CN102076714A - 结合Aβ(1-42)球聚体的人源化抗体及其应用 - Google Patents

结合Aβ(1-42)球聚体的人源化抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及结合蛋白以及特别是可例如在阿尔茨海默病和相关病症的诊断、治疗和预防中使用的人源化抗体。

Description

结合Aβ(1-42)球聚体的人源化抗体及其应用
联合研究协议参考
本申请的内容受蛋白质设计实验室有限公司(Protein Design Labs，Inc.)与阿伯特实验室(Abbott Laboratories)于2006年8月31日缔结的联合研究协议约束，涉及人源化淀粉样蛋白β抗体。
相关申请交叉引用
本申请涉及2006年11月30日提交的国际申请号PCT/EP2006/011530。
发明背景
发明领域
本发明涉及可用于例如诊断、治疗和预防病症例如淀粉样变性(如阿尔茨海默病)和有关病症的抗体。
背景信息
阿尔茨海默病(AD)是一种神经变性疾病，具有如下特点：进行性丧失认知能力和包含淀粉样蛋白沉积物的特有的神经病理学特征、神经纤维缠结以及在脑的某些区域中神经元丢失(参见Hardy和Selkoe(Science297，353(2002)；Mattson Nature 431，7004(2004)。淀粉样蛋白沉积物的主成分是淀粉样蛋白β-肽(Aβ)，具有42个氨基酸长度类型(Aβ1-42)是最主要的。
具体而言，淀粉样蛋白β(1-42)蛋白是一种具有42个氨基酸的多肽，其来源于淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的蛋白酶解加工。除人变体之外，其还包括存在于非人生物(具体而言其他哺乳动物，特别是大鼠)中的淀粉样蛋白β(1-42)蛋白的同种型。该蛋白由于在水相环境中倾向于聚合，因此可以非常不同的分子形式存在。
已证明不溶蛋白的沉积与痴呆病症如阿尔茨海默病的发生或进展的简单相关是不可信的(Terry等，Ann.Neurol.30.572-580(1991)；Dickson等，Neurobiol.Aging 16，285-298(1995))。与此相反，突触和认知感觉的丧失似乎与Aβ(1-42)的可溶形式更相关(Lue等，Am.J.Pathol.155，853-862(1999)；McLean等，Ann.Neurol.46，860-866(1999))。
尽管在过去已出现抗Aβ(1-42)的多克隆和单克隆抗体，但没有一种被证明产生期望的疗效并且还没有在动物和/或人中引起严重的副作用。例如，由每周一次持续5个月接受针对N-端的抗-Aβ(1-42)抗体的非常老的APP23小鼠的临床前研究引起的被动免疫显示了治疗相关的副作用。具体而言，与盐水处理的小鼠相比，这些小鼠显示在微出血(microhaemorrhages)量和严重程度上的增加(Pfeifer等，Science 2002298：1379)。还针对非常老(＞24个月)的Tg2576和PDAPP小鼠描述了相似的出血增加(Wilcock等，J Neuroscience 2003，23：3745-51；Racke等，J Neuroscience 2005，25：629-636)。在这两种小鼠中，抗-Aβ(1-42)注射导致了明显增加的微出血。因此，对于开发预防或减缓疾病进展而不诱导针对人体的消极效应和可能的致死效应的生物制剂而言，存在着巨大的、未满足的治疗需求。鉴于一般人群渐增的寿命，并且随着寿命的增加，每年诊断有阿尔茨海默病或相关病症的患者数量也连带增加，因此这样的需求格外明显。此外，这样的抗体可供在经历阿尔茨海默病症状的患者(目前仅可通过尸体解剖来确诊)中正确诊断阿尔茨海默病之用。此外，这样的抗体可供阐明引起该使人虚弱的疾病的蛋白和其他生物因素的生物学特性之用。
所有在本文中引用的专利和出版物以其全文在此并入作为参考。
发明概述
本发明涉及能结合存在于阿尔茨海默病患者脑中的可溶性寡聚体特别是Aβ(1-42)球聚体的结合蛋白，尤其是抗体(如在本文中对于小鼠/鼠单克隆抗体称为术语“8F5”以及对于人源化8F5称为“8F5hum8”的抗体)。为了本文的目的，这些结合蛋白以及尤其是抗体将被称为“球聚体-表位特异性抗体”。这意味着这些抗体结合被认为是引起阿尔茨海默病的球聚体或抗原的一个或更多个表位(如Aβ(1-42)肽的(1-42)氨基酸区)。此外，本发明还提供了生产和使用这些结合蛋白或其部分的方法。
本发明的一个方面涉及包含能结合Aβ(1-42)球聚体的抗原结合域的结合蛋白(如抗体)。在一个实施方案中，该抗原结合域包含至少一个包含选自如下的氨基酸序列CDR：
CDR-VH1.X1-X2-X3-X4-X5(SEQ ID NO：5)，其中：
X1是S；
X2是Y；
X3是G；
X4是M；和
X5是S，
CDR-VH2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X1 6-X17(SEQ ID NO：6)，其中：
X1是S；
X2是I；
X3是N；
X4是S；
X5是N；
X6是G；
X7是G；
X8是S；
X9是T；
X10是Y；
X11是Y；
X12是P；
X13是D；
X14是S；
X15是V；
X16是K；和
X17是G，
CDR-VH3.X1-X2-X3-X4(SEQ ID NO：7)，其中：
X1是S；
X2是G；
X3是D；和
X4是Y，
CDR-VL1.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16(SEQ ID NO：8)，其中：
X1是R；
X2是S；
X3是S；
X4是Q；
X5是S；
X6是L；
X7是V；
X8是Y；
X9是S；
X10是N；
X11是G；
X12是D；
X13是T；
X14是Y；
X15是L；和
X16是H，
CDR-VL2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO：9)，其中：
X1是K；
X2是V；
X3是S；
X4是N；
X5是R；
X6是F；和
X7是S，
以及
CDR-VL3.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO：10)，其中：
X1是S；
X2是Q；
X3是S；
X4是T；
X5是H；
X6是V；
X7是P；
X8是W；和
X9是T，
优选地，该抗原结合域包含至少一个包含选自如下的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO.：1的残基31-35(即SYGMS(SEQ ID NO：11)；8F5VHCDR1)；SEQ ID NO.：1的残基50-66(即SINSNGGSTYYPDSVKG(SEQID NO：12)；8F5VH CDR2)；SEQ ID NO.：1的残基98-108(即SGDY(SEQID NO：13)；8F5VH CDR3)；SEQ ID NO.：2的残基24-39(即RSSQSLVYSNGDTYLH(SEQ ID NO：14)；8F5VL CDR1)；SEQ ID NO.：2的残基55-61(即KVSNRFS(SEQ ID NO：15)；8F5VL CDR2)和SEQ IDNO.：2的残基94-102(即SQSTHVPWT(SEQ ID NO：16)；8F5VL CDR3)。在一个优选的实施方案中，结合蛋白包含至少3个选自上述披露的序列的CDR。更优选地，该3个CDR选自可变域CDR组，所述可变域CDR组选自：
  VH 8F5 CDR组
  VH 8F5 CDR-H1   SEQ ID NO.：1的残基31-35
  VH 8F5 CDR-H2   SEQ ID NO.：1的残基50-66
  VH 8F5 CDR-H3   SEQ ID NO.：1的残基98-101
  VL 8F5 CDR组
  VL 8F5 CDR-L1   SEQ ID NO.：2的残基24-39
  VL 8F5 CDR-L2   SEQ ID NO.：2的残基55-61
  VL 8F5 CDR-L3   SEQ ID NO.：2的残基94-102
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白包含至少两个可变域CDR组。更优选地，这两个可变域CDR组是：VH 8F5CDR组和VL 8F5CDR组。在另一个实施方案中，上述披露的结合蛋白进一步包含人接纳体构架。优选地，人接纳体构架包含选自如下的氨基酸序列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：17)；WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO：18)；RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA(SEQ ID NO：19)；WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：20)；DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC(SEQ ID NO：21)；WYLQKPGQSPQLLIY(SEQ ID NO：22)；GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO：23)和FGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：24)。
在一个优选的实施方案中，结合蛋白是能结合Aβ(1-42)球聚体的CDR嫁接抗体或其抗原结合部分。优选地，CDR嫁接抗体或其抗原结合部分包含一个或更多个上述披露的CDR。更优选地，CDR嫁接抗体或其抗原结合部分包含至少一个具有选自SEQ ID NO：25和SEQ IDNO：26的氨基酸序列的可变区。最优选地，CDR嫁接抗体或其抗原结合部分包含两个选自上述披露的组的可变区。优选地，CDR嫁接抗体或其抗原结合部分包含人接纳体构架。更优选地，人接纳体构架是任何一种上述披露的人接纳体构架。
在一个优选的实施方案中，结合蛋白是能结合Aβ(1-42)球聚体的人源化抗体或其抗原结合部分。优选地，人源化抗体或其抗原结合部分包含并入人接纳体构架的人抗体可变区中的一个或更多个上述披露的CDR。优选地，人抗体可变区是共有人可变区。更优选地，人接纳体构架包含位于关键残基处的至少一个构架区氨基酸取代，其中该关键残基选自邻接CDR的残基；糖基化位点残基；稀有残基；能与Aβ(1-42)球聚体相互作用的残基；能与CDR相互作用的残基；规范残基；在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；游标区中的残基；和在Chothia-定义的可变重链CDR1与Kabat-定义的第一重链构架之间重叠区中的残基。优选地，人接纳体构架包含至少一个构架区氨基酸取代，其中该构架的氨基酸序列是至少65％相同于所述人接纳体构架的序列并包含至少52个与所述人接纳体构架相同的氨基酸残基。
在一个优选的实施方案中，结合蛋白是能结合Aβ(1-42)球聚体的人源化抗体或其抗原结合部分。优选地，人源化抗体或其抗原结合部分包含一个或更多个上述披露的CDR。更优选地，人源化抗体或其抗原结合部分包含3个或更多个上述披露的CDR。最优选地，人源化抗体或其抗原结合部分包含6个上述披露的CDR。
在本发明的另一个实施方案中，人源化抗体或其抗原结合部分包含至少一个具有选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO.：2的氨基酸序列的可变域。关于SEQ ID NO：1(8F5hum8VL)，基于Kabat编号，第19位氨基酸可以是K；第40位可以是T；第42位可以是D；第44位可以是R；第82A位可以是S；第83位可以是K；第84位可以是S；第89位可以是M，以及J片段107-109“TLV”可以是“STL”。关于SEQ ID NO：2(8F5hum7VH)，基于Kabat编号，第7位氨基酸可以是T；第14位可以是S；第15位可以是L；第17位可以是D；第18位可以是Q；第83位可以是L；以及第87位可以是F。更优选地，人源化抗体或其抗原结合部分包含两个选自上述披露的组的可变域。最优选地，人源化抗体或其抗原结合部分包含两个可变域，其中所述两个可变域具有选自SEQ IDNOS.：11、12和13以及SEQ ID NOS.：14、15和16的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，上述披露的结合蛋白包含选自如下的重链免疫球蛋白恒定域：人IgM恒定域、人IgG1恒定域、人IgG2恒定域、人IgG3恒定域、人IgG4恒定域、人IgE恒定域和人IgA恒定域。更优选地，该结合蛋白包含SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28。
本发明的结合蛋白能结合Aβ(1-42)球聚体。优选地，结合蛋白是能调节Aβ(1-42)球聚体的生物学功能的人源化抗体(如8F5)。更优选地，结合蛋白能中和Aβ(1-42)球聚体。此外，与结合淀粉样蛋白β蛋白单体相比，该人源化抗体以更强的特异性结合淀粉样蛋白β(Aβ)蛋白球聚体。因此，观察到优先的结合。对球聚体的结合特异性与对单体的结合特异性的比率为至少1.4。具体而言，该比率优选为至少约1.4-至少约16.9。(包括端点的1.0-17.5的比率)也被认为是落入本发明的范围中，以及其的十进百分数，例如，1.1、1.2、1.3、...、2.0、2.1、2.2...、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5以及所有在此之间的全整数及其百分数都被认为是落入本发明的范围中。淀粉样蛋白β蛋白单体可以是例如Aβ(1-42)单体或Aβ(1-40)单体。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白具有1×10-6M-1×10-12的针对Aβ(1-42)球聚体的解离常数(KD)。优选地，抗体以高亲和力，例如以1×10-7M的KD或更大的亲和力(例如以3×10-8M的KD或更大的亲和力)，以1×10-9M的KD或更大的亲和力(例如以3×10-10M或更大的亲和力)，以1×10-10M的KD或更大的亲和力(例如以3×10-11M的KD或更大的亲和力)或以1×10-11M的KD或更大的亲和力结合Aβ(1-42)球聚体。
