CN102091717B

CN102091717B - 一种菌酶联合修复土壤ddt污染的方法

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Publication number: CN102091717B
Application number: CN2011100228298A
Authority: CN
Inventors: 赵月春; 马伟娟
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2011-01-20
Filing date: 2011-01-20
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2031-01-20
Also published as: CN102091717A

Abstract

本发明公开了一种菌酶联合修复土壤DDT污染的方法。本发明将白腐菌和游离漆酶以先后次序与含有DDT的土壤在室温下均匀混合，利用白腐菌—游离漆酶联合对土壤DDT污染进行修复。本发明所述方法对土壤中DDT的降解率均达到了50%以上，是一种操作简便、成本低廉、无二次污染的修复土壤DDT污染的方法。

Description

一种菌酶联合修复土壤DDT污染的方法

技术领域

本发明涉及一种土壤DDT污染的生物修复方法，特别是一种利用白腐菌—游离漆酶联合修复土壤中DDT污染的方法。

背景技术

有机氯农药DDT（双对氯苯基三氯乙烷）作为一种高效的杀虫剂曾被广泛使用，但由于其具有高毒和高残留性，因此，DDT已在2001年联合国环境规划署（UNEP）通过的《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》中要求全球统一行动优先控制和消除的12种持久性有机污染物（POPs）之一。尽管中国早在1983年就停用DDT，但由于DDT仍被用作疟疾防治药剂或农药三氯杀螨醇的原料，导致环境中不断有新的DDT输入，所以土壤中仍有大量的DDT残留。一些地区土壤中残留的DDT浓度远远超出国家土壤质量标准（GB/T 18407-2001）。

DDT可通过食物链在脂肪中积累，严重干扰人体内分泌系统，引发生殖障碍，甚至导致“三致”（致癌、致畸、致突变）作用。鉴于DDT可通过食物链给农产品安全和人体健康带来的潜在危害，开发有效修复土壤DDT污染的修复方法是十分紧迫的。

近年来，一些物理的、化学的和生物的修复方法已被应用于土壤DDT污染的清除。与传统的物理、化学方法相比，生物修复技术是利用特定的生物（植物、微生物或原生动物等）吸收、转化、清除或降解农药污染物，从而实现土壤净化、生态效应恢复的生物技术，是一种公认的有效、安全、廉价和无二次污染的方法而日益受到重视。上述不同生物修复技术本身也还存在各种缺陷亟待进一步研究解决，如：植物修复需要的时间可能过长、微生物修复存在接种微生物与土著微生物的竞争问题、接种微生物更多地是利用土壤本源有机物而不是污染物作为底物问题、在DDT浓度较低时修复效果欠佳问题等；本申请人在专利号为200710032998.3的发明中公开了一种修复土壤DDT污染的方法，将漆酶投加到DDT污染的土壤中直接催化降解残留在土壤中的DDT，降解效率高，是一种有效的土壤DDT污染的治理方法，对解决当今土壤DDT污染做出了重要贡献，但是酶修复也存在不足，包括酶纯化和提取耗时长、花费高和易失活等缺陷，影响了其实际推广应用。

鉴于土壤DDT污染的微生物修复技术和酶修复技术两者各自存在一些优点和一些不足，需要对二者进行取长补短，发挥其协同作用。但是具体如何寻找微生物和酶的合适的调配机制，包括合适的调配对象以及调配比例等，使微生物修复技术和酶修复技术能有效发挥协同作用，这一直是本领域的技术难题，缺少具体可行的技术方案。

发明内容

本发明的目的是弥补现有DDT污染土壤的修复技术的不足，提供一种被DDT污染土壤的微生物联合修复方法，采用本发明方法可以实现低成本、高效、安全的土壤修复。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种利用白腐菌—游离漆酶联合修复土壤DDT污染的方法，包括以下步骤：

