CN102077077A - 分类和计数微观元素的电光测量装置和电光测量方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于通过测量存在于测量槽(111)中的流体的光致发光来进行生物分析的装置(100)。所述装置(100)包括至少两个光源(121，131)，该至少两个光源适于在分别适合用于吸收和荧光的测量的不同的光谱域内发光，该装置(100)还包括传感器装置(140)，该传感器装置(140)包括传感器(141)、光学系统(142)和滤光器装置(144)，这三个组件根据本发明互相作用以使得吸收和/或荧光能够被测量。根据本发明，所述传感器(141)的内部增益可配置为使得荧光和吸收测量能够被顺序地执行。

Description

分类和计数微观元素的电光测量装置和电光测量方法

技术领域

本发明的领域是生物分析领域，特别是血液分析。本发明涉及用于对存在于测量槽中的流体进行电光测量的装置和方法的通用领域。这样的装置和方法特别意欲用于对流体，例如生物流体中的微观对象进行分类和计数。

更精确地说，本发明涉及使用分析方法的装置，该分析方法基于使用电的和光学测量来计数和区分存在于待分析的样品中的细胞。在本发明的内容中，优选是血液样品。

背景技术

对于造血细胞，本领域技术人员知道，细胞的体积的或者衍射的形态学分析，包括消光或者吸收现象，能够辨别主要的细胞系，包括红血球(红细胞)、凝血细胞(血小板)、以及白血球(白细胞)。白细胞种群本身分成多个种类，诸如淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜曙红细胞和嗜碱细胞。

这些细胞的成熟度在一定程度上可以通过同时确定它们的体积和它们对白光的表观吸收来确定，如申请人提交的美国专利5,138,181中所述的。在申请WO 2006/053960中描述了使用准单色光的装置。

细胞成熟度的这种评估是非常重要的，因为其能够用于早期诊断。通常来说，存在于循环血液中的大部分的细胞都是成熟细胞。

对于上述的各个细胞种类来说，各种成熟度是已知的。因此红细胞，也叫做红血球，最初以原成红细胞的形式生成，然后是嗜碱性的成红血球细胞，然后是多色的成红血球细胞，其演化为嗜酸性成红血球细胞，然后是网状细胞。这些网状细胞一旦进入循环血液中，就最终变异为红细胞。

白细胞，也叫做白血球，同样最初以初始成髓细胞的形式产生于骨髓中。这些成髓细胞随后产生前粒性白细胞，前粒性白细胞随后转化成嗜碱性的、嗜曙红的、或者嗜中性的粒性白细胞，首先是未分裂的，然后其细胞核随生长期不断地分裂。

相同的成髓细胞还是单核细胞系的来源，单核细胞系产生成单核细胞、前单核细胞、以及进入外围循环系统的单核细胞。

从中产生成髓细胞的干细胞也通过变异以淋巴干细胞的形式产生淋巴细胞系，该细胞系的一部分在胸腺和神经节(T线)中继续成熟，残余物残存在骨髓中以产生B淋巴细胞系。相同的B淋巴细胞，一旦以浆细胞的形式被激活，就产生抗体来抵御致病的抗原。

血小板，也叫做凝血细胞，来源于成巨核细胞，成巨核细胞本身从骨髓祖代细胞中产生，从骨髓祖代细胞中产生成髓细胞，这些成髓细胞，一旦达到它们成熟的最后阶段(血小板型巨核细胞)就通过分裂其细胞质产生血小板。刚产生的血小板(网状的血小板)含有RNA，其是原始细胞的残余物。

一些病理学的诊断需要愈加精确的血液细胞的计数。特别是，需要能够示出新的种群，诸如网状细胞和成红血球细胞，它们是红血球的不成熟的形态。类似地，示出不成熟的细胞，所谓的不成熟的淋巴细胞的白细胞的前体、单核细胞或者粒细胞都是非常重要的。同样地，对活性的淋巴细胞或者网状的血小板进行分类和计数对于病人的诊断可以获得有意义的改进。

由于红细胞的平均寿命是120天，因此正常的再生速度必须是0.83％。通常接受的正常的平均百分比在0.5％到1.5％的范围内，这些值在出生小于三周的婴儿体内会高一些(从2％到6％)。对网状细胞的观察和计数因此是红血球生成活性的指标，并因此，特别是在化疗之后监控骨髓再生过程中，通过重组促红细胞生成素(rHuEpo)的后续治疗中，在贫血探测平衡中，或者在寻找溶血或者代偿性出血中，都是非常有用的参数。

以下将给出几个病理的示例，其中以这一方法对细胞进行区分和计数是有用的。

对成红血球细胞进行计数的临床价值已证实对于检测例如特定形式的贫血症是很重要的。溶血性贫血的共同的特点是成熟红血球的过量的破坏，这可由细胞外的因素或者红细胞的结构或者功能的本质的异常引起。