本发明的一个实施方案提供了一种抗体构建体，包含任一上述披露的结合蛋白和连接多肽或免疫球蛋白。在一个优选的实施方案中，抗体构建体选自免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR-嫁接抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单域抗体、双抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、双可变域抗体和双特异性抗体。在一个优选的实施方案中，抗体构建体包含选自如下的重链免疫球蛋白恒定域：人IgM恒定域、人IgG1恒定域、人IgG2恒定域、人IgG3恒定域、人IgG4恒定域、人IgE恒定域和人IgA恒定域。更优选地，抗体构建体包含(SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26)或(SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28)。在另一个实施方案中，本发明提供了一种抗体缀合物，包含上述披露的抗体构建体和选自如下的剂：免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。在一个优选的实施方案中，显像剂选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。更优选地，显像剂是选自如下的放射性标记：3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。在一个优选的实施方案中，治疗或细胞毒性剂选自：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗-血管发生剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素和细胞凋亡剂。
在另一个实施方案中，抗体构建体是糖基化的。优选地，该糖基化是人糖基化模式。
在一个进一步的实施方案中，上述披露的结合蛋白、抗体构建体或抗体缀合物作为晶体存在。优选地，该晶体为无载体药物控释晶体。在一个优选的实施方案中，结晶的结合蛋白、结晶的抗体构建体或结晶的抗体缀合物具有较其可溶性对应物更长的体内半衰期。在另一个优选的实施方案中，结晶的结合蛋白、结晶的抗体构建体或结晶的抗体缀合物在结晶后保留生物活性。
本发明的一个方面涉及一种分离的编码上述披露的结合蛋白、抗体构建体或抗体缀合物的核酸。一个进一步的实施方案提供了一种包含上述披露的分离的核酸的载体，其中所述载体选自pcDNA；pTT(Durocher等，Nucleic Acids Research 2002，Vol 30，No.2)；pTT3(带有附加的多克隆位点的pTT)；pEFBOS(Mizushima，S.和Nagata，S.，(1990)NucleicAcids Research，Vol.18，No.17)；pBV；pJV和pBJ。
本发明还包括用上述披露的载体转化的宿主细胞。优选地，宿主细胞是原核细胞。更优选地，宿主细胞是大肠杆菌。在一个相关的实施方案中，宿主细胞是真核细胞。优选地，真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于CHO和COS；或真菌细胞例如酿酒酵母；或昆虫细胞例如Sf9。
另外，本发明包括一种生产结合Aβ(1-42)球聚体的结合蛋白的方法，包括在足以产生结合Aβ(1-42)的结合蛋白的条件和时间下，在培养基中培养任何一种上述披露的宿主细胞。另一个实施方案提供了一种根据上述披露的方法生产的结合蛋白。
一个实施方案提供了一种用于释放如本文中所定义的结合蛋白的组合物，其中该组合物包含一种制剂，该制剂又包含如上披露的结晶的结合蛋白、结晶的抗体构建体或结晶的抗体缀合物和组分；以及至少一种聚合物载体。优选地，该聚合物载体是选自如下一种或更多种的聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(酯肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸乙醇酸共聚物)或PLGA、聚(b-羟基丁酸酯)、聚(已内酯)、聚(二氧杂环己酮)；聚(乙二醇)、聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚[(有机)膦腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、马来酸酐-烷基乙烯醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、海藻酸盐、纤维素及纤维素衍生物、胶原蛋白、血纤蛋白、明胶、透明质酸、低聚糖、糖胺聚糖、硫酸多糖、它们的混合物和共聚物。优选地，所述组分选自白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。另一个实施方案提供了一种治疗哺乳动物的方法，包括向哺乳动物施用有效量的上述披露的组合物的步骤。
本发明还包括一种包含上述披露的结合蛋白、抗体构建体或抗体缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在一个进一步的实施方案中，该药物组合物包含至少一种用于治疗其中活性是有害的病症的附加治疗剂。优选地，该附加治疗剂选自胆固醇酶抑制剂、部分NMDA受体阻断剂、糖胺聚糖模拟物、γ分泌酶抑制剂或别构调节剂、黄体生成素阻断促性腺激素释放激素激动剂、5-羟色胺5-HT1A受体拮抗剂、螯合剂、神经元选择性L-型钙离子通道阻断剂、免疫调节剂、淀粉样蛋白原纤维形成抑制剂或淀粉样蛋白沉积抑制剂、PDE4抑制剂、组胺激动剂、高级聚糖化终产物受体蛋白、PARP刺激物、5-羟色胺6-受体拮抗剂、5-HT4受体激动剂、人类固醇、增强神经元代谢的葡萄糖摄取刺激物、选择性CB1拮抗剂、苯并二吖庚因受体部分激动剂、淀粉样蛋白β产生拮抗剂或抑制剂、淀粉样蛋白β沉积抑制剂、NNRα-7部分拮抗剂、治疗靶向PDE4、RNA翻译抑制剂、毒蕈碱性激动剂、神经生长因子受体激动剂、NGF受体激动剂和基因治疗调节剂。
在另一个方面中，本发明提供了一种抑制Aβ(1-42)球聚体活性的方法，包括将Aβ(1-42)球聚体与上述披露的结合蛋白接触，使得Aβ(1-42)球聚体活性被抑制。在一个相关的方面中，本发明提供了一种在患有其中Aβ(1-42)球聚体活性是有害的病症的人个体中抑制人Aβ(1-42)球聚体活性的方法，包括向人个体施用上述披露的结合蛋白，使得人个体中的Aβ(1-42)球聚体活性被抑制从而实现治疗。可使用该方法治疗的病症或疾病的实例包括但不限于甲抗胰蛋白酶缺乏症、C1-抑制剂缺乏血管性水肿、抗凝血酶缺乏血栓栓塞性疾病、库鲁病、Creutzfeld-Jacob病/羊瘙痒症、牛绵状脑病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、家族致命性失眠症、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调、Machado-Joseph萎缩、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩、额颞痴呆、镰状细胞贫血、不稳定性血红蛋白包含体溶血、药物性包含体溶血、帕金森氏病、全身性AL型淀粉样变性、小结节性AL淀粉样变性、全身性AA淀粉样变性、前列腺淀粉样、血液透析淀粉样变性、遗传性(冰岛人)大脑血管病、亨廷顿病、家族性内脏淀粉样、家族性内脏多神经病、家族性内脏淀粉样变性、老年全身性淀粉样变性、家族性淀粉样神经病、家族性心脏淀粉样、阿尔茨海默病、唐氏综合征、甲状腺髓样癌和2型糖尿病(T2DM)。优选地，所述疾病选自淀粉样变性，例如阿尔茨海默病或唐氏综合征。
在另一个方面中，本发明提供了一种治疗患有其中Aβ(1-42)球聚体是有害的病症的患者的方法，包括在施用如上所述的第二药剂之前、同时或之后施用任何一种上述披露的结合蛋白的步骤。在一个优选的实施方案中，第二药剂选自小分子或生物药剂(即参见上述所列的附加治疗剂(如附加的抗体、胆碱酯酶抑制剂、部分NMDA受体阻断剂等))。
在一个优选的实施方案中，通过至少一种选自如下的方式将上述披露的药物组合物施用于个体：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、大肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、含服、舌下、鼻内和经皮。
本发明的一个方面提供了针对至少一种本发明的Aβ(1-42)球聚体结合蛋白的至少一种Aβ(1-42)球聚体抗-独特型抗体。该抗-独特型抗体包括任何包含含有免疫球蛋白分子至少一部分的分子的蛋白或肽，所述免疫球蛋白分子至少一部分例如但不限于至少一个重链或轻链的互补决定区(CDR)或重链或轻链的配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区、或它们能并入本发明的接合蛋白中的任何部分。
附图简述
图1(A)显示了人源化抗体8F5的可变重链的核苷酸序列(SEQ IDNO：3)，和图1(B)显示了该核苷酸序列编码的可变重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。图1(C)显示了人源化抗体8F5的可变轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)，和图1(D)显示了该核苷酸序列编码的可变轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。(所有CDR区均是加下划线的)。
图2(A)显示了标准蛋白(分子标记蛋白，泳道1)；Aβ(1-42)原纤维制备物，对照(泳道2)；Aβ(1-42)原纤维制备物+mAb 8F5hum8，20h，37℃，上清液(泳道3)；Aβ(1-42)原纤维制备物+mAb 8F5hum8，20h，37℃，(泳道4)；Aβ(1-42)原纤维制备物+mAb 6E10，20h，37℃，上清液(泳道5)；Aβ(1-42)原纤维制备物+mAb 6E10，20h 37℃，沉淀(泳道6)；Aβ(1-42)原纤维制备物+mAb IgG2a，20h 37℃，上清液(泳道7)；Aβ(1-42)原纤维制备物+mAb IgG2a，20h 37℃，沉淀(泳道8)的SDS PAGE，以及图2(B)以总抗体的百分数显示了mAbs结合Aβ-原纤维的定量分析结果。
图3显示了生物素化小鼠8F5抗体与Aβ(1-42)球聚体的结合。具体而言，该生物素化小鼠8F5抗体的结合受增加量的未标记的小鼠抗体(HYB)或人源化抗体(HUM8)抑制。
图4显示了8F5VH区氨基酸序列的比对。8F5VH(SEQ ID NO：100)、Hu8F5VHv1(SEQ ID NO：101)、Hu8F5VHv2(SEQ ID NO：102)以及人YSE’CL(SEQ ID NO：103)和JH4片段的氨基酸序列以单字母编码显示。在小鼠8F5VH序列中基于Kabat，E.A.，等(1991)的定义的CDR序列加下划线。在该图中接纳体人VH片段中的CDR序列被省略。在Hu8F5VHv1和Hu8F5VHv2序列中的单下划线氨基酸被预测与CDR序列接触，因此已被相应的小鼠残基所取代。Hu8F5VHv1和Hu8F5VHv2序列中的双下划线氨基酸已被改变为在相同人VH亚组中的共有氨基酸以消除潜在的免疫原性。
图5显示了8F5VL区氨基酸序列的比对。8F5VL(SEQ ID NO：104)、Hu8F5VL(SEQ ID NO：105)以及人TR1.37’CL(SEQ ID NO：106)和JK4片段的氨基酸序列以单字母编码显示。在小鼠8F5VL序列中基于Kabat，E.A.，等(1991)的定义的CDR序列加下划线。在该图中接纳体人VL片段中的CDR序列被省略。在Hu8F5VL序列中的单下划线氨基酸被预测与CDR序列接触，因此已被相应的小鼠残基所取代。Hu8F5VL序列中的双下划线氨基酸已被改变为在相同人VL亚组中的共有氨基酸以消除潜在的免疫原性。
图6显示了小外显子中Hu8F5VHv1的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：107)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：108)。信号肽序列以斜体字显示。成熟重链起始于谷氨酸残基(以粗体显示)。基于Kabat，E.A.，等(1991)的定义的CDR加下划线。该序列侧接有单一MluI(ACGCGT)和XbaI(TCTAGA)位点。
图7显示了小外显子中Hu8F5VHv2的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：109)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：110)。信号肽序列以斜体字显示。成熟重链起始于谷氨酸残基(以粗体显示)。基于Kabat，E.A.，等(1991)的定义的CDR加下划线。该序列侧接有单一MluI(ACGCGT)和XbaI(TCTAGA)位点。
图8显示了小外显子中Hu8F5VL的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：111)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：112)。信号肽序列以斜体字显示。成熟轻链起始于天冬氨酸残基(以粗体显示)。基于Kabat，E.A.，等(1991)的定义的CDR加下划线。该序列侧接有单一MluI(ACGCGT)和XbaI(TCTAGA)位点。
图9显示了表达质粒pHu8F5VHv1-Cg1和pVk-Hu8F5VL的限制性酶切图。
图10显示了竞争性ELISA以比较各种8F5抗体对人A-β寡聚体抗原(1-42)的相对结合亲和力。如实施例I中所描述的，在不同量的Mu8F5和Hu8F5竞争抗体存在下分析生物素化Mu8F5与固定化人A-β寡聚体抗原(1-42)的结合。
发明详述
