCACAATTGGGATCCACTTTATTAAATTT

AGATGATAATTATGTTCAATCAACTAGAGGCATAATTGATTTTTTATCATCTTTTATAGAAGCTGTATGTGATGATGAAA

TTGTTAGAGAAGCTTCAAGAAATGGTATGCAACCTCAATCACCAGCTCTTATATTATTATCTTCATCAAAATTTAAAACA

ATTAATTTTAATAATAGTTCTCAATCTATCAAAAATTGGAATGCTCAATCAAGACGTGAGAATCCTGTATATGAGTACAA

AAATCCAATGTTGTTTGAATATAAAAATTCTTATATTTTACAACGCGCAAATCCACAATTTGGAAGCGTCATGGGTTTAA

GATATTATACAACAAGTAATATTTGTCAAATTGCAGCATTTGATTCCACCCTAGCTGAAAATGCACCAAATAATACGCAA

CGCTTCGTTTATAATGGCAGACTAAAAAGACCCATATCAAATGTTTTAATGAAAATAGAAGCTGGTGCTCCAAATATAAG

CAACCCAACTATTTTACCTGATCCTAATAATCAAACAACTTGGCTTTTTAATCCGGTACAATTAATGAATGGAACATTTA

CCATTGAATTCTATAATAATGGTCAACTAATTGATATGGTTCGAAATATGGGAATAGTTACTGTAAGAACTTTTGATTCT

TATAGAATAACAATTGACATGATTAGACCAGCTGCTATGACTCAATACGTTCAACGAATTTTTCCACAAGGTGGACCTTA

TCATTTTCAGGCTACATATATGTTAACATTAAGTATATTAGATGCTACCACAGAGTCCGTTCTATGTGATTCTCATTCAG

TAGAATATTCAATAGTAGCAAACGTCAGAAGAGATTCAGCAATGCCAGCTGGAACTGTTTTTCAACCGGGATTTCCATGG

GAACACACACTATCCAATTACACTGTTGCTCAAGAAGATAATTTAGAAAGATTATTGTTAATCGCATCTGTGAAGAGAAT

GGTAATGTAGATAAGCTAGAAGACTAAACATCTTCTATGCGGCCTACATACCATGTAGCATGAATCACGACTGGGTTTAG

TCCATGCTCGCATAGGGGCAAATATGCATGATATGGATGATCCCCAGAAGGATGAAATGTGAACTATGTGGCT

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在本说明书中提及的任何专利或出版物在这里通过参考纳入，就如每份单独出版物具体地和单独地通过参考纳入至相同的程度。

在这里描述的组合物和方法是目前优选具体实施例的代表，是示例性的，而不是作为对本发明的范围的限制。本领域技术人员将想到其中的变化和其它用途。可以作出这些变化和其它用途而不背离权利要求记载的本发明的范围。在这里描述的所有的数值范围包括在该范围内的所有整数和十进制数值，也包括端点。

Claims (29)

1.一种分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其特征在于，包括人轮状病毒C组VP6蛋白和人轮状病毒C组VP7蛋白。

2.根据权利要求1所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其特征在于，还包括人轮状病毒C组VP2蛋白。

3.根据权利要求1所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其特征在于，其中病毒样颗粒不含有人轮状病毒C组VP1、VP3、VP4和人轮状病毒C组非结构蛋白NSP1、NSP2、NPS3、NSP4、NSP5、NSP6和NSP7。

4.根据权利要求1所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其特征在于，其中人轮状病毒C组VP6蛋白包括SEQ ID No.32的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其特征在于，其中人轮状病毒C组VP7蛋白包括SEQ ID No.34的氨基酸序列。

6.根据权利要求2所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒，其特征在于，其中人轮状病毒C组VP2蛋白包括SEQ ID No.1的氨基酸序列。

7.一种用于检测生物样本中人轮状病毒C组抗体的方法，其特征在于，包括：

将许多根据权利要求1所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒接触第一生物样本；和

检测在存在第一生物样本中的抗人轮状病毒C组抗体和许多分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒之间的复合物的形成，以获得表明抗人轮状病毒C组抗体存在的第一信号。

