CN102093931A - 莳萝子挥发油制备方法及其对油菜菌核病的防治作用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农药技术领域，提供了一种莳萝子挥发油的制备方法：将干燥的莳萝子粉碎，称取适量，加入蒸馏水，进行水蒸气蒸馏，馏出物除掉水相后，干燥得莳萝子挥发油。本发明的制备方法简单易行，容易操作。分别在接触、挥发实验条件下测定了莳萝子挥发油对核盘菌菌丝生长及菌核萌发的抑制作用。结果证明莳萝子挥发油对核盘菌菌丝生长和菌核萌发有较好的抑制作用，体内抑制核盘菌菌丝生长也表现出较好活性，可用于油菜菌核病的防治。
Description
技术领域
本发明涉及莳萝子挥发油的制备方法，以及莳萝子挥发油对油菜菌核病的防治作用，属于农药技术领域。
背景技术
挥发油（essential oil）是一类由挥发性天然化合物组成并带有强烈气味的油状液体总称，它是一种植物体内的次生代谢物。挥发油在植物界分布广泛，主要集中在菊科、伞形科、唇形科、芸香科、樟科、姜科、木兰科等植物中。挥发油具有丰富的生物活性，具体表现为抗菌驱虫、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、解热镇痛 祛痰止咳等。目前已知的植物挥发油有大约3000种，其中约300种已被广泛应用于制药、食品、农业、化妆品等工业中。
莳萝（Anethum graveolens L）为伞形科一年生草本植物。莳萝用作药用植物的历史可追溯到2000多年前，在食品工业中，莳萝被广泛的用作调味剂。现世界各地多有栽培，主要生产国为印度，我国南北各地均有栽培。我国应用其作为药用植物历史悠久，历代本草，多有著录。其干燥成熟果实称为莳萝子，亦为常用的维吾尔族药。莳萝在临床上主要用于治疗消化系统疾病，如：胃痛、消化不良、口臭及肠胃气胀，并有安神、镇静的疗效，亦可用于治疗小儿打嗝，对哺乳期妇女有催乳的作用。现代药理学研究表明莳萝子挥发油具有抗菌、驱虫、抗氧化、催乳、调节女性生育周期及降血脂等药理活性。
油菜菌核病由核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary]引起，在我国各油菜产区，尤其在长江流域及东南沿海冬油菜产区发生最为严重，一般年份油菜菌核病发病率为10%～30%，严重年份达80%以上，油菜感病后减产达11%～73%，含油量降低1%～5%。核盘菌是一种危害严重、世界性的植物病害真菌，寄主超过400种植物。我国报道的核盘菌自然寄主有36科214种植物，目前主要采用抗病品种和化学农药苯丙咪唑类或二甲酰亚胺类等抗菌剂作为防治手段。如今，合成抗菌剂的安全性日益受到人们的关注，使得植物源农药（挥发油、植物提取物等）需求量逐渐增加。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种莳萝子挥发油的制备方法，以及莳萝子挥发油对油菜菌核病的防治作用
莳萝子挥发油的制备方法如下：
将干燥的莳萝子粉碎，过筛，称取适量，加入蒸馏水，蒸馏，馏出物除掉水相后，干燥得莳萝子挥发油。
采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用的方法，从制得的莳萝子挥发油中共鉴定出了23个化合物（表1），占总含量的99.4wt%。主要化合物有香芹酮（41.5wt%）、柠檬烯（32.6wt%）及芹菜脑（16.8wt%）等。
《香料香精化妆品》1995年第4期，报道了用水蒸气蒸馏法提取甘肃产莳萝子挥发油主要成分为香芹酮（40.37%）及柠檬烯（12.64 %）。《香料香精化妆品》2009年第2期报道了用顶空固相萃取方法富集广西产的莳萝子粉碎时释放的挥发气体成分，用GC-MS分析了其主要成分为柠檬烯（50.48%）、香芹酮（41.14%）及二氢香芹酮(3.73%)。《天然产物研究与开发》2010年第22期报道了用水蒸气蒸馏的方法提取了广西产莳萝子挥发油，用GC-MS方法鉴定了其主要成分为香芹酮(54.587%)、柠檬烯(18.492%)及芹菜脑(11.949%)。《Journal of Agricultural and Food Chemistry》2003年第13期报道了用水蒸气蒸馏方法提取了保加利亚莳萝子挥发油，GC-MS分析其主要成分为香芹酮（50.1%%）、柠檬烯（44.1 %）及二氢香芹酮（1.9%）。中国专利CN101298581A公开了一种用超临界提取方法制备了莳萝子挥发油，GC-MS分析其重要成分为香芹酮（73.6%）和柠檬烯（14.7 %）。这些报告都与本发明涉及的莳萝子挥发油主要化学成分或含量有所不同。