除非在此另有规定，关于本发明使用的科学和技术术语应当具有为本领域技术人员所通常理解的含义。术语的含义和范围应当是清楚的；然而，在任何潜在歧义的情况下，在此提供的定义优先取代任何辞典或外来定义。此外，除非上下文另有需要，否则单数术语应当包括复数，以及复数术语应当包括单数。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式例如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用是不受限的。同样，除非另有明确说明，术语例如“元件”或“组件”包括包含一个单元的元件和组件以及包含多于一个亚单元的元件和组件。
一般地，在本文所描述的组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交方面所使用的术语以及这些方面的技术是本领域公知且常用的。除非另有说明，一般根据本领域公知的以及如在本说明书全文中所引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的常规方法执行本发明的方法和技术。如本领域中所通常进行的或如本文中所描述的，根据厂商说明书执行酶促反应和纯化技术。在本文所描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学方面所使用的术语以及这些方面的实验程序和技术是本领域公知且常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗。
为了使本发明更易于理解，挑选术语定义如下。
当在本文中使用时，术语“多肽”指氨基酸的任意聚合链。术语“肽”和“蛋白”与术语多肽可交换地使用，也指氨基酸的聚合链。术语“多肽”包括天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。
术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是一种根据其起源或来源与在其天然状态中伴随其的天然相关成分无关联的；基本上不含有来自相同物种的其他蛋白；通过来自不同物种的细胞表达的；或不存在于自然界中的蛋白或多肽。因此，化学合成的或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的多肽应是与其天然相关成分相“分离的”。使用本领域公知的蛋白纯化技术，通过分离还可使蛋白基本上不含有天然相关成分。
当在本文中使用时，术语“回收”指例如使用本领域公知的蛋白纯化技术，通过分离使化学物种如多肽基本上不含有天然相关成分的过程。
术语“Aβ(X-Y)”在此指包括X和Y的人淀粉状β蛋白的从氨基酸第“X”位到氨基酸第“Y”位的氨基酸序列，特别是指从氨基酸序列DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA(SEQID NO：29)的氨基酸第1位到氨基酸第42位的氨基酸序列或任何一种其天然存在的变体，特别是那些具有至少一个选自如下突变：A2T、H6R、D7N、A21G(“佛兰芒人”)、E22G(“北极地区人”)、E22Q(“荷兰人”)、E22K(“意大利人”)、D23N(“艾奥瓦人”)、A42T和A42V的氨基酸序列，其中编号相对于包括第X位和第Y位或具有至多3个额外的氨基酸取代的序列的Aβ肽的起点，所述额外的氨基酸取代都不会阻止球聚体形成。“额外的”氨基酸取代在此定义为任何未见于自然界中的规范序列的背离。
更具体地说，术语“Aβ(1-42)”在此指包括1和42的人淀粉状β蛋白的从氨基酸第1位到氨基酸第42位的氨基酸序列，特别是指氨基酸序列DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA(即相应于氨基酸第1-42位的全长序列；SEQ ID NO：29)的氨基酸第1位到氨基酸第42位的氨基酸序列或任何一种其天然存在的变体。这样的变体可以是例如那些具有至少一个选自A2T、H6R、D7N、A21G(“佛兰芒人”)、E22G(“北极地区人”)、E22Q(“荷兰人”)、E22K(“意大利人”)、D23N(“艾奥瓦人”)、A42T和A42V的突变的变体，其中编号相对于包括1和42或具有至多3个额外的氨基酸取代的序列的Aβ肽的起点，所述额外的氨基酸取代都不会阻止球聚体形成，优选在从氨基酸第20位到氨基酸第42位不具有额外的氨基酸取代。同样地，术语“Aβ(1-40)”在此指包括1和40的人淀粉状β蛋白的从氨基酸第1位到氨基酸第40位的氨基酸序列，特别是指氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV(SEQ ID NO：30)的氨基酸第1位到氨基酸第40位的氨基酸序列或任何一种其天然存在的变体。这样的变体包括例如那些具有至少一个选自A2T、H6R、D7N、A21G(“佛兰芒人”)、E22G(“北极地区人”)、E22Q(“荷兰人”)、E22K(“意大利人”)和D23N(“艾奥瓦人”)的突变的变体，其中编号相对于包括1和40或具有至多3个额外的氨基酸取代的序列的Aβ肽的起点，所述额外的氨基酸取代都不会阻止球聚体形成。
术语“Aβ(X-Y)球聚体”(也称为“Aβ(X-Y)球状寡聚体”)在此指具有均质性及截然不同的物理特性的如上所定义的Aβ(X-Y)肽的可溶的、球状的、非共价的缔合物。Aβ(X-Y)球聚体是通过与阴离子去污剂温育可获得的Aβ(X-Y)肽的稳定的、非原纤维的、寡聚的集合。与单体和原纤维形成对比的是，这些球聚体具有规定的亚基装配数的特征(例如，于在此并入作为参考的国际申请公开号WO 04/067561中所描述的，早期装配形式，n＝3-6，“寡聚体A”，和晚期装配形式，n＝12-14，“寡聚体B”)。该球聚体具有三维球形结构(“熔球(molten globule)”，参见Barghorn等，2005，J Neurochem，95，834-847)。它们可进一步具有一种或更多种如下特征：
-N-端氨基酸X-23为混栖蛋白酶(如嗜热菌蛋白酶或内切蛋白酶GluC)可切割产生截短形式的Aβ(X-Y)球聚体；
-C-末端氨基酸24-Y不为混栖蛋白酶和抗体所可接近；
-这些球聚体的截短形式维持所述球聚体的3-维核心结构，在其球聚体构象中的核心表位Aβ(20-Y)具有更好的可接近性。
根据本发明以及特别是为了评价本发明的抗体的结合亲和力，术语“Aβ(X-Y)球聚体”在此特别是指通过如其全文在此并入作为参考的国际申请公开号WO 04/067561中所描述的方法可获得的产物。该方法包括解折叠天然、重组或合成的Aβ(X-Y)肽或其衍生物；将至少部分解折叠的Aβ(X-Y)肽或其衍生物暴露于去污剂，降低去污作用并持续温育。
为了解折叠肽，可让氢键断裂剂如六氟异丙醇(HFIP)作用于蛋白。当作用温度为约20-50℃，特别是约35-40℃时，几分钟的作用时间，例如约10-60分钟就足够了。之后在与含水缓冲液可混溶的适合的有机溶剂如二甲亚砜(DMSO)中，优选以浓缩形式溶解蒸发残留物至干燥，产生至少部分解折叠的肽或其衍生物的悬液，其可被接着使用。如果需要的话，原悬液可在低温下例如在约-20℃下贮藏临时的一段时间。
或者，所述肽或其衍生物可处于微酸性、优选含水的溶液中，例如约10mM HCl水溶液中。在约几分钟的温育时间后，通过离心除去不溶性成分。在10,000g下离心几分钟是有利的。这些方法步骤优选在室温下，即在20-30℃的温度下进行。离心后获得的上清液含有Aβ(X-Y)肽或其衍生物并可在低温下例如在约-20℃下贮藏临时的一段时间。
以下暴露于去污剂中涉及所述肽或其衍生物的寡聚化以产生中间类型的寡聚体(在国际申请公开号WO 04/067561中称为寡聚体A)。为了该目的，让去污剂作用于至少部分解折叠的肽或其衍生物直至足够的中间类型寡聚体产生。优选施用离子型去污剂，特别是阴离子去污剂。
根据一个具体的实施方案，使用了式(I)的去污剂：
R-X，
，其中“R”基是具有6-20个以及优选10-14个碳原子的无支链或支链烷基或具有6-20个以及优选10-14个碳原子的无支链或支链烯基，以及“X”基是酸性基团或其盐，X优选自-COO-M+、-SO3 -M+，以及最优选是-OSO3 -M+，并且M+是氢阳离子或优选自碱金属、碱土金属阳离子和铵阳离子的无机或有机阳离子。最有利的是其中R是的去污剂无支链烷基、特别是烷基-1-基的式(I)的去污剂。特别优选的是十二烷基硫酸钠(SDS)。月桂酸和油酸也可有利地使用。去污剂月桂酰基肌氨酸(lauroylsarcosin)(也称为肌氨酰NL-30或
Figure GPA00001010821000161
)的钠盐也是特别优选的。
去污剂的作用时间无论如何都具体取决于解折叠的肽或其衍生物寡聚化的程度。如果，根据解折叠步骤，已用氢键断裂剂(即特别是用六氟异丙醇)预先处理了所述肽或其衍生物，则当作用温度为约20-50℃以及特别是约35-40℃时，作用时间在几个小时的范围内，优选约1-20个小时，特别是约2-10小时就足够了。如果较少解折叠或基本上没有解折叠的肽或其衍生物是起点，则相应地更长的作用时间是权宜的。如果所述肽或其衍生物已进行预处理，例如，根据上述作为HFIP处理的替代的操作或所述肽或其衍生物直接寡聚化，则当作用温度为约20-50℃以及特别是约35-40℃时，作用时间为约5-30小时以及特别是约10-20小时就足够了。温育后，通过离心除去不溶性成分是有利的。在10,000g下离心几分钟是合适的。
取决于所使用的去污剂选择去污剂浓度。如果使用SDS，则按重量计算浓度为0.01-1％，优选0.05-0.5％，例如约0.2％被证明是合适的。如果使用月桂酸或油酸，稍高的浓度是合适的，例如按重量计算为0.05-2％，优选0.1-0.5％，例如约0.5％。
去污作用应当在大约生理学范围的盐浓度下进行。因此，特别是50-500mM，优选100-200mM以及尤其是约140mM的NaCl浓度是合适的。
去污作用的随后降低以及持续温育涉及进一步的寡聚化以产生本发明的Aβ(X-Y)球聚体(在国际申请公开号WO 04/067561中称为寡聚体B)。由于获得自上述步骤的组合物通常含有去污剂并且盐浓度处于生理学范围内，因此方便降低去污作用以及优选地也方便减少盐浓度。这可通过减少去污剂和盐浓度来实行，例如通过方便地用水或更低盐浓度的缓冲液如Tris-HCl，pH 7.3稀释。已证实稀释因子为约2-10，优选为约3-8，以及特别是约4是合适的。还可通过添加能中和所述去污作用的物质实现降低去污作用。这些物质的例子包括能与去污剂络合的物质，如能在纯化和抽提方法过程中稳定细胞的物质，例如特定的EO/PO嵌段共聚物，特别是商标名为F68的嵌段共聚物。处于特定临界胶束浓度周围或高于特定临界胶束浓度的浓度范围内的烷氧基化以及特别是乙氧基化烷基酚如X系列的乙氧基化叔辛基酚，特别是
Figure GPA00001010821000173
X100、3-(3-胆酰胺丙基二甲氨基)-1-丙磺酸内盐(
Figure GPA00001010821000174
)或烷氧基化以及特别是乙氧基化山梨糖醇酐脂肪酸酯如那些
Figure GPA00001010821000175
系列的，特别是
Figure GPA00001010821000176
20，可同等地使用。
随后，温育溶液直至足够的本发明的Aβ(X-Y)球聚体产生为止。当在约20-50℃下以及特别是在约35-40℃下作用时，作用时间在几个小时范围内，优选约10-30小时以及特别是约15-25小时就足够了。然后，可浓缩溶液并通过离心除去可能的残留物。这里也一样，在10,000g下离心几分钟被证实是合适的。离心后获得的上清液含有在此所述的Aβ(X-Y)球聚体。
Aβ(X-Y)球聚体可例如通过超滤、透析、沉淀或离心得以最终回收。进一步优选如果在变性条件下Aβ(X-Y)球聚体电泳分离如通过SDS-PAGE，则产生两条带(如对于Aβ(1-42)具有38/48kDa的表观分子量)，以及特别优选如果在分离前球聚体进行戊二醛处理，则这两条带合并为一条带。还优选如果球聚体进行大小排阻层析则产生单峰(如对于Aβ(1-42)相应于大约60kDa的分子量)。起始于Aβ(1-42)肽，所述方法特别适合于获得Aβ(1-42)球聚体。优选地，该球聚体显示针对神经元细胞的亲和力，同时也具有神经元调节作用。“神经元调节作用”定义为与神经元可塑性相关的导致神经元功能失调的神经元的长期抑制作用。
根据本发明的另一个方面，术语“Aβ(X-Y)球聚体”在此指基本上由Aβ(X-Y)亚基组成的球聚体，其中优选平均起来至少11/12的亚基为Aβ(X-Y)型，更优选少于10％的球聚体包含任何非-Aβ(X-Y)肽，以及最优选制备物中非-Aβ(X-Y)肽的含量低于检出阈值。更具体地说，术语“Aβ(1-42)球聚体”在此指包含如上定义的Aβ(1-42)单元的球聚体；术语“Aβ(12-42)球聚体”在此指包含如上定义的Aβ(12-42)单元的球聚体；以及术语“Aβ(20-42)球聚体”在此指包含如上定义的Aβ(20-42)单元的球聚体。
术语“交联的Aβ(X-Y)球聚体”在此指通过交联、优选化学交联、更优选醛交联、以及最优选戊二醛交联球聚体组成单位，可获得自如上所描述的Aβ(X-Y)球聚体的分子。在本发明的另一个方面中，交联的球聚体基本上为其中所述单位是至少部分通过共价键连接而非仅通过非共价相互作用结合的球聚体。
术语“Aβ(X-Y)球聚体衍生物”在此特别指通过共价连接利于检测的基团而被标记的球聚体，所述基团优选荧光团，如异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、维多利亚多管发光水母(Aequorea Victoria)荧光蛋白、网鳚属(Dictyosoma)荧光蛋白或它们的任何组合或荧光活性衍生物；生色团；化学发光体，如荧光素酶，优选北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶、费氏弧菌(Vibrio fischeri)荧光素酶或它们的任何组合或化学发光活性衍生物；酶活性基团，如过氧化物酶，如辣根过氧化物酶或其任何酶活性衍生物；高电子密度基团，如含重金属的基团，如含金的基团；半抗原，如酚衍生的半抗原；强抗原结构，如预计具有抗原性的肽序列，如通过Kolaskar和Tongaonkar的算法预计具有抗原性的肽序列；针对另一种分子的适体；螯合基团，如六组氨酸基；天然或天然衍生的蛋白结构介导的进一步的特异性蛋白-蛋白相互作用，如fos/jun对成员；磁性基团，如铁磁性基团；或放射性基团，如包含1H、14C、32P、35S或125I或它们的任何组合的基团；或指通过高亲和力相互作用共价或非共价连接所标签的球聚体，优选共价连接有利于失活、多价螯合、降解和/或沉淀的基团，优选用促进体内降解的基团、更优选用泛素进行标签，在此如果该标签的寡聚体在体内装配则是特别优选的；或指通过任何上述组合所修饰的球聚体。这样的标记和标签基团及用于将它们连接在蛋白上的方法是本领域已知的。标记和/或标签可在球聚化之前、期间或之后进行。在本发明的另一个方面中，球聚体衍生物是通过标记和/或标签反应可获得自球聚体的分子。相应地，术语“Aβ(X-Y)单体衍生物”在此特别指如对球聚体所描述的被标记或标签的Aβ单体。
