CN102105464A - Wnt蛋白信号转导抑制剂 - Google Patents

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CN102105464A CN2009801294300A CN200980129430A CN102105464A CN 102105464 A CN102105464 A CN 102105464A CN 2009801294300 A CN2009801294300 A CN 2009801294300A CN 200980129430 A CN200980129430 A CN 200980129430A CN 102105464 A CN102105464 A CN 102105464A
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麦克·罗特
陈宝芝
陈绰
迈克尔·道奇
唐炜
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Abstract

本发明一般涉及蛋白信号。特别地，本发明公开了抑制Wnt蛋白信号转导途径的化合物。这些化合物可用于治疗与Wnt蛋白信号转导相关的疾病和病症，如癌症、退行性疾病、II型糖尿病和骨硬化症。

Description

Wnt蛋白信号转导抑制剂
发明背景
本申请要求2008年5月27日提交的U.S.临时申请No.61/130,149和2009年1月2日提交的美国临时申请No.61/204,279的优先权，这两个申请的全部内容以引用方式并入本文。本发明是在国立卫生研究院授予的资助号1R01GM076398-01的政府支持下进行的。政府享有本发明的某些权益。
1.发明领域
本发明一般涉及分子生物学和医药领域。更具体地，其涉及抑制Wnt-介导的信号转导途径(包括Wnt/β-联蛋白途径)之化合物的发现。
2.相关技术的描述
在脊椎动物胚胎发育的几乎所有方面都利用了分泌的Wnt信号蛋白(Clevers，2006)。在胚后动物中，它们的功能对于内稳态组织更新和再生而言是必不可少的(Reya和Clevers，2005)。与已显示出对于决定细胞命运而言具有重要性的一些其它信号转导途径类似，Wnt/β-联蛋白途径的活性维持着能够使干细胞保持其多能性的转录程序(Cole等，2008；Van der Flier等，2007)。不能维持这些转录程序(可能通过损失转录效应器的TCF/LEF家族成员或β-联蛋白转录辅激活因子)导致干细胞自我更新能力受损(Cole等，2008；Fevr等，2007；Korinek等，1998；Muncan等，2007)。
可以由干细胞功能改变引起的病理状态(如退行性疾病和癌症)常常与Wnt/β-联蛋白途径的活性改变有关。实际上，认为Wnt/β-联蛋白途径的过度活化引起干细胞的过早衰老和干细胞功能的年龄相关性丧失(Brack等，2007；Liu等，2007)。在癌症中，Wnt/β-联蛋白途径的过度活化(常常与其它细胞生长调节基因的突变一起)可导致细胞生长异常(Reya和Clevers，2005)。值得注意的是，90％的结肠直肠癌是由于腺瘤性结肠息肉病(adenomatosis polyposis coli，APC)基因的缺失而引发的，腺瘤性结肠息肉病基因是Wnt/β-联蛋白途径的主要抑制剂(Kinzler和Vogelstein，1996；Sjoblom等，2006)。较少地，在正常情况下抑制Wnt蛋白功能的细胞外抑制剂的损失可引起Wnt配体依赖性肿瘤(Polakis，2007)。最近，不依赖于β-联蛋白的Wnt介导的细胞应答(所谓的“非经典途径”)也已显示出在癌症中起到重要作用(Veeman等，2003)。
因此，对调节Wnt依赖性细胞应答之方法和化合物的鉴定可以提供用于治疗性处理与这些途径之异常活性相关的疾病的途径。
发明简述
本发明一般提供了作为Wnt蛋白信号转导抑制剂的化合物及其用途。本发明还提供了这些化合物的合成方法及其药物组合物。
因此，在一个方面，本发明提供一种抑制细胞中Wnt蛋白信号转导的方法，包括向所述细胞施用有效量的式(A)化合物：
Figure BPA00001307415300021
其中：
R1选自：
Figure BPA00001307415300022
Figure BPA00001307415300031
Figure BPA00001307415300032
其中R4和R5各自独立地选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure BPA00001307415300033
并且
r和t各自独立地为0或1；或者
R4和R5一起形成下述结构部分：
其中R13选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和标记物；
R6、R7和R9-R11各自独立地选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure BPA00001307415300041
和
R12选自：
Figure BPA00001307415300042
其中R14选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)；
R2选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)；并且
R3选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)，
Figure BPA00001307415300043
Figure BPA00001307415300051
在某些实施方案中，所述化合物为：
Figure BPA00001307415300052
在某些实施方案中，所述化合物为下述第III部分(名称为“Wnt蛋白信号转导抑制剂”)中所公开化合物中的任一种。
在某些实施方案中，本发明提供了一种抑制细胞中Wnt蛋白信号转导的方法，包括向所述细胞施用有效量的式(I)化合物：
Figure BPA00001307415300053
其中：R1选自：
Figure BPA00001307415300054
其中R4和R5各自独立地选自氢、烷基C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
r和t各自独立地为0或1，或者
R4和R5一起形成下述结构部分：
Figure BPA00001307415300071
其中R13选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和标记物；
R6、R7和R9-R11各自独立地选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)，和
Figure BPA00001307415300072
并且
R12选自：
Figure BPA00001307415300073
其中R14选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)；
R2选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)；和
R3选自：氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)，
Figure BPA00001307415300081
而且，涉及细胞的该方法或任何其它方法都可以进行，其中所述细胞在体外，或者其中所述细胞在体内。
在某些实施方案中，本发明的方法(例如，抑制细胞中Wnt蛋白信号转导的方法)可以进一限定为抑制Wnt应答的方法。
在某些实施方案中(例如但不限于抑制Wnt应答的方法中)，式(I)化合物可以进一步定义为式(II)化合物：
Figure BPA00001307415300082
其中：R15选自：
Figure BPA00001307415300083
Figure BPA00001307415300091
其中：R17和R18各自独立地选自氢、烷基C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure BPA00001307415300092
或者
R17和R18一起形成下述结构部分：
Figure BPA00001307415300093
其中R24选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)，和标记物；
R19和R20各自独立地选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure BPA00001307415300094
R23选自：
Figure BPA00001307415300101
其中R24选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)；和
R16选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)，
Figure BPA00001307415300102
在具体的实施方案中，式(II)化合物可进一步定义为下述化合物中的任何一种或多种：
Figure BPA00001307415300103
Figure BPA00001307415300111
在某些实施方案中，本发明的方法(例如抑制Wnt蛋白信号转导的方法)可以进一步限定为抑制Wnt蛋白产生的方法。例如，一种抑制细胞中Wnt蛋白产生的方法，可包括向所述细胞施用式(I)化合物。在某些实施方案中，所述式(I)化合物可以进一步定义为式(III)化合物：
其中：R25为烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)或取代烷氧基(C≤4)；并且
R26选自：
Figure BPA00001307415300122
其中R27-R30、R27a和R28各自独立地选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)，和并且
r和t各自独立地为0或1。
在某些实施方案中，式(III)化合物进一步定义为下述化合物中的任何一种或多种：
Figure BPA00001307415300131
Figure BPA00001307415300141
在某些实施方案中，式(I)化合物进一步定义为式(IV)化合物：
Figure BPA00001307415300142
其中：R31选自：
其中R33-R35选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure BPA00001307415300151
t为0或1；和
R32选自：
Figure BPA00001307415300152
其中R36-R38选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)。
在本发明的方法、化合物和组合物中使用的标记物可以是本领域技术人员已知的任何类型。例如，标记物还可以定义为包括生物素，比如下述化合物：
Figure BPA00001307415300153
或者，所述标记物可以包含荧光团，如下述化合物：
在另一个方面，本发明提供了化合物：
Figure BPA00001307415300162
在又一个方面，本发明提供了式(V)或式(VI)的化合物：
其中对于任一个通式：
R1和R2，当单独存在时，各自独立地为：
氢、羟基、卤素、氨基、硝基、羟氨基、氰基、叠氮基或巯基；或者
烷基(C≤12)、烯基(C≤12)、炔基(C≤12)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤12)、杂芳基(C≤12)、杂芳烷基(C≤12)、烷氧基(C≤12)、烯氧基(C≤12)、炔氧基(C≤12)、芳氧基(C≤12)、芳烷氧基(C≤12)、杂芳氧基(C≤12)、杂芳烷氧基(C≤12)、酰氧基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、烷氧基氨基(C≤12)、烯基氨基(C≤12)、炔基氨基(C≤12)、芳基氨基(C≤12)、芳烷基氨基(C≤12)、杂芳基氨基(C≤12)、杂芳烷基氨基(C≤12)、酰氨基(C≤12)或任何这些基团的取代形式；或者
R1和R2一起为亚烷基(alkanediyl)(C2-12)、亚烯基(alkenediyl)(C2-12)，或任何这些基团的取代形式。
在某些实施方案中，R1和R2一起为：
Figure BPA00001307415300171
在另一些实施方案中，R1或R2为卤素。在某些变化形式中，R1或R2为溴。在另一些实施方案中，R1或R2为烷氧基(C≤6)，例如，R1或R2可以为甲氧基。本发明提供的化合物的实例包括：
Figure BPA00001307415300172
Figure BPA00001307415300181
在另一个方面，本发明提供了一种抑制细胞中Wnt蛋白信号转导的方法，包括向所述细胞施用有效量的式(V)或式(VI)的化合物：
Figure BPA00001307415300182
Figure BPA00001307415300191
其中对于任一个通式：
R1和R2，当单独存在时，各自独立地为：
氢、羟基、卤素、氨基、硝基、羟氨基、氰基、叠氮基或巯基；或者
烷基(C≤12)、烯基(C≤12)、炔基(C≤12)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤12)、杂芳基(C≤12)、杂芳烷基(C≤12)、烷氧基(C≤12)、烯氧基(C≤12)、炔氧基(C≤12)、芳氧基(C≤12)、芳烷氧基(C≤12)、杂芳氧基(C≤12)、杂芳烷氧基(C≤12)、酰氧基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、烷氧基氨基(C≤12)、烯基氨基(C≤12)、炔基氨基(C≤12)、芳基氨基(C≤12)、芳烷基氨基(C≤12)、杂芳基氨基(C≤12)、杂芳烷基氨基(C≤12)、酰氨基(C≤12)或任何这些基团的取代形式；或者
R1和R2一起为亚烷基(C2-12)、亚烯基(C2-12)，或任何这些基团的取代形式。
在某些实施方案中，所述细胞在体外。在另一些实施方案中，所述细胞在体内。在某些实施方案中，所述抑制Wnt蛋白信号转导的方法进一步限定为抑制Wnt应答的方法。在某些实施方案中，所述方法还包括上述具体化合物之一。
本发明还包括治疗方法。所述方法可以使用本文所述化合物中的任何一种化合物。例如，所述方法可以使用上述和下述的式(A)和(I)-(VI)的化合物。例如，本发明包括治疗患者的癌症的方法，包括向所述患者施用有效量的式(A)或其任一子通式(sub-generic formula)(I)、(II)(III)和/或(IV)的化合物。类似地，本发明包括治疗患者的癌症的方法，包括向所述患者施用有效量的式(V)或(VI)或其任一子通式的化合物。本文描述的具体化合物也考虑用于治疗癌症的方法。例如，其包括在下述第III部分(名称为“Wnt蛋白信号抑制剂”)中公开的任何化合物。
所述癌症可以是结肠直肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌或前列腺癌。治疗癌症的方法还可进一步包括施用化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗、毒素治疗或基因治疗：这些额外的方法也是本领域熟知的。施用方法可以包括：静脉内施用、皮内施用、动脉内施用、腹膜内施用、病变内施用、颅内施用、关节内施用、前列腺内施用、胸膜内施用、气管内施用、鼻内施用、玻璃体内施用、阴道内施用、直肠内施用、表面施用、瘤内施用、肌内施用、皮下施用、结膜下施用、囊泡内施用、粘膜施用、心包内施用、脐带内施用、眼内施用、口服施用、局部施用、通过吸入施用、通过注射施用、通过输注施用、通过连续输注施用、通过局部灌注浸浴靶细胞而直接施用、通过导管施用、通过灌洗施用、在乳膏中施用、在脂质组合物中施用，或其任意组合。剂量可以包括例如约1μg/kg至约100mg/kg，或可来自其中的任何范围。
在本文描述的任一种方法中，本文公开的化合物可以与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂一起组合在药物组合物中。
如上所述，本发明包括药物组合物。在某些实施方案中，包括包含可药用载体、稀释剂和/或赋形剂及下述化合物中任何一种或多种的药物组合物：
Figure BPA00001307415300201
本发明的另一个一般方面包括一种治疗或预防患者的骨硬化症的方法，包括向患者施用有效量的本文公开的化合物。这样的方法可以进一步包括施用第二骨硬化症治疗剂或第二骨硬化症预防剂。目的化合物的施用可以通过选自下述的途径进行：静脉内施用、皮内施用、动脉内施用、腹膜内施用、病变内施用、颅内施用、关节内施用、鼻内施用、表面施用、肌内施用、皮下施用、脐带内施用、口服施用、局部施用、通过吸入施用、通过注射施用、通过输注施用、通过连续输注施用、通过局部灌注浸浴靶细胞而直接施用、通过导管施用、在乳膏中施用、在脂质组合物中施用或其任意组合。剂量可以在例如约1μg/kg至约100mg/kg的范围内，或者在可来自其中的任何范围内。