没有任何文献报道过用莳萝子挥发油防治油菜菌核病。在本发明中，通过体内、体外实验证实了莳萝子挥发油在接触和挥发条件下对核盘菌菌丝生长有较好的抑制作用。测定了不同浓度莳萝子挥发油在接触实验时对于菌丝生长的抑制作用，结果表明在挥发油浓度为0.25-0.3 μl/ml时对核盘菌菌丝生长抑制率可达50-60%，在挥发油浓度为0.9-1.2 μl/ml时，对于菌丝生长的抑制率范围可达90-100%。在挥发条件下测定了不同浓度莳萝子挥发油对于菌丝生长的抑制作用，结果表明挥发油浓度在0.02μl/ml air以下时对于核盘菌菌丝生长没有抑制作用，当挥发油浓度为0.10-0.14μl/ml air时对于菌丝生长的抑制率可达75-100%。
莳萝子挥发油在接触和挥发条件下对核盘菌菌核萌发也有较好的抑制作用。在接触条件下，测定了不同浓度莳萝子挥发油对于核盘菌菌核萌发的抑制作用。结果表明当挥发油浓度低于0.1μl/ml以下时，对于菌核萌发没有抑制作用；当挥发油浓度为0.8-1.0μl/ml时，菌核萌发率仅为20%至0。在挥发条件下，测定了不同浓度莳萝子挥发油对于核盘菌菌核萌发的抑制作用。结果表明当挥发油浓度低于0.04μl/ml air时，对于核盘菌菌核萌发没有抑制作用；当浓度为0.14-0.16μl/ml air时，菌核萌发率仅为20%至0。
莳萝子挥发油对核盘菌有较强的体内抑制活性。在预防实验中，当挥发油浓度为0.1-0.25μl/ml时 ，菌斑直径范围为23.8-12.1mm，而空白对照菌斑直径为30mm，效果明显；当挥发油浓度在0.5μl/ml及以上时，完全抑制了核盘菌菌丝在油菜叶片上的生长，表现出良好的预防效果。在治疗实验中，当挥发油浓度为0.75-1.0μl/ml时，菌斑直径范围为10.9-8.7mm，而空白对照菌斑直径为30.4mm，表现出明显的治疗效果。
总之，本发明莳萝子挥发油的制备方法简单易行，容易操作。所制备的莳萝子挥发油对核盘菌菌丝生长和菌核萌发有较好的抑制作用，可用于油菜菌核病的防治。
具体实施方式
实施例1：莳萝子挥发油的制备
将干燥的莳萝子粉碎后过40目筛，称取400-500g，加入适量蒸馏水，蒸馏, 馏出物除掉水相后，每90-100ml挥发油用35-45g无水硫酸钠进行干燥，得到莳萝子挥发油，于4℃冰箱内密封避光保存。
以此法获得的莳萝子挥发油得率可达3.5%（v/m干重）以上。
采用日本SHIMADZU GCMS-QP2010型气相色谱-质谱联用仪对制得的莳萝子挥发油进行了分析。GC条件：Rtx -5MS毛细管柱（30m×0.25mm×0.25 mm）；进样口温度240℃；分流进样，分流比20：1；挥发油进样量1 μl；载气（99.999%的高纯氦）恒线速度40 cm/sec；吹扫气流量3 ml/min。升温程序：初始温度70 ℃，保持2 min；再以10 ℃/min程序升温至250℃，保持10min。MS条件：电子轰击源（Electron Impact, EI），电子能量为70 eV，离子源温度200℃，接口温度220℃。选取SCAN模式时，质量扫描范围为30~500（m/z），溶剂延迟2.5 min。根据保留时间，同时对各化合物质谱在NIST数据库进行相似检索，对各组分进行定性分析，其相对含量采用面积归一化法进行计算。GC-MS分析结果见表1。从莳萝子挥发油中共鉴定出了23个化合物（表1），占总含量的99.4wt%。主要物质有香芹酮（41.5wt %），柠檬烯（32.6 wt%）及芹菜脑（16.8 wt%）等。
表1 莳萝子挥发油主要化学成分
| Peak No. | R.I.a | Compound | Relativeconcentration (%) |
| 1 | 902 | α-侧柏烯 | tr |
| 2 | 948 | α-蒎烯 | tr |
| 3 | 958 | β-桂叶烯 | tr |
| 4 | 964 | β-水芹烯 | tr |
| 5 | 969 | α-水芹烯 | 0.5 |
| 6 | 998 | γ-松油烯 | 0.1 |