术语“更大的亲和力”在此指一种相互作用的程度，其中未结合的抗体和未结合的球聚体在一边而抗体-球聚体复合物在另一边之间的平衡是更有利于抗体-球聚体复合物。同样地，术语“更小的亲和力”在此指一种相互作用的程度，其中未结合的抗体和未结合的球聚体在一边而抗体-球聚体复合物在另一边之间的平衡是更有利于未结合的抗体和未结合的球聚体。术语“更大的亲和力”与术语“更高的亲和力”是同义的，以及术语“更小的亲和力”与术语“更低的亲和力”是同义的。
术语“Aβ(X-Y)单体”在此指Aβ(X-Y)肽的分离形式，优选地指一种基本上不卷入与其他Aβ肽的非共价相互作用的Aβ(X-Y)肽的形式。事实上，Aβ(X-Y)单体通常以水溶液形式提供。优选地，当例如用于测定本发明抗体的结合亲和力时，单体水溶液含有0.05％-0.2％，更优选约0.1％NaOH。在另一个优选的情况下，单体水溶液含有0.05％-0.2％，更优选约0.1％NaOH。当使用时，可以适当的方式方便地稀释所述溶液。此外，通常有利的是在其沉淀后2小时内、特别是1小时内以及尤其在30分钟内使用所述溶液。
术语“原纤维”在此指一种包含非共价缔合的单个Aβ(X-Y)肽的装配体的分子结构，其在电子显微镜下显示纤丝结构，其结合刚果红，在偏振光下显示双折射，并且其的X-射线衍射图谱为交叉-β结构。原纤维还可被定义为一种通过包括如在0.1M HCl中，于去污剂不存在的情况下合适的Aβ肽的自身诱导的聚合聚集，所述聚集导致多于24个单体、优选多于100个单体的聚集体形成的处理可获得的分子结构。该处理为本领域众所周知。有利地，Aβ(X-Y)原纤维以水溶液形式得到使用。在本发明的一个特别优选的实施方案中，通过将Aβ肽溶解于0.1％NH4OH中，用20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH7.4以1∶4稀释其，然后调pH至7.4，在37℃下温育溶液20小时，接着在10000g下离心10分钟并重悬于20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH7.4中来制备原纤维水溶液。
术语“Aβ(X-Y)原纤维”在此指包含Aβ(X-Y)亚基的原纤维，其中优选平均起来至少90％的亚基为Aβ(X-Y)型，更优选至少98％的亚基为Aβ(X-Y)型，以及最优选非-Aβ(X-Y)肽的含量低于检出阈值。
回到抗体8F5，与例如竞争抗体如m266和3D6相反，该Aβ(1-42)球聚体-特异性抗体主要识别Aβ(1-42)球聚体形式并且不主要识别Aβ(1-40)单体、Aβ(1-42)单体、Aβ-原纤维或sAPP(即Aβ前体)的标准制备物。这样的针对球聚体的特异性是重要的，因为用球聚体优先抗体例如8F5特异性靶向Aβ的球聚体形式会：1)避免靶向不溶性淀粉样蛋白沉积物，因为与其结合可能是在用不溶性Aβ免疫接种过程中观察到的炎性副作用的原因；2)不伤害被报道具有认知生理功能的Aβ单体和APP(Plan等，J.of Neuroscience 23：5531-5535(2003)；和3)增加抗体的生物利用度，因为通过与不溶性沉积物广泛结合，从而其不会被遮蔽或无法接近。
本发明还包括编码抗体8F5的可变轻链和重链的分离的核苷酸序列(或其片段)以及那些具有包含、相应于、相同于、能杂交于或互补于这些编码核苷酸序列，与这些编码核苷酸序列具有至少约70％(如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％)，优选至少约80％(如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％)，以及更优选至少约90％(如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的核苷酸序列(或其片段)。(关于同一性百分数，处于70％和100％之间并包括70％和100％的所有整数(及其部分)都被认为处于本发明的范围中)。这样的序列可源自于任何来源(如分离自天然来源、通过半合成途径产生或从头合成)。具体而言，这样的序列可分离自或源自除实施例中所描述的来源以外的来源(如细菌、真菌、藻类、小鼠或人)。
除上述核苷酸序列以外，本发明还包括抗体8F5的可变轻链和重链的氨基酸序列(或这些氨基酸序列的片段)。此外，本发明还包括包含、相应于、相同于或互补于本发明蛋白的氨基酸序列，与本发明蛋白的氨基酸序列具有至少约70％(如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％)，优选至少约80％(如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％)，以及更优选至少约90％同一性(如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的氨基酸序列(或其片段)。(同样，关于同一性百分数，处于70％和100％之间并包括70％和100％的所有整数(及其部分)(如在上述核苷酸序列同一性方面中所述的)都被认为处于本发明的范围中)。
对本发明来说，核苷酸序列的“片段”定义为相应于特定核苷酸序列的一个区域的大约至少6个，优选至少约8个，更优选至少约10个核苷酸，以及还更优选至少约15个核苷酸的连续序列。
术语“同一性”指在一个特定比较窗口或节段上，于逐个核苷酸基础上的两条序列的关联性。因此，同一性定义为两条DNA片段(或两条氨基酸序列)的相同链(有义或反义)之间的一致性、对应性或等价性的程度。通过在特定区域上比较两条最佳比对序列，确定在两条序列中都存在的相同碱基或氨基酸的位置的数目以便产生匹配位置的数目，将上述位置的数目除以正比较的片段中位置的总数目并将结果乘以100，从而计算出“序列同一性百分数”。可通过如下实施序列的最佳比对：Smith& Waterman，Appl.Math.2：482(1981)的算法，Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的算法，Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：2444(1988)的方法和执行有关算法(如Clustal Macaw Pileup(http://cmgm.stanford.edu/biochem218/11Multiple.pdf；Higgins等，CABIOS.5L 151-153(1989))、FASTDB(Intelligenetics)、BLAST(NationalCenter for Biomedical Information；Altschul等，Nucleic Acids Research25：3389-3402(1997))、PILEUP(Genetics Computer Group，Madison，WI)或GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7.0，Genetics Computer Group，Madison，WI)的计算机程序(参见美国专利号5,912,120)。
对本发明来说，“互补性”定义为两条DNA片段之间关联性的程度。其通过测定在合适的条件下一条DNA片段的有义链与另一条DNA片段的反义链杂交以形成双螺旋的能力而得以确定。“互补体”定义为基于经典的碱基配对法则与给定序列配对的一条序列。例如，在一条核苷酸链中的序列A-G-T是“互补”于另一条链中的T-C-A的。
在双螺旋中，如果腺嘌呤出现在一条链中，则胸腺嘧啶就出现在另一条链中。类似地，如果鸟嘌呤出现在一条链中，则胞嘧啶就出现另一条链中。两条DNA片段的核苷酸序列之间的关联性越大，则在这两条DNA片段的链之间形成杂种双链体的能力就越强。
两条氨基酸序列之间的“相似性”定义为在两条序列中存在一系列相同的以及保守的氨基酸残基。两条氨基酸序列之间的相似性水平越高，则这两条需列的相应性、一致性或等价性就越高。(两条氨基酸序列之间的“同一性”定义为在两条序列中存在一系列的精确相同或不变的氨基酸残基)。“互补性”、“同一性”和“相似性”的定义是本领域技术人员众所周知的。
“为......编码”指编码多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列或其部分含有来自为所述核酸序列编码的多肽的至少3个氨基酸，更有选至少8个氨基酸，以及还更有选至少15个氨基酸的氨基酸序列。
当在本文中使用时，“生物活性”指球聚体的Aβ(1-42)区的所有内在的生物学性质。这样的性质包括例如结合在此描述的8F5以及功能性相关抗体的能力。
当在本文中使用时，关于抗体、蛋白或肽与另一化学物种的相互作用，术语“特异结合”或“特异性结合”意指取决于化学物种上特定结构(如抗原决定簇或表位)存在的相互作用；例如抗体识别并结合特定蛋白结构而非一般蛋白。如果抗体特异于表位“A”，则在包含标记的“A”和抗体的反应中含有表位A(或不含有，未标记A)的分子会减少标记的A与抗体结合的量。
当在本文中使用时，术语“抗体”概括地指任何由四条多肽链——两条重(H)链和两条轻(L)链或它们的任何功能性片段、突变体、变体或衍生物组成的免疫球蛋白(Ig)分子，其保留有Ig分子的必需表位结合特征。这样的突变体、变体或衍生物抗体形式在本领域中是已知的。其的非限制的实施方案讨论如下。
在全长抗体中，每条重链由重链可变区(在此简写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个区CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在此简写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个区CL组成。VH和VL区可进一步再分成称为互补决定区(CDR)的高变区，称为构架区(FR)的交替分布的更保守的区域。每一VH和VL区由以如下顺序从氨基末端到羧基末端的排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的。
当在本文中使用时，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)指保留有与抗原(如Aβ(1-42)球聚体)特异性结合能力的抗体的一条或多条片段。已经表明抗体的抗原结合功能可为全长抗体的一条或多条片段所执行。这样的抗体实例还可以是特异性结合两个或更多个不同抗原的双特异性、二重特异性或多特异性抗体。包含于术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1区组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，一种包含在铰链区通过二硫桥键连接的两条Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1区组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH区组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546，Winter等，国际申请公开号WO90/05144A1，在此并入作为参考)，其包含单个可变区；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个区，VL和VH，为分开的基因所编码，但是使用重组技术通过合成接头可将它们连接在一起，所述接头能使它们作为其中VL和VH区配对形成单价分子的单条蛋白链而得以制备(被称为单链Fv(scFv)；参见如Bird等(1988)Science242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)。在此这样的单链抗体同样包含在术语抗体的“抗原结合部分”中。其他形式的单链抗体例如双抗体也包括在其中。双抗体是二价的、双特异性抗体，其中VH和VL区在单条多肽链上表达，但使用的接头太短以至于同一链上两个区之间无法配对，从而迫使所述区与另一条链的互补区配对并产生两个抗原结合位点(参见如Holliger，P.，等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，等(1994)Structure 2：1121-1123)。这样的抗体结合部分是本领域已知的(Kontermann和Dubel编，Antibody Engineering(2001)Springer-Verlag.New York.790pp.(ISBN 3-540-41354-5))。
当在本文中使用时，术语“抗体构建体”指一种包含连接到连接多肽或免疫球蛋白恒定域的一个或更多个本发明的抗原结合部份的多肽。连接多肽包含通过肽键连接的两个或更多个氨基酸残基并用于连接一个或更多个抗原结合部分。这样的连接多肽是本领域公知的(参见如Holliger，P.，等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，等(1994)Structure 2：1121-1123)。免疫球蛋白恒定域指重链或轻链恒定区。人IgG重链和轻链恒定区氨基酸序列是本领域已知的并示于表1中。
表1：人IGG重链恒定区和轻链恒定区的序列
  蛋白   序列标识符   序列
  12345678901234567890123456789012
  Igγ-1恒定区   SEQ ID NO.：25   ASTKGPSVFFLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
  蛋白   序列标识符   序列
  12345678901234567890123456789012