本发明还包括治疗患者的退行性疾病的方法，包括向所述患者施用有效量的本文公开的化合物。所述退行性疾病可以是例如II型糖尿病或年龄相关性的组织修复受损。所述方法可以进一步包括施用治疗退行性疾病的第二药剂。施用方法可选自：静脉内施用、皮内施用、动脉内施用、腹膜内施用、病变内施用、颅内施用、关节内施用、前列腺内施用、胸膜内施用、气管内施用、鼻内施用、玻璃体内施用、阴道内施用、直肠内施用、表面施用、肌内施用、皮下施用、结膜下施用、囊泡内施用、粘膜施用、心包内施用、脐带内施用、眼内施用、口服施用、局部施用、通过吸入施用、通过注射施用、通过输注施用、通过连续输注施用、通过局部灌注浸浴靶细胞而直接施用、通过导管施用、通过灌洗施用、在乳膏中施用、在脂质组合物中施用或其任意组合。剂量可以在例如约1μg/kg至约100mg/kg的范围内，或者在可来自其中的任何范围内。
本文还公开了治疗患者的II型糖尿病的方法，包括向所述患者施用有效量的本文公开的化合物。这样的这样的方法可进一步包括施用治疗糖尿病的第二药剂。施用方法可选自：静脉内施用、皮内施用、动脉内施用、腹膜内施用、病变内施用、颅内施用、关节内施用、前列腺内施用、胸膜内施用、气管内施用、鼻内施用、玻璃体内施用、阴道内施用、直肠内施用、表面施用、肌内施用、皮下施用、结膜下施用、囊泡内施用、粘膜施用、心包内施用、脐带内施用、眼内施用、口服施用、局部施用、通过吸入施用、通过注射施用、通过输注施用、通过连续输注施用、通过局部灌注浸浴靶细胞而直接施用、通过导管施用、通过灌洗施用、在乳膏中施用、在脂质组合物中施用，或其任意组合。剂量可以在例如约1μg/kg至约100mg/kg的范围内，或者在可来自其中的任何范围内。
特别包括的是，对于本发明的一个实施方案所讨论的任何限制可以适用于本发明的任何其它实施方案。而且，本发明的任何组合物都可以用于本发明的任何方法中，本发明的任何方法都可以用于制备或使用本发明的任何组合物。
根据下述详细说明，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，指出本发明优选实施方案的详细描述和具体实施例仅仅作为举例说明的方式来提供，因为对本领域技术人员而言，根据该详细说明，在本发明的精神和范围内的各种变化和修饰将变得显而易见。
附图说明
下述附图构成本发明说明书的一部分，其被包括在本说明书内，用于进一步阐明本发明的某些方面。参照一幅或多幅这些附图，并结合本文中给出的具体实施方案的详细说明，将可以更好地理解本发明。
本专利或申请文件包含至少一幅彩色图。专利局将根据提出的请求和支付的必要费用而提供具有彩色图的本专利或专利申请的副本。
图1.Wnt/β-联蛋白信号转导途径的小分子拮抗剂的鉴定。使用具有由细胞自主性Wnt3A蛋白产生而维持的组成型Wnt/β-联蛋白途径活性的细胞系(L-Wnt-STF细胞；初筛)来筛选来自U.T.Southwestern(Dallas，TX)(UTSW)的～200K化学品文库。使用稳定转染的Wnt应答性萤火虫萤光素酶(FL)和对照Renilla萤光素酶(RL)受体鉴定潜在的Wnt/β-联蛋白途径拮抗剂。将所述库中评价为选中化合物(hit)的约1％的化合物以剂量依赖性方式再次试验，以鉴定具有最小细胞毒性的最强效化合物(剂量依赖性试验)。除去那些可能通过直接抑制FL活性而消除FL活性或或通常阻断蛋白之细胞分泌的化合物(FL抑制剂和胞吐作用试验)。为了分离抑制Wnt/β-联蛋白途径应答或Wnt3A蛋白产生的化合物，在HEK293细胞中使用与在初筛中所述相同的测定来测试化合物，不同在于使用外源性Wnt3A蛋白(在条件培养基中提供)来刺激途径应答(外源性Wnt试验)。在该试验中保持其抗途径活性的化合物被认为是Wnt应答抑制剂(IWR))，而没有保持其抗途径活性的那些则被认为是Wnt产生抑制剂(IWP)。使用与用于鉴定Wnt/β-联蛋白途径拮抗剂类似的基于培养细胞的测定(Hh和Notch途径试验)，测试这两类化合物对两种其它信号转导途径(Hh和Notch途径)的作用。分别使用Shh或活化的Notch(NICD)cDNA构建物活化Hh和Notch途径。最小程度地影响这两种途径的那些化合物被认为是对Wnt/β-联蛋白途径具有特异性活性。最后，直接地测试IWP抑制Wnt3A蛋白分泌的能力(Wnt分泌试验；参见图9)。选择选中化合物的标准提供在图1中。最后，选出对于攻击Wnt/β-联蛋白途径具有高特异性的五种IWR和四种IWP进行进一步分析(图9)。记录每个试验中所使用化合物的浓度。插图显示筛选中所用的测定和利用每种萤光素酶读数的第二试验的示意图。
图2.IWR和IWP化合物的化学结构和效力。图2A.IWR化合物的结构和效力。将仅在于单个甲基不同且共同具有相似IC50(如在L-Wnt-STF细胞中所测定的；图的右上方)的两种IWR化合物指定为第I类化合物。将具有结构相似性的其余三种IWR(也参见图10)指定为第II类化合物。图2B.IWP化合物的结构和效力。所有的IWP化合物与具有相同核心结构(IWP-2)的IWP 2-4相比，都共同具有结构相似性和相似的IC50，其区别仅仅在于存在另外的氟或甲氧基加合物(分别为IWP-3和IWP-4)。
图3.IWR和IWP化合物对Wnt/β-联蛋白途径抑制的生物化学证据。将显示出组成型Wnt途径活化作用的L-Wnt-STF细胞与IWR(10mM)和IWP(5mM)化合物一起孵育24小时，之后溶胞。将细胞裂解产物进行Western印迹分析，以测定LRP6和Dvl2磷酸化水平和β-联蛋白积聚、以及与Wnt/β-联蛋白途径活性相关的所有生物化学事件。可预测的是，IWP阻断了所有三种生物化学事件，而IWR似乎阻断β-联蛋白积聚而不影响LRP6和Dvl2磷酸化。Kif3A和和微管蛋白起上样对照作用。用条件化培养基中提供的外源性Wnt3A蛋白刺激的野生型L-细胞显示出与Wnt途径组分中相似的生物化学变化，如在L-Wnt-STF细胞中所观察到的。
图4A-G.靶向Porcupine O-酰基转移酶的IWP化合物。图4A.在HEK293细胞中，O-酰基转移酶Porc而不是Wnt伴侣分子Evi的过表达对抗IWP化合物对Wnt/β-联蛋白途径活性的作用。在24小时的测定中，使用如前所述STF报告子测量Wnt/β-联蛋白途径活性。图4B.Porc的过表达逆转了IWP化合物诱导的对Wnt蛋白分泌的阻断。当Porc过表达时，使用Wnt3A-Gaussia萤光素酶融合蛋白测量到的Wnt蛋白的细胞分泌减少(参见图1和图9)恢复到对照水平，所述Wnt3A-Gaussia萤光素酶融合蛋白在IWP-处理的细胞中减少。图4C.IWP化合物以Porc依赖性方式抑制Wnt3A的脂质化。在用于检测经修饰Wnt蛋白的已建立的相分离测定中的洗涤剂级分中发现的脂质化Wnt3A蛋白在IWP处理的细胞中不存在。在过表达Porc的细胞中，即使在IWP-2存在下可溶于洗涤剂的Wnt3A也保留。图4D.IWP化合物不抑制ShhN蛋白的脂质化。使用与在图4C中相同的相分离测定，在用IWP化合物处理的细胞中观察到可溶于洗涤剂的ShhN蛋白的水平没有变化。注意在含有ShhNC25S(其不能棕榈酰化)的样品中不存在ShhN(箭头)的最慢迁移形式。图4F.生物素化的IWP-2的结构及其与Porc的结合。为了产生可固定到用于生化研究的基于链霉亲和素之固体载体的IWP-2化合物(IWP-PEG-生物素；参见图13的合成方案)，将连接基和生物素基团连接至IWP-2上苯基的对位，该位置很可能可以适应修饰而不影响与靶蛋白的相互作用(左侧；参加图2C，IWP-3，4)。在存在或不存在未修饰IWP-2的情况下，将生物素化的IWP-2或结合了经链霉亲和素涂覆之琼脂糖珠粒的对照PEG生物素基团(右侧)与包含myc表位标签的Porc蛋白的细胞裂解产物一起孵育。与IWP-2-珠粒结合的Porc-Myc可以与可溶性的未修饰IWP竞争，如通过结合了珠粒的物质的western印迹分析所测定的。图4G.IWP作用的模型。IWP抑制Porc功能，从而导致Wnt蛋白无功能。
图5A-H.IWR化合物对Axin2降解复合物的稳定作用。图5A.IWR化合物阻断由APC肿瘤阻遏物损失所引起的β-联蛋白积聚。用APCsiRNA处理的小鼠L-细胞中β-联蛋白的积聚可以被IWR-1阻断。图5B.IWR阻止结肠直肠癌(CRC)细胞中Wnt/β-联蛋白途径活性的异常。在APC中存在失去功能之突变的DLD-1细胞、CRC细胞中的Wnt/β-联蛋白途径活性之异常被IWR化合物所消除。使用STF受体监测途径活性，并如前所述将其针对RL对照受体进行归一化。图5C.IWR诱导Axin2蛋白积聚。对参与调节DLD-1细胞中β-联蛋白水平之蛋白的Western印迹分析表明，在用IWR化合物处理的细胞中的Axin2蛋白积聚与其它途径组分的表达水平相比几乎没有不同。注意在这些细胞中APC蛋白被截短。图5D.在IWR化合物的存在下，在可进行Wnt应答的CRC细胞中β-联蛋白水平降低。与E-钙粘蛋白受体蛋白结合之β-联蛋白的消耗显示出在用IWR处理的细胞中，可用于Wnt途径应答之β-联蛋白水平的降低。图5E.IWR稳定Axin2蛋白。在用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺处理的DLD-1细胞中，Axin2蛋白的快速降解很明显。用环己酰亚胺和IWR-1两者处理的细胞几乎不显示出Axin2的转换(turn-over)，表明IWR化合物防止Axin2降解，而不是诱导其表达。图5F.生物素化IWR-1(IWR-1-PEG-B)的结构。图5G.Axin2与IWR-1-PEG-B相互作用。将来源于转染细胞的溶胞产物与IWR-1-PEG-B、链霉亲和素琼脂糖珠粒和DMSO或IWR-1一起孵育，所述细胞转染了对照、Axin2或缺乏DAX C末端结构域(Axin2ΔDAX)的Axin2表达构建物。图5H.IWR作用的提议模型。向细胞中加入IWR导致Axin2蛋白稳定，结果是β-联蛋白的降解增加。
图.6A-C.在再生和癌症中Wnt/β-联蛋白途径的化学抑制。图6A.IWR-1防止斑马鱼的尾鳍再生。将切除了尾鳍的成年斑马鱼放置在含有DMSO载体或IWR-1(10μM)的水中四天，每天补充水和所述化合物。与IWR-1抑制Wnt/β-联蛋白途径响应一致，用IWR-1而不是DMSO处理的鱼没有再生出鳍组织。再生组织的长度用条(bar)表示。图6B.IWR-1阻断胃肠道的正常内稳态的恢复。用载体或IWR-1(10μM)处理来自鱼的中肠组织的代表性组织切片8天或14天，然后，用苏木精和伊红(H&E)染色或进行BrdU掺入。在延长化学品暴露(14天)之后，在IWR-1处理的鱼(8天；箭头)的肠褶皱基质中BrdU标记的细胞丧失，接着肠组织结构发生明显变化。图6C.在对照或IWR-1处理的鱼的肠道中BrudU标记细胞的定量。评价如图5B所示的组织切片(中间栏)中包含BrdU标记细胞的肠褶皱的百分数。四个独立的评分员分析了来自对照或IWR-1处理组的八条鱼的切片。提供的比值表示分子为BrdU标记细胞的数目，分母为所评价的肠褶皱的数目。
图7A-D。癌症中Wnt-介导的细胞应答的化学抑制。图7A.IWR和IWP化合物对癌细胞的生长抑制作用。用递增浓度的IWR-4或IWP-1处理来自肺或结肠癌的细胞6天，并每日补充培养基和化合物，所述细胞具有引起异常Wnt途径应答的已知分子变化。使用Cell-Titer Glo测定法测量细胞活力。图7B.在用IWR或IWP化合物处理的癌细胞中的Wnt途径组分的生物化学变化。用IWR或IWP处理来自H460或DLD-1细胞的溶胞产物，并对Dvl2、Axin2、Axin1或肌动蛋白进行Western印迹分析。尽管这两个细胞系都表达Axin2，但在H460细胞中Axin2表达不存在。图7C.癌细胞中非β-联蛋白依赖性Wnt介导的信号的遗传证据。使用RNAi靶向肺癌或CRC细胞系中的Porc导致克隆细胞的密度生长降低，而用类似方法靶向β-联蛋白则仅仅引起DLD-1细胞的生长变化。图7D.IWR和IWP化合物对配体依赖性和配体非依赖性Wnt途径活性的抑制-一种提议的机制。基于如图7D所示的所提议作用机制，IWP和IWR化合物可以抑制以配体依赖性方式驱动的途径应答。另外，IWR化合物可以阻断配体非依赖性途径应答，例如在结肠直肠癌细胞中由APC损失所诱导的配体非依赖性途径应答。
图8.在筛选中用于鉴定选中化合物的标准。鉴定如图1所示的Wnt/β-联蛋白途径活性之化学抑制剂的筛选方法流程图，不同在于每个步骤中用于鉴定所示目的化合物的标准不同。
图9A-C.特异性抑制Wnt/β-联蛋白途径的IWR和IWP化合物。图9A.与来自筛选方法的IWR和IWP化合物有关的结果的归纳。在响应于自主性产生的Wnt蛋白的细胞(L-Wnt-STF细胞)或在条件化培养基中外源性提供的Wnt(HEK293细胞)中进行Wnt途径试验。图9B.IWP化合物抑制Wnt3A分泌。左图：用于监测细胞培养基中分泌的Wnt蛋白水平的Wnt-Gaussia萤光素酶(Wnt-GL)融合蛋白的示意图。右图：与用载体处理的细胞相比，用IWP化合物处理的细胞分泌的Wnt-GL而不是GL的水平降低。Wnt-GL蛋白引起的Wnt/β-联蛋白途径应答的水平与Wnt3a蛋白的(数据未显示)相似。图9C.IWR和IWP化合物通常抑制Wnt蛋白诱导的Wnt/β-联蛋白途径应答。在用IWR-1或IWP-2处理的细胞中，由Wnt1、Wnt2或Wnt3a诱导的且使用STF报告子监测的途径活性降低。如前所述，将FL活性针对对照RL活性进行归一化。
图10.IWR 3-5具有结构相似性。使用AM1半经验方法，IWR 3-5的平衡几何构型的三维图形显示出结构相似性。将所有的三个结构都重叠在右侧。
图11A-B.IWP-2和IWP PEG-生物素的合成方案。示出了IWP-2(图11A)和IWP-PEG-生物素(图11B)的合成路线。
图12A-G.IWR-1、IWR-1-PEG-B和IWR-Cy3化合物的合成方案。图12A.IWR-1的合成路线。内型和外型非对映异构体的产生取决于起始原料。图12B.内型和外型IWR-1结构的图。图12C.有关内型和外型IWR-1对Wnt途径应答的归一化数据。图12D.IWR-Cy3的合成方案。图12E.IWR-1-PEG-B的合成方案。图12F.当使用L-Wnt-STF细胞测量时，IWR-Cy3和IWR-1-PEG-B保留了针对Wnt/β-联蛋白途径的活性。图12G.与其母体化合物IWR-1相似，IWR-Cy3和IWR-1-PEG_B抑制β-联蛋白在L-Wnt细胞中的积聚。
图13A-C.具有增强的代谢稳定性的第二代IWR化合物。作为寻找IWR相关化合物的一部分，所述化合物比IWR-1观察到的更强效或具有更有利的药代动力学参数，鉴定了保留抑制Wnt/β-联蛋白途径应答之能力(图13B)的两种化合物(IWR-6和IWR-7；图13A)。当使用肝细胞共培养测定来测量时，其中一种(IWR-7)还具有比IWR-1更长的半衰期(图13C)。
图14A-C.IWP作用和特异性的表征。图14A.IWP-2不诱导Porcn降解。在IWP-2存在下，过表达的Porcn水平升高。IWP-2似乎不改变Porcn的定位。图14C.与IWP-2相关的一些化合物的化学结构和活性。当使用STF报告子测量时，IWP-2-v2保留针对Wnt/β-联蛋白途径的活性(右侧)，而IWP-2-v1和-v3则没有保持该活性。
图15-24.Wnt应答抑制剂的1H-NMR谱。图15对应于化合物IWR-8。图16对应于化合物IWR-9。图17对应于化合物IWR-10。图18对应于化合物IWR-11。图19对应于化合物IWR-12。图20对应于化合物IWR-13。图21对应于化合物IWR-14。图22对应于化合物IWR-15。图23对应于化合物IWR-18。图24对应于化合物IWR-19。
图25.IWR对斑马鱼的鳍再生的抑制作用。箭头指示切除点。IWR-1的最低抑制浓度为0.5μm。采用中等抑制剂13和43仅观察到了对鳍再生的部分抑制。弱抑制剂17仅仅延缓尾鳍的生长(图片未显示)。
示例性实施方案的描述
已经鉴定了靶向Wnt依赖性信号转导途径(如Wnt/β-联蛋白途径)的小分子。这些小分子揭示了在这些信号转导途径内的化学敏感性调节机制，其可以被用于医学应用比如再生和抗癌治疗的药理学方式利用。
I.Wnt信号转导途径
Wnt基因家族编码分泌配体蛋白，其在分化和发育中起关键作用。该家族包括至少15种脊椎动物的和无脊椎动物的基因，包括果蝇体节极性基因wingless，以及其脊椎动物的同源物之一integrated(Wnt名称即衍生于此)。如上所述，Wnt蛋白似乎有助于多个发育过程和内稳态过程。
Wnt信号转导途径包括许多参与细胞应答之转导以分泌Wnt/wingless信号转导蛋白的蛋白。控制“非经典”途径的Wnt蛋白(如Wnt/钙)和二维细胞极性途径引起不依赖于β-联蛋白的细胞应答。然后，在Wnt/β-联蛋白途径中，Frizzled受体活化Disheveled蛋白，其阻断Zeste-white-3激酶(或脊椎动物中的GSK3β，糖原合酶激酶-3β)对Armadillo蛋白(一种β-联蛋白)的抑制作用。所述β-联蛋白将来自胞浆的Wnt信号转导到细胞核。在不存在Wnt信号转导的情况下，β-联蛋白被蛋白酶体组成型降解，并且可见于具有conductin(或axin)、APC(腺瘤结肠息肉病)和GSK3β的多聚复合物中。APC介导β-联蛋白与conductin的结合，并且起到活化conductin蛋白的作用。Conductin起到组装β-联蛋白降解途径组分之支架的作用。GSK3β(一种丝氨酸/苏氨酸激酶)使β-联蛋白磷酸化，从而促进蛋白酶体对其降解。