| 7 | 1018 | 柠檬烯 | 32.6 |
| 8 | 1031 | 氧化柠檬烯 | tr |
| 9 | 1042 | 聚伞花烃 | 0.2 |
| 10 | 1103 | 3,6-二甲基-2,3,3a,4,5,7a-六氢-1-苯并呋喃 | tr |
| 11 | 1121 | 茴香酮 | tr |
| 12 | 1179 | D-二氢黄蒿萜酮 | 2.6 |
| 13 | 1179 | L-二氢黄蒿萜酮 | 3.4 |
| 14 | 1190 | 香芹酮 | 41.5 |
| 15 | 1196 | 二氢葛缕醇 | 0.2 |
| 16 | 1196 | 新二氢香芹醇 | 0.3 |
| 17 | 1206 | 葛缕醇 | 0.2 |
| 18 | 1326 | 2,5-二乙基苯酚 | 0.6 |
| 19 | 1507 | 氧化石竹烯 | tr |
| 20 | 1515 | 1,6-环癸二烯 | tr |
| 21 | 1516 | 肉豆蔻醚 | 0.4 |
| 22 | 1568 | 细辛醚 | tr |
| 23 | 1705 | 芹菜脑 | 16.8 |
| 共计 | 99.4 |
a RI,保留指数 retention index on the Rtx-5MS column; tr (trace): 相对含量（relative content ）< 0.1%。
实施例2：莳萝子挥发油对核盘菌菌丝生长的抑制作用
在体外用接触、挥发实验测定了莳萝子挥发油对核盘菌菌丝生长的抑制作用。供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。供试病原真菌为核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）。
在接触实验中，在直径90mm的培养皿中加入温度为40℃的PDA培养基20ml，再加入一定量溶有0.1%吐温20的挥发油溶液与之混匀，获得挥发油终浓度为0.1-1.5 μl/ml，待培养基凝固后接种活化好的核盘菌菌落边缘菌丝块（直径为6mm），培养皿用Parafilm密封置于20℃培养箱中培养4天后用十字交叉法测量菌丝生长直径，并计算菌丝生长抑制率。
在挥发实验中，在直径为70mm滤纸片上分别加入溶有0.5%乙醇的不同浓度挥发油溶液1ml，在直径为90mm的培养皿加入20mlPDA培养基后将提供80ml的空间，将滤纸片置于培养皿盖中央，此时培养皿中挥发油的终浓度为0.01-0.16 μl/ml air。待培养基凝固后接入活化好的核盘菌菌落边缘菌丝块（直径为6mm），培养皿用Parafilm密封，置于20℃培养箱中培养。以十字交叉法测量菌圈，并计算菌丝生长抑制率。
上述实验分别在培养基中加入等量的0.1%吐温20溶液（接触实验）和在滤纸片上加入等量0.5%无菌乙醇溶液（挥发实验）作为空白对照组，通过下列公式可计算菌丝生长抑制率(%) MGI= [(d c －d t)/d c ]×100，公式中d c 、d t分别表示空白组及处理组菌丝生长直径。每个浓度处理2个培养皿，整个实验重复3次。
使用SPSS（13.0）软件对数据进行处理分析。在接触条件下，挥发油浓度为0.25-0.3 μl/ml时对核盘菌菌丝生长抑制率可达50-60%，挥发油浓度为0.9-1.2μl/ml时对于菌丝生长的抑制率可达90-100%。在挥发条件下，挥发油浓度在0.02μl/ml air以下时对于核盘菌菌丝生长没有抑制作用，当挥发油浓度为0.10-0.14μl/ml air时对于菌丝生长的抑制率可达75-100%。
实施例3：莳萝子挥发油对于核盘菌菌核萌发的抑制作用
在体外用接触、挥发实验测定了莳萝子挥发油对核盘菌菌核萌发的抑制作用。供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。供试病原真菌为核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）。
在接触实验中，将无菌沙土20ml与一定量的挥发油溶液（含0.1%吐温20）在直径为90mm的培养皿内混匀，使获得挥发油的终浓度为0.05-1.20 μl/ml，每个浓度的培养皿内沙土（沙土含水量约为70%）深度为0.5cm处放置10粒菌核，用Parafilm密封，在20℃培养箱内培养10天后，观察菌核萌发菌丝情况，以长出菌丝的菌核即认为是萌发菌核，计算萌发率。