  Igγ-1恒定区突变体   SEQ ID NO.：26   ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
  IgK恒定区   SEQ ID NO.：27   TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
  Igλ恒定区   SEQ ID NO.：28   QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
更进一步，抗体或其抗原结合部分可以是由抗体或抗体部分与一个或更多个其他蛋白或肽共价或非共价缔合形成的较大的免疫黏附分子的一部分。这样的免疫黏附分子的实例包括使用链霉抗生物素蛋白核心区来制备四聚scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等(1995)Human Antibodiesand Hybridomas 6：93-101)以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C-末端多组氨酸标签来制备二价和生物素化scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。可使用常规技术例如分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化全抗体，由全抗体制备抗体部分例如Fab和F(ab′)2片段。此外，可使用如本文中所描述的标准的重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫黏附分子。
当在本文中使用时，“分离的抗体”意指一种基本上不含有具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(如一种特异性结合Aβ(1-42)球聚体的分离的抗体是基本上不含有特异性结合除Aβ(1-42)球聚体以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合Aβ(1-42)球聚体的分离的抗体可具有与其他抗原的交叉反应性，所述其他抗原例如来自其他物种的Aβ(1-42)球聚体分子。此外，分离的抗体可基本上不含有其他的细胞物质和/或化学药品。
当在本文中使用时，术语“人抗体”意在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不为人种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点专一诱变或体内体细胞突变所导入的突变)，例如在CDR中以及特别在CDR3中。然而，当在本文中使用时，术语“人抗体”并不意在包括其中已被嫁接到人构架序列上的来源于另一哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列的抗体。
当在本文中使用时，术语“重组人抗体”意在包括所有通过重组手段制备、表达、创建或分离的人抗体，例如使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(描述在下)，分离自重组的、组合的人抗体文库的抗体(Hoogenboom H.R.，(1997)TIB Tech.15：62-70；Azzazy H.，和Highsmith W.E.，(2002)Clin.Biochem.35：425-445；Gavilondo J.V.，和Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29：128-145；Hoogenboom H.，和ChamesP.(2000)Immunology Today 21：371-378)，分离自转入人免疫球蛋白基因的转基因动物(如小鼠)的抗体(参见如Taylor，L.D.，等(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295；Kellermann S-A.，和Green L.L.(2002)CurrentOpinion in Biotechnology 13：593-597；Little M.等(2000)ImmunologyToday 21：364-370)或通过任何其他涉及人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的手段制备、表达、创建或分离的抗体。这样的重组人抗体具有来源人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，这样的重组人抗体受到体外诱变(或者，当使用转入人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞突变)，因此该重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是当来源于人种系VH和VL序列以及与之相关时，可以不天然存在于体内人抗体种系库中的序列。
术语“嵌合抗体”指包含来自一种物种的重链和轻链可变区序列以及来自另一物种的恒定区序列的抗体，例如具有连接人恒定区的鼠重链和轻链可变区的抗体。
术语“CDR嫁接抗体”指包含来自一种物种的重链和轻链可变区序列，但其中VH和/或VL的一个或更多个CDR区序列为另一物种的CDR序列所取代的抗体，例如具有其中一个或更多个鼠CDR(如CDR3)已为人CDR序列所取代的鼠重链和轻链可变区的抗体。
术语“人源化抗体”指包含来自非人物种(如小鼠)的重链和轻链可变区序列，但其中至少一部分的VH和/或VL序列已被改变成更加“人样的”，即更类似于人种系可变区序列的抗体。一种类型的人源化抗体是其中将人CDR序列导入非人VH和VL序列中替代相应的非人CDR序列的CDR嫁接抗体。
在本文中，术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”是可交换使用的。这些本领域公知的术语指编号与抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基相比更加可变(即高变)的氨基酸残基的体系(Kabat等(1971)Ann.NY Acad，Sci.190：382-391和Kabat，E.A.，等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242)。对于重链可变区，高变区CDR1从氨基酸第31位到第35位，CDR2从氨基酸第50位到第65位，CDR3从氨基酸第95位到第102位。对于轻链可变区，高变区CDR1从氨基酸第24位到第34位，CDR2从氨基酸第50位到第56位，CDR3从氨基酸第89位到第97位。
当在本文中使用时，术语“接纳体”和“接纳体抗体”指提供或编码至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的一个或更多个构架区的氨基酸序列的抗体或核酸序列。在某些实施方案中，术语“接纳体”指提供或编码恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在又一个实施方案中，术语“接纳体”指提供或编码一个或更多个构架区和恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在一个具体的实施方案中，术语“接纳体”指提供或编码至少80％、优选至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的一个或更多个构架区的氨基酸序列的人抗体氨基酸或核酸序列。根据该实施方案，接纳体可含有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少10个不存在于人抗体的一个或更多个特定位置上的氨基酸残基。接纳体构架区和/或接纳体恒定区可以是例如来源于或获得自种系抗体基因、成熟抗体基因、功能性抗体(如本领域公知的抗体、开发中的抗体或市售抗体)。
当在本文中使用时，术语“CDR”指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链可变区内各自存在三个CDR，对于每一可变区其称为CDR1、CDR2和CDR3。当在本文中使用时，术语“CDR组”指存在于能结合抗原的单个可变区中的一组三个CDR。根据不同的系统对这些CDR的确切边界已作不同的定义。Kabat描述的该系统(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1987)和(1991))不仅提供了可适用于任何抗体可变区的明确的残基编号系统，还提供了限定这三个CDR的精确的残基边界。这些CDR可称为Kabat CDRs。Chothia和同事(Chothia & Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)和Chothia等，Nature 342：877-883(1989))发现Kabat CDRs中的某些子位置尽管在氨基酸序列水平上差异较大，但采用了几乎相同的肽主链构象。这些子位置被命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区。这些区可称为Chothia CDRs，其具有与Kabat CDRs重叠的边界。其他与Kabat CDRs重叠的边界定义的CDR已为Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))所描述。尽管如此，其他CDR边界定义可以不必严格地遵照上述系统中的任何一种，但仍然是与Kabat CDRs重叠的，尽管根据预测或特定的残基或残基组或甚至整个CDR都不明显影响抗原结合的实验结论它们可以更短或更长。用于本文中的方法可利用根据任何一种这些系统所定义的CDR，尽管优选的实施方案利用了Kabat或Chothia定义的CDR。
当在本文中使用时，术语“规范”残基指规定了如Chothia等(J.Mol.Biol.196：901-907(1987)；Chothia等，J.Mol.Biol.227：799(1992)，两者都在此并入作为参考)所定义的特定的规范CDR结构的CDR中或构架区中的残基。根据Chothia等，许多抗体CDR的关键位置尽管在氨基酸序列水平上差异较大，但具有几乎相同的肽主链构象。每个规范结构规定了主要是一组形成环的氨基酸残基的连续区段的肽主链扭转。
当在本文中使用时，术语“供体”和“供体抗体”指提供一个或更多个CDR的抗体。在一个优选的实施方案中，供体抗体是一种来自不同于构架区所获得自或来源于的抗体的物种的抗体。在人源化抗体的上下文中，术语“供体抗体”指提供一个或更多个CDR的非人抗体。
当在本文中使用时，术语“构架区”或“构架区序列”指可变区减去CDR所剩下的序列。由于可使用不同系统确定CDR序列的确切定义，因此构架区序列的含义可相应地进行不同的解释。6个CDR(轻链的CDR-L1、-L2和-L3以及重链的CDR-H1、-H2和-H3)还将轻链和重链每条链上的构架区分成四个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，以及CDR3位于FR3和FR4之间。没有规定特定的亚区为FR1、FR2、FR3或FR4，他人所提及的构架区代表了天然存在的免疫球蛋白链的单个可变区中组合的FR′s。当在本文中使用时，FR代表四个亚区中的一个，FRs代表了构成构架区的四个亚区中的两个或更多个。
人重链和轻链接纳体序列在本领域中是已知的。在本发明的一个实施方案中，人重链和轻链接纳体序列选自下述序列：
表2：重链接纳体序列
  SEQ ID No.   蛋白区域   序列
  17   VH3-23/JH4 Fr1   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS
  18   VH3-23/JH4 Fr2   WVRQAPGKGLEWVS
  19   VH3-23/JH4 Fr3   RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
  20   VH3-23/JH4 Fr4   WGQGTLVTVSS
表3：轻链接纳体序列
  SEQ ID No.   蛋白区域   序列
  21   A19/JK1 Fr1   DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC
  22   A19/JK1 Fr2   WYLQKPGQSPQLLIY
  23   A19/JK1 Fr3   GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC
  24   A19/JK1 Fr4   FGGGTKVEIKR
当在本文中使用时，术语“种系抗体基因”或“基因片段”指为没有经历导致用于特定免疫球蛋白表达的基因重排及突变的成熟过程的非淋巴样细胞所编码的免疫球蛋白序列(参见如Shapiro等，Crit.Rev.Immunol.22(3)：183-200(2002)；Marchalonis等，Adv Exp Med Biol.484：13-30(2001))。本发明多个实施方案所提供的一个优点源于这样的发现，即与成熟抗体基因相比，种系抗体基因更有可能在物种中保存个体基本的氨基酸序列结构特征，因此当在该物种中用作治疗时较不可能被识别为来自外源的。
当在本文中使用时，术语“关键”残基指对抗体，特别是人源化抗体的结合特异性和/或亲和力具有更大影响的可变区中的某些残基。关键残基包括但不限于如下的一种或更多种：与CDR邻接的残基、潜在的糖基化位点(其可以是N-或O-糖基化位点)、稀有残基、能与抗原相互作用的残基、能与CDR相互作用的残基、规范残基、在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基、游标区中的残基以及在Chothia定义的可变重链CDR1与Kabat定义的第一重链构架区之间重叠的区中的残基。