红白血病是严重的成髓细胞白血病的变种，其特征在于红系的细胞和粒状系的前体的恶性的增殖。从细胞学的观点来说，在最初阶段，已注意到，循环血液中存在着外围白血球过多(59％)。髓细胞血症对应于不成熟元素、粒状系或者红血球系进入循环血液中。

在区分的方面，网状细胞组成最感兴趣的细胞群之一，在自动血液分析领域存在着许多方法，并且在发展中。这些细胞系可通过使用荧光染色剂，例如不对称的青色素，特别是噻唑橙对核酸进行标记来计数。

该分子对于核酸(RNA或者DNA)的内部细胞质的探测具有独特的理化特性。当在溶液中成自由状态时，这种分子表现出由光子激发引起的非常微弱的荧光特性。噻唑橙的立体化学结构使得这种分子在核酸的基体之间是交错的。在这种状态下，这种分子发出荧光。因此探测和测量荧光的水平就能够对细胞质内的核酸定量。细胞的性质可以从细胞质内的核酸的量，结合辅助的光学或者电学测量得出，因此能够对它们进行绝对的或者相对的计数。

现有的用于测量这种荧光的电光装置相对比较复杂。它们使用很多的硬件资源，特别是如果需要较高的分析速度的时候。在这种情况下，相对标准的实施方法是使用激光光源以及一组用于测量衍射的、通常使用缩写FSC(前向散射)和SSC(侧向散射)来标识的传感器，或者用于测量消光的、通常使用缩写ALL(轴向光损失)来标识的传感器。

相同的激光可以在细胞经过激光束的时候，引起细胞内或者细胞上存在的标记物或者染色剂发出荧光。以标准方式，基于荧光和衍射光的光谱特性将它们分开。为此，通常使用多层介质(multi-dielectric)干涉滤光片，即通过将具有不同折射率的两种或者多种透明材料交替沉积而形成的滤光片。为了测量荧光，使用大多数时间都工作于雪崩模式的光电倍增管或者光光电二极管。这些系统在光学和机械方面来看相对比较复杂。

美国专利申请2006/0219873公开了AGC(自动增益控制)雪崩光电二极管的使用。该装置用于流动血细胞计数器，其中光电二极管的增益根据所施加的电压的改变而自动调节。

Sysmex名下的专利申请EP1 710 558公开了用于从每个光源恢复数据的多个传感器。这种装置也只能实现SSC测量。

专利申请EP 0 533 333公开了一种在线读数装置，其中细胞在流动时并未被分析。同样，尽管能够获得数据(吸收、荧光、反射数据)，但该数据无法使用单个传感器来获得。

专利申请WO 2008/019448公开了一种没有吸收读数的落射荧光装置。

专利申请EP 0 806 664公开了在必要的时候使用多个传感器从多个不同的光源获得数据。

美国专利No.4 745 285公开了一种能够对以多种荧光染料标记的颗粒进行计数的装置。这种装置具有单波长光源和多个能够恢复每个荧光的数据的传感器。

美国专利NO.5 408 307公开了一种能够使用多个不同的传感器实现FSC、SSC和荧光测量的装置。

美国专利No.6 897 954(Becton Dickinson与Co)描述了使用多种荧光结合多个光传感器在流动时对细胞计数。每个光传感器的增益可以调节，以使其适应所检测的荧光。

已知的装置没有一个集合了电光的和光-流体的测量系统，而这对于生物细胞，特别是循环血液中的那些细胞的区分和计数来说是必要的。现有装置的尺寸和复杂性使其造价昂贵，而且操作复杂。

发明内容

因此本发明的主要目的在于提出一种对测量槽中的流体进行电光测量来进行生物分析的装置，来克服上述缺点，该装置包括至少两个光源，该至少两个光源适于在分别适合用于吸收和荧光的测量的不同光谱域内发光，该装置还包括用于测量与每个吸收和荧光测量相关联的阻抗的装置，以及共用的传感器装置，该共用的传感器装置包括传感器、光学系统和滤光器装置，其中这三个组件互相作用以使得吸收和/或荧光能够被测量，传感器的内部增益可配置为使得荧光和吸收测量能够被连续地执行。

该装置配置为通过光学系统测量荧光，使用传感器测量吸收。这一方法导致作为本发明特征的最优化的集成水平。本发明的优点包括降低制造成本，并且易于实现。

使用这样的装置，可在“双测量”模式下测量每个细胞，即，电阻测量与吸收和/或荧光测量一起。电阻测量与吸收或者荧光测量的结合能够获得测定体积的信息。

表观吸收主要涉及细胞的折射/衍射现象。以上测量获得足够可靠的数据，来获得对特定的细胞种群来说是灵敏的结果。

本发明提出原创和简化的光学装置，能够对使用具有特定功能的试剂预先使用化学方法制备的细胞悬浮液进行读取。使用体积-吸收读取和体积-荧光测量，即通过相同的传感器装置执行的双参数电光测量顺序地分析这些细胞悬浮液。