当Wnt信号转导时，GSK3β激酶失活，导致β-联蛋白稳定化。然后，β-联蛋白从所述多聚复合物中释放出来并转移到细胞核内。一旦在细胞核内，β-联蛋白就与HMG(高迁移率基团)盒转录因子的LEF/TCF(淋巴增强子因子/T细胞因子)家族相互作用。通过与β-联蛋白相互作用，LEF/TCF因子受刺激转变成多种基因(包括c-myc和cyclin D1)的强效反式激活因子。
II.Wnt控制的信号转导途径的治疗意义
如上所述，证据表明，对Wnt介导之信号转导途径的靶向将可用于治疗多种疾病(Barker和Clevers，2006)(Veeman等，2003)。用Wnt途径的细胞外蛋白抑制剂处理过的老年小鼠或显示出干细胞早衰的小鼠显示出多种组织再生能力的改善(Brack等，2007；Liu等，2007)。导致Wnt途径的组成型活化的突变是多种人类癌症中的关键事件，所述人类癌症包括结肠癌、黑素瘤、肝细胞癌等。Wnt/β-联蛋白途径的组成型活化的最终结果是胞浆中β-联蛋白的水平显著增加。导致蛋白水平增加的β-联蛋白的不适当稳定化可由Wnt信号转导途径中多种蛋白质的突变引起。使用遗传方法或化学方法阻断多种癌症中Wnt/β-联蛋白途径显示出消除了异常细胞生长(Barker和Clevers，2006)。此外，抑制该途径还可直接影响延长癌细胞生长和能够转移并被认为对常规化疗剂具有抗性的细胞(Ailles和Weissman，2007)。
Wnt蛋白在组织内稳态和肿瘤发生中的广泛影响表明，诸如再生医学和抗癌治疗等方面可受益于靶向该途径的治疗。获得对病理性Wnt应答的瞬时抑制而不引起对正常干细胞功能的永久性损伤是重要的抗癌治疗目标。我们测试了斑马鱼在化学诱导阻断鳍再生长后恢复再生过程的能力。在除去化学物之后，将切除尾鳍的鱼饲养在含有IWR 1的水中7天，其能够使组织再生至接近正常水平，表明Wnt/β-联蛋白反应的瞬时抑制并不永久性改变干细胞自我更新的能力(图6a)。
由导致Wnt配体活性改变或途径调节剂之功能改变的遗传变化所维系的Wnt介导途径应答异常已经与多种癌症有关。参见Clevers，2006和Polakis，2007，这两篇文献均通过引用并入本文。特别地，超过90％的结肠直肠癌(CRC)肿瘤发生APC(Wnt/β-联蛋白途径抑制剂)的功能丧失突变。参见Sjoblom等，2006，其通过引用并入本文。IWR化合物稳定Axin蛋白和诱导β-联蛋白降解(即使在缺乏正常APC蛋白功能的情况下)的能力表明，它们可阻断Wnt/β-联蛋白应答过度活化所导致的异常细胞生长。
实际上，IWR化合物能够抑制小鼠L细胞(使用Apc小干扰RNA)和DLD-1结肠直肠癌细胞(其发生APC功能丧失的突变)中Apc丧失所引起的异常Wnt/β-联蛋白活性。还测试了在几种癌细胞系中IWR-3模拟β-联蛋白siRNA的细胞生长作用的能力，所述癌细胞系显示出在Wnt/β-联蛋白途径活性的生长依赖性方面的差异。特别地，IWR-3模拟β-联蛋白siRNA对来源于结肠癌(DLD-1)和前列腺癌(DU145)而不是肺癌(H460)的癌细胞生长的作用，这表明，IWR-3在这些细胞中成功地靶向Wnt β-联蛋白途径。实际上，β-联蛋白的过表达可以克服IWR-3对DLD-1细胞生长的作用。
通常在发生APC肿瘤阻遏物的功能丧失突变的CRC细胞中观察到Wnt/β-联蛋白靶基因的异常转录诱导。与IWR化合物抑制癌性Wnt/β-联蛋白途径应答的能力相一致，在暴露于IWR-12小时后，观察到Axin2在DLD-1细胞中的表达减少。因此，可化学控制Axin蛋白稳定性以便抑制癌性Wnt/β-联蛋白活性，如通过IWR化合物所证实的。参见Chen等(2007)，其通过引用并入本文。
III.Wnt蛋白信号转导抑制剂
因此，本发明提供了抑制Wnt蛋白信号转导途径的小分子。这些化合物的实例包括与其相应的体外活性一起显示的IWR-1和IWR-2：
Figure BPA00001307415300301
表1和2提供这些化合物的进一步实例，以及通过测量Wnt/β-联蛋白依赖性转录应答的基于萤光素酶的报告子法来测定的其活性。
表1：小分子Wnt抑制剂的实例
Figure BPA00001307415300321
表2：小分子Wnt抑制剂的进一步实例
Figure BPA00001307415300331
Wnt信号转导抑制剂的更进一步实例为化合物50、51和52：
Figure BPA00001307415300341
仍然更进一步的实例包括：
Figure BPA00001307415300351
Figure BPA00001307415300361
一些上述化合物是使用Chen等(2009)提供的方法制备的，其全文通通过引用并入本文。本文公开的某些小分子Wnt信号转导抑制剂是通过下述图11和12及实施例部分列出的方法制备的。这些方法的变化形式提供了进一步的小分子Wnt信号转导抑制剂。示例性的表征数据也提供在实施例部分中。
本文公开的某些小分子Wnt信号转导抑制剂是新的。其中，化合物IWR-8至IWR-14可以根据下述方案制备：
Figure BPA00001307415300362
Figure BPA00001307415300371
本文公开的某些化合物(例如IWR-15至IWR-22)可以根据下述方案制备：
Figure BPA00001307415300372
注意化合物IWR-16、IWR-17、IWR-20、IWR-21和IWR-22是预言性的，既没有制备也没有试验。
所有这些方法都可以使用本领域技术人员采用的有机化学的原理和技术进行进一步修改和优化。这些原理和技术在例如March’s Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure(2007)中有教导，其通过引用并入本文。
IV.定义
本文中使用的“Wnt蛋白信号转导途径”指通过该途径Wnt蛋白与细胞外受体的结合被翻译到细胞核并引起多种基因的转录激活，或者导致影响细胞行为的生物化学变化。所述Wnt蛋白信号转导途径涉及多种蛋白，包括Frizzled、Disheveled、Axin、APC、GSK3β、β-联蛋白、LEF/TCF转录因子等。来自许多不同物种的细胞表达涉及Wnt蛋白信号转导途径的蛋白的同源物，因此，其具有功能上等同的Wnt蛋白信号转导途径。
本文中使用的“Wnt蛋白信号转导抑制剂”是抑制Wnt蛋白信号转导活性的有机药物(即有机小分子)。Wnt蛋白信号转导抑制剂通常分子量为约1000g/mol或更小。
本文中使用的“抑制Wnt应答的方法”指抑制与功能性Wnt蛋白产生相关或与对Wnt蛋白的细胞应答相关之已知生物化学事件的方法。如本文讨论的，根据该定义，有机小分子可以抑制Wnt应答。
本文中使用的“氢”指-H；“羟基”指-OH；“氧代”(“oxo”)指＝O；“卤素”独立地指-F、-Cl、-Br或-I；“氨基”指-NH2(参见下文对于包含术语氨基的基团例如烷基氨基的定义)；“羟氨基”指-NHOH；“硝基”指-NO2；亚氨基指＝NH(参见下文对于包含术语亚氨基之基团的定义，例如烷基氨基)；“氰基”指-CN；“叠氮基”指-N3；“磷酸酯”指-OP(O)(OH)2；“巯基”指-SH；“硫代”(“thio”)指＝S；“亚磺酰氨基”指-NHS(O)2-(参见下文对于包含术语亚磺酰氨基之基团的定义，例如烷基亚磺酰氨基)；“磺酰基”指-S(O)2-(参见下文对于包含术语磺酰基之基团的定义，例如烷基磺酰基)；“亚硫酰基”指-S(O)-(参见下文对于包含术语亚硫酰基之基团的定义，例如烷基亚磺酰基)；“甲硅烷基”指-SiH3(参见下文对于包含术语甲硅烷基之基团的定义，例如烷基甲硅烷基)。
对于如下基团，下述的括号中的下标进一步如下限定基团：“(Cn)”限定基团中的确切碳原子数。“(C≤n)”限定可以在基团中存在的碳原子的最大数值(n)，在该基团中的碳原子最小数目至少为一个，但在所述基团中可以小至最小的可能数值。例如，应当理解，基团“烯基(C≤8)”中碳原子的最小数值为2。例如，“烷氧基(C≤10)”指定具有1至10个碳原子(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，或者可来自其中的任何范围(例如3-10个碳原子))的那些烷氧基。(Cn-n’)限定基团中碳原子的最小数值(n)和最大数值(n’)。类似地，“烷基(C2-10)”指具有2至10个碳原子(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个，或者可来自其中的任何范围(例如3-10个碳原子))的那些烷基。
术语“烷基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指具有饱和碳原子作为连接点的直链或支链、环、环状或非环状结构的非芳族一价基团，其无碳-碳双键或三键，且没有除碳和氢之外的原子。基团-CH3(Me)、-CH2CH3(Et)、-CH2CH2CH3(n-Pr)、-CH(CH3)2(异-Pr)、-CH(CH2)2(环丙基)、-CH2CH2CH2CH3(n-Bu)、-CH(CH3)CH2CH3(仲丁基)、-CH2CH(CH3)2(异丁基)、-C(CH3)3(叔丁基)、-CH2C(CH3)3(新戊基)、环丁基、环戊基、环己基和环己基甲基都是烷基的非限定性实例。术语“取代烷基”指具有饱和碳原子作为连接点的直链或支链、环、环状或非环状结构的非芳族一价基团，其无碳-碳双键或三键，且至少一个原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。下述基团是取代烷基的非限定性实例：-CH2OH、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2SH、-CF3、-CH2CN、-CH2C(O)H、-CH2C(O)OH、-CH2C(O)OCH3、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)NHCH3、-CH2C(O)CH3、-CH2OCH3、-CH2OCH2CF3、-CH2OC(O)CH3、-CH2NH2、-CH2NHCH3、-CH2N(CH3)2、-CH2CH2Cl、-CH2CH2OH、-CH2CF3、-CH2CH2OC(O)CH3、-CH2CH2NHCO2C(CH3)3和-CH2Si(CH3)3。
术语“亚烷基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指具有一个或两个饱和碳原子作为连接点的直链或支链、环、环状或非环状结构的非芳族二价基团，其无碳-碳双键或三键，且没有除碳和氢之外的原子，其中该亚烷基连接两个σ键。基团-CH2-(亚甲基)、-CH2CH2-、-CH2C(CH3)2CH2-、-CH2CH2CH2-和是亚烷基的非限定性实例。术语“取代亚烷基”具有一个或两个饱和碳原子作为连接点的直链或支链、环、环状或非环状结构的非芳族一价基团，其无碳-碳双键或三键，且至少一个原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S，其中该亚烷基连接两个σ键。下述基团是取代亚烷基的非限定性实例：-CH(F)-、-CF2-、-CH(Cl)-、-CH(OH)-、-CH(OCH3)-和-CH2CH(Cl)-。
术语“烯基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指具有非芳族碳原子作为连接点的直链或支链、环、环状或非环状结构的一价基团，其具有至少一个非芳族碳-碳双键，无碳-碳三键，且没有除碳和氢之外的原子。烯基的非限定性实例包括：-CH＝CH2(乙烯基)、-CH＝CHCH3、-CH＝CHCH2CH3、-CH2CH＝CH2(烯丙基)、-CH2CH＝CHCH3和-CH＝CH-C6H5。术语“取代烯基”指具有非芳族碳原子作为连接点的直链或支链、环、环状或非环状结构的一价基团，其至少一个非芳族碳-碳双键，无碳-碳三键，且至少一个原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。基团-CH＝CHF、-CH＝CHCl和-CH＝CHBr是取代烯基的非限定性实例。
术语“亚烯基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指具有两个碳原子作为连接点的直链或支链、环、环状或非环状结构的非芳族二价基团，其至少一个非芳族碳-碳双键，无碳-碳三键，且没有除碳和氢之外的原子，其中该亚烯基连接两个σ键。基团-CH＝CH-、-CH＝C(CH3)CH2-、-CH＝CHCH2-和
Figure BPA00001307415300401
是亚烯基的非限定性实例。术语“取代亚烯基”指具有两个碳原子作为连接点的直链或支链、环、环状或非环状结构的非芳族二价基团，其至少一个非芳族碳-碳双键，无碳-碳三键，且至少一个原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S，其中该亚烯基连接两个σ键。下述基团是取代亚烯基的非限定性实例：-CF＝CH-、-C(OH)＝CH-和-CH2CH＝C(Cl)-。
术语“炔基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指具有非芳族碳原子作为连接点的直链或支链、环、环状或非环状结构的一价基团，其至少一个碳-碳三键，且没有除碳和氢之外的原子。基团-C≡CH、-C≡CCH3、-C≡CC6H5和-CH2C≡CCH3是炔基的非限定性实例。术语“取代炔基”指具有非芳族碳原子作为连接点的直链或支链的、环、环状或非环状结构的一价基团，其具有至少一个碳-碳三键，且至少一个原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S。基团-C≡CSi(CH3)3是取代炔基的非限定性实例。
术语“亚炔基”(“alkynediyl”)当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指具有两个碳原子作为连接点的直链或支链、环、环状或非环状结构的非芳族二价基团，其具有至少一个碳-碳三键，且没有除碳和氢之外的原子，其中该亚炔基连接两个σ键。基团-C≡C-、-C≡CCH2-和-C≡CCH(CH3)-是亚炔基的非限定性实例。术语“取代亚炔基”指具有两个碳原子作为连接点的直链或支链、环、环状或非环状结构的非芳族二价基团，其具有至少一个非芳族碳-碳三键，且至少一个原子独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S，其中该亚炔基连接两个σ键。基团-C≡CCFH-和-C≡CHCH(Cl)-是取代亚炔基的非限定性实例。
术语“芳基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指具有芳族碳原子作为连接点的一价基团，所述碳原子形成其中环原子都是碳的六元芳香环结构的一部分，并且其中所述一价基团不含除碳和氢之外的原子。芳基的非限定性实例包括：苯基(Ph)、甲基苯基、(二甲基)苯基、-C6H4CH2CH3(乙基苯基)、-C6H4CH2CH2CH3(丙基苯基)、-C6H4CH(CH3)2、-C6H4CH(CH2)2、-C6H3(CH3)CH2CH3(甲基乙基苯基)、-C6H4CH＝CH2(乙烯基苯基)、-C6H4CH＝CHCH3、-C6H4C≡CH、-C6H4C≡CCH3、萘基和衍生自联苯基的一价基团。术语“取代芳基”指具有芳族碳原子作为连接点的一价基团，所述碳原子形成其中环原子都是碳的六元芳香环结构的一部分，并且其中所述一价基团进一步具有至少一个独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S的原子。取代芳基的非限定性实例包括如下基团：-C6H4F、-C6H4Cl、-C6H4Br、-C6H4I、-C6H4OH、-C6H4OCH3、-C6H4OCH2CH3、-C6H4OC(O)CH3、-C6H4NH2、-C6H4NHCH3、-C6H4N(CH3)2、-C6H4CH2OH、-C6H4CH2OC(O)CH3、-C6H4CH2NH2、-C6H4CF3、-C6H4CN、-C6H4CHO、-C6H4CHO、-C6H4C(O)CH3、-C6H4C(O)C6H5、-C6H4CO2H、-C6H4CO2CH3、-C6H4CONH2、-C6H4CONHCH3和-C6H4CON(CH3)2。
术语“亚芳基”(“arenediyl”)当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指具有两个芳族碳原子作为连接点的二价基团，其中所述亚芳基连接两个σ键，所述碳原子形成其中环原子都是碳的六元芳香环结构的一部分，并且其中所述一价基团不含除碳和氢之外的原子。亚芳基的非限定性实例包括：
术语“取代亚芳基”指具有两个芳族碳原子作为连接点的二价基团，其中所述亚芳基连接两个σ键，所述碳原子形成其中环原子都是碳的六元芳香环结构的一部分，并且其中所述二价基团进一步具有至少一个独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S的原子。