8.一种抗人轮状病毒C疫苗组合物，其特征在于，包括与药学上可接受的载体混合的根据权利要求1所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒。

9.一种输送货物部分至细胞的方法，其特征在于，包括：

将货物部分导入由根据权利要求1所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒限定的内部空间；和

将分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒接触细胞。

10.根据权利要求14所述的输送货物部分的方法，其特征在于，其中货物部分选自由标签、抗原、编码蛋白或肽的核酸分子和治疗剂组成的组。

11.一种抗人轮状病毒C组抗体检测试剂盒，其特征在于，包括：

根据权利要求1所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒；和

至少一种辅助试剂。

12.根据权利要求11所述的抗人轮状病毒C组抗体检测试剂盒，其特征在于，其中病毒样颗粒附着至固体基质。

13.一种免疫原性组合物，其特征在于，包括根据权利要求1-6任一所述的分离的重组人轮状病毒C组病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

13、根据权利要求13所述的免疫原性组合物，其特征在于，还包括免疫佐剂。

14.一种在人中产生免疫反应的方法，其特征在于，包括施用根据权利要求13所述的免疫原性组合物至人。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，施用免疫原性组合物的步骤是施用至粘膜表面。

16.一种分离的多肽，其特征在于，包括下列氨基酸序列之一：

a)与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)具有至少98％一致性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)具有至少99％一致性的氨基酸序列；

c)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列(ASP88 VP2氨基酸序列)；

d)SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列(S-1 VP6氨基酸序列)。

17.一种分离的核酸分子，其特征在于，包括编码根据权利要求16所述的分离的多肽的核苷酸序列。

18.一种免疫原性组合物，其特征在于，包括包含任何SEQ ID NOS：1-13的至少一氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列是由抗体识别的抗原表位。

19.根据权利要求18所述的免疫原性组合物，其特征在于，其中所述免疫原性组合物还包括根据权利要求1-6任一所述的病毒样颗粒。

20.一种抗体制剂，其特征在于，识别SEQ ID NOS：1-13的任一氨基酸序列。

21.一种分离的多肽，其特征在于，包括SEQ ID NO：3或8的至少一氨基酸序列。

22.一种分离的核酸分子，其特征在于，包括编码根据权利要求21所述的分离的多肽的核苷酸序列。

23.一种载体，其特征在于，包括根据权利要求17或22所述的核酸分子。

24.一种分离的宿主细胞，其特征在于，包括根据权利要求23所述的载体。

25.一种用于形成人C组轮状病毒样颗粒的方法，其特征在于，包括：

构建包括核酸分子的第一载体，核酸分子包括编码人C组轮状病毒VP6衣壳蛋白的序列，其可操作地连接至启动所述蛋白在昆虫细胞中表达的启动子；

构建包括核酸分子的第二载体，核酸分子包括编码人C组轮状病毒VP7衣壳蛋白的序列，其可操作地连接至启动所述蛋白在昆虫细胞中表达的启动子；

在促进VP6衣壳蛋白和VP7衣壳蛋白表达并结合以形成人C组轮状病毒样颗粒的条件下，用所述第一和第二杆状病毒载体感染昆虫细胞培养物。

26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，还包括：

构建包括核酸分子的第三载体，核酸分子包括编码人C组轮状病毒VP2核心蛋白的序列，其可操作地连接至启动所述蛋白在昆虫细胞中表达的启动子；和

在促进VP6衣壳蛋白、VP7衣壳蛋白和所述VP2核心蛋白表达的条件下，用所述第一杆状病毒载体、第二杆状病毒载体和第三杆状病毒载体感染昆虫细胞培养物。

27.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，还包括确定人C组轮状病毒样颗粒存在所述培养物中。

28.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，还包括从所述培养物分离人C组轮状病毒样颗粒。

29.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，其中所述第一载体和所述第二载体均具有杆状病毒启动子。

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