这种双测量极大地简化了硬件资源。本发明的装置因此能够对以下细胞进行分类和计数，例如，血小板、红细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、网状细胞、成红血球细胞、网状血小板、未成熟的淋巴细胞、未成熟的单核细胞、未成熟的粒细胞、活性的淋巴细胞和非分节的嗜中性粒细胞。

在本发明的一个实施例中，传感器是连接至偏置电路的雪崩光电二极管，该偏置电路适于抑制内部雪崩增益。

本发明新颖的内容中，使用特定偏置的简单的雪崩光电二极管能够以相对低的成本简单并且有效地实施本发明。

在本发明的优选实施例中，所抑制的内部增益为1，雪崩光电二极管作为简单的光电二极管工作。

该实施例为了吸收测量的目的，将雪崩光电二极管的操作简化成如传统使用的标准光电二极管。在不存在本发明提供的增益抑制的情况下，如果在高光强下用于吸收测量，雪崩光电二极管将立即饱和。

在本发明的一个实施例中，偏置电路包括一个双位开关，其提供两个不同的电压，即高电压和低电压，并数字受控来提供偏置光电二极管的高电压或者低电压。

通过简单的开关控制，本发明的该实施例提供了非常可靠的操作。二极管随着开关的位置的改变而相继地以高电压和低电压偏置。这修改了内部增益，并且因此修改了接收器的灵敏度。

在本发明的另外一个实施例中，偏置电路包含可编程的电压发生器或者通过数字或者模拟方式控制的电压发生器，来控制由该发生器施加到雪崩光电二极管上的偏置电压。

该另外的实施例能够使用单个电压发生器。

根据本发明的一个具体特征，该两个光源具有与光传感器的光轴共面的发射光轴。

在吸收模式下，光学装置结合三个平面，即，入瞳平面，细胞穿过该入瞳平面，以及接收瞳平面。照明因此是符合牛顿物理学的。在此，光学系统对第三级像差进行校正，也即校正由测量腔的平面、水面和玻璃、折射表面引入的几何像差和色差。所有对测量来说起作用的光路都是共面的。

根据本发明的有利特征，发出吸收波长的光的光源的光轴与光传感器的光轴是一致的，用于激发荧光的光源的光轴与传感器和另一光源的光轴是垂直的。

该特征使得传感器装置具有良好的吸收和荧光性能。对于吸收测量，传感器装置定位于面对光源。对于荧光测量，将光源布置为与传感器装置垂直，防止了光发射对低强度荧光测量的干扰。

根据本发明的另一具体特征，用于荧光的标记物是噻唑橙，荧光激发源必须发出大约470纳米(nm)的光，传感器装置的滤光器装置必须包括截止于495nm的彩色滤光片。

已经知道使用噻唑橙对于区分多种细胞种群是有利的。在本发明的内容中，其允许使用相对低成本的彩色玻璃滤光片。这样的廉价的滤光片仅对于特定类型的带宽才是可用的。噻唑橙即使在位于488nm处的低于其次级最大激发的位置被激发，仍然具有一定的功效。因此本发明人发现在波长大约470nm处激发噻唑橙，同时结合使用以相对低的成本就能够得到的彩色玻璃，并使用雪崩光电二极管或者具有高的内部增益的传感器，能够实施完全相关的定量荧光测量，即灵敏且特定的测量。该发现被本发明通过优选的方式使用，使本发明进一步能够使用雪崩二极管执行吸收测量。

传感器优选连接至具有基于所实施的测量而改变的电子增益的电子放大级。

使用电子放大级通过最大化用于随后的数据处理的可用动态范围的使用，提高了发光强度量化改善的可能性。

根据本发明的一个应用特征，传感器的内部增益和电子增益可配置为能够用于多个细胞种群的吸收和荧光测量的区分，所述细胞种群选自嗜碱细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、红色血细胞(红血球)、血小板、成红血球细胞、红色血细胞前体、网状细胞、以及网状的血小板。

该特征在使装置适于测量待计数的不同种类的细胞方面提供了一定的灵活性。这一灵活性使得能够调节传感器装置的灵敏度以及随着细胞种类的改变而使用数据处理动态范围。

特别是，传感器的内部增益和电子增益可有利地配置为能够使用传感器装置在每一次分析周期内区分吸收和荧光测量。

在此，分析周期指的是使用该装置对存在于样品中的细胞种群进行分类和绝对计数的每个周期。

这还对应于包括使用特定的试剂和其它参数，例如细胞进入测量槽的速度，对待分析的样品进行培养的过程。因此在本发明中，例如可实施五个不同的分析周期。LMNE周期对应于能够对淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜曙红细胞进行精确分类和计数的分析周期。GR/PLT周期能够对红血球和血小板绝对计数。BASO周期能够对嗜碱细胞区分和计数。RETIC周期能够对网状细胞，即红细胞的前体区分和计数。ERB周期能够对这些网状细胞的前体，即成红血球细胞计数。