术语“芳烷基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指一价基团-亚烷基-芳基，其中所述术语亚烷基和芳基各自以与上述提供的定义一致的方式使用。芳烷基的非限定性实例为：苯甲基(苄基，Bn)、1-苯基-乙基、2-苯基-乙基、茚基和2，3-二氢茚基，前提是茚基和2，3-二氢茚基只不过是在每种情况下连接点都是饱和碳原子之一的芳烷基的实例。当术语“芳烷基”与“取代(的)”修饰词一起使用时，亚烷基和芳基中一个或两个是被取代的。取代芳烷基的非限定性实例为：(3-氯苯基)-甲基、2-氧代-2-苯基-乙基(苯基羰基甲基)、2-氯-2-苯基乙基、色满基(其中连接点是饱和碳原子之一)、和四氢喹啉基(其中连接点是饱和碳原子之一)。
术语“杂芳基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指具有芳族碳原子或氮原子作为连接点的一价基团，所述碳原子或氮原子形成其中至少一个环原子是氮、氧或硫的芳环结构的一部分，并且其中所述一价基团不含除碳、氢、芳族氮、芳族氧和芳族硫之外的原子。芳基的非限定性实例包括吖啶基、呋喃基、咪唑并咪唑基、咪唑并吡唑基、咪唑并吡啶基、咪唑并嘧啶基、吲哚基、吲唑啉基、甲基吡啶基、噁唑基、苯基咪唑基、吡啶基、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、四氢喹啉基、噻吩基、三嗪基、吡咯并吡啶基、吡咯并嘧啶基、吡咯并吡嗪基、吡咯并三嗪基、吡咯并咪唑基、苯并吡喃基(其中连接点为芳族原子之一)和色满基(其中连接点为芳族原子之一)。术语“取代杂芳基”指具有芳族碳原子或氮原子作为连接点的一价基团，所述碳原子或氮原子形成其中至少一个环原子是氮、氧或硫的芳香环结构的一部分，并且其中所述一价基团具有至少一个独立地选自非芳族氮、非芳族氧、非芳族硫、F、Cl、Br、I、Si和P的原子。
术语“杂亚芳基(heteroarenediyl)”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指具有芳族碳原子或氮原子作为连接点的二价基团，其中所述碳原子形成其中环碳原子都是碳的一个或多个六元芳香环结构的一部分，并且其中所述一价基团不含除碳和氢之外的原子，其中所述杂亚芳基连接两个σ键。杂亚芳基的非限定性实例包括：
Figure BPA00001307415300431
术语“取代杂亚芳基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指具有两个芳族碳原子作为连接点的二价基团，其中该杂亚芳基连接两个σ键，所述碳原子形成其中环原子都是碳的六元芳香环结构的一部分，并且其中所述二价基团进一步具有至少一个独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S的原子。
术语“杂芳烷基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指一价基团-亚烷基-杂芳基，其中术语亚烷基和杂芳基各自以与上述提供的定义一致的方式使用。芳烷基的非限定性实例为吡啶基甲基和噻吩基甲基。当术语“杂芳烷基”与“取代(的)”修饰词使用时，亚烷基和杂芳基中一个或两个是被取代的。
术语“酰基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指具有羰基碳原子作为连接点的一价基团，其进一步具有直链或支链、环、环状或非环状结构(除了羰基氧原子之外，不具有另外(不是碳或氢)的原子)。基团-CHO、-C(O)CH3(乙酰基、Ac)、-C(O)CH2CH3、-C(O)CH2CH2CH3、-C(O)CH(CH3)2、-C(O)CH(CH2)2、-C(O)C6H5、-C(O)C6H4CH3、-C(O)C6H4CH2CH3、-COC6H3(CH3)2和-C(O)CH2C6H5为酰基的非限定性实例。因此，术语“酰基”包括但不限于有时候被称为“烷基羰基”和“芳基羰基”的基团。术语“取代酰基”指具有羰基碳原子作为连接点的一价基团，其进一步具有直链或支链、环、环状或非环状结构，进一步具有除羰基氧原子之外的至少一个独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S的原子。基团-C(O)CH2CF3、-CO2H(羧基)、-CO2CH3(甲基羧基)、-CO2CH2CH3、-CO2CH2CH2CH3、-CO2C6H5、-CO2CH(CH3)2、-CO2CH(CH2)2、-C(O)NH2(氨基甲酰基)、-C(O)NHCH3、-C(O)NHCH2CH3、-CONHCH(CH3)2、-CONHCH(CH2)2、-CON(CH3)2、-CONHCH2CF3、-CO-吡啶基、-CO-咪唑酰基和-C(O)N3是取代酰基的非限定性实例。术语“取代酰基”包括但不限于“杂芳基羰基”基团。
术语“烷叉基”(“alkylidene”)当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指二价基团＝CRR’，其中所述烷叉基连接一个σ键和一个π键，其中R和R’独立地为氢、烷基，或者R和R’一起代表亚烷基。烷叉基的非限定性实例包括：＝CH2、＝CH(CH2CH3)和＝C(CH3)2。术语“取代烷叉基”指基团＝CRR’，其中所述烷叉基连接一个σ键和一个π键，其中R和R’独立地为氢、烷基、取代烷基，或者R和R’一起代表取代亚烷基，条件是R和R’之一是取代烷基或者R和R’一起代表取代亚烷基。
术语“烷氧基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指基团-OR，其中R为如上所定义的术语烷基。烷氧基的非限定性实例包括：-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3、-OCH(CH3)2、-OCH(CH2)2、-O-环戊基和-O-环己基。术语“取代烷氧基”指基团-OR，其中R为如上所定义的术语取代烷基。例如，-OCH2CF3为取代烷氧基。
类似地，术语“烯氧基”、“炔氧基”、“芳氧基”、“芳烷氧基”、“杂芳氧基”、“杂芳烷氧基”和“酰氧基”，当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指定义为-OR的基团，其中R为烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和酰基，分别为如上述定义的那些术语。当术语烯氧基、炔氧基、芳氧基、芳烷氧基和酰氧基中任一个被“取代(的)”修饰时，其指基团-OR，其中R分别为取代的烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和酰基。
术语“烷基氨基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指基团-NHR，其中R为如上述定义的术语烷基。烷基氨基的非限定性实例包括：-NHCH3、-NHCH2CH3、-NHCH2CH2CH3、-NHCH(CH3)2、-NHCH(CH2)2、-NHCH2CH2CH2CH3、-NHCH(CH3)CH2CH3、-NHCH2CH(CH3)2、-NHC(CH3)3、-NH-环戊基和-NH-环己基。术语“取代烷基氨基”指基团-NHR，其中R为如上述定义的术语取代烷基。例如-NHCH2CF3为取代烷基氨基。
术语“二烷基氨基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指基团-NRR’，其中R和R’可以是相同或不同的烷基，或者R和R’可以一起代表具有两个或更多个饱和碳原子的亚烷基，其中所述饱和碳原子中的至少两个连接至氮原子。二烷基氨基的非限定性实例包括：-NHC(CH3)3、-N(CH3)CH2CH3、-N(CH2CH3)2、N-吡咯烷基和N-哌啶基。术语“取代二烷基氨基”指基团-NRR’，其中R和R’可以是相同或不同的取代烷基，R和R’中一个是烷基，另一个是取代烷基，或者R和R’可以一起代表具有两个或更多个饱和碳原子的亚烷基，其中所述饱和碳原子中的至少两个连接至所述氮原子。
术语“烷氧基氨基”、“烯基氨基”、“炔基氨基”、“芳基氨基”、“芳烷基氨基”、“杂芳基氨基”、“杂芳烷基氨基”和“烷基磺酰基氨基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指定义为-NHR的基团，其中R分别为如上定义的术语烷氧基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和烷基磺酰基。芳基氨基的一个非限定性实例为-NHC6H5。当术语烷氧基氨基、烯基氨基、炔基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、杂芳基氨基、杂芳烷基氨基和烷基磺酰基氨基中的任一个被“取代(的)”修饰时，其指基团-NHR，其中R分别为取代的烷氧基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和烷基磺酰基。
术语“酰氨基”(酰基氨基)当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指基团-NHR，其中R为如上述定义的术语烷基。酰基氨基的一个非限定性实例为-NHC(O)CH3。当术语酰氨基与“取代(的)”修饰词使用时，其指定义为-NHR的基团，其中R为如上述定义的术语取代酰基。基团-NHC(O)OCH3和-NHC(O)NHCH3是取代酰氨基的非限定性实例。
术语“烷基亚氨基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指基团＝NR，其中所述烷基亚氨基连接一个σ键和一个π键，其中R为如上定义的术语烷基。烷基亚氨基的非限定性实例包括：＝NCH3、＝NCH2CH3和＝N-环己基。术语“取代烷基亚氨基”指基团＝NR，其中所述烷基亚氨基连接一个σ键和一个π键，其中R为如上定义的术语取代烷基。例如，＝NCH2CF3是取代烷基亚氨基。
类似地，术语“烯基亚氨基”、“炔基亚氨基”、“芳基亚氨基”、“芳烷基亚氨基”、“杂芳基亚氨基”、“杂芳烷基亚氨基”和“酰基亚氨基”，当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指定义为＝NR的基团，其中所述烷基亚氨基连接一个σ键和一个π键，其中R分别为如上定义的术语烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和酰基。当术语烯基亚氨基、炔基亚氨基、芳基亚氨基、芳烷基亚氨基和酰基亚氨基中的任一个被“取代(的)”修饰时，其指基团＝NR，其中所述烷基亚氨基连接一个σ键和一个π键，其中R分别为取代的烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和酰基。
术语“氟代烷基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指如上定义的术语烷基，其中一个或多个氢已被氟取代。基团-CH2F、-CF3和-CH2CF3是氟代烷基的非限定性实例。术语“取代氟代烷基”指具有饱和碳原子作为连接点的直链或支链、环、环状或非环状结构的非芳族一价基团，其含有至少一个氟原子，无碳-碳双键或三键，且至少一个原子独立地选自N、O、Cl、Br、I、Si、P和S。下述基团是取代氟代烷基的非限定性实例：-CFHOH。
术语“烷基磷酸酯”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指基团-OP(O)(OH)(OR)，其中R为如上定义的术语烷基。烷基磷酸酯的非限定性实例包括：-OP(O)(OH)(OMe)和-OP(O)(OH)(OEt)。术语“取代烷基磷酸酯”指基团-OP(O)(OH)(OR)，其中R为如上定义的术语取代烷基。
术语“二烷基磷酸酯”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指基团-OP(O)(OR)(OR’)，其中R和R’可以是相同或不同的烷基，或者R和R’可以一起代表具有两个或更多个饱和碳原子的亚烷基，其中所述饱和碳原子中的至少两个碳原子通过所述氧原子连接至所述磷原子。二烷基磷酸酯基团的非限定性实例包括：-OP(O)(OMe)2、-OP(O)(OEt)(OMe)和-OP(O)(OEt)2。术语“取代二烷基磷酸酯”指基团-OP(O)(OR)(OR’)，其中R和R’可以是相同或不同的取代烷基，R或R’中一个是烷基，另一个是取代烷基，或者R和R’可以一起代表具有两个或多个饱和碳原子的亚烷基，其中所述饱和碳原子中的至少两个碳原子通过所述氧原子连接至所述磷。
术语“烷基硫基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指基团-SR，其中R为如上定义的术语烷基。烷基硫基的非限定性实例包括：-SCH3、-SCH2CH3、-SCH2CH2CH3、-SCH(CH3)2、-SCH(CH2)2、-S-环戊基和-S-环己基。术语“取代烷基硫基”指基团-SR，其中R为如上定义的术语取代烷基。例如，-SCH2CF3是取代烷基硫基。
类似地，术语“烯基硫基”、“炔基硫基”、“芳基硫基”、“芳烷基硫基”、“杂芳基硫基”、“杂芳烷基硫基”和“酰基硫基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指定义为-SR的基团，其中R分别为如上定义的术语烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和酰基。当术语烯基硫基、炔基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基、杂芳基硫基、杂芳烷基硫基和酰基硫基中的任一个被“取代(的)”修饰时，其指基团-SR，其中R分别为取代的烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基和酰基。
术语“硫酰基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指具有硫代羰基的碳原子作为连接点的一价基团，其进一步具有直链或支链、环、环状或非环状结构，并且除了羰基硫原子之外不具有除碳或氢以外的其它原子。基团-CHS、-C(S)CH3、-C(S)CH2CH3、-C(S)CH2CH2CH3、-C(S)CH(CH3)2、-C(S)CH(CH2)2、-C(S)C6H5、-C(S)C6H4CH3、-C(S)C6H4CH2CH3、-C(S)C6H3(CH3)2和-C(S)CH2C6H5是硫酰基的非限定性实例。因此，术语“硫酰基”包括但不限于有时候被称为“烷基硫代羰基”和“芳基硫代羰基”的基团。术语“取代硫酰基”指具有碳原子作为连接点的基团，其进一步具有直链或支链、环、环状或非环状结构，除了羰基硫原子之外进一步具有独立地选自N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S的至少一个原子的基团，所述作为连接点的碳原子作为硫代羰基的一部分。基团-C(S)CH2CF3、-C(S)O2H、-C(S)OCH3、-C(S)OCH2CH3、-C(S)OCH2CH2CH3、-C(S)OC6H5、-C(S)OCH(CH3)2、-C(S)OCH(CH2)2、-C(S)NH2、和-C(S)NHCH3是取代硫酰基的非限定性实例。术语“取代硫酰基”包括但不限于“杂芳基硫代羰基”基团。
术语“烷基磺酰基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指基团-S(O)2R，其中R为如上定义的术语烷基。烷基磺酰基的非限定性实例包括：-S(O)2CH3、-S(O)2CH2CH3、-S(O)2CH2CH2CH3、-S(O)2CH(CH3)2、-S(O)2CH(CH2)2、-S(O)2-环戊基和-S(O)2-环己基。术语“取代烷基磺酰基”指基团-S(O)2R，其中R为如上定义的术语取代烷基。例如，-S(O)2CH2CF3是取代烷基磺酰基。
类似地，术语“烯基磺酰基”、“炔基磺酰基”、“芳基磺酰基”、“芳烷基磺酰基”、“杂芳基磺酰基”和“杂芳烷基磺酰基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指定义为-S(O)2R的基团，其中R分别为如上定义的术语烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基。当术语烯基磺酰基、炔基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、杂芳基磺酰基和杂芳烷基磺酰基中的任一个被“取代(的)”修饰时，其指基团-S(O)2R，其中R分别为取代的烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基。