当在本文中使用时，术语“人源化抗体”是一种与目标抗原免疫特异性结合并包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的构架区(FR)和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)的抗体或其变体、衍生物、类似物或片段。当在本文中使用时，在CDR上下文中术语“基本上”指CDR具有至少80％，优选至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一于非人抗体CDR的氨基酸序列的氨基酸序列。人源化抗体包含基本上所有的至少一个，以及特别是两个可变区(Fab、Fab′、F(ab′)2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有的CDR区都相应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的那些CDR区以及所有的或基本上所有的构架区都是人免疫球蛋白的那些构架区共有序列。优选地，人源化抗体还包含至少一部分的的免疫球蛋白恒定域(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。在某些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变区。抗体还可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在具体的实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链可变区和/或人源化重链。
人源化抗体可选自任何类型的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型的免疫球蛋白，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可包含来自多于一类或一种同种型的序列，以及可使用本领域众所周知的技术选择具体的恒定区以优化所需的效应子功能。
人源化抗体的构架区和CDR区不需要准确相应于亲本序列，如供体抗体CDR或共有构架区可通过取代、插入和/或缺失至少一个氨基酸残基得到诱变，使得在该位点的CDR或构架区残基不与供体抗体或共有构架区准确相应。然而，在一个优选的实施方案中，这样的突变不应当是广泛的。一般来说，至少80％，优选至少85％，更优选至少90％以及最优选至少95％的人源化抗体残基应当相应于亲本FR和CDR序列的那些残基。当在本文中使用时，术语“共有构架区”指以共有免疫球蛋白序列存在的构架区。当在本文中使用时，术语“共有免疫球蛋白序列”指由相关的免疫球蛋白序列家族中最常见的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见如Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987)。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每一个位置为在该家族中于该位置处最常见的氨基酸所占据。在两个氨基酸以相同频率占据的情况下，皆可包括在共有序列中。
当在本文中使用时，“游标”区指为Foote和Winter(1992，J.Mol.Biol.224：487-499，其在此并入作为参考)所描述的一亚组的可调节CDR结构并调整使适于抗原的构架区残基。游标区残基构成一支承CDR的层并可影响CDR结构及抗体的亲和力。
当在本文中使用时，术语“中和”指当结合蛋白特异性结合球聚体时，球聚体生物活性的中和。优选地，中和结合蛋白是一种其结合球聚体的Aβ(1-42)氨基酸区导致球聚体生物活性抑制的中和抗体。优选地，中和结合蛋白结合球聚体的Aβ(1-42)区并减少至少约20％、40％、60％、80％、85％或更多的球聚体生物活性。可通过测定一种或更多种本领域公知的球聚体生物活性指示剂，从而评价球聚体生物活性通过中和结合蛋白的抑制。
术语“活性”包括诸如抗体对抗原的结合特异性/亲和力的活性，例如抗-Aβ(1-42)抗体结合Aβ(1-42)球聚体和/或抗体的中和能力，例如结合Aβ(1-42)的抗-Aβ(1-42)抗体抑制球聚体的生物活性。
术语“表位”包括任何能与免疫球蛋白或T-细胞受体特异性结合的多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，以及在某些实施方案中，可具有特定的三维结构特性和/或特定的荷电特性。表位是为抗体所结合的抗原的一个区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，就说该抗体特异性结合抗原。
当在本文中使用时，术语“表面等离振子共振”指一种供通过例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden andPiscataway，NJ)检测生物传感器矩阵中蛋白浓度改变，从而分析实时生物特异性相互作用之用的光学现象。更进一步的描述参见
Figure GPA00001010821000321
U.，等(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；
Figure GPA00001010821000322
U.，等(1991)Biotechniques11：620-627；Johnsson，B.，等(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；和Johnnson，B.，等(1991)Anal.Biochem.198：268-277。
当在本文中使用时，术语“Kon”意指如本领域中所知的抗体与抗原缔合形成抗体/抗原复合物的结合速率常数。
当在本文中使用时，术语“Koff”意指如本领域中所知的抗体由抗体/抗原复合物上解离的解离速率常数。
当在本文中使用时，术语“Kd”或“KD”意指如本领域中所知的特定抗体-抗原相互作用的解离常数。
当在本文中使用时，术语“标记的结合蛋白”指一种具有提供用于鉴定结合蛋白的掺入标记的蛋白。优选地，该标记是可检测的标记，如掺入放射性同位素标记的氨基酸或将可通过标记的抗生物素蛋白(如包含荧光标记或可通过光学或比色方法检测的酶活性的链霉抗生物素蛋白)检测的生物素基部分连接于多肽。用于多肽的标记的实例包括但不限于如下：放射性同位素或放射性核素(如3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm)；荧光标记(如FITC、若丹明、镧系元素磷光体)；酶标记(如辣根过氧化物酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标记；生物素基团；为第二报道分子(如亮氨酸拉链对序列、针对第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)所识别的预定的多肽表位；以及磁性介质例如钆螯合物。
术语“抗体缀合物”指一种化学连接有第二化学部分如治疗剂或细胞毒素剂的结合蛋白，例如抗体。术语“剂”在本文中用于指化合物、化合物混合物、生物大分子或由生物材料制备的提取物。优选地，治疗剂或细胞毒素剂包括但不限于百日咳毒素、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴乙啶、依米丁、丝裂霉素、足叶乙甙、鬼臼噻吩甙、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾甾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素以及它们的类似物或同系物。
当在本文中使用时，术语“晶体”和“结晶”指以晶体形式存在的抗体或其抗原结合部分。晶体是一种类型的固体物态，不同于其他类型例如无定形固体或液晶态。晶体由原子、离子、分子(如蛋白例如抗体)或分子装配体(如抗原/抗体复合物)的规则的、重复的、三维阵列组成。这些三维阵列根据本领域中公知的特定数学关系排列。晶体中重复的基本单位或结构单元称为不对称单元。遵循给定的、定义明确的晶体学对称性的排列中不对称单元的重复规定了晶体的“单位晶胞”。在全三维空间中通过正则转换的单位晶胞的重复规定了晶体。参见Giege，R和Ducruix，A.Barrett，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，aPractical Approach，第2版.，pp.20 1-16，Oxford University Press，NewYork，New York，(1999)。
当在本文中提及时，术语“多核苷酸”指两个或更多个核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任何一种类型的核苷酸的修饰形式)的多聚形式。该术语包括单链和双链形式的DNA但优选为双链DNA。
当在本文中使用时，术语“分离的多核苷酸”应指根据其来源与该“分离的多核苷酸”所见于的自然界中所具有的全部或一部分的多核苷酸无关的；可操作地与在自然界中没有连接的多核苷酸连接的；或不作为较大序列的一部分存在于自然界中的多核苷酸(如基因组、cDNA或合成来源的，或它们的某些组合)。
当在本文中使用时，术语“载体”意指一种能转运另一种其已连接的核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指其中可连接额外的DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可连接到病毒基因组中。某些载体能在它们所导入的宿主细胞中自主复制(如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(如非附加型哺乳动物载体)刚一导入宿主细胞中就可整合入宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能指导其可操作连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中表达载体通常是以质粒形式应用。在本发明说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常使用的形式。然而，本发明意在包括这样的其他形式的表达载体例如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，其提供了相等的作用。
术语“可操作地连接”指一种其中所描述的组分以容许它们以它们预期的方式起作用的关系存在的毗邻关系。控制序列“可操作地连接”编码序列是以这样一种方式即在相容于控制序列的条件下实现编码序列的表达来连接的。“可操作地连接的”序列包括邻接目标基因的表达控制序列和反式作用或在远处控制目标基因的表达控制序列。当在本文中使用时，术语“表达控制序列”指为影响它们所连接的编码序列表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起点、终点、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；提高蛋白稳定性的序列；以及当需要时，增加蛋白分泌的序列。取决于宿主生物体上述控制序列的特性有所差异；在原核生物中，上述控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，上述控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意在包括其存在对表达和加工必不可少的元件，并还可包括其存在是有利的额外元件，例如前导序列和融合伴侣序列。
如本文中所定义的，“转化”指外源DNA进入宿主细胞的任何过程。使用本领域众所周知的多种方法可在天然或人工条件下发生转化。转化可依赖于任何已知的用于将外源核酸序列插入原核或真核宿主细胞中的方法。该方法是基于要被转化的宿主细胞进行选择的并且可包括但不限于病毒感染、电穿孔、脂质转染和粒子轰击。这样的“转化的”细胞包括其中插入的DNA能作为自主复制质粒或作为宿主染色体一部分复制的稳定转化的细胞。它们还包括持续有限的一段时间瞬时表达插入的DNA或RNA的细胞。
当在本文中使用时，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)意指外源DNA已导入其中的细胞。应当明白上述术语不仅意指特定的受试细胞，还指这样的细胞的后代。由于突变或环境影响某些修饰可在后代中发生，因此事实上这样的后代可以不同于亲本细胞，但仍包括在如本文中所使用的术语“宿主细胞”的范围中。优选地，宿主细胞包括选自任何生命界的原核和真核细胞。优选的真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。最优选的宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293和COS；昆虫细胞系Sf9和真菌细胞酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养以及转化(如电穿孔、脂质转染)。可根据厂商使用说明书或如本领域中所通常实行的或如本文中所描述的进行酶促反应和纯化技术。前述技术和方法可通常根据本领域众所周知的常规方法以及如各种常用的和在本发明说明书全文中所引证和讨论的更具体的参考文献所描述的来执行。参见如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))，其在此并入作为用于任何用途的参考文献。
如本领域所知的以及当在本文中使用时，“转基因生物”指具有含有转基因的细胞的生物体，其中导入生物体(或该生物体的祖先)中的转基因表达在该生物体中不天然表达的多肽。“转基因”是一种DNA构建物，其稳定且可操作地整合入转基因生物体所发育自的细胞的基因组中，在转基因生物体的一种或更多种细胞类型或组织中指导编码基因产物的表达。
术语“调节(regulate)”和“调制(modulate)”是可交换地使用的，以及当在本文中使用时，指目标分子活性(如Aβ(1-42)球聚体的生物活性)的变化或改变。调节可以是目标分子的某种活性或功能在量值上的增加或减少。作例证的分子活性和功能包括但不限于结合特性、酶活性、细胞受体活化和信号转导。