传感器的内部增益和电子增益可有利地配置为能够使用传感器装置对至少嗜碱细胞和网状细胞区分吸收和荧光测量。

该特征能够覆盖对上述每种细胞类型所观测的平均照射强度的光谱。在RETIC周期期间荧光发光强度是最低的。因此传感器的灵敏度必须是最大灵敏度。相反，嗜碱细胞通过以发光强度是最高的配置的吸收测量来测量。因此在BASO周期中，传感器的灵敏度必须是最小灵敏度。通过确保这两种极端细胞的计数，通过调节传感器的内部增益和电子增益，必然能够调节装置以用于其它的细胞类型。

根据本发明进一步的附加特征，所述两个光源可以同时接通，来获得生化和形态学的数据。

附图说明

本发明的其它特点和优点将会在下文中结合附图得以清楚说明，其中附图中示出了本发明的一个非限定性的实施例。在附图中：

图1是本发明的装置的透视图；

图2是图1的装置的(XZ)截面图；

图3是图1的装置的(YZ)截面图；

图4是图1的装置的简化平面图；

图5示出了噻唑橙的激发和荧光光谱；

图6是本发明的一个实施例中与传感器连接的电控制电路的示意图；

图7示出用于本发明的优选实施例中的彩色玻璃滤光器的高通传输；以及

图8是使用该装置能够获得的各种结果的示意图。

具体实施方式

图1是本发明的装置100的优选实施例的透视图。该装置100包括四个功能组件：支撑测量槽的组件110，支撑光源的组件120和130，以及支撑光传感器的组件140。在所示的本发明的实施例中，支撑光源的两个组件120和130互相垂直，两个中的其中之一面对支撑传感器的组件140。

图2是装置100在平面XZ上的截面图，其中平面XZ与测量平面相交。组件110包括测量槽111和喷嘴112，该喷嘴112根据流体血细胞计数器的原理，向测量槽111内放出流体，从而在其中产生待分析的流体。组件130包括光源131和光学系统132，用以向测量槽提供合适的照明。

组件140包括传感器141和用于使传感器141适当地接收光的光学系统142。组件130和140的光轴垂直于流动方向。

图3是装置100在平面YZ上的截面图，其中平面YZ与测量平面相交。组件120包括光源121和光学系统122，用以向测量槽提供合适的照明。

这里应当再次指出，组件120的光轴垂直于流体流动的方向。组件120、130和140的三个光轴因此共面，并且在测量槽111中流动的流体垂直于该共同的平面。

图4是装置100的简化平面图，其中测量槽111图示性地以光源121、131和传感器141表示。

两个光源121和131发出不同波长的光，用于两种类型的测量，即吸收测量和荧光测量。吸收测量是对表观吸收的测量，该表观吸收是由于细胞的存在，且特别是由于细胞中原生的或者人造的细胞色素的存在而引起的衍射、折射/反射以及真实的吸收效果的总和。

表观吸收主要涉及细胞的折射/衍射现象。对于大多数细胞，特别是对于粒细胞系的细胞，微粒和对它们大小和数量的精确评估有助于高质量的形态学的分析。

以下描述用于测量噻唑橙的荧光以及测量吸收的本发明的非限定性的实施例。

图5示出了噻唑橙的光谱特性。注意到，最大吸收波长为大约510nm。该波长与位于530nm附近的再发射波长邻近，但是优选使用主要在大约480nm的次极大值处发光的光源。

在本发明的一个实施例中，光源121是20毫瓦(mW)的473nm的激光二极管，用于激发在流动细胞计数器的测量槽111中循环的以噻唑橙标记的细胞。每个细胞发出的荧光，正比于构成其的核酸的量，在传感器141的光轴成90°的位置被收集。为了稳定波长，激光二极管121优选经整流来防止温度以及发光功率随着时间的波动。