（1）将白腐菌液与DDT污染土壤混合均匀；所述白腐菌液投加量为每15 g土壤投加5mL～15mL白腐菌液，白腐菌菌落数为3×10⁹ CFU/mL；

（2）往步骤（1）混合了白腐菌液的土壤中投加游离漆酶。

如果土壤的DDT污染浓度为5 mg/kg，那么步骤（2）所述游离漆酶最佳投加量为每克土壤6 U，其它污染水平的DDT污染土壤也适合。

步骤（2）是在白腐菌液与DDT污染土壤混合均匀14天后投加游离漆酶。

本发明可采用气相色谱仪方法，每隔7天对经上述处理的土壤中的DDT残留量进行分析检测。

所述白腐菌为市售品，为木材腐生菌，引起木材白色腐朽或褐色腐朽，菌肉白色或污白色，稍厚，菌柄侧生或偏生，有微细绒毛，后变光滑。

白腐菌的培养和游离漆酶的制备可参照本技术领域常规，本发明提供优选的白腐菌培养和游离漆酶的制备方法如下：

本发明以土豆作为培养基的主要成分，然后加入一些营养物，在往复式频率为130 rpm、温度为28℃的恒温培养振荡器中培养白腐菌，最佳培养时间为9天左右；上述培养基的组成主要为：土豆200g、水1000mL、葡萄糖20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、VB1 0.01 g及5 g酵母膏。

所述游离漆酶的制备方法包括以下步骤：

（A）将培养好的白腐菌培养液离心，然后取上清液为粗酶液；

（B）往步骤（A）制备得到的粗酶液中加入硫酸铵粉末使溶液中硫酸铵饱和度达到20%，常温静置；

（C）将步骤（B）静置后的体系在4 ℃下冷冻离心，取上清液，在上清液中加入固体硫酸铵至其饱和度达到80%，静置后冷冻离心，收集沉淀，用pH4.6的0.02 mol/L醋酸盐缓冲溶液溶解所得到的沉淀蛋白，除去不溶性蛋白，即制得游离漆酶。

步骤（B）所述静置时间优选为2小时。

步骤（C）所述静置时间优选为8小时。

相对于现有技术，本发明具有以下的有益效果：

（1）本发明采用白腐菌—游离漆酶直接联合修复土壤DDT污染是有效的、可行的，白腐菌和游离漆酶发挥了联合增效作用，对土壤中DDT的降解率均达到了50%以上，是一种高效、安全、无二次污染的修复土壤DDT污染的方法。

（2）白腐菌对浓度较高的污染物的降解效果比较好，而对于浓度小的污染物的降解效果不很理想；游离漆酶对于低浓度的污染物的降解效果比较理想，但游离漆酶存在纯化和提取耗时长、花费高等缺陷，本发明将白腐菌—游离漆酶联合使用，有效解决DDT污染土壤修复难题。

（3）本发明所用的白腐菌与游离漆酶制备方法简单，施用操作简便，与现有物理化学修复方法相比修复成本低。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明。下述实施例中所采用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料；所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1 游离漆酶的制备

（1）白腐菌的培养

液态培养基的组成：以200g土豆作为培养基，然后加入葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4 1.5g、VB1 0.01g及5g酵母膏和1000mL水。

将白腐菌菌种（购自中国科学院广州化学有限公司，其他公司出品的常规白腐菌菌种也可适用）直径为10 mm的菌片2片接种量接入上述100 mL培养基中，在往复式频率为130 rpm、温度为28℃的恒温培养振荡器中培养白腐菌。

（2）游离漆酶的分离纯化

将部分培养好（培养至9天的程度为最佳的）的白腐菌培养液倒入塑料离心杯，置于4000 rpm的冷冻离心机中4 ℃下离心15 min，取其上清液即为漆酶粗酶液；然后在得到的每100 mL 粗酶液中，在搅拌时缓缓加入研细的硫酸铵粉末11.3 g，使溶液中硫酸铵饱和度达到20%，25 ℃静置2 h，在4 ℃下冷冻离心后弃去沉淀，取上清液进一步纯化；每100 mL上清液中再加入固体硫酸铵42.4 g至饱和度达到80%，静置8 h后在同样条件下冷冻离心收集沉淀，用pH4.6的0.02 mol/L醋酸盐缓冲溶液溶解所得到的沉淀蛋白，并除去不溶性蛋白，即可制得游离漆酶，此漆酶为黄色的液体状；利用ABTS测定漆酶的活性。

实施例2

研究白腐菌加菌量对白腐菌—游离漆酶联合修复土壤DDT污染的影响。

供试土壤为赤红壤，取自广州华南农业大学树木园。土壤室内风干后过2 mm筛备用。该土壤均未检测出DDT。将DDT溶液与供试土壤在室温下均匀混合制备出5 mg/kg的DDT污染赤红壤，放置4周后进行修复试验。试验中保持土壤的含水率为15%左右。实验设置对照（不加菌、不加漆酶）、加菌量1（白腐菌投加量为5 mL/15 g土、漆酶投加量为6 U/g土）、加菌量2（白腐菌投加量为10 mL/15 g土、漆酶投加量为6 U/g土）、加菌量3（白腐菌投加量为15 mL/15 g土、漆酶投加量为6 U/g土）共4个处理。其中白腐菌是在第1天投加，白腐菌的菌落数为3×10⁹ CFU/mL左右；游离漆酶是在第15天投加，漆酶的投加量均为6 U/g土。试验每个处理用土15 g，设3个重复，分别置于烧杯中试验处理28 天。

