CN102094066A

CN102094066A - 一种筛选ε-聚赖氨酸产生菌的方法

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Publication number: CN102094066A
Application number: CN2010105850343A
Authority: CN
Inventors: 林俊芳; 杨博; 郭丽琼
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2010-12-13
Filing date: 2010-12-13
Publication date: 2011-06-15
Anticipated expiration: 2030-12-13
Also published as: CN102094066B

Abstract

本发明属于微生物发酵工程领域，涉及一种筛选ε-聚赖氨酸产生菌的方法，是采用在不含指示剂的初筛培养基表面加入Dragendorff试剂，通过与产透明圈的菌株周围形成砖红色聚集圈来筛选ε-聚赖氨酸产生菌。本发明改进了原有的筛选方法，可直观高效的筛选ε-聚赖氨酸产生菌。本发明工艺简单，有效缩短了筛选周期和工作量，筛选效率较高。

Description

一种筛选ε-聚赖氨酸产生菌的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种简便快捷的ε-聚赖氨酸产生菌筛选方法。

背景技术

ε-聚赖氨酸（ε-polylysine）是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能和巨大商业潜力的微生物类食品防腐剂，通常由25-35个赖氨酸残基聚合而成，是链霉菌、北里孢菌和麦角真菌等微生物的天然代谢产物。与传统的食品防腐剂相比，其抗菌谱广，在中性和微酸性条件下，对大部分革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌等都有抑制作用；其安全无毒，不但对人体健康无害，而且分解代谢后还具有一定的营养价值；此外还具有水溶性好、热稳定性好等特点。ε-聚赖氨酸在日本、韩国被广泛应用于食品防腐剂。2003年10月，美国FDA将其规定为GRAS，认可其为世界标准级的食品添加剂。迄今为止，ε-聚赖氨酸在日本已实现工业化生产，产量高达50 g/L左右。我国目前对ε-聚赖氨酸的研究基本还处于实验室阶段，商业化生产也刚处于起步阶段，目前只有浙江银象公司将ε-聚赖氨酸投入生产。如果加大在该领域的技术研究，势必将产生巨大的经济效益，因此，开展对ε-聚赖氨酸生产技术的研究具有重要的意义。

ε-聚赖氨酸产生菌的筛选方法复杂，目前普遍采用2002年日本学者Nishikawa的方法，即在培养基中加入一定浓度的碱性染料亚甲基蓝，通过带正电的亚甲基蓝与同样带正电的ε-聚赖氨酸相互间的静电排斥，产生肉眼可见的透明圈来初筛目的菌株，然后再通过摇瓶发酵，从发酵液中检验是否呈Dragendorff阳性反应。这种筛选方法虽然定向，较为简便，但是在培养基中加入亚甲基蓝后对目的菌株有一定的毒害性，会抑制其生长，且所有产透明圈菌株均需通过摇瓶发酵复筛验证，工作量大，周期较长。

发明内容

本发明克服了现有技术的不足之处，提供一种简便快捷的ε-聚赖氨酸产生菌筛选方法，该方法在初筛培养基中不添加任何带电荷的指示剂，并利用Dragendorff试剂与产透明圈菌株周围产生砖红色聚集圈的表观来灵敏地筛选目的菌株。

实现本发明的技术方案是：

一种筛选ε-聚赖氨酸产生菌的方法在初筛培养基表面加入Dragendorff试剂，通过与产透明圈的菌株周围形成砖红色聚集圈来筛选ε-聚赖氨酸产生菌。包括如下步骤：

(1) 将适当稀释后的土壤悬液涂布在含有50 mg/L-100 mg/L重铬酸钾的初筛培养基上，28-30℃培养5-7d；挑取产生透明圈的单菌落，置于斜面培养基上30℃培养5-7天，4℃保藏。

(2) 滴加Dragendorff试剂到初筛培养基上产生透明圈的单菌落，静置，观察菌株周围的颜色变化，其中周围能与Dragendorff试剂形成明显砖红色聚集圈的产透明圈菌株为ε-聚赖氨酸产生菌。

所述的初筛培养基不加任何带电荷的指示剂。步骤（2）所述的Dragendorff试剂是以滴加的形式覆盖整个培养基表面；滴加Dragendorff试剂后，应静置20-30 min再观察菌株周围的砖红色聚集圈。