此外还知道，由激光二极管121发出的光非常显著地发散，在一个轴上的半高宽角度达到40°，在与前一个轴垂直的另外一个轴上达到10°。

而且，还需要特别的准直光学系统，以校正激光二极管121发出的光束的非常显著的发散。通常使用模制非球面透镜来实现这一目的，因为它们批量制造而成本很低。为了收集所发出的全部激光束，这些透镜的数值孔径通常至少为0.5。使用这种类型的透镜能够形成低发散的准直光束。通过一对变形棱镜，目前为椭圆的校准光束可以变为圆形的。这一操作通过压缩长轴或者拉伸短轴来获得圆形的光束。应该注意，压缩长轴在本发明的装置中并不是必要的，因为激光二极管121的椭圆的形状并不是问题；相反，它有利于使光束适合于椭圆的捕捉窗口117，该窗口在距离注入喷嘴112开口的距离为200微米(μm)处的大小大约为20×60平方微米(μm²)(参见图4)。

第二光源131优选发出大约650nm的光。在本发明的一个实施例中，该光源是谐振腔发光二极管(RCLED)。

根据本发明，使用传感器141来测量荧光和吸收。光学系统142也与传感器141相关联用于荧光和吸收。

传感器141连接至电控制电路143，该电控制电路143适于调节其增益。

在此描述的本发明的实施例中，传感器141是雪崩光电二极管，其偏置通过控制电路143来调节，以使得光电二极管141根据本发明的原理来工作。

本发明使用控制电路143来抑制雪崩增益，以将雪崩二极管配置成简单的二极管。因此雪崩二极管具有可切换的增益。这是使用雪崩二极管的创新的、之前未公开的模式。

本发明的有益之处在于仅使用一个传感装置来对血液元素进行特性化和计数。由于对每个测量(吸收和荧光)来说，不使用双探测通道，这样就节约了成本。

图6是用于控制光电二极管141的控制电路143的结构的功能框图。该电路143具有能够产生低的和高的电压的可编程电压源。

电路143中的两个数字控制用于设定光电二极管141的探测灵敏度和增益参数，该光电二极管141例如可以是滨松(Hamamatsu)S5343。

如功能模块201所示出的，通过对应于双位开关的TTLS 1-数字数控器来控制雪崩增益M。该增益，也称为内部增益，决定了接收器的灵敏度，即其能探测到的光子的最小数量。

当TTLS＝1，即所谓的高电压，例如等于150伏特(V)时，使结点偏置于雪崩模式，给与传感器大于1的内部增益M，例如M＝60；则传感器的灵敏度是最大灵敏度，典型地是10皮瓦(pW)。

在雪崩模式下，调节反向电压来获得与待探测的荧光的水平相适应的增益。在本发明的优选实施例中，考虑到部件141运行所处的环境温度的变化，电压校准到它们的标称值附近。这样的电压校准在25℃到40℃的给定温度范围内，能够在其标称值点稳定增益，典型地达到60的量级。

当TTLS＝0，即所谓的低电位，例如15伏特时，使结点偏置于光电二极管模式，则没有增益(M＝1)，其中接收器的灵敏度为1纳瓦(nW)的量级。

所使用的偏置电压当然可以随着所使用的二极管的改变而变化。对于本实施例中使用的二极管类型，可以选择低于30V且开始发生雪崩效应的非零电压来提供单位增益。相反，由于在低于15V时结点电容快速增加，优选选择不明显低于该值的电压值，来获得所需的频率范围内的操作。

在低电压时，典型地在10到20V的范围，即使在PN结内的空间电荷区域也很小。因此，雪崩效应的放大基本上被抑制，部件141用作简单的发光二极管。

为了减小发光二极管皮法(pF)量级的结电容至充分值而将偏置电压设置为非零值提供给传感器141适于探测短的光脉冲的宽带，该短的光脉冲的持续时间典型地为10微秒(μs)。然而，该电压必须维持足够低来防止光电二极管中的内部放大。

结电容的减小对于向传感器提供适合用于分析来自于分析系统的信号的最优带宽是必要的。这些信号是随机的脉冲序列。

对瞬时分辨率的需求以及对基本未由接收器电路变形的信号进行分析的必要性要求带宽F_p＞F_co，其中F_co是最小截止频率，从而脉冲没有明显的变形。实际上，F_co例如等于350千赫兹(kHz)。

在这种雪崩效应被抑制的操作模式下，传感器141用于测量细胞的表观吸收。例如，血色素是红血球的原生的细胞色素。曙红是人工的细胞色素，其可通过例如在专利EP 0 430 750中描述的方法与白细胞固定。

本发明的不同实施例可以使用可编程的或者可控制的电压产生器。可以通过数字或者模拟的方法来控制施加到雪崩光电二极管141上的反向电压，从而控制其内部的增益并因此控制接收器的灵敏度。