试验前测试供试土壤中的DDT初始浓度，其后分别在第7、14、21、28天进行取样分析。称取10 g土壤置于索式抽提器中，用体积比为1﹕1的石油醚和丙酮混合液100 mL浸泡10 h后抽提6 h。同时做空白试验。将抽提液转移至分液漏斗中，加入10%的无水硫酸钠溶液，摇荡1 min后静止分层，取上层石油醚层并加入相当于石油醚层体积1/10的浓硫酸分配3～4次，直至上下层都呈无色为止。再加入剩余石油醚层体积一半的10% 无水硫酸钠溶液洗涤，直至石油醚层溶液至中性，过无水硫酸钠脱水，浓缩，定容至10 mL，待测。最后利用气相色谱进行分析检测。

气相色谱仪为HP5890Ⅱ，色谱柱为HP-5，30 m×0.320 mm（id）×0.25 μm；载气为99.999%的高纯氮气，气化室温度220 ℃，柱温195 ℃，检测器（ECD）温度为245 ℃，载气流速2 mL·min-1。采用不分流进样，进样量为2 μL。表1描述了加菌量对DDT降解率的影响。由表1可知，对照处理中，DDT的降解率随时间缓慢增加，降解过程不显著；当加菌量分别为5 mL、10 mL、15 mL时，28天后DDT的降解率均达到了50%以上，这说明白腐菌与游离漆酶能有效地降解土壤中的DDT，这为采用白腐菌—游离漆酶联合修复土壤DDT污染提供了保证。

表1 加菌量对DDT降解率的影响结果

由表1可以看出，当白腐菌的加菌量为5 mL时，DDT的降解率最高，达到了66.82%，

因此，采用白腐菌—游离漆酶联合修复土壤DDT污染时，在固定漆酶加入量为6 U/g土的前提下，白腐菌的最佳投加量为5 mL/15 g土（菌落数为3×10⁹ CFU/mL左右）。

实施例3

研究白腐菌、游离漆酶、白腐菌—游离漆酶联合分别对修复土壤DDT污染的影响。

采用同实施例2的方法制备5 mg/kg的DDT污染赤红壤。分别采用单独投加白腐菌、单独投加游离漆酶、白腐菌—游离漆酶联合不同微生物处理方法进行土壤DDT污染的修复试验。试验设置对照（不加菌、不加漆酶）、试验1（单独加菌5 mL/15g土）、试验2（单独添加漆酶6 U/g土）、试验3（白腐菌投加量为5 mL/15 g土、漆酶投加量为6 U/g土）4个处理。其中单独添加的白腐菌或者漆酶都是第一天投加；而联合的白腐菌是在第1天投加，游离漆酶是在第15天投加。其中，白腐菌的菌落数为3×10⁹ CFU/mL左右。每个处理用土15 g，设3个重复，分别置于烧杯中试验处理28天。试验中保持土壤的含水率为15% 左右。

试验前测试供试土壤中的DDT初始浓度，然后分别在第7、14、21、28天进行取样分析，分析方法如实施例1。表2投加不同微生物对DDT降解率的影响。

由表2可知，对照处理中，DDT的降解率随时间缓慢增加，降解过程不显著；对于试验组中，DDT的降解率均随着处理时间的增加而增加；单独投加白腐菌、单独投加游离漆酶、白腐菌—游离漆酶联合投加的降解率分别是：45.37%、47.65%和66.82%；明显看出，白腐菌—游离漆酶联合投加的修复效果远远高于单独投加白腐菌和单独投加游离漆酶的修复效果。

表2投加不同微生物对DDT降解率的影响

实施例4

研究土壤微生物对白腐菌—游离漆酶联合修复土壤DDT污染的影响。

采用同实施例2的方法制备5 mg/kg的DDT污染赤红壤。分别采用非灭菌土和灭菌土两种不同的处理土样进行土壤DDT污染的修复试验。灭菌土样是在灭菌锅中进行灭菌。设置非灭菌对照、非灭菌加白腐菌—游离漆酶、灭菌对照和灭菌加白腐菌—游离漆酶共4个处理，其中白腐菌是在第1 天投加，游离漆酶是在第15 天投加。土样加菌量为5 mL/15g土（菌落数为3×10⁹ CFU/mL左右）；漆酶投加量为6 U/g土。每个处理用土15 g，设3个重复，分别置于烧杯中试验处理28 天。试验中保持土壤的含水率为15%左右。