术语“烷基亚磺酰基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指基团-S(O)R，其中R为如上定义的术语烷基。烷基亚磺酰基的非限定性实例包括：-S(O)CH3、-S(O)CH2CH3、-S(O)CH2CH2CH3、-S(O)CH(CH3)2、-S(O)CH(CH2)2、-S(O)-环戊基和-S(O)-环己基。术语“取代烷基亚磺酰基”指基团-S(O)R，其中R为如上定义的术语取代烷基。例如，-S(O)CH2CF3为取代烷基亚磺酰基。
类似地，术语“烯基亚磺酰基”、“炔基亚磺酰基”、“芳基亚磺酰基”、“芳烷基亚磺酰基”、“杂芳基亚磺酰基”和“杂芳烷基亚磺酰基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指定义为-S(O)R的基团，其中R分别为如上定义的术语烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基。当术语烯基亚磺酰基、炔基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、芳烷基亚磺酰基、杂芳基亚磺酰基和杂芳烷基亚磺酰基中的任一个被“取代(的)”修饰时，其指基团-S(O)R，其中R分别为取代的烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基。
术语“烷基铵”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指定义为-NH2R+、-NHRR’+或-NRR’R”+的基团，其中R、R’和R”为相同或不同的烷基，或者R、R’和R”中两个的任意组合可一起代表亚烷基。烷基铵阳离子基团的非限定性实例包括：-NH2(CH3)+、-NH2(CH2CH3)+、-NH2(CH2CH2CH3)+、-NH(CH3)2 +、-NH(CH2CH3)2 +、-NH(CH2CH2CH3)2 +、-N(CH3)3 +、-N(CH3)(CH2CH3)2 +、-N(CH3)2(CH2CH3)+、-NH2C(CH3)3 +、-NH(环戊基)2 +和-NH2(环己基)+。术语“取代烷基铵”指-NH2R+、-NHRR’+或-NRR’R”+，其中R、R’和R”中至少一个是取代烷基，或者R、R’和R”中两个一起代表取代亚烷基。当R、R’和R”中多于一个是取代烷基时，它们可以相同或不同。R、R’和R”中任一个不是取代烷基或取代亚烷基时，其可以是烷基，可以相同或不同，或者可以一起代表具有两个或更多个碳原子的亚烷基，其中所述碳原子中的至少两个连接至氮原子，如下式所示。
术语“烷基硫鎓”(“alkyl sulfonium”)当在没有”取代(的)”修饰词下使用时，指基团-SRR’+，其中R和R’可以是相同或不同的烷基，或者R和R’可以一起代表亚烷基。烷基硫鎓基团的非限定性实例包括：-SH(CH3)+、-SH(CH2CH3)+、-SH(CH2CH2CH3)+、-S(CH3)2 +、-S(CH2CH3)2 +、-S(CH2CH2CH3)2 +、-SH(环戊基)+和-SH(环己基)+。术语“取代烷基硫鎓”指基团-SRR’+，其中R和R’可以是相同或不同的取代烷基，R或R’中一个是烷基，另一个是取代烷基，或者R和R’可以一起代表取代亚烷基。例如，-SH(CH2CF3)+是取代烷基硫鎓基团。
术语“烷基甲硅烷基”当在没有“取代(的)”修饰词下使用时，指定义为-SiH2R、-SiHRR’或-SiRR’R”的一价基团，其中R、R’和R”可以是相同或不同的烷基，或者R、R’和R”中任意两个的组合可以一起代表亚烷基。基团-SiH2CH3、-SiH(CH3)2、-Si(CH3)3和-Si(CH3)2C(CH3)3是未取代烷基甲硅烷基的非限定性实例。术语“取代烷基甲硅烷基”指-SiH2R、-SiHRR’或-SiRR’R”，其中R、R’和R”中至少一个是取代烷基，或者R、R’和R”中两个一起代表取代亚烷基。当R、R’和R”中多于一个是取代烷基时，它们可以相同或不同。R、R’和R”中任一个不是取代烷基或取代亚烷基时，其可以是烷基，可以相同或不同，或者可以一起代表具有两个或更多个饱和碳原子的亚烷基，其中所述碳原子中的至少两个连接至硅原子。
另外，构成本发明化合物的原子旨在包括该原子的同位素形式。本文中使用的同位素包括具有相同原子序数但不同质量数的那些原子。作为一般实例而不是限制，氢的同位素包括氚和氘，碳的同位素包括13C和14C。类似地，可以设想，本发明化合物的一个或多个碳原子可以被硅原子代替。此外，可以设想，本发明化合物的一个或多个氧原子可以被硫原子或硒原子代替。
具有由虚线键代表的式的化合物旨在包括任选地具有零个、一个或多个双键的通式。因此，例如，结构
Figure BPA00001307415300491
包括结构
Figure BPA00001307415300492
和
Figure BPA00001307415300493
本领域技术人员将理解，这些环原子中没有任何一个形成多于一个双键的一部分。
在本申请所示结构的原子上任何未明确的化合价均默认地代表键合至该原子的氢原子。
显示有未连接的“R”基团的环结构指环上的任何未言明的氢原子均可被R基团替代。在二价R基团(例如氧代、亚氨基、硫基(thio)、亚烷基等)的情况下，连接至该环的一个原子的任何未言明的氢原子对均可被R基团替代。这一概念举例说明如下：
Figure BPA00001307415300494
代表
Figure BPA00001307415300495
本文中使用的“手性助剂”指能够影响反应的立体选择性的可除去的手性基团。本领域技术人员熟悉这样的化合物，许多是市售可获得的。
本文中使用的“标记物”为可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法检测的任何组分或部分。可以应用于本发明的标记物包括放射性标记(例如32P、125I、14C、3H和35S)和荧光染料(例如，Cy3)。一个不是直接检测但是通过使用间接方法检测的标记物的实例是生物素。
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含(包括)”联合使用时，单数形式的表述也可包含复数形式的含义。
在整个本申请中，术语“约”是用于表示值包括用于确定该值的装置、方法的误差的固有差异，或存在于研究对象之间的差异。
术语“包含”、“具有”和“包括”为开放式含义。任何形式或时态的一个或多个这些动词，比如“包含”、“含有”、“具有”和“包括”都是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于只具有所述一个或多个步骤，还涵盖其它未列出的步骤。
如在说明书和/或权利要求书中使用的术语“有效的”指足以实现所期望的、预期的或意图的结果。
术语“水合物”当用作化合物的修饰词时指该化合物具有与每个化合物分子(例如该化合物的固体形式)缔合的少于一个(例如半水合物)、一个(例如一水合物)或多于一个(例如二水合物)水分子。
本文中使用的术语“IC50”指获得50％的最大响应的抑制剂量。
第一化合物的“异构体”是单独的化合物，其中每个分子包含与所述第一化合物相同的组成原子，但是其中那些原子的三维构型不同。
本文中使用的术语“患者”或“对象”指活的哺乳动物生物体，比如人、猴、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因种类。在某些实施方案中，所述患者或对象为灵长类。人类对象的非限定性实例为成年人、青少年、儿童和胎儿。
“可药用”指可用于制备药物组合物，其通常是安全、无毒的，其在生物学方面和其它方面均符合要求，包括用于兽医应用和人类药物应用的可接受的那些。
“可药用盐”指本发明的化合物的盐是如上定义的可药用的，并且具有期望的药理学活性。这样的盐包括与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸比如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或者与有机酸形成的酸加成盐，所述有机酸比如1，2-乙烷二磺酸、2-羟基乙磺酸、2-萘磺酸、3-苯基丙酸、4，4’-亚甲基二(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、4-甲基二环[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、乙酸、脂肪族单羧酸和二羧酸、脂肪族硫酸、芳族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、庚酸、己酸、羟萘甲酸、乳酸、月桂基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、邻-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对氯苯磺酸、苯基取代的链烷酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、叔丁基乙酸、三甲基乙酸等。可药用盐还包括碱加成盐，当存在的酸质子能够与无机碱或有机碱反应时可以形成碱加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡萄糖胺等。应当认识到，形成本发明的任一种盐的特定阴离子或阳离子均不是关键的，只要该盐在整体上是药理学上可接受的即可。可药用盐及其制备方法和应用的另外实例存在于Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，and Use(P.H.Stahl & C.G.Wermuth eds.，Verlag Helvetica Chimica Acta，2002)中。
本文中使用的“主要为一种对映异构体”指化合物包含至少约85％的一种对映异构体，或更优选地至少约90％的一种对映异构体，或者甚至更优选地至少约95％的一种对映异构体，或者最优选地至少约99％的一种对映异构体。类似地，短语“基本上不含其它光学异构体”指该组合物包含至多约15％的另一种对映异构体或非对映异构体，更优选地至多约10％的另一种对映异构体或非对映异构体，甚至更优选地至多约5％的另一种对映异构体或非对映异构体，最优选地至多约1％的另一种对映异构体或非对映异构体。
“预防”或“防止”包括：(1)抑制对象或患者中疾病的发生，该对象或患者可处于该疾病风险中和/或易患该疾病，但还没有经历或表现出该疾病的任何或全部的病变或症状；和/或(2)减缓对象或患者中疾病的病变或症状的发病，该对象或患者可处于该疾病风险中和/或易患该疾病，但还没有经历或表现出该疾病的任何或全部的病变或症状。
“前药”指可在体内经代谢转变成本发明抑制剂的化合物。前药本身可以具有或不具有针对给定靶蛋白的活性。例如，包含羟基的化合物可以作为酯施用，其在体内水解成羟基化合物。可以在体内转化成羟基化合物的合适的酯包括乙酸酯、柠檬酸酯、乳酸酯、磷酸酯、酒石酸酯、丙二酸酯、草酸酯、水杨酸酯、丙酸酯、丁二酸酯、富马酸酯、马来酸酯、亚甲基双-β-羟基萘甲酸酯、龙胆酸酯、羟乙基磺酸酯、二-对甲苯酰酒石酸酯、甲磺酸酯、乙磺酸酯、苯磺酸酯、对甲苯磺酸酯、环己基氨基磺酸酯、奎尼酸酯、氨基酸酯等。类似地，包含胺基的化合物可以作为酰胺施用，其在体内通过水解转化成胺化合物。
术语“饱和的”当涉及原子时指该原子仅仅通过单键连接至其它原子。
“立体异构体”或“光学异构体”是给定化合物的异构体，其中相同的原子键合至相同的其它原子上，但是其中这些原子的三维构型不同。“对映异构体”是给定化合物的立体异构体，其彼此成镜像，如同左手和右手。“非对映异构体”是给定化合物的不是对映异构体的立体异构体。
本发明包括立体化学还未确定的任何立体中心或手性轴，该立体中心或手性轴可以以R形式、S形式或者R和S形式的混合物存在，包括外消旋混合物和非外消旋混合物。
“在体内可转化成氢的取代基”指可通过酶学或化学方法转化成氢原子的任何基团，所述酶学或化学方法包括但不限于水解和氢解。实例包括可水解的基团，比如酰基、含有氧羰基的基团、氨基酸残基、肽残基、邻硝基苯基亚磺酰基、三甲基甲硅烷基、四氢吡喃基、二苯基氧膦基等。酰基的实例包括甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基等。含有氧代羰基的基团的实例包括乙氧羰基、叔丁氧羰基(-C(O)OC(CH3)3)、苄氧羰基、对甲氧基苄氧羰基、乙烯基氧羰基、β-(对甲苯磺酰基)乙氧羰基等。合适的氨基酸残基包括但不限于Gly(甘氨酸)、Ala(丙氨酸)、Arg(精氨酸)、Asn(天冬酰胺)、Asp(天冬氨酸)、Cys(半胱氨酸)、Glu(谷氨酸)、His(组氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Lys(赖氨酸)、Met(蛋氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Ser(丝氨酸)、Thr(苏氨酸)、Trp(色氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Nva(正缬氨酸)、Hse(高丝氨酸)、4-Hyp(4-羟基脯氨酸)、5-Hyl(5-羟基赖氨酸)、Orn(鸟氨酸)和β-Ala的残基。合适的氨基酸残基的实例还包括被保护基保护的氨基酸残基。合适的保护基的实例包括通常应用于肽合成的那些，包括酰基(如甲酰基和乙酰基)、芳基甲氧羰基(比如苄氧羰基和对硝基苄氧羰基)、叔丁氧羰基(-C(O)OC(CH3)3)等。合适的肽残基包括含有两个至五个任选地氨基酸残基的肽残基。这些氨基酸或肽的残基可以以D型、L型或其混合物的立体化学构型存在。另外，所述氨基酸或肽残基可以具有不对称碳原子。具有不对称碳原子的合适的氨基酸残基的实例包括Ala、Leu、Phe、Trp、Nva、Val、Met、Ser、Lys、Thr和Tyr的残基。具有不对称碳原子的肽残基包括具有一个或多个具有不对称碳原子的组成型氨基酸残基的肽残余物。合适的氨基酸保护基的实例包括通常应用于肽合成的那些，包括酰基(如甲酰基和乙酰基)、芳基甲氧羰基(比如苄氧羰基和对硝基苄氧羰基)、叔丁氧羰基(-C(O)OC(CH3)3)等。“在体内可转化成氢”的取代基的其它实例包括可通过还原除去的可氢解基团。合适的可还原除去的可氢解基团的实例包括但不限于芳基磺酰基(如邻甲苯磺酰基)；苯基或苄氧基取代的甲基(如苄基、三苯甲基和苄氧甲基)；芳基甲氧羰基(比如苄氧羰基和邻甲氧基苄氧羰基)；和卤代乙氧羰基(如β，β，β-三氯乙氧羰基和β-碘代乙氧羰基)。
“治疗有效量”或“药用有效量”指当向对象或患者施用以治疗疾病时足以产生对该疾病的治疗作用的量。
在本申请全文中使用的术语“治疗益处”或“治疗有效的”指对于病症的医学治疗而言，促进或增强对象的健康状况的任何事情。这包括但不限于疾病的征兆或症状的发生、频率、持续时间或严重程度的减少或降低。例如，本发明的化合物(即Wnt蛋白信号转导抑制剂)的治疗有效量可以是足以治疗或预防骨硬化症的量。
术语“抑制”或“减少”或这些术语的任何变化形式，当在权利要求书和/或说明书中使用时，包括为了获得期望的结果的任何可测量的减少或完全抑制。例如，与正常相比，活性可以减少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多，或者任何可得自其中的范围。在另一个实例中，在施用Wnt蛋白信号转导抑制剂之后，癌症患者可发生肿瘤尺寸减小。
“治疗”包括：(1)抑制对象或患者中的疾病，该对象或患者正在经受或表现出所述疾病的病变或症状(例如，阻止所述病变和/或症状的进一步发展)；(2)改善对象或患者的疾病，该对象或患者正在经受或表现出所述疾病的病变或症状(例如，逆转所述病变和/或症状)，和/或(3)使对象或患者的疾病产生任何可测量的减少，该对象或患者正在经受或表现出所述疾病的病变或症状。
术语“接触”和“暴露”当应用于细胞时，在本文中用于描述将本发明的化合物施用或递送至靶细胞或使其直接接触靶细胞的过程。术语“施用”和“递送”与“接触”和“暴露”可互换地使用。
本文中使用的术语“水溶性的”指化合物溶于水中的程度至少为0.010mole/升，或者根据现有文献归类为可溶性的。
本文中使用的其它缩写如下：DMSO，二甲亚砜；NO，一氧化氮；iNOS，可诱导的一氧化氮合酶；COX-2，环氧合酶-2；NGF，神经生长因子；IBMX，异丁甲基黄嘌呤；FBS，胎牛血清；GPDH，3-磷酸甘油酯脱氢酶；RXR，类视黄醇X受体；TGF-β，转化生长因子-β；IFNγ或IFN-γ，干扰素-γ；LPS，细菌性内毒素脂多糖；TNFα或TNF-α，肿瘤坏死因子α；IL-1β，白细胞介素-1β；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；MTT，3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑；TCA，三氯乙酸；HO-1，可诱导的血红素加氧酶。
可以预计，在本说明书全文中公开的化合物、试剂和活性成分的修饰或衍生物都可用于本发明的方法和组合物。衍生物可以由本领域技术人员已知的任何方法(如本文描述的方法)制备，并且这些衍生物的性质也可以由本领域技术人员已知的任何方法测定其期望的性质。