无论怎样的偏置模式，光电二极管都耦接到跨阻抗放大器模块202，用以将光电流转变为电压。

在本发明的优选实施例中，跨阻抗增益等于300千欧(kΩ)。输出电压为±15V，以便获得足够的输出动态范围。具体而言，需要宽的动态范围来实现精确的吸收测量。

吸收测量包括观测连续分量I的光损失δI。分析信号δI＝σI，其中σ是由于被分析的颗粒造成的吸收导致的光损失的分数。使用由光电噪声限制的接收器，均方噪声值等于

其中q是电子的电量，B是接收器电路的带宽。

信噪比为

$\mathrm{\δI}/b=\mathrm{\σI}/.\sqrt{2\mathrm{qIB}}=(\mathrm{\σ}/\sqrt{2\mathrm{qB}})\sqrt{I}$

该公式表明，信噪比随着增加，从而需要使用最高的光通量的值。然而该光通量不能大于特定的值该值通过等式来定义，其中R是跨阻抗增益，η是在照射波长下传感器的量子产率，Vs是第一放大器的饱和电压。这里示例性地给出了典型的值，Vs＝12V，R＝300千欧，在650nm处η＝0.6安培/瓦(A/W)，从而能够计算出

微瓦(μW)。通过标准δI/b＝1定义出的探测界限则能够确定可探测的光分数σ：

$\mathrm{\σ}=\sqrt{2\mathrm{qB}}/\hat{I}={4.10}^{-5}$

有可能探测到的最小有效吸收部分等于

σ′＝σ.(a.b)＝0.1μm²

其中a和b分别为测量窗口的高度和宽度，该窗口适合对诸如血小板的小元素进行探测。

在雪崩模式下，灵敏度是最优化的灵敏度，接收器电路的灵敏度由光电二极管的特性给出，特别是在M＝60的雪崩模式下获得10pW的量级的噪声等效功率(NEP)。

模块203调节在下游电路范围内来自第一模块202的信号。模块203能够将电压调节到模数转换器或者处理器电路的输入动态范围。信号由放大器增益的最优化调节来确定。在此，放大器是非反相操作放大器，其闭环增益由下式给出：G＝(1+r/R)，其中r是反馈电阻，R是在非反相输入与地之间的旁路的等效电阻。增益G有利地以比值1∶5变化，能够进一步增加光探测的灵敏度。

在此应注意，电阻R是数字控制的，这对于通过微控制器进行远程控制是有利的，例如，图5中示出的本发明的实施例中，模块205包括现货供应的AD5290数字电位计。该电阻R的位置并不重要的，因为这一布置保持了电路的带宽。

模块204包括用于控制电路143的已滤波并整流的电压供应。

模块206包括去耦电容器，用于对由控制线路传输的不需要的信号进行滤波。

模块207是I/O线路电借口连接器。

下表的增益值总结了用于血液中含有的不同类型的等分试样的分析的增益M和G的调节值：

分析周期	M	G
			LMNE	1	3
GR/PLT	1	5
			BASO	1	2
RETIC	60	5
			ERB	60	1

以下描述为了获得上述全部的数据，使用本发明的装置并在特定条件下进行的一系列的分析周期和操作。

通常来说，对于荧光测量，APD增益切换至“M＝60”的位置，随后激光二极管121接通。关闭光源131。对于吸收测量，APD增益切换至“M＝1”的位置，随后接通RCLED。关断激光二极管。在RCLED的发射光纤上设置二向色滤光片以朝向接收器反射荧光是有利的。

病人的血液被取样在etda管中。然后该血液样品被分成多个等分试样，根据用于获得期望的结果的试剂对该多个等分试样进行不同的处理。

等分试样LMNE是其中被引入试剂的等分试样，该试剂诸如申请人在专利EP1 239 283中所述的。该试剂适于引起红细胞的溶解，并且能够通过吸收和阻抗测量，对淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜曙红细胞进行区分和计数。在此，15微升(μL)的血液与1.8毫升(mL)的试剂混合。随后光电二极管的增益为1。这保持了光电二极管用于吸收的定量特性。操作放大器的电子增益有利地略微高于用于嗜碱细胞时的增益，例如为3。各种细胞的种群在图8a中示出，其中还示出了任何不成熟的微粒的位置。

GR/PLT等分试样中加入的试剂是申请人在专利EP 0 856 735中所述的试剂。该试剂适于通过测量吸收和阻抗来标记红细胞和血小板。8μL的血液与2.8mL的试剂混合。光电二极管的增益M然后设定为1，同样保持用于测量吸收的定量特性。操作放大器的电子增益G有利地高于用于白细胞的增益，例如为5。红细胞和血小板的数量可以如图8b中所表示的。

BASO等分试样中加入的试剂是在专利EP 1 039 297中已经描述的试剂。该试剂适于通过测量吸收和阻抗来标记嗜碱细胞，因为其减小除了嗜碱细胞外的白细胞的体积大小，这样就能够对它们进行区分和计数。15μL的血液与1.8mL的试剂混合。光电二极管的增益M还是1。这能保持光电二极管用于测量吸收的定量特性。操作放大器的电子增益G有利地是大于1的较小的值，例如是2。嗜碱细胞因此如图8c中所示。