试验前要测试供试土壤中的DDT初始浓度，分别在第7、14、21、28天进行取样分析，分析方法如实施例1。表3为非灭菌土和灭菌土对白腐菌—游离漆酶联合修复土壤DDT污染的影响。

由表3可知，对于白腐菌—游离漆酶联合处理的非灭菌土壤和灭菌土壤中， DDT的降解率均随着处理时间的增加而增加，灭菌土中DDT的降解率稍高于非灭菌土的，但相差不大，在各个时间点两种土壤中的DDT的降解率几乎相当。28天后灭菌土中DDT的降解率为70.17%，而非灭菌土中DDT的降解率为68.63%。

表3 土壤微生物对对白腐菌—游离漆酶联合修复土壤DDT污染的影响

实施例5

研究金属离子Cd²⁺对白腐菌—游离漆酶联合修复土壤DDT污染的影响。

采用同实施例2的方法制备5 mg/kg的DDT污染赤红壤，同时按照实验设计投加一定浓度的CdCl₂溶液，然后将该溶液与DDT污染土壤混合均匀，使土壤中Cd²⁺污染水平分别为0 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg和2 mg/kg，放置4周后进行修复试验。白腐菌是在第1天投加，游离漆酶是在第15天投加。土样加菌量为5 mL/15 g土（菌落数为3×10⁹ CFU/mL左右）；漆酶投加量为6 U/g土。每个处理用土15 g，设3个重复，分别置于烧杯中试验处理28天。试验中保持土壤的含水率为15%左右。

试验前测试供试土壤的DDT初始浓度，然后分别在试验进行后的第7、14、21、28天进行取样分析，分析方法如实施例2。

表4为不同Cd²⁺浓度对白腐菌—游离漆酶联合修复土壤DDT污染的影响。

由表4可知，对于所述4种不同Cd²⁺浓度的DDT污染土壤，经过白腐菌—游离漆酶联合处理后，土壤中的DDT均有不同程度的降解，但随着土壤中Cd²⁺浓度的增加，DDT的降解率却在逐渐减小，这表明Cd²⁺对白腐菌—漆酶联合修复土壤DDT污染具有抑制作用。

表4 不同Cd²⁺浓度对白腐菌—游离漆酶联合修复土壤DDT污染的影响

Claims

1.一种菌酶联合修复土壤DDT污染的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将白腐菌液与DDT污染土壤混合均匀；所述白腐菌液投加量为每15g土壤投加5mL～15mL白腐菌液，白腐菌菌落数为3×10⁹CFU/mL；

(2)往步骤(1)混合了白腐菌液的土壤中投加游离漆酶，所述游离漆酶投加量为每克土壤6U；

其中，步骤(1)所述白腐菌是将白腐菌接种于培养基中并置于往复式频率为130rpm、温度为28℃的恒温培养振荡器中培养得到；所述培养基的组成主要为：土豆200g、水1000mL、葡萄糖20g、KH₂PO₄ 3g、MgSO₄ 1.5g、VB1 0.01g及5g酵母膏；

步骤(2)所述游离漆酶的制备方法包括以下步骤：

(A)将培养好的白腐菌培养液再离心，取上清液为粗酶液；

(B)往步骤(A)制备得到的粗酶液中加入硫酸铵粉末使溶液中硫酸铵饱和度达到20％，常温静置；

(C)将步骤(B)静置后的体系在4℃下冷冻离心，取上清液，在上清液中加入固体硫酸铵至其饱和度达到80％，静置后冷冻离心，收集沉淀，用pH4.6的0.02mol/L醋酸盐缓冲溶液溶解所得到的沉淀蛋白，除去不溶性蛋白，即制得游离漆酶；

步骤(2)是在白腐菌液与DDT污染土壤混合均匀2周后投加游离漆酶。

2.根据权利要求1所述菌酶联合修复土壤DDT污染的方法，其特征在于步骤(B)所述静置时间为2小时。

3.根据权利要求1所述菌酶联合修复土壤DDT污染的方法，其特征在于步骤(C)所述静置时间为8小时。