在某些方面，“衍生物”指化学修饰的化合物，其仍然保持在进行化学修饰之前所述化合物的作用。因此，“Wnt蛋白信号转导抑制剂衍生物”指仍然保持在其化学修饰之前的母体Wnt蛋白信号转导抑制剂的所期望作用的化学修饰的Wnt蛋白信号转导抑制剂。这样的作用相对于母体Wnt蛋白信号转导抑制剂可以是增强(例如，稍微更有效、两倍有效等)或减弱(例如，效力稍微减小、效力减小至二分之一等)，但是仍然可以认为是Wnt蛋白信号转导抑制剂衍生物。这样的衍生物可以添加、除去或替换母体分子上的一个或多个化学部分。可以对本文公开的化合物和结构进行修饰类型的非限定性实例包括添加或除去低级未取代烷基，例如甲基、乙基、丙基或取代低级烷基如羟甲基或氨基甲基；羧基和羰基；羟基；硝基、氨基、酰胺、酰亚胺和偶氮基；硫酸酯、磺酸酯、亚磺酸酯基(sulfono)、巯基、亚磺酰基、磺酰基、sulfoxido、磺酰胺、磷酸酯、膦酰基、磷酰基和卤化物取代基。另外的修饰可以包括添加或除去原子结构中的一个或多个原子，例如，用丙基替换乙基，或者用较大或较小的芳香基替换苯基。或者，在环状或双环结构中，杂原子如N、S或O可以替代结构中的碳原子。
本文还包括本发明化合物的前药和溶剂化物。本文中使用的术语“前药”应理解为这样的化合物：当向对象如哺乳动物施用时，其通过代谢或化学过程发生化学转化而得到本文任一个通式的化合物或其盐和/或溶剂化物。本发明化合物的溶剂化物优选为水合物。
本文中使用的“保护基”指与官能团相连用于防止该官能团的不需要的反应的部分。术语“官能团”通常指本领域技术人员对化学反应基团进行分类的方法。官能团的实例包括羟基、胺、巯基、酰胺、羧基、羰基等。保护基是本领域技术人员所熟知的。非限定性的示例性保护基分为如下类别，例如羟基保护基、氨基保护基、巯基保护基和羰基保护基。这些保护基可见于Greene和Wuts，1999中，其全部内容通过引用并入本文。本文描述的Wnt蛋白信号转导抑制剂还包括被一个或多个保护基保护-即，所述抑制剂预计以其“受保护形式”存在。
本发明化合物可以包含一个或多个不对称中心，因此，可以作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、非对映体混合物和单独的非对映异构体而存在。在某些实施方案中，存在单一的非对映异构体。预计本发明化合物的所有可能立体异构体都在本发明的范围之内。然而，在某些方面，包括特定的非对映异构体。本发明化合物的手性中心可以具有S-或R-构型，如IUPAC 1974 Recommendations所定义的。在某些方面，本发明的某些化合物可以在特定碳中心包含S-或R-构型。
可用于制备本发明的某些化合物的合成技术提供在实施例部分中。制备本发明化合物以及衍生物的其它合成技术是本领域技术人员熟知的。例如，Smith和March，2001讨论了多种合成转化、反应条件以及与其相关的可能缺陷。其中所讨论的方法可适于由市售的起始原料制备本发明化合物。
用于制备本发明化合物的溶剂选择将是本领域普通技术人员已知的。溶剂选择可以取决于例如哪一种会促进所有的试剂溶解，或例如哪一种可最好地促进所期望的反应(特别是当反应机制已知时)。溶剂可以包括例如极性溶剂和非极性溶剂。溶剂的选择包括但不限于四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二噁烷、甲醇、乙醇、己烷、二氯甲烷和乙腈。对于任何特定的反应或纯化步骤来说，可以选择多于一种溶剂。还可以将水混合到任何选择的溶剂中。进一步地，水(如蒸馏水)可构成代替溶剂的反应介质。
本领域普通技术人员将熟悉纯化本发明化合物的方法。本领域普通技术人员将理解，本发明化合物通常可以按任何步骤纯化，包括中间体的纯化以及最终产品的纯化。在优选的实施方案中，通过硅胶柱色谱或HPLC进行纯化。
根据上述定义，本领域技术人员可以容易地理解在整个申请中使用的其它化学术语。术语可以单独使用或以其任意组合使用。
上述定义替代通过引用而并入本文的任何参考文献中的任何相矛盾的定义。然而，对某些术语进行定义这一事实不应当被认为是表示未定义的任何术语就是不确定的。相反，相信使用的所有术语都明确描述本发明，使得普通技术人员可以理解本发明的范围和实施。
V.药物制剂和施用途径
本发明的药物组合物包含在可药用载体中溶解或分散的有效量的一种或多种候选物质(例如Wnt蛋白信号转导抑制剂)或者其它药剂。短语“可药用的或药理学上可用的”指当向动物(如人，视情况而定)施用时不产生不利的、过敏性的或其它不想要的反应的分子实体和组合物。根据本发明公开内容，包含至少一种候选物质或其它活性成分的药物组合物的制备对于本领域技术人员是已知的，如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990中所举例说明的，其通过引用并入本文。此外，对于动物(例如人)施用而言，应当理解，制剂应当满足FDA生物标准办公室(FDA Office of Biological Standards)所规定的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
本文中使用的“可药用载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、这样的类似物质及其组合，其为本领域普通技术人员已知的(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，pp 1289-1329，1990)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则其在治疗或药物组合物中的应用均考虑在内。
所述候选物质可以包含不同类型的载体，这取决于它是以固体、液体还是气雾剂形式施用，以及这样的施用途径(如注射)是否需要是无菌的。本发明化合物可以以如下方式施用：口服施用、脂肪内施用、动脉内施用、关节内施用、颅内施用、皮内施用、病变内施用、肌内施用、鼻内施用、眼内施用、心包内施用、腹膜内施用、胸膜内施用、前列腺内施用、直肠内施用、鞘内施用、气管内施用、瘤内施用、脐带内施用、阴道内施用、静脉内施用、囊泡内(intravesicularlly)施用、玻璃体内施用、脂质体内施用、局部施用、粘膜施用、口服施用、肠胃外施用、直肠施用、结膜下施用、皮下施用、舌下施用、表面施用(topically)、经口腔施用、透皮施用、阴道施用、在乳剂中施用、在脂质组合物中施用、通过导管施用、通过灌洗施用、通过连续输注施用、通过输注施用、通过吸入施用、通过注射施用、通过局部递送施用、通过局部灌注施用、通过浸浴靶细胞而直接施用、或通过其它方法或本领域普通技术人员已知的前述方法的任何组合施用(参见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，1990)。在特定的实施方案中，所述组合物可以配制成用于口服递送。还可以预见到包含本发明化合物的药物组合物，这样的组合物可以适于通过本领域技术人员已知的任何方法(如上述方法)施用。
在特定的实施方案中，使用药物递送装置将所述组合物施用给对象。考虑使用任何药物递送装置来递送药用有效量的Wnt蛋白信号转导抑制剂。
施用给动物患者的本发明组合物的实际剂量可以由身体和生理因素来确定，所述身体和生理因素例如体重、病症的严重性、所治疗疾病的类型、以前或同时进行的治疗干预、患者的特发病和施用途径。负责施用的从业医生通常会确定组合物中活性成分的浓度和用于个体对象的合适剂量。
所述剂量可以由本领域普通技术人员根据需要决定重复施用。因此，在本文所述方法的某些实施方案中，包括单剂量。在另一些实施方案中，包括两个或更多个剂量。当向对象施用超过一个剂量时，剂量施用间的时间间隔可以是任何时间间隔，其由本领域普通技术人员确定。例如，剂量施用间的时间间隔可以是约1小时至约2小时、约2小时至约6小时、约6小时至约10小时、约10小时至约24小时、约1天至约2天、约1周至约2周或更长时间，或可得自这些列举的范围的任何时间间隔。
在某些实施方案中，期望向患者提供药物组合物的连续供给。例如，这可通过插管并且然后连续施用治疗剂来实现。所述施用可以在手术中或手术后。
在某些实施方案中，药物组合物可以包含例如至少约0.1％的Wnt蛋白信号转导抑制剂。在另一些实施方案中，所述Wnt蛋白信号转导抑制剂可以包含约2％至约75％重量的单位，或者约25％至约60％之间，及可得自其中的任何范围。在另一些非限定性实例中，每次施用的剂量还可以包含约1微克/kg/体重，约5微克/kg/体重，约10微克/kg/体重，约50微克/kg/体重，约100微克/kg/体重，约200微克/kg/体重，约350微克/kg/体重，约500微克/kg/体重，约1毫克/kg/体重，约5毫克/kg/体重，约10毫克/kg/体重，约50毫克/kg/体重，约100毫克/kg/体重，约200毫克/kg/体重，约350毫克/kg/体重，约500毫克/kg/体重，至约1000mg/kg/体重或更多，以及可得自其中的任何范围。在本文所列数值的可衍生范围的非限定性实例中，基于上述数值，可以施用约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重，约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等。
在任何情况下，组合物可以包含各种抗氧化剂，以延迟一种或多种组分的氧化。另外，可以使用防腐剂预防微生物作用，所述防腐剂例如抗菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。
所述Wnt蛋白信号转导抑制剂可以以游离碱、中性或盐形式配制成组合物如药物组合物。可药用盐如本文中所述。
在其中组合物是液体形式的实施方案中，载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、脂质(例如甘油三酯、植物油、脂质体)及其组合。可以通过例如以下的方法来维持合适的流动性：使用包衣(如卵磷脂)；通过分散在载体(如液体多元醇或脂质)中来维持所需要的粒径；使用表面活性剂(如羟丙基纤维素)；或者这些方法的组合。优选包括等渗剂，例如糖、氯化钠或其组合。
在另一些实施方案中，可以在本发明中使用滴眼剂、鼻溶液或喷雾剂、气雾剂或吸入剂。这些组合物通常设计成与靶组织类型相容。在一个非限定性实例中，鼻溶液通常为设计成以滴液或喷雾剂向鼻道施用的水溶液。将鼻溶液制备成在许多方面与鼻分泌物相类似，从而维持正常的纤毛作用。因此，在某些实施方案中，水性鼻溶液通常是等渗的，或者轻微被缓冲处理以维持pH为约5.5至约6.5。另外，如果需要，可以将抗微生物防腐剂(类似于在眼科制剂、药物中使用的那些)或合适的药物稳定剂包含在制剂中。例如，多种市售的鼻制剂是已知的，其包含药物如抗生素或抗组胺药。
在某些实施方案中，将候选物质制备用于通过口服摄入的途径施用。在这些实施方案中，固体组合物可以包括例如溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂(例如硬或软壳明胶胶囊)、持续释放制剂、口含组合物、糖锭剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂(wafer)或其组合。可将口服组合物直接掺入到饮食食物中。在某些实施方案中，用于口服施用的载体包括惰性稀释剂(例如葡萄糖、乳糖或甘露醇)、可吸收的可食用载体或其组合。在本发明的另一些方面，所述口服组合物可以配制成糖浆剂或酏剂。糖浆剂或酏剂可以包括例如至少一种活性剂、甜味剂、防腐剂、调味剂、染料、防腐剂或其组合。
在某些优选实施方案中，口服组合物可以包含一种或多种粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、调味剂或其组合。在某些实施方案中，组合物可以包含下述一种或多种：粘合剂，例如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸或其组合；润滑剂，例如硬脂酸镁；甜味剂，例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；调味剂，例如薄荷、冬青油、樱桃香料、橙子香料等；或前述的组合。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的物质之外，其还可包含载体，如液体载体。多种其它物质可以作为包衣或以其它方式修饰所述剂量单位的物理形式。例如，可以用虫胶、糖或二者将片剂、丸剂或胶囊包衣。
无菌可注射溶液可以通过将所需量的本发明化合物根据需要掺入含有多种上述其它成分的适当溶剂中并且然后进行过滤灭菌来制备。通常，分散体是通过将各种灭菌活性成分掺入到包含基础分散介质和/或其它成分的无菌介质中来制备。在用于制备无菌可注射溶液、混悬剂或乳剂的无菌粉末的情况下，某些制备方法可以包括真空干燥或冷冻干燥技术，它们产生活性成分和来自先前无菌过滤的液体介质的任何其它期望成分的粉末。如有必要，应当将液体介质进行适当缓冲处理，并且在与足够的盐水或葡萄糖注射之前，首先使液体稀释剂(例如水)等渗。还包括用于直接注射的高浓缩组合物的配制，其中可预见到使用DMSO作为溶剂会导致极快速的渗透，将高浓度的活性试剂递送到小区域。
组合物应当在生产和贮存条件下是稳定的，并贮存防止微生物如细菌和真菌的污染作用。应当理解，应当使内毒素污染保持在最小程度(在安全水平上)，例如，低于0.5ng/mg蛋白质。
在特定的实施方案中，可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或其组合)来实现可注射组合物的延长吸收。
VI.组合治疗
为了增强或增加本发明的Wnt蛋白信号转导抑制剂的有效性，所述抑制剂可以与另外的治疗剂组合，所述另外的治疗剂为例如抗击和/或预防癌症、骨硬化症、退行性疾病或II型糖尿病的另外的药剂。例如，本发明的Wnt蛋白信号转导抑制剂可以以组合量与有效量的已知减小肿瘤尺寸的另外的药剂一起提供。
本发明的组合治疗可考虑在体外或体内使用。这些方法可以包括同时施用所述药剂，或者在一段时间内施用所述药剂，其中所述物质的单独施用产生所期望的治疗益处。这可以通过使包含两种或更多种药剂的单一组合物或药理学制剂接触细胞、组织或生物体，或者通过使两种或更多种分开的组合物或制剂(其中一种组合物包含一种药剂，另一种包含另外的药剂)接触细胞来实现。
本发明的化合物可以在施用其它试剂之前、与其同时和/或在其之后施用，时间间隔为从数分钟至数周。在其中将所述药剂单独施用于细胞、组织或生物体的实施方案中，通常应当保证在每次递送的时间之间没有超出显著的时间段，从而所述药剂仍然能对所述细胞、组织或生物体发挥有利的联合作用。例如，在这样的情况下，可以使所述细胞、组织或生物体与作为候选物质的两种、三种、四种或更多种治疗手段(modality)基本上同时(即，在少于约一分钟内)接触。在另一些方面中，一种或多种药剂可以在施用所述候选物质之前和/或之后的约1分钟、约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约22小时、约23小时、约24小时、约25小时、约26小时、约27小时、约28小时、约29小时、约30小时、约31小时、约32小时、约33小时、约34小时、约35小时、约36小时、约37小时、约38小时、约39小时、约40小时、约41小时、约42小时、约43小时、约44小时、约45小时、约46小时、约47小时、约48小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周或约8周或更长时间、或者可得自其中的任何范围内施用。
可以采用药剂的各种组合方案。这样的组合的非限定性实例显示如下，其中Wnt蛋白信号转导抑制剂为“A”，第二试剂如抗癌剂为“B”：
A/B/A    B/A/B    B/B/A    A/A/B    A/B/B    B/A/A   A/B/B/B  B/A/B/B
B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A
B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A
A.抗癌治疗
抗癌剂可以用于与本发明的Wnt蛋白信号转导抑制剂组合治疗。本文中使用的“抗癌”剂能够对对象的癌症造成不利影响，例如，通过杀死一种或多种癌细胞、诱导一种或多种癌细胞的细胞凋亡、减少一种或多种癌细胞的生长速率、减少转移的发生率或数量、减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少向肿瘤或者一种或多种癌细胞的血液供应、促进抗一种或多种癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症的发展，或增加患有癌症对象的寿命。抗癌剂是本领域熟知的，包括例如化疗剂(化疗)、放疗剂(放疗)、外科手术、免疫治疗剂(免疫治疗)、基因治疗剂(基因治疗)、呼肠孤病毒(reoviral)治疗、激素治疗、其它生物剂(生物治疗)，和/或其它治疗剂。
B.骨硬化症的治疗