RET等分试样中加入的试剂是如专利EP 0 856 735中描述的试剂，用于通过测量荧光来标记网状细胞。2.4μL的血液与2.5mL的试剂混合。光电二极管的增益M最大化至光电二极管的雪崩增益，在此等于60。同样，这样能够使光电二极管对荧光测量足够灵敏。因为期望的光的量很低，操作放大器的电子增益G有利地被最大化，在此等于5。例如，网状细胞可如图8d中所示。可以测量网状细胞是本发明的一个优点，因为这样的测量对于血液分析而言是真正附加的新价值。通过该发明，可以以较低的成本可靠地实现这一测量。而且，网状细胞越年轻，RNA的量就越大。因为噻唑橙以化学计量统计的方式与核酸基反应，网状细胞越年轻，荧光的强度越大。这在此所述的本发明的装置以及相关的方法因此提供了以相对低的成本对网状细胞进行分类和计量的简单方法，并且给出了这些细胞成熟度的指示。

ERB等分试样中加入的是诸如专利EP 1 239 283中所述的试剂，用于通过测量荧光来标记成红血球细胞、网状细胞的前体。通过将30μL的血液与2mL的试剂混合来制备待分析的试样。随后光电二极管的增益M最大化至光电二极管的雪崩增益，在此等于60。这样能够使光电二极管对测量荧光足够灵敏。操作放大器的电子增益G例如为1。该值能够在后续的数据处理提供的动力学范围内实现荧光的正确量化。成红血球细胞可如图8e中所示。

对于使用合适的试剂得到的每个等分试样，如本发明这样的双测量(荧光和阻抗，或者吸收和阻抗)是能够实现的。这以明确的以及敏感的方式，使上文中的细胞种群的分类和计数成为可能，即红血球、网状细胞、成红血球细胞、血小板、网状的血小板、白细胞，对这些细胞来说，通过本发明可识别多种分类，例如淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞和嗜碱细胞。因此利用本发明，可以容易地识别十种细胞种群，并且使用上述五种等分试样可以对它们进行量化。对于以上每个制备的混合物，荧光和吸收测量以及相关联的阻抗测量能够区分这些细胞群。利用本发明，能够对其它的细胞种类计数，包括白细胞的前体、单核细胞、成淋巴细胞、以及未成熟的粒细胞。

除了在此包括光电二极管的合适的传感器，接收器光学系统还包括消色差双合透镜。该孔径足以实现来自与核酸耦合的噻唑橙的荧光探测，该核酸诸如那些包括在网状细胞中的核酸。

消色差(achromatisation)波长集中在感兴趣的波长。在一个具体实施例中，在650nm处测量细胞的吸收。当使用噻唑橙时，在530nm波长处发出最大荧光。对于530nm和650nm波长进行优化的两者之一能够在这两个波长下最优地光学聚焦于细胞流上。

同样，为了精确地探测荧光和吸收波长下的光量，光学系统142在530nm的荧光波长以及650nm的吸收波长下校正色差。

吸收剂滤光器144，例如Schott GG495滤光器，其厚度达到3mm的量级，安装在接收管中的装配部分，其中光束是平行的。该滤光器144吸收从激光束以直角衍射的激光。

图7示出了滤光器144的高通传输特性。显然，通过在470nm即噻唑橙的第二吸收最大值的波长处而不是488nm处的发光，能够使用这种简单并且相对成本低的滤光器144，其开始允许光在大约480nm处通过。实际上这是一个简单的彩色玻璃，有效的彩色玻璃在光谱上是很少见的。当然，在488nm处实现本发明也是可行的，但是(至少目前)这会带来更多的成本。

因此为了在488nm处发光，希望使用另外一种玻璃(诸如GG510或者OG515玻璃)，来避免在传感器装置的方向上大的衍射角。在本发明的装置中，通过在470nm附近激发噻唑橙，可以发现即使使用相对较低成本的彩色玻璃，也能获得虽然低于488nm处但仍然有效的发光效率，而这是非常有利的。

该特征还能够降低在本发明的装置中设置荧光测量的成本。该滤光器144具有宽的带宽(在400nm到700nm之间)的抗反射处理，来降低菲涅尔反射。

来自于激光二极管121的473nm的光束全部被滤光器吸收。只有发射带位于500nm到600nm之间的荧光，以及来自于光源131的650nm的光束可以透过。

在此优选地，校正光学系统用于三级像差，也即校正由测量腔111的平面(水或者玻璃)折射表面引起的几何像差及色差。

在最后的分析中，所示的装置能够将细胞流成像在传感器141的瞳孔上。在该平面的光学分辨率通过下式给出：

R＝λ/(NAe+NAr)