在挥发实验中，在直径为90mm的培养皿内放入灭菌沙土（沙土含水量约为70%），在直径70mm滤纸片上分别加入溶有0.5%无菌乙醇的不同浓度挥发油1ml，再将滤纸片置于培养皿盖中央，获得挥发油的终浓度为0.02-0.18μl/ml air。每个浓度的培养皿内沙土表面放置10粒菌核，培养皿用Parafilm密封在20℃培养箱内培养10天后，观察菌核萌发菌丝情况，以长出菌丝的菌核即认为是萌发菌核，计算萌发率。
在以上实验中，在培养基中加入等量的0.1%吐温20溶液（接触实验）及在滤纸片上加入等量的0.5%无菌乙醇溶液（挥发实验）作为空白组，进行对照。萌发率计算公式为：萌发率（%）=菌核萌发数/菌核总数×100。每个浓度处理2个培养皿，整个实验重复3次。
使用SPSS（13.0）软件对数据进行处理分析。在接触条件下，当挥发油浓度低于0.1μl/ml以下时，对于菌核萌发没有抑制作用，当挥发油浓度为0.8-1.0μl/ml时，菌核萌发率仅为20%至0。挥发条件下，测定了不同浓度莳萝子挥发油对于核盘菌菌核萌发的抑制作用，当挥发油浓度低于0.04μl/ml air时其对核盘菌菌核萌发没有抑制作用，而当浓度为0.14-0.16μl/ml air时，菌核萌发率仅为20%至0。
实施例4：莳萝子挥发油对油菜菌核病的防治实验
用离体叶片，测定了莳萝子挥发油对核盘菌菌丝在叶片上生长的抑制作用。供试油菜（Brassica campestris L.，品种：“中油821” ）于8月上旬在室外环境条件下种植油菜。具体种植方法如下，取用75%乙醇消毒后的油菜种子10粒埋于装有湿润栽培土的花盆内（直径为80mm）内，覆盖种子的土壤厚度约为20mm。长出子叶时要适当遮阴，防治种苗晒伤，待油菜长出真叶后，可增加光照时间，促进其生长。油菜生长5周后，长出叶片约4-6片时，可用于莳萝子挥发油抑制核盘菌生长体内实验。供试病原真菌为核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）。
在预防实验中，取 “中油821” 油菜叶片2片放置于培养皿中（直径为90mm），叶片底垫滤纸（直径90mm），将不同浓度（0.1-1.0μl/ml）莳萝子挥发油溶液（含0.1%吐温20）5ml用10ml注射器喷洒于叶片上，培养皿用封口膜（Parafilm）密封置于20℃培养箱中培养，12h后，在叶片上接种活化好的核盘菌菌落边缘菌丝块（直径为6mm），每片叶片上接种1块。培养3天后用十字交叉法测量叶片上的菌斑大小。
在治疗实验中，取 “中油821” 油菜叶片2片放置于培养皿中（直径为90mm），叶片底垫滤纸（直径90mm），先接种活化好的核盘菌菌落边缘菌丝块（直径为6mm），每片叶片上接种1块。用封口膜（Parafilm）密封置于20℃培养箱中培养，12h后，将不同浓度（0.1-1.0μl/ml）莳萝子挥发油溶液（含0.1%吐温20）5ml用10ml注射器喷洒于叶片上，密封继续培养3天后，用十字交叉法测量叶片上的菌斑大小。
使用SPSS（13.0）软件对数据进行处理分析。在预防实验中，当挥发油浓度为0.1-0.25μl/ml时 ，菌斑直径范围为23.8-12.1mm，而空白对照菌斑直径为30mm，效果明显；当挥发油浓度在0.5μl/ml及以上时，完全抑制了核盘菌菌丝在油菜叶片上的生长，表现出良好的预防效果。在治疗实验中，当挥发油浓度为0.75-1.0μl/ml时，菌斑直径范围为10.9-8.7mm，而空白对照菌斑直径为30.4mm，表现出明显的治疗效果。
Claims (6)
1.一种莳萝子挥发油的制备方法，其特征在于：将干燥的莳萝子粉碎，称取适量，加入蒸馏水，进行水蒸气蒸馏，馏出物除掉水相后，干燥得莳萝子挥发油。
2.如权利要求1所述的莳萝子挥发油的制备方法，其特征在于：将干燥的莳萝子粉碎过40目筛。
3.如权利要求1所述的莳萝子挥发油的制备方法，其特征在于：馏出物除掉水相后，每90-100ml挥发油用35-45g无水硫酸钠干燥。
4.莳萝子挥发油用于抑制核盘菌菌丝的生长。
5.莳萝子挥发油用于抑制核盘菌菌核的萌发。
6.莳萝子挥发油用于油菜菌核病的防治。
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