骨硬化症，也称为大理石状骨病和阿耳伯斯-尚堡氏病，是一种非常罕见的遗传病症，与更常见的其中骨骼软化的骨软化症不同，骨硬化症的骨骼硬化，密度增高。可以将骨髓移植治疗与本发明的Wnt蛋白信号转导抑制剂联合施用来治疗或预防骨硬化症。可以与本文所述的Wnt蛋白信号转导抑制剂联合的针对骨硬化症的其它治疗包括在下述文件中公开的那些，其每篇均通过引用并入本文：美国专利7,241,732；7,186,683；6,943,151；6,833,354；6,699,873；6,686,148；5,806,529；5,777,193；RE35,694；5,641,747和4,843,063。
C.退行性疾病的治疗
如本文所述，可以使用本发明的Wnt蛋白信号转导抑制剂治疗退行性疾病。因此，针对退行性疾病的其它治疗可以与施用Wnt蛋白信号转导抑制剂联合。退行性疾病的非限定性实例包括II型糖尿病和年龄相关性的组织修复受损。
1.II型糖尿病的治疗
II型糖尿病是一种慢性进行性疾病，其还没有明确地建立治愈方法。其是一种主要以胰岛素抵抗、胰岛素相对不足和高血糖症为特征的代谢紊乱。可以与Wnt蛋白信号转导抑制剂施用相组合的治疗包括锻炼、饮食控制以控制葡萄糖的摄入、和使用抗糖尿病药物(例如二甲双胍、苯乙双胍、瑞格列奈、那格列奈、罗格列酮、吡格列酮或米格列醇)。
2.年龄相关性的组织修复受损的治疗
多种组织随着个体衰老而退化，比如骨骼肌和器官组织(例如心、肾、肺和肝)。Wnt蛋白信号转导抑制参与例如肌肉再生(Brack等，2007)。与年龄相关性的组织修复受损相关的治疗可以与施用Wnt蛋白信号转导抑制剂相组合，包括例如基因治疗(比如由Barton-Davis等所描述的(1998；其通过引用并入本文))和Lynch描述的药物(2004；其通过引用并入本文)。
VII.实施例
包括下述实施例用于展示本发明的某些优选实施方案。本领域技术人员应当理解，在下面实施例中公开的技术代表由本发明人发现的会很好实施本发明的技术，因此可以视为构成其实施的优选方式。然而，本领域技术人员在参考本说明书的公开内容后应当理解，可以对公开的具体实施方案作出许多改变但仍获得相似或类似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
实施例1：
材料和方法
细胞系、构建物、抗体和siRNA.L-Wnt-STF细胞是通过用SuperTopFlash(STF；R.Moon提供)和SV-40 Renilla萤光素酶质粒转染L-Wnt细胞(ATCC)并选择对G418和Zeocin有抗性的克隆而产生的。用于表达Shh和Wnt3A的构建物由P.Beachy提供，R.Kopan。用于表达Notch细胞内结构域(NICD)的构建物由Notch提供。Notch报告子构建物由J.LaBorda提供，Wnt 1和Wnt 2表达构建物购自OpenBiosystems(其为MGC Clone collection的一部分)。Wnt-GL表达构建物是通过利用经改造的XbaI位点将Wnt3A编码序列连接到GL(缺少信号序列；AA15-185)而产生的。CMV-GL是通过将CMV启动子插入到pGluc-Basic载体(New England Biolabs)中而产生的。mPorc-myc、hAxin2-myc和hAxinΔDIX的表达构建物是使用基于PCR的克隆和诱变策略而改造的。使用下述一抗用于检测：β-联蛋白、Kif3A、肌动蛋白和β-微管蛋白(所有均购自Sigma)；磷酸化的LRP6、Dvl2和Axin2(来自Cell Signalling Technology)；E-钙粘蛋白(BD Transduction Laboratories)；APC(Santa Cruz Biotechnology)；和GSK3β(Stressgen)。在RNAi实验中使用的预设计的siRNA试剂库(每个基因四种siRNA)购自Qiagen(GSK3β、CK1α、PP1、PP2CA、PP2CB、KAP、WTX、ASEF、DLG1)或Dharmacon(APC、Axin2)。
生物化学研究在48小时的测定期内，用IWR(10μM)或IWP(5μM)化合物和/或环己酰亚胺(100μM)以48孔或6孔形式进行了涉及L-Wnt-STF或DLD-1细胞的生物化学研究。通过用SMARTPool APC siRNA(50nM；Dharmacon)转染细胞而实现在L-细胞中利用RNAi靶向APC。在4℃下，使用在PBS/1％NP-40/蛋白酶抑制剂中裂解的DLD-1细胞进行E-钙粘蛋白消耗研究。对于Wnt3A相分离测定而言，使用Effectene转染试剂(QIAGEN)根据需要将小鼠Porcupine(C同工型)和人Wnt3A-myc转染到HEK 293细胞(6孔形式，400K细胞/孔)中。在孵育48小时之后，在室温下，用PL缓冲剂(蒸馏水，10mM tris-HCl，150mMNaCl)/1％TritionX-114裂解细胞15分钟。将溶胞产物在冰上稍冷却，在4℃沉淀10分钟，将上清液与等体积的PL缓冲液/3.5％TX-114混合。将溶液在4℃下离心15分钟，在37℃下放置5分钟，接着在室温下以2000g再离心5分钟。收集分离的相，并与PL缓冲液合并至总体积1mL。将样品在冰上冷却，加入ConA琼脂糖(GE Healthcare)，将样品在4℃下离心2小时。用PL缓冲液洗涤珠粒2次，使用抗c-myc抗体，用洗脱的蛋白进行Western印迹。对于IWP-PEG-生物素结合研究而言，将来自用Porc-myc构建物转染的HEK293细胞的细胞裂解产物(PBS/1％NP-40)与DMSO、连接基(165μM)、IWP-生物素(165μM)或IWP-生物素(165μM)+IWP3(585μM)一起孵育，并离心30分钟，之后加入NeutrAvidin琼脂糖树脂(Pierce)，并在室温下再离心20分钟。然后，用溶胞缓冲剂洗涤树脂，并用加样缓冲液洗脱蛋白质。
实施例2：
Wnt蛋白信号转导抑制剂的鉴定
基于细胞的高严格筛选策略鉴定了来自U.T.Southwestern(Dallas，TX)(UTSW)的约200K合成化学品文库的Wnt/β-联蛋白途径的小分子调节剂(图1)。可以利用该测定来鉴定Wnt-蛋白信号转导抑制剂和可增强Wnt/β-联蛋白活性的化学物。
实验条件：初筛和基于第二报告基因的测定。对于“初筛”和“剂量依赖性试验”而言，将约5,000个L-Wnt-STF细胞接种到白色不透明的384孔培养板的每个孔中，24小时后向每个孔中加入来自UTSW化学品文库的单个化合物至最终浓度2.5μM(初筛)或其它所示浓度。24小时后，测量萤光素酶活性。为了鉴定FL抑制剂和阻断蛋白分泌的化合物，将L-细胞用CMV-FL和CMV-GL构建物瞬时转染，并立即与所述化合物一起孵育。24小时后，分别分析培养基和细胞裂解产物的GL和FL活性。对于“外源性Wnt试验”而言，将按照ATCC提供的方案制备的含Wnt3A的条件化培养基施用于已用STF和对照报告子瞬时转染的HEK293细胞。对于Hedgehog和Notch试验而言，将NIH-3T3细胞或L-细胞分别用指定的报告子构建物瞬时转染，并立即与所述化合物一起孵育。24小时后测量萤光素酶活性。在用Wnt-GL表达构建物瞬时转染的L-细胞中进行“Wnt分泌试验”，并立即与所述化合物一起孵育。48小时后分析培养基和细胞裂解产物的GL活性。如前所述，在L-Wnt-STF细胞中进行用于计算化合物IC50的测定。
结果讨论：筛选简述如下：将稳定地载有良好表征的Wnt/β-联蛋白途径应答性荧光虫萤光素酶(FL)报告基因质粒(SuperTopFlash或STF)、对照报告子和编码Wnt蛋白的表达构建物Wnt3A的小鼠L-细胞暴露于单独的化合物两天，然后测量报告子活性。选择改变FL而不改变对照报告基因活性的化学品进行进一步试验(图1；图8)。该筛选策略能够鉴定潜在地增强或降低Wnt/β-联蛋白途径活性的化合物。
进行了几次第二试验，以便进一步选择目的化合物。设计这些试验是为了鉴定具有最小细胞毒性(“剂量依赖性试验”)和对于攻击Wnt/β-联蛋白途径具有特异性(“Hh和Notch途径试验”和“FL抑制剂/蛋白胞吐作用试验”；图1)的特别强效化合物。由于预测在初筛中使用的细胞自主性信号发生测定能获得破坏配体产生或响应的化合物，因此鉴定了在经外源提供的Wnt蛋白处理的细胞中测试时保持活性且可能起到响应抑制剂作用的化合物。在该试验中没有阻断Wnt/β-联蛋白途径应答和可能阻断Wnt配体产生(图9A)的那些化合物中，有四种抑制Wnt分泌，如使用Wnt-萤光素酶融合蛋白所测定的(图1和图9)。基于来自这些第二试验的结果，鉴定出了七种化合物起到Wnt应答抑制剂(IWR)作用，鉴定出了四种化合物起到Wnt产生抑制剂(IWP；图1)的作用。
尽管IWP都具有相同的核心化学结构，但基于结构相似性可以鉴定两类不同的IWR(图2A和图2B)。通常，IWP是比IWR中最强的那些类别更有效的途径拮抗剂(分别为约40nM和200nM)。利用Wnt/β-联蛋白途径活化的生物化学标志物，一般性地定位了每种化合物的作用位点(图3)。与所预测的其对Wnt蛋白产生的作用相一致，IWP阻断了测定的所以Wnt依赖性生物化学变化(LRP6报告子和Dvl2的磷酸化作用，以及β-联蛋白的积聚；图3)。另一方面，IWR化合物似乎只影响β-联蛋白的水平，这表明它们靶向LRP6和Dvl2的下游调节事件。
实施例3：
合成和表征
如在图12和图13所描述的，进行了IWR-1，、IWP-2、IWR-1-PEG-生物素、IWP-PEG-生物素和IWR-Cy3的合成。本文公开的一些化合物的示例性表征数据提供如下。化合物IWR-8、9、10、11、12、13、14、15、18和19的1H-NMR谱分别提供在图15-24中。
IWP-1：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.42(br，1H，NH)，8.98(t，J＝5.9Hz，1H，NH)，8.73(d，J＝7.8Hz，1H)，8.38(d，J＝7.8Hz，1H)，7.99(dd，J＝7.8，7.6Hz，1H)，7.92(dd，J＝7.8，7.6Hz，1H)，7.65(d，J＝8.2Hz，2H)，7.63(d，J＝8.5Hz，1H)，7.54(d，J＝2.3Hz，1H)，7.08(d，J＝8.2Hz，2H)，7.02(dd，J＝8.5，2.3Hz，1H)，4.28(d，J＝5.9Hz，2H)，3.83(s，3H)，3.80(s，3H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ179.7，168.3，163.7，158.7，158.4，156.2，155.7，137.9，134.3，133.9，132.8，132.3，128.0，127.5，127.3，126.8，126.7，121.2，114.9，113.7，104.7，55.6，55.5，42.4；C26H22N5O5的MS(ES+)理论值：(M+H)+516.1，实测值：516.1
IWR-1：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ10.72(s，1H，NH)，8.89(dd，J＝7.3，1.1Hz，1H)，8.81(dd，J＝4.1，1.2Hz，1H)，8.17(dd，J＝8.2，1.1Hz，1H)，8.13(d，J＝8.4Hz，2H)，7.56(dd，J＝8.2，7.3Hz，1H)，7.53(dd，J＝8.2，1.2Hz，1H)，7.46(dd，J＝8.2，4.1Hz，1H)，7.37(d，J＝8.4Hz，2H)，6.28(s，2H)，3.53(s，2H)，3.47(s，2H)，1.80(d，J＝8.8，1H)，1.62(d，J＝8.8，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ176.5，164.6，148.4，138.8，136.5，135.2，134.9，134.8，134.5，128.2，128.0，127.5，126.9，122.0，121.8，116.6，52.4，46.0，45.7；C25H20N3O3的MS(ES+)理论值：(M+H)+410.2，实测值：410.1。
IWR-3：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.24(t，J＝6.0Hz，1H，NH)，8.09(dd，J＝7.8，0.4Hz，1H)，7.70-7.64(m，2H)，7.32-7.19(m，9H)，6.92(d，J＝6.9Hz，1H)，6.05(s，1H)，5.25(s，2H)，4.23(d，J＝6.0Hz，2H)，3.88(d，J＝6.9Hz，2H)，2.90(s，3H)，2.16-2.11(m，1H)，1.77-1.71(m，5H)，1.37-1.28(m，2H)，1.09-1.00(m，2H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ175.1，161.5，161.2，160.6，153.4，151.0，143.6，139.9，136.9，135.4，128.3，128.2，127.1，126.7，124.5，123.0，118.9，115.1，114.8，101.9，47.2，46.9，44.0，41.8，35.7，29.7，28.9，24.1；C33H34N5O4的MS(ES+)理论值：(M+H)+564.3，实测值：564.1。
实施例4：
靶向Porcupine酰基转移酶的Wnt产生抑制剂(IWP)
测试了已知对Wnt配体产生必不可少的两种基因(即Evenness interrupted(Evi)和Porcupine(Porc))在挽救经IWP处理之细胞中的途径应答的能力。Porc而不是Evi的表达减弱了IWP-2对途径活性(图4A)和Wnt分泌(图4B)的作用，表明总体而言IWP可作用于Porc。Porc(膜结合O-酰基转移酶(MBOAT)家族的成员)将棕榈酰基添加到Wnt蛋白上，这对于Wnt蛋白的正常功能是必不可少的并且是将Wnt蛋白转运出ER所必需的(Takada等，2006)。与IWP抑制Porc功能相一致，在用IWP-2处理的细胞中，使用洗涤剂溶解度分级测定法测量的脂质化Wnt3A的水平降低，但是在过表达Porc的那些细胞中，脂质化Wnt3A的水平则没有变化(图4C)。为了试验Porc是否与IWP化合物相互作用，制备了允许使用链霉亲和素涂覆的基质[IWP-PEG-生物素(IWP-PB)；图4D]对IWP相关蛋白进行阻滞的生物化学试剂。实际上，可观察到Porc与IWP-PB的特异性结合(图4F)。综合考虑功能数据和生物化学数据，且不受理论的束缚，IWP作用的最简单模型是其直接抑制Porc的活性(图4G)。最新证据表明，胞浆酰基转移酶通过将棕榈酰基加合物添加到跨膜序列附近的残基来控制LRP6蛋白成熟(Abrami等，2008)。与IWP对Porc和Wnt配体产生具有特异性相一致，这些化合物不改变对外源提供的Wnt蛋白的细胞应答(图9A)。
实施例5：
IWR化合物通过稳定Axin2降解复合物来下调β-联蛋白的蛋白水平
基于生物化学证据，IWR化合物可能通过靶向在LRP6和Dvl2下游发挥作用之途径组分(参见图3)来抑制Wnt诱导的β-联蛋白积聚。为了进一步定位其作用位点，测试了IWR-1阻断在经靶向APC肿瘤阻遏物之siRNA处理的小鼠L-细胞中β-联蛋白积聚的能力(图5A)。IWR-1在这方面的有效性促进了IWR化合物在结肠直肠癌(CRC)细胞中的试验，所述结肠直肠癌细胞经常发生APC的功能丧失性突变(Sjoblom等，2006)。实际上，IWR化合物能够消除在DLD-1细胞(一种表达截短形式的APC的CRC系)中表现出的不同程度的Wnt途径活性异常(图5B)。
所述β-联蛋白降解复合物由APC、Axin、CK1和GSK3β组成，其促进磷酸化β-联蛋白的蛋白酶体介导的蛋白水解(Huang和He，2008)。IWR化合物对DLD-1细胞中该降解复合物组分的生物化学作用，观察到Axin2蛋白的IWR依赖性诱导，在APC或GSK3β中的水平很少变化(图5C)。尽管有这种Axin2蛋白的增加，但没有观察到β-联蛋白水平同时降低，这可基于报告子测定结果(参见图5B)和对Axin2功能的理解可预测到。由于结肠上皮细胞中大部分β-联蛋白螯合在含有细胞-细胞粘附分子E-钙粘蛋白的复合物中(Orsulic等，1999)，因此检验了可用于Wnt介导之应答的“游离”β-联蛋白库。实际上，在加入IWR-1之后，DLD-1细胞中未结合E-钙粘蛋白的β-联蛋白的水平降低(图5D)。IWR对Axin2蛋白的诱导似乎不取决于转录，表明这些化合物通过稳定蛋白质起作用(图5E)。IWR化合物抑制Wnt/β-联蛋白途径应答的效力可以部分地由Axin2在途径应答中的限速作用来解释(Lee等，2003)。
在体外Axin2与生物素化IWR化合物的相互作用表明，IWR化合物直接与靶标Axin2或Axin2相关蛋白相互作用(图5F、G)。不受关于IWR化合物如何改变Axin2蛋白转换之理论的束缚，本发明人推测其抑制Wnt/β-联蛋白途径应答的有效性可以部分地由Axin2在途径应答中的限速作用来解释(Lee等，2003)。总之，所述IWR化合物已显示出在可以开发用于控制Wnt/β-联蛋白途径应答水平的该途径内化学上易于处理的调节机制(图5H)。
实施例6：
Wnt/β-联蛋白途径在再生中的化学降解
为了测试所鉴定的IWR和IWP化合物的体内活性，进行了简单快速的Wnt/β-联蛋白途径活性的测定一斑马鱼尾鳍的再生(Stoick-Cooper等，2007).