其中λ是发光波长，NAe和NAr分别是发光和接收光束的数值孔径。

虽然在图像平面上实现的测量只是光度测定的，即传感器141的灵敏度，但是其通过异质性来区别两种不同细胞的能力与参数R，即测量的信噪比密切相关。

为了最佳地区分白细胞，在0.65μm处，观察到参数R需要小于或者等于1μm。这就强制要求数值孔径限定NAe+NAr＞0.65。在本发明的一个实施例中，发射和接收孔径相等，优选NAe＝NAr≥0.325。在一个优选实施例中，该孔径固定在0.35。

最后，过氧化物酶的吸收谱用于改善对嗜中性粒细胞的区分，过氧化物酶是一种存在于嗜曙红细胞中的生物酶，其在650nm处进行吸收。在这个意义上，相对于先前开发的装置，本发明显著地提高了嗜中性粒细胞/嗜曙红细胞的区分。

显然，本装置可使用其它的试剂，并且使用相对不同的处理来获得相似的结果。还可以开发其它的试剂以用于除了T、B、或者NK淋巴细胞外的细胞种类的区分和计数。这样的试剂可包括由化学荧光分子或者与抗体结合的颗粒组成的免疫学探针。应该注意，试剂的结构必须能够实现上述的双参数区分。

最后，应该注意，根据本发明的原理，能够实现多种实施例。具体而言，两个光源可以同时接通来同时确定生化的和形态学的特性。尽管通过本发明实现了测量的连续性质，但是通过在相对低成本的装置中实现荧光测量无疑具有经济上以及医学上的优势，该装置到目前为止，只能实现吸收测量，因此经由这样的装置仅能实现种群的测定。

Claims (14)

1.一种用于通过对测量槽(111)中的流体进行电光测量来进行生物分析的装置(100)，该装置(100)包括至少两个光源(121，131)，该至少两个光源适于在分别适合用于吸收和荧光的测量的不同的光谱域内发光，该装置(100)还包括用于测量与每个吸收和荧光测量相关联的阻抗的装置，以及共用的传感器装置(140)，该共用的传感器装置(140)包括传感器(141)、光学系统(142)和滤光器装置(144)，这三个组件互相作用以使得吸收和/或荧光能够被测量，所述传感器(141)的内部增益可配置为使得荧光和吸收测量能够被顺序地执行。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述传感器(141)是连接至偏置电路(143)的雪崩光电二极管，该偏置电路适于抑制内部雪崩增益。

3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所抑制的内部增益为1，所述雪崩光电二极管(141)作为简单光电二极管工作。

4.根据权利要求2或者3所述的装置，其特征在于，所述偏置电路(143)包括双位开关，该双位开关用于提供两个不同电压，即高电压和低电压，并且受到电控制以提供用于偏置该光电二极管(141)的所述高电压或者所述低电压。

5.根据权利要求2或者3所述的装置，其特征在于，所述偏置电路(143)包括可编程的电压发生器，该可编程的电压发生器由数字或者模拟的方式控制，以控制由该发生器施加到所述雪崩光电二极管上的偏置电压。

6.根据前述任一项权利要求所述的装置，其特征在于，所述两个光源(121，131)具有与光传感器(141)的光轴共面的发射光轴。

7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，发出吸收波长的光的光源(131)的光轴与所述光传感器(141)的光轴一致，并且用于激发荧光的光源(121)的光轴与所述传感器(141)以及另一光源(131)的光轴垂直。

8.根据前述任一项权利要求所述的装置，其特征在于，所述传感器(141)连接至电子放大级(203)，该电子放大级具有基于所实现的测量而变化的电子增益。

9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述传感器(141)的内部增益以及所述电子增益可配置为能够区分多个细胞种群的吸收和荧光测量，该多个细胞种群至少选自嗜碱细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、红血球、血小板、成红血球细胞、网状细胞、以及网状的血小板。

10.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述传感器(141)的所述内部增益以及所述电子增益可配置为能够使用所述传感器装置在每个分析周期内区分吸收和荧光测量，该分析周期是能够对存在于样品中的细胞族群进行分类和绝对计数的周期。

11.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，所述传感器(141)的所述内部增益和所述电子增益可配置为能够使用所述传感器装置在至少嗜碱细胞和网状细胞的所述分析周期内区分吸收和荧光测量。

12.根据前述任一项权利要求所述的装置，其特征在于，所使用的荧光标记物为噻唑橙，荧光激发源发出大约470nm的光，所述传感器装置的所述滤光器装置包括彩色玻璃类型的滤光片，其截止波长位于495nm附近。

13.根据前述任一项权利要求所述的装置，其特征在于，所述两个光源可同时接通，以获得生化和形态学数据。

14.一种方法，使用根据前述任一项权利要求所述的装置对存在于生物样品中的细胞种群进行分类和计数。

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