可以采用以下优选方法：（1）将适当稀释后的土壤悬液涂布在含有50 mg/L重铬酸钾的初筛培养基上，30℃培养5-7d，挑取产生透明圈的单菌落到斜面培养基保藏；（2）滴加适量的Dragendorff试剂到含有产透明圈菌株的初筛培养基表面，使其覆盖整个平板，静置数分钟后观察菌株周围的颜色变化。周围能与Dragendorff试剂形成明显砖红色聚集圈的产透明圈菌株为ε-聚赖氨酸产生菌。

初筛培养基和斜面培养基均包括碳源、氮源和无机盐成分。可分别采用如下组分：

初筛培养基（w/v）：葡萄糖1%~5%，(NH₄)₂SO₄ 0.1%~0.5%，NaH₂PO₄·12H₂O 0.1%~0.3%，MgSO₄·7H₂O 0.05%~0.1%，琼脂1.5%~2%，余量为水。pH 6.8~7.0，1×10⁵Pa灭菌30 min。

斜面培养基（w/v）：葡萄糖1%~5%，酵母膏0.5%~1%，牛肉膏0.5%~0.8%，MgSO₄0.03%~0.05%，K₂HPO₄ 0.005%-0.025%，琼脂1.5%-2%，余量为水。pH 7.0，1×10⁵Pa灭菌30 min。

应该指出的是，上述初筛培养基中的碳源成分葡萄糖也可以替换成甘油、可溶性淀粉或其它碳源；氮源成分(NH₄)₂SO₄也可以替换成硝酸铵、牛肉膏、酵母膏或其它氮源；无机盐成分NaH₂PO₄·12H₂O也可替换成Na₂HPO₄·2H₂O、KH₂PO₄或K₂HPO₄。

Dragendorff试剂：称取0.85 g硝酸铋溶解于10 mL冰醋酸中，用蒸馏水定容至50 mL；另称取8 g碘化钾溶解于20 mL水中；将这两种溶液等体积混合，摇匀保存于棕色瓶中。

本发明方法的原理是：首先，带正电荷ε-聚赖氨酸属于菌体胞外分泌物，可分泌扩散到菌体周围的初筛培养基内，与琼脂中带正电荷的成分产生静电排斥，形成肉眼可见的透明圈，利用此表观可初步筛选ε-聚赖氨酸产生菌。其次，Dragendorff试剂作为一种生物碱试剂，可与属于生物碱的ε-聚赖氨酸反应产生特征性砖红色沉淀。当在含有产透明圈菌株的初筛培养基上直接滴加Dragendorff试剂后，其扩散到固体培养基内与菌体周围分泌的ε-聚赖氨酸产生砖红色沉淀，从而在菌体周围形成明显的砖红色聚集圈，利用此表观可进一步区分鉴别ε-聚赖氨酸产生菌。

本发明在初筛培养基中没有添加任何带电荷的指示剂，因为固体培养基中含有琼脂，其作为一种带正电的略带颜色的高分子化合物，本身即可与带正电ε-聚赖氨酸相互排斥产生肉眼可见的透明圈，达到定向筛菌的目的。另外，本发明在初筛培养基中加入了重铬酸钾，其能够有效抑制细菌和真菌的生长，而不会抑制放线菌的生长，而本发明筛选的ε-聚赖氨酸产生菌属于放线菌，故添加重铬酸钾作为抑菌剂可有效提高筛选效率。

初筛获得产透明圈菌株后，传统的方法是通过摇瓶发酵，然后再用Dragendorff试剂复筛发酵液是否呈阳性反应。本发明首次将透明圈初筛和Dragendorff试剂复筛过程结合在一起，在初筛平板上就可以直接复筛呈Dragendorff阳性反应的产透明圈菌株。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明在初筛培养基中不添加任何对菌体有抑制作用的指示剂，通过菌体周围产生透明圈的表观来初筛ε-聚赖氨酸产生菌，可尽可能多地筛选目的菌株，提高了筛选效率。并首次将透明圈初筛和Dragendorff试剂复筛结合在同一个阶段进行，通过在初筛培养基表面加入Dragendorff试剂与产透明圈的菌株周围形成砖红色聚集圈，在初筛平板上就可以快速灵敏地复筛ε-聚赖氨酸产生菌，省去了现有技术中的转接斜面和复筛发酵验证的2个环节，有效地减少了筛选过程中60%左右的工作量，同时降低了筛选成本，并使筛选周期从原有的14天左右缩短到5天左右，大大缩短了筛选周期。