实验条件：斑马鱼研究在28.5℃下，在补充有10μM IWR的养鱼池水中或在作为对照的0.1％DMSO中培养6月龄斑马鱼8天或14天。给鱼饲喂标准饮食，每天更换溶液。在暴露结束时，将斑马鱼在室温下含有1mM BrdU的养鱼池水中培养2小时，然后在养鱼池水中清洗几次，用0.1％三卡因麻醉，并在4℃下的4％低聚甲醛中固定48小时。将肠剖离，脱水，石蜡包埋，并以5mm的间距切片。用苏木精和伊红染色切片，或者如所述的处理用于BrdU免疫组织化学(Shepard等，2005)。由四名盲蔽的观察者独立地对来自IWR和DMSO组的8只动物的切片进行评分。对每个切片，计数肠的中间和末端切片中肠壁褶皱总数和BrdU阳性核的总数。对于尾鳍再生测定，用0.2％三卡因麻醉3-6月龄的斑马鱼，使用刀片切除一半鳍。将切除鳍的鱼饲养在31℃的池中，该池含有300ml水和DMSO或IWR(10μM)。在全部4天的测定期中，每日重新补足水和化合物。
结果讨论：将IWR-1加入到斑马鱼的水中可抑制机械切除后的鳍再生，但加入IWP-2则没有这一作用，表明IWP化合物的生物利用度较差，或者其靶向的基因产物中的决定簇在斑马鱼中并不存在(图6A)。接着，检验IWR-1处理对于维持斑马鱼胃肠(GI)道中分裂细胞的作用，其是另一种Wnt依赖性过程(Muncan等，2007)。大量遗传证据表明，后生动物的GI组织对于Wnt途径活性的扰动特别敏感(Clevers，2006)。与在斑马鱼中IWR-1抗Wnt/β-联蛋白途径的特异性活性相一致，发现通常在IWR 1-处理的鱼的肠基部中找到的溴脱氧尿苷(BrdU)标记细胞的数量减少(图6B左侧，6C)。处理时间长于4天的鱼显示出嗜睡和食欲减退，其与GI组织结构中明显的组织学变化有关(图6B，右侧)。总之，在斑马鱼中，IWR-1阻断Wnt/β-联蛋白途径依赖性过程的能力表明，IWR化合物可以类似地用于哺乳动物的体内研究。
实施例7：
癌症中Wnt途径应答的化学降解
如本文讨论的，异常Wnt途径活性(由导致Wnt配体活性改变的遗传变化或途径调节剂功能所维持)已经与大量癌症有关(Clevers，2006；Polakis，2007)。许多来自结肠直肠癌和某些肺癌的细胞发生了导致Wnt介导的细胞应答异常活化的分子变化。DLD-1细胞，如同许多其它CRC细胞一样，发生APC突变，而所选的肺癌细胞系(A549、H1299、H460细胞)则显示出有助于其致瘤行为的异常表达水平的Porc(Chen等，2008；Polakis，2007)。在这两种情况下，异常途径活性可受到抑制正常Wnt蛋白功能的影响(Clevers，2006)。
实验条件：癌细胞生长研究：在涉及IWR和IWP处理的实验中，在指定的Wnt途径抑制剂(0.5％DMSO终浓度)的存在下，将癌细胞接种到24孔形式(2.5k细胞/孔)中。每24小时更换培养基和化合物，共5天。在第6天，通过cell titer glo assay(Promega)定量ATP水平。在涉及siRNA转染的实验中，使用Effectene转染试剂(Qiagen)，用50nM的对照、Ctnnb1或Porcn siRNA(SMARTPools，Dharmacon)转染细胞，并将其接种到96孔板中，7.5k细胞/孔，一式三份。48小时后，将2.5K细胞从各孔转移到六孔形式中。120小时后，通过Cell Titer Glo测定(Promega)测量ATP水平。
结果讨论：在肺癌和结肠直肠癌细胞的生长敏感性试验中，一般性地观察到了对IWR和IWP化合物的剂量依赖性应答(图7A)，其与在这些细胞中化学诱导的生物化学变化相一致(图7B)。有趣的是，发现在抑制癌细胞生长方面，IWP-1比IWR-4总是更有效，这可能反映了IWP化合物总体而言抑制该途径的能力更强(参见图2、3)。还相关的是可能IWP而不是IWR化合物影响所有的Wnt途径应答，包括不依赖于β-联蛋白的那些(所谓的“非经典”Wnt途径)。实际上，控制这些其它途径的Wnt蛋白的成熟和功能性似乎也依赖于Pore(FIG.7C；Kurayoshi等，2007)。在用IWP处理的DLD-1的情况下，本发明人怀疑有一种或多种非Dvl依赖性途径应答已被抑制。目前，关于这些其它Wnt途径对致癌作用的贡献还知之甚少。与不依赖于β-联蛋白的Wnt途径维持两种癌细胞系生长的作用相一致，用Pore siRNA处理任一种细胞类型都会引起细胞生长损失，而β-联蛋白siRNA则主要影响DLD-1生长行为(图7D)。尽管目前不知道“非经典”Wnt途径是否可在这些细胞中有效，但本发明人不受理论的束缚，提出了一种模型，其中所述IWR化合物选择性地抑制β-联蛋白依赖性信号发生，并且所述IWP化合物更广泛地攻击Wnt介导的细胞应答(图7E)。
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
根据本发明公开内容，可以制备和实施本文中所公开和要求保护的所有方法和装置，而无需过多的实验。虽然已经按照优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文描述的方法和装置以及方法的步骤或步骤的顺序进行改变。更具体地，显而易见的是，在化学和生理学上均相关的某些药剂可以替代本文描述的药剂而获得相同或类似的结果。对本领域技术人员显而易见的是，所有这些类似的替代和变化都被认为在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
下述参考文献具体地通过引用并入本文，其程度在于其提供作为本文所述内容之补充的示例性的方法或其它细节。
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Claims (60)

1.一种抑制细胞中Wnt蛋白信号转导的方法，包括向所述细胞施用有效量的式(A)化合物：
Figure FPA00001307415200011
其中：
R1选自：
Figure FPA00001307415200012
其中
R4和R5各自独立地选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)
和
Figure FPA00001307415200022
并且
r和t各自独立地为0或1；或者
R4和R5一起形成下述结构部分：
Figure FPA00001307415200023
其中R13选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和标记物；
R6、R7和R9-R11各自独立地选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure FPA00001307415200031
并且
R12选自：
其中R14选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)；
R2选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)；和
R3选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)，
Figure FPA00001307415200033
2.权利要求1的方法，其中所述化合物进一步定义为式(I)：
Figure FPA00001307415200041
其中：
R1选自：
Figure FPA00001307415200042
Figure FPA00001307415200051
其中R4和R5各自独立地选自氢、烷基C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure FPA00001307415200052
并且
r和t各自独立地为0或1；或者
R4和R5一起形成下述结构部分：
Figure FPA00001307415200053
其中R13选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和标记物；
R6、R7和R9-R11各自独立地选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure FPA00001307415200054
并且
R12选自：
Figure FPA00001307415200061
其中R14选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)；
R2选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)；和
R3选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)，
Figure FPA00001307415200062
3.权利要求2的方法，其中所述细胞在体外。
4.权利要求2的方法，其中所述细胞在体内。
5.权利要求2的方法，其中所述抑制Wnt蛋白信号转导的方法进一步限定为抑制Wnt应答的方法。
6.权利要求5的方法，其中所述式(I)化合物进一步定义为式(II)化合物：
Figure FPA00001307415200063
其中：
R15选自：
Figure FPA00001307415200071
Figure FPA00001307415200072
其中
R17和R18各自独立地选自氢、烷基C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure FPA00001307415200073
或者
R17和R18一起形成下述结构部分：
Figure FPA00001307415200074
其中R24选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和标记物；
R19和R20各自独立地选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure FPA00001307415200081
R23选自：
Figure FPA00001307415200082
其中R24选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)；并且
R16选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、
Figure FPA00001307415200083
7.权利要求6的方法，其中所述式(II)化合物为：
Figure FPA00001307415200084
Figure FPA00001307415200091
Figure FPA00001307415200101
8.权利要求1的方法，其中所述式(A)化合物为：
Figure FPA00001307415200102
9.权利要求2的方法，其中所述抑制Wnt蛋白信号转导的方法进一步限定为抑制Wnt蛋白产生的方法。
10.权利要求9的方法，其中所述式(I)化合物进一步定义为式(III)化合物：
Figure FPA00001307415200103
其中：
R25为烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)或取代烷氧基(C≤4)；并且
R26选自：
Figure FPA00001307415200104
Figure FPA00001307415200111
其中R27-R30各自独立地选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure FPA00001307415200112
并且
r和t各自独立地为0或1。
11.权利要求10的方法，其中所述式(III)化合物进一步定义为下述化合物中的任何一种或多种：
Figure FPA00001307415200113
Figure FPA00001307415200121
12.权利要求2的方法，其中所述式(I)化合物进一步定义为式(IV)化合物：
Figure FPA00001307415200122
其中：
R31选自：
Figure FPA00001307415200131
其中R33-R35选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure FPA00001307415200132
并且t为0或1；并且
R32选自：
Figure FPA00001307415200141
其中R36-R38选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)。
13.权利要求2的方法，其中所述标记物进一步定义为
Figure FPA00001307415200142
14.一种治疗患者中癌症的方法，包括向所述患者施用有效量的式(I)化合物：
其中：
R1选自：
Figure FPA00001307415200152
Figure FPA00001307415200161
其中
R4和R5各自独立地选自氢、烷基C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure FPA00001307415200163
r和t各自独立地为0或1，或者
R4和R5一起形成下述结构部分：
Figure FPA00001307415200164
其中R13选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和标记物；
R6、R7和R9-R11各自独立地选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure FPA00001307415200171
R12选自：
Figure FPA00001307415200172
其中R14选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)；
R2选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)；和
R3选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)，
Figure FPA00001307415200173
15.权利要求14的方法，其中所述式(I)化合物进一步定义为下述化合物中的任何一种或多种：
Figure FPA00001307415200181
Figure FPA00001307415200191
16.权利要求14的方法，其中所述式(I)化合物与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂一起包含在药物组合物中。
17.权利要求14的方法，其中所述癌症为结肠直肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌或前列腺癌。
18.权利要求14的方法，还包括施用化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗、毒素治疗或基因治疗。
19.权利要求14的方法，其中所述施用方法选自静脉内施用、皮内施用、动脉内施用、腹膜内施用、病变内施用、颅内施用、关节内施用、前列腺内施用、胸膜内施用、气管内施用、鼻内施用、玻璃体内施用、阴道内施用、直肠内施用、表面施用、瘤内施用、肌内施用、皮下施用、结膜下施用、囊泡内施用、粘膜施用、心包内施用、脐带内施用、眼内施用、口服施用、局部施用、通过吸入施用、通过注射施用、通过输注施用、通过连续输注施用、通过局部灌注浸浴靶细胞而直接施用、通过导管施用、通过灌洗施用、在乳膏中施用、在脂质组合物中施用，或其任意组合。
20.权利要求14的方法，其中所施用的式(I)化合物的剂量为约1μg/kg至约100mg/kg。
21.一种治疗或预防患者中骨硬化症的方法，包括向所述患者施用有效量的式(I)化合物：
Figure FPA00001307415200211
其中：
R1选自：
Figure FPA00001307415200212
Figure FPA00001307415200222
其中
R4和R5各自独立地选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure FPA00001307415200223
r和t各自独立地为0或1，
或者
R4和R5一起形成下述结构部分：
Figure FPA00001307415200231
其中R13选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和标记物；
R6、R7和R9-R11各自独立地选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure FPA00001307415200232
并且
R12选自：
Figure FPA00001307415200233
其中R14选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)；
R2选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)；并且
R3选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)，
Figure FPA00001307415200234
Figure FPA00001307415200241
22.权利要求21的方法，还包括施用第二骨硬化症治疗剂或第二骨硬化症预防剂。
23.权利要求21的方法，其中所述施用方法选自静脉内施用、皮内施用、动脉内施用、腹膜内施用、病变内施用、颅内施用、关节内施用、鼻内施用、表面施用、肌内施用、皮下施用、脐带内施用、口服施用、局部施用、通过吸入施用、通过注射施用、通过输注施用、通过连续输注施用、通过局部灌注浸浴靶细胞而直接施用、通过导管施用、在乳膏中施用、在脂质组合物中施用，或其任意组合。
24.权利要求14的方法，其中所施用的式(I)化合物的剂量为约1μg/kg至约100mg/kg。
25.一种治疗患者中退行性疾病的方法，包括向所述患者施用有效量的式(I)化合物：
Figure FPA00001307415200242
其中：
R1选自：
Figure FPA00001307415200243
Figure FPA00001307415200251
Figure FPA00001307415200252
其中
R4和R5各自独立地选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和r和t各自独立地为0或1，
或者
R4和R5一起形成下述结构部分：
Figure FPA00001307415200261
其中R13选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和标记物；
R6、R7和R9-R11各自独立地选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
R12选自：
Figure FPA00001307415200263
其中R14选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)；
R2选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)；并且
R3选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)，
Figure FPA00001307415200264
Figure FPA00001307415200271
26.权利要求25的方法，其中所述退行性疾病是II型糖尿病或年龄相关性的组织修复受损。
27.权利要求25的方法，还包括施用第二药剂以治疗退行性疾病。
28.权利要求25的方法，其中所述施用方法选自静脉内施用、皮内施用、动脉内施用、腹膜内施用、病变内施用、颅内施用、关节内施用、前列腺内施用、胸膜内施用、气管内施用、鼻内施用、玻璃体内施用、阴道内施用、直肠内施用、表面施用、肌内施用、皮下施用、结膜下施用、囊泡内施用、粘膜施用、心包内施用、脐带内施用、眼内施用、口服施用、局部施用、通过吸入施用、通过注射施用、通过输注施用、通过连续输注施用、通过局部灌注浸浴靶细胞而直接施用、通过导管施用、通过灌洗施用、在乳膏中施用、在脂质组合物中施用，或其任意组合。
29.权利要求25的方法，其中所施用的式(I)化合物的剂量为约1μg/kg至约100mg/kg。
30.一种治疗患者中II型糖尿病的方法，包括向所述患者施用有效量的式(I)化合物：
Figure FPA00001307415200272
其中：
R1选自：
Figure FPA00001307415200281
Figure FPA00001307415200282
其中
R4和R5各自独立地选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure FPA00001307415200291
r和t各自独立地为0或1，
或者
R4和R5一起形成下述结构部分：
Figure FPA00001307415200292
其中R13选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和标记物；
R6、R7和R9-R11各自独立地选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)和
Figure FPA00001307415200293
R12选自：
Figure FPA00001307415200294
其中R14选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)；
R2选自氢、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)和取代烷氧基(C≤4)；和
R3选自氢、卤素、烷基(C≤4)、取代烷基(C≤4)、烷氧基(C≤4)、取代烷氧基(C≤4)，
Figure FPA00001307415200301
31.权利要求30的方法，其进一步包括施用第二药剂以治疗糖尿病。
32.权利要求30的方法，其中所述施用方法选自静脉内施用、皮内施用、动脉内施用、腹膜内施用、病变内施用、颅内施用、关节内施用、前列腺内施用、胸膜内施用、气管内施用、鼻内施用、玻璃体内施用、阴道内施用、直肠内施用、表面施用、肌内施用、皮下施用、结膜下施用、囊泡内施用、粘膜施用、心包内施用、脐带内施用、眼内施用、口服施用、局部施用、通过吸入施用、通过注射施用、通过输注施用、通过连续输注施用、通过局部灌注浸浴靶细胞而直接施用、通过导管施用、通过灌洗施用、在乳膏中施用、在脂质组合物中施用，或其任意组合。
33.权利要求30的方法，其中所施用的式(I)化合物的剂量为约1μg/kg至约100mg/kg。
34.一种药物组合物，其包含可药用载体、稀释剂和/或赋形剂，以及下述化合物中的任何一种或多种：
Figure FPA00001307415200302
Figure FPA00001307415200311
Figure FPA00001307415200321
35.具有下式的化合物：
Figure FPA00001307415200322
36.式(V)或式(VI)的化合物：
Figure FPA00001307415200323
其中，对于任一个通式：
R1和R2当独立存在时，各自独立地为：
氢、羟基、卤素、氨基、硝基、羟氨基、氰基、叠氮基或巯基；或者
烷基(C≤12)、烯基(C≤12)、炔基(C≤12)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤12)、杂芳基(C≤12)、杂芳烷基(C≤12)、烷氧基(C≤12)、烯氧基(C≤12)、炔氧基(C≤12)、芳氧基(C≤12)、芳烷氧基(C≤12)、杂芳氧基(C≤12)、杂芳烷氧基(C≤12)、酰氧基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、烷氧基氨基(C≤12)、烯基氨基(C≤12)、炔基氨基(C≤12)、芳基氨基(C≤12)、芳烷基氨基(C≤12)、杂芳基氨基(C≤12)、杂芳烷基氨基(C≤12)、酰氨基(C≤12)，或任何这些基团的取代形式；或者
R1和R2一起为亚烷基(C2-12)、亚烯基(C2-12)，或任何这些基团的取代形式。
37.权利要求36的化合物，其中R1和R2一起为
Figure FPA00001307415200331
38.权利要求36的化合物，其中R1或R2为卤素。
39.权利要求38的化合物，其中R1或R2为溴。
40.权利要求36的化合物，其中R1或R2为烷氧基(C≤6)。
41.权利要求40的化合物，其中R1或R2为甲氧基。
42.权利要求36的化合物，其中所述化合物为：
Figure FPA00001307415200332
Figure FPA00001307415200341
43.一种抑制细胞中Wnt蛋白信号转导的方法，包括向所述细胞施用有效量的式(V)或式(VI)化合物：
Figure FPA00001307415200342
Figure FPA00001307415200351
其中，对于任一个通式：
R1和R2当独立存在时，各自独立地为：
氢、羟基、卤素、氨基、硝基、羟氨基、氰基、叠氮基或巯基；或
烷基(C≤12)、烯基(C≤12)、炔基(C≤12)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤12)、杂芳基(C≤12)、杂芳烷基(C≤12)、烷氧基(C≤12)、烯氧基(C≤12)、炔氧基(C≤12)、芳氧基(C≤12)、芳烷氧基(C≤12)、杂芳氧基(C≤12)、杂芳烷氧基(C≤12)、酰氧基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、烷氧基氨基(C≤12)、烯基氨基(C≤12)、炔基氨基(C≤12)、芳基氨基(C≤12)、芳烷基氨基(C≤12)、杂芳基氨基(C≤12)、杂芳烷基氨基(C≤12)、酰氨基(C≤12)，或任何这些基团的取代形式；或者
R1和R2一起为亚烷基(C2-12)、亚烯基(C2-12)，或任何这些基团的取代形式。
44.权利要求43的方法，其中所述细胞在体外。
45.权利要求43的方法，其中所述细胞在体内。
46.权利要求43的方法，其中所述抑制Wnt蛋白信号转导的方法进一步限定为抑制Wnt应答的方法。
47.权利要求43的方法，其中R1和R2一起为：
Figure FPA00001307415200352
48.权利要求43的方法，其中R1或R2为卤素。
49.权利要求48的方法，其中R1或R2为溴。
50.权利要求43的方法，其中R1或R2为烷氧基(C≤6)。
51.权利要求50的方法，其中R1或R2为甲氧基。
52.权利要求43的方法，其中所述化合物为：
Figure FPA00001307415200361
Figure FPA00001307415200371
53.一种治疗患者中癌症、骨硬化症、退行性疾病或II型糖尿病的方法，包括向所述患者施用有效量的式(V)或式(VI)化合物：
Figure FPA00001307415200372
其中，对于任一个通式：
R1和R2当独立存在时，各自独立地为：
氢、羟基、卤素、氨基、硝基、羟氨基、氰基、叠氮基或巯基；或者
烷基(C≤12)、烯基(C≤12)、炔基(C≤12)、芳基(C≤12)、芳烷基(C≤12)、杂芳基(C≤12)、杂芳烷基(C≤12)、烷氧基(C≤12)、烯氧基(C≤12)、炔氧基(C≤12)、芳氧基(C≤12)、芳烷氧基(C≤12)、杂芳氧基(C≤12)、杂芳烷氧基(C≤12)、酰氧基(C≤12)、烷基氨基(C≤12)、二烷基氨基(C≤12)、烷氧基氨基(C≤12)、烯基氨基(C≤12)、炔基氨基(C≤12)、芳基氨基(C≤12)、芳烷基氨基(C≤12)、杂芳基氨基(C≤12)、杂芳烷基氨基(C≤12)、酰氨基(C≤12)，或任何这些基团的取代形式；或者
R1和R一起为亚烷基(C2-12)、亚烯基(C2-12)，或任何这些基团的取代形式。
54.权利要求53的方法，其中R1和R2一起为：
Figure FPA00001307415200381
55.权利要求53的方法，其中R1或R2为卤素。
56.权利要求55的方法，其中R1或R2为溴。
57.权利要求53的方法，其中R1或R2为烷氧基(C≤6)。
58.权利要求57的方法，其中R1或R2为甲氧基。
59.权利要求53的方法，其中所述化合物为：
Figure FPA00001307415200382
60.一种药物组合物，其包含可药用载体、稀释剂和/或赋形剂，以及下述化合物中的任何一种或多种：
Figure FPA00001307415200392
Figure FPA00001307415200401
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