相应地，当在本文中使用时，术语“调节剂”是一种能变化或改变目标分子活性或功能(如Aβ(1-42)球聚体的生物活性)的化合物。例如，与该调节剂不存在的情况下所观察到的活性或功能的量值相比，调节剂可导致分子某种活性或功能在量值上增加或减少。在某些实施方案中，调节剂是一种抑制剂，其减少了分子的至少一种活性或功能的量值。作例证的抑制剂包括但不限于蛋白、肽、抗体、肽抗体(peptibodies)、碳水化合物或有机小分子。肽抗体描述于例如国际申请公开号WO 01/83525中。
当在本文中使用时，术语“激动剂”指与该激动剂不存在的情况下所观察到的活性或功能的量值相比，当与目标分子接触时导致该分子某种活性或功能在量值上增加的一种调节剂。具体的目标激动剂可包括但不限于Aβ(1-42)球聚体多肽或与Aβ(1-42)球聚体结合的多肽、核酸、碳水化合物或任何其他分子。
当在本文中使用时，术语“拮抗剂”或“抑制剂”指与该拮抗剂不存在的情况下所观察到的活性或功能的量值相比，当与目标分子接触时导致该分子某种活性或功能在量值上减少的一种调节剂。具体的目标拮抗剂包括那些阻断或调节Aβ(1-42)球聚体的生物或免疫活性的拮抗剂。Aβ(1-42)球聚体的拮抗剂和抑制剂可包括但不限于结合Aβ(1-42)球聚体的蛋白、核酸、碳水化合物或任何其他分子。
当在本文中使用时，术语“有效量”指足以减少或改善病症或其一种或更多种症状的严重程度和/或持续时间，阻止病症进展，导致病症消退，阻止与病症相关的一种或更多种症状复发、发展、发生或进展，检出病症，或提高或改善另一治疗(如预防剂或治疗剂)的预防或治疗效果的治疗的量。
当在本文中使用时，术语“样品”以其最广义使用。当在本文中使用时，“生物样品”包括但不限于来自生物或前生物(formerly living thing)的任何量的物质。这样的生物包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴、狗、兔和其他哺乳动物或非哺乳动物的动物。这样的物质包括但不限于血液、血清、尿、滑液、细胞、器官、组织(如脑)、骨髓、淋巴结、脑脊液和脾。
结合AB(1-42)球聚体的抗体
本发明的一个方面提供了以高亲和力、慢解离速率和高中和容量结合Aβ(1-42)球聚体的分离的鼠单克隆抗体或其抗原结合部分。本发明的第二个方面提供了结合Aβ(1-42)球聚体的嵌合抗体。本发明的第三个方面提供了结合Aβ(1-42)球聚体的CDR嫁接抗体或其抗原结合部分。本发明的第四个方面提供了结合Aβ(1-42)球聚体的人源化抗体或其抗原结合部分。优选地，抗体或其部分是分离的抗体。优选地，本发明的抗体是中和的人抗-Aβ(1-42)球聚体抗体。
A.制备抗-AB(1-42)球聚体抗体的方法
可通过任何一种本领域已知的技术制备本发明的抗体。几种这些方法详述如下：
1.使用杂交瘤技术制备抗-AB(1-42)球聚体单克隆抗体
可使用多种本领域已知技术制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组体以及噬菌体展示技术或它们的组合。例如，可使用杂交瘤技术产生单克隆抗体，所述杂交瘤技术包括那些本领域已知的和例如在Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版.1988)；Hammerling，等，in：Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(所述文献以其全文并入作为参考)中教导的技术。当在本文中使用时，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指一种来源于包括任何真核生物、原核生物或噬菌体克隆在内的单一克隆而非来源于产生其的方法的抗体。
使用杂交瘤技术用于产生和筛选特定抗体的方法是本领域惯用且熟知的。在一个实施方案中，本发明提供了产生单克隆抗体的方法以及通过该方法产生的抗体，包括培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中优选通过将分离自用本发明抗原免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后对融合产生的杂交瘤筛选分泌能结合本发明多肽的抗体的杂交瘤克隆，从而产生杂交瘤。简言之，小鼠可用Aβ(1-42)球聚体抗原免疫。在一个优选的实施方案中，抗原与佐剂一起施用以刺激免疫应答。这样的佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。这样的佐剂可通过将多肽隔绝于局部沉淀物中，从而保护其免于快速分散，或它们可包含刺激宿主分泌对于巨噬细胞和免疫系统的其他组分是趋化因子的物质。优选地，如果正在施用多肽，免疫接种程序表将包括在几周内两次或更多次施用多肽。
在用Aβ(1-42)球聚体抗原免疫动物后，抗体和/或抗体产生细胞可获得自该动物。通过放血或处死动物由动物获得含抗-Aβ(1-42)球聚体抗体血清。由于该血清获得自动物，因此其可以使用，免疫球蛋白级分可获得自血清，或抗-Aβ(1-42)球聚体抗体可纯化自血清。以该方法获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，因此具有非均质系统特性。
一旦检测到免疫应答，如在小鼠血清中检测到特异性针对抗原Aβ(1-42)球聚体的抗体，则采集小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过公知技术将脾细胞融合至任何合适的骨髓瘤细胞，例如来自可获得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)的细胞系SP20的细胞。选择杂交瘤并通过有限稀释进行克隆。然后，针对分泌能结合Aβ(1-42)球聚体的抗体的细胞，通过本领域已知方法分析杂交瘤克隆。可通过用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠产生通常含有高水平抗体的腹水。
在另一个实施方案中，可由经免疫的动物制备产生抗体的永生化杂交瘤。在免疫后，处死动物并如本领域所公知的将脾B细胞融合至永生化骨髓瘤细胞。参见如Harlow和Lane，出处同上。在一个优选的实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌细胞系)。在融合和抗生素选择后，使用Aβ(1-42)球聚体或其部分、或表达Aβ(1-42)球聚体的细胞筛选杂交瘤。在一个优选的实施方案中，使用酶联免疫测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)，优选ELISA进行最初的筛选。ELISA筛选的一个实例提供于国际申请公开号WO 00/37504中，在此并入作为参考。
对抗-Aβ(1-42)球聚体抗体产生杂交瘤进行选择、克隆以及为了所需特性进行进一步的筛选，所述所需特性包括加强的杂交瘤生长、高抗体产量以及如下所进一步讨论的所需的抗体特性。可在同系动物中、在缺乏免疫系统的动物如裸鼠中于体内，或在细胞培养物中于体外培养并扩增杂交瘤。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法是本领域技术人员公知的。
在一个优选的实施方案中，杂交瘤是如上所描述的小鼠杂交瘤。在另一个优选的实施方案中，杂交瘤是在非人、非小鼠物种例如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中产生的。在另一个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人无分泌功能骨髓瘤与表达抗-Aβ(1-42)球聚体抗体的人细胞融合。
可通过已知技术产生识别特异性表位的抗体片段。例如，可通过使用酶例如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab′)2片段)蛋白酶解切割免疫球蛋白分子产生本发明的Fab和F(ab′)2片段。F(ab′)2片段包含可变区、轻链恒定区和重链的CHI区。
2.使用SLAM制备抗-AB(1-42)球聚体单克隆抗体
在本发明的另一个方面中，使用如在美国专利号5,627,052、国际申请公开号WO 92/02551和Babcock，J.S.等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-7848中所描述的，在本领域中称为选择淋巴细胞抗体法(SLAM)的方法，由单个分离的淋巴细胞产生重组抗体。在该方法中，使用抗原特异性溶血斑检测筛选分泌目标抗体的单个细胞，如来源于任何一种第1节中所描述的经免疫动物的淋巴细胞，其中使用接头如生物素将抗原Aβ(1-42)球聚体、Aβ(1-42)球聚体的亚基或其片段与绵羊红细胞偶联，并用于鉴定分泌具有针对Aβ(1-42)球聚体特异性的抗体的单个细胞。在鉴定了目标抗体分泌细胞后，通过逆转录酶-PCR从细胞中拯救出重链和轻链可变区cDNAs，然后在哺乳动物宿主细胞如COS或CHO细胞中，于合适的免疫球蛋白恒定域(如人恒定区)背景中可表达这些可变区。接着，来源于体内选择的淋巴细胞用扩增的免疫球蛋白序列转染的宿主细胞可在体外经历进一步的分析和选择，例如通过淘选转染细胞以分离表达针对Aβ(1-42)球聚体的抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列可进一步在体外进行操作，例如通过体外亲和力成熟法，如在国际申请公开号WO 97/29131和国际申请公开号WO 00/56772中所描述的那些方法。
3.使用转基因动物制备抗-AB(1-42)球聚体单克隆抗体
在本发明的另一个实施方案中，通过用Aβ(1-42)球聚体抗原免疫包含某些或全部人免疫球蛋白基因座的非人动物产生抗体。在一个优选的实施方案中，非人动物是XENOMOUSE转基因小鼠，一种包含人免疫球蛋白基因座大片段并且无法产生小鼠抗体的工程化的小鼠品系。参见如Green等Nature Genetics 7：13-21(1994)和美国专利号5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。还参见1991年7月25日公开的国际申请公开号WO91/10741、1994年2月3日公开的WO 94/02602、都于1996年10月31日公开的WO 96/34096和WO 96/33735、1998年4月23日公布的WO98/16654、1998年6月11日公布的WO 98/24893、1998年11月12日公布的WO 98/50433、1999年9月10日公布的WO 99/45031、1999年10月21日公布的WO 99/53049、2000年2月24日公布的WO 00/09560和2000年6月29日公布的WO 00/037504。XENOMOUSE转基因小鼠产生成人样人全人抗体谱并产生抗原特异的人Mabs。XENOMOUSE转基因小鼠通过导入人重链基因座和x轻链基因座的兆碱基大小的、种系构型YAC片段，从而包含大约80％的人抗体谱。参见Mendez等，NatureGenetics 15：146-156(1997)，Green和Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)，其内容在此并入作为参考。
4.使用重组抗体文库制备抗-AB(1-42)球聚体单克隆抗体
体外方法也可用于制备本发明的抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有期望结合特异性的抗体。用于这样的重组抗体文库筛选的方法是本领域公知的并包括在如下文献中描述的方法：例如Ladner等，美国专利号5,223,409；Kang等，国际申请公开号WO 92/18619；Dower等，国际申请公开号WO 91/17271；Winter等，国际申请公开号WO 92/20791；Markland等，国际申请公开号WO 92/15679；Breitling等，国际申请公开号WO 93/01288；McCafferty等，PCT公开号WO 92/01047；Garrard等，国际申请公开号WO 92/09690；Fuchs等(1991)，Bio/Technology9：1370-1372；Hay等，(1992)Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse等(1989)，Science 246：1275-1281；McCafferty等，Nature(1990)348：552-554；Griffiths等(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等，(1992)J Mol Biol 226：889-896；Clackson等，(1991)Nature 352：624-628；Gram等，(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad等(1991)Bio/Technology9：1373-1377；Hoogenboom等(1991)，Nuc Acid Res 19：4133-4137；和Barbas等(1991)，PNAS 88：7978-7982，美国专利申请公开号20030186374以及国际申请公开号WO 97/29131，各自内容在此并入作为参考。
重组抗体文库可来自用Aβ(1-42)球聚体或Aβ(1-42)球聚体的部分免疫的个体。或者，重组抗体文库可来自首次用于实验的
Figure GPA00001010821000401
个体，即从未用Aβ(1-42)球聚体免疫的个体，例如来自从未用人Aβ(1-42)球聚体免疫的人个体的人抗体文库。通过用包含人Aβ(1-42)球聚体的肽筛选重组抗体文库来选择本发明抗体，以从而选择那些识别Aβ(1-42)球聚体的抗体。用于进行这样的筛选和选择的方法是本领域公知的，例如描述于之前段落的参考文献中。为选择针对Aβ(1-42)球聚体具有特定结合亲和力的本发明抗体，例如那些以特定koff速率常数从人Aβ(1-42)球聚体上解离的抗体，本领域已知的表面等离振子共振法可用于选择具有期望koff速率常数的抗体。为选择针对Aβ(1-42)球聚体具有特定中和活性的本发明抗体，例如那些具有特定IC50的抗体，可使用本领域已知的用于评估人Aβ(1-42)球聚体活性抑制的标准方法。
在一方面，本发明涉及一种结合人Aβ(1-42)球聚体的分离的抗体或其抗原结合部分。优选地，该抗体是中和抗体。在不同的实施方案中，该抗体是重组抗体或单克隆抗体。