附图说明

图1是产透明圈菌株在初筛培养基上的形态；

图2是Dragendorff试剂与产透明圈菌株周围形成的砖红色聚集圈。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明技术方案作进一步说明。

本发明实施例中使用到的培养基和试剂如下：

初筛培养基（g/L）：葡萄糖10 g，(NH₄)₂SO₄ 1 g，NaH₂PO₄·12H₂O 1 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，琼脂20 g，定容到1 L，pH 7.0，1×10⁵Pa灭菌30 min。

复筛培养基（g/L）：甘油20 g，酵母膏5 g，Na₂HPO₄0.8 g，KH₂PO₄ 1 g，MgSO₄·7H₂O 0.25 g，(NH₄)₂SO₄5 g，ZnSO₄·7H₂O 0.05 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，定容至1 L，pH 7.0，1×10⁵Pa灭菌30 min。

斜面培养基（g/L）：葡萄糖10 g，酵母膏5 g，牛肉膏5 g，MgSO₄0.5 g，K₂HPO₄ 1 g，琼脂20 g，定容至1 L，pH 7.0，1×10⁵Pa灭菌30 min。

实施例：

取风干3天的土样1 g，加入9 mL无菌蒸馏水，在试管中充分振荡，静置1 h。然后将土壤悬液进行梯度稀释，取一定稀释度的稀释液涂布于含有50 mg/L 重铬酸钾的初筛培养基，30℃培养。培养5天后，由于微生物分泌出来的带正电聚合物可在琼脂培养基上产生透明圈，故依据此现象可灵敏地区分产正电物质的微生物。挑取40株产透明圈的单菌落到斜面培养基，培养5天。

滴加适量的Dragendorff试剂到含有产透明圈菌株的初筛培养基表面，使其覆盖平板表面，静置30分钟后观察菌株周围的颜色变化，发现有24株产透明圈菌株周围有砖红色聚集圈产生，即得到了24株阳性菌株。

将24株阳性菌株接种到复筛培养基分别摇瓶发酵后，取其发酵液及其水解物进行薄层色谱鉴定，发现它们的发酵产物均为ε-聚赖氨酸，即得到了24株ε-聚赖氨酸产生菌。取它们的发酵液适量，采用打孔法做抑菌实验分析，指示菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色假丝酵母菌。发现所得的24株ε-聚赖氨酸产生菌的发酵产物对4种指示菌都有明显的抑制作用，抑菌圈较清晰，抑菌效果良好。

最后，应当指出，上述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以上述实施例来限定本发明的保护范围。

Claims

1.一种筛选ε-聚赖氨酸产生菌的方法，其特征在于：在初筛培养基表面加入Dragendorff试剂，通过与产透明圈的菌株周围形成砖红色聚集圈来筛选ε-聚赖氨酸产生菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是包括如下步骤：

将适当稀释后的土壤悬液涂布在含有50 mg/L-100 mg/L重铬酸钾的初筛培养基上，28-30℃培养5-7d；挑取产生透明圈的单菌落，置于斜面培养基上30℃培养5-7天，4℃保藏。

3.滴加Dragendorff试剂到初筛培养基上产生透明圈的单菌落，静置，观察菌株周围的颜色变化，其中周围能与Dragendorff试剂形成明显砖红色聚集圈的产透明圈菌株为ε-聚赖氨酸产生菌。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述的初筛培养基不加任何带电荷的指示剂。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征是步骤（2）所述的Dragendorff试剂是以滴加的形式覆盖整个培养基表面。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征是滴加Dragendorff试剂后，所述的静置时间是20-30 min。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述的初筛培养基和斜面培养基均包括碳源、氮源和无机盐成分。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述的初筛培养基由以下组分构成：葡萄糖1%~5%，(NH₄)₂SO₄ 0.1%~0.5%，NaH₂PO₄·12H₂O 0.1%~0.3%，MgSO₄·7H₂O 0.05%~0.1%，琼脂1.5%~2%，余量为水。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述的斜面培养基由以下组分构成：葡萄糖1%~5%，酵母膏0.5%~1%，牛肉膏0.5%~0.8%，MgSO₄·7H₂O 0.03%~0.05%，K₂HPO₄ 0.005%~0.025%，琼脂1.5%~2%，余量为水。