例如，还可使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生本发明的抗体。在噬菌体展示方法中，在携带有编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上展示功能性抗体结构域。具体而言，这样的噬菌体可被用于展示表达自谱或组合抗体文库(如人或鼠)的抗原结合域。可用抗原选择或鉴定表达结合目标抗原的抗原结合域的噬菌体，例如使用标记抗原或被结合或捕捉至固体表面或珠的抗原。在这些方法中使用的噬菌体通常是包括表达自具有被重组融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白的Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体区的噬菌体的fd和M13结合域的丝状噬菌体。可用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的实例包括那些披露于Brinkman等，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames等，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等，Gene 1879-18(1997)；Burton等，Advancesin Immunology 57：191-280(1994)；国际申请号PCT/GB91/01134；国际申请公开号WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；以及美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中的方法，各自以其全文在此并入作为参考。
如在上述参考文献中所描述的，在噬菌体选择后，可分离来自噬菌体的抗体编码区并用于产生包括人抗体或任何其他所需抗原结合片段的全抗体，以及如以下所详述的，在任何期望的宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌中表达。例如，使用本领域已知的方法，例如那些披露于国际申请公开号WO 92/22324；Mullinax等，BioTechniques 12(6)：864-869(1992)；和Sawai等，AJRI 34：26-34(1995)；以及Better等，Science 240：1041-1043(1988)(所述参考文献以其全文并入作为参考)中的方法，重组生产Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术也可得以使用。可用于产生单链Fvs和抗体的技术的实例包括那些描述于美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等，Methods in Enzymology203：46-88(1991)；Shu等，PNAS 90：7995-7999(1993)；和Skerra等，Science 240：1038-1040(1988)中的技术。
对于通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替代方案，其他本领域已知用于筛选大组合文库的方法可应用于鉴定本发明的双特异性抗体。一种类型替代表达系统是如在Szostak和Roberts的国际申请公开号WO98/31700以及Roberts，R.W.和Szostak，J.W.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12297-12302中所描述的，其中重组抗体文库被表达为RNA-蛋白融合物的表达系统。在该系统中，在mRNA和肽或蛋白之间创建了共价融合物，所述肽或蛋白为在它们的3’末端携带嘌呤霉素(一种肽酰基受体抗生素)的合成的mRNAs的体外翻译所编码。因此，基于编码肽或蛋白如抗体或其部分的性质，例如抗体或其部分与双特异性抗原的结合，特异性mRNA可富集自mRNAs的复杂混合物(如组合文库)。由筛选这样的文库所收回的编码抗体或其部分的核酸序列可通过如上所述的重组手段(如在哺乳动物宿主细胞中)进行表达，以及此外可通过额外轮次的其中突变已被导入最初选择的序列中的mRNA-肽融合物的筛选，或如上所述通过其他用于重组抗体体外亲和力成熟的方法进行进一步的亲和力成熟。
在另一种方法中，还可使用本领域已知的酵母展示法产生本发明的抗体。在酵母展示法中，遗传方法用于将抗体结构域系在酵母细胞上并在酵母表面上展示它们。具体而言，这样的酵母可被利用来展示表达自谱(repertoire)或组合抗体文库(如人或鼠)的抗原结合域。可用于制备本发明抗体的酵母展示方法的实例包括那些披露于在此并入作为参考的Wittrup等，美国专利号6,699,658中的方法。
B.生产重组AB(1-42)球聚体抗体
如上所述，可通过多种本领域已知技术中的任何一种来生产本发明的抗体。例如，由宿主细胞表达，其中编码重链和轻链的表达载体通过标准技术被转染入宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意在包括多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞中的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但优选在真核细胞中，特别是在哺乳动物宿主细胞中表达抗体，这是因为与原核细胞相比，这样的真核细胞(以及特别是哺乳动物细胞)更有可能装配并分泌正确折叠的和免疫活性的抗体。
优选用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，利用了DHFR选择标记，如描述于R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞一段足以在该宿主细胞中表达抗体的时间来生产抗体，或更优选地，将抗体分泌入其中该宿主细胞生长的培养基中。可使用标准的蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。
宿主细胞还可用于产生功能性抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。应当明白上述方法的变形处在本发明的范围中。例如，可期望用编码本发明抗体的轻链和/或重链的功能性片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术还可用于除去对于与目标抗原结合并非是所需的轻链和重链任一或两者的编码DNA的某些或全部。由这样的截短DNA分子所表达的分子也包括在本发明的抗体中。此外，通过利用标准的化学交联方法将本发明的抗体与另一种抗体交联，有可能产生其中一条重链和一条轻链为本发明的抗体的以及其他的重链和轻链特异于除目标抗原之外的抗原的双功能抗体。
在用于本发明的抗体或其抗原结合部分重组表达的优选的系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体导入dhfr-CHO细胞中。在该重组表达载体中，抗体重链和轻链基因各自可操作地连接CMV增强子/AdMLP启动子调节元件以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带有DHFR基因，其利用氨甲喋呤分泌/扩增能用于选择已用该载体转染的CHO细胞。培养经选择的转化体宿主细胞，使得抗体重链和轻链表达，并从培养基中回收完整的抗体。使用标准的分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞以及从培养基中回收抗体。更进一步地，本发明提供了一种通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直至本发明的重组抗体被合成，从而合成本发明的重组抗体的方法。该方法可进一步包括从培养基中分离重组抗体。
1.抗-AB(1-42)球聚体抗体
在此描述的分离的抗-Aβ(1-42)球聚体抗体CDR序列(参见表4)建立了一个新的Aβ(1-42)球聚体结合蛋白家族，该结合蛋白是根据本发明所分离的，并且包含包括上述列表CDR序列的多肽。为产生并选择对于Aβ(1-42)球聚体具有优选的Aβ(1-42)球聚体结合和/或中和活性的本发明的CDR，可使用本领域已知用于产生本发明结合蛋白以及评估那些结合蛋白的Aβ(1-42)球聚体结合和/或中和特性的标准方法，包括但不限于那些在此具体描述的标准方法。
2.抗-AB(1-42)球聚体嵌合抗体
嵌合抗体是一种其中抗体的不同部分来源于不同动物物种的分子，例如具有来源于鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定域的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的并详细讨论于实施例2.1中。参见如Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等，(1989)J.Immunol.Methods 125：191-202；美国专利号5,807,715；4,816,567和4,816,397，以其全文在此并入作为参考。此外，可以使用通过剪接来自合适的抗原特异性的小鼠抗体分子的基因和来自合适的生物活性的人抗体分子的基因而被开发用于产生“嵌合抗体”的技术(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855；Neuberger等，1984，Nature 312：604-608；Takeda等，1985，Nature 314：452-454，以其全文在此并入作为参考)。
在一个实施方案中，通过用人IgG1恒定区取代上述鼠单克隆抗-人Aβ(1-42)球聚体抗体的重链恒定区，产生本发明的嵌合抗体。在一个具体的实施方案中，本发明的嵌合抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
3.抗-AB(1-42)球聚体CDR嫁接抗体
本发明的CDR-嫁接抗体包含来自人抗体的重链和轻链可变区序列，其中VH和/或VL的一个或更多个CDR区被替换为本发明的鼠抗体的CDR序列。来自任何人抗体的构架序列可用作模板用于CDR嫁接。
然而，在这样的构架上直接链替换通常导致针对抗原的结合亲和力的一定损失。人抗体与原始的鼠抗体越同源，则将鼠CDR与人构架组合较不可能在CDR中导入会降低亲和力的失真。因此，优选地选择除CDR之外与鼠抗体可变区构架具有至少65％序列同一性的人可变构架来替换鼠可变构架。更优选地，除CDR之外人和鼠可变区具有至少70％序列同一性。还更优选地，除CDR之外人和鼠可变区具有至少75％序列同一性。最优选地，除CDR之外人和鼠可变区具有至少80％序列同一性。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的并详细讨论于实施例2.2中(还参见EP 239,400；国际申请公开号WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)，镶饰(veneering)或重塑(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等，PNAS 91：969-973(1994))和链改组(美国专利号5,565,352)。
4.抗-AB(1-42)球聚体人源化抗体
下表4包括本发明优选的抗-Aβ(1-42)人源化球聚体抗体的VH和VL区以及包含在其中的CDR的氨基酸序列的列表。
表4：VH和VL区氨基酸序列列表
Figure GPA00001010821000451
Figure GPA00001010821000461
人源化抗体是来自结合期望抗原的非人物种抗体的抗体分子，具有一个或更多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区。已知的人Ig序列披露于例如www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi；www.atcc.org/phage/hdb.html；www.sciquest.com/；
www.abcam.com/；www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；
www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html；
www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html；
www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm；
www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html；
www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；
www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikeimages.html；
www.antibodyresource.com/；mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno-logy.html.www.immunologylink.com/；
pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html；
www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/；
www.pebio.com/pa/340913/340913.html-；
www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；
www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html；
www.biodesign.com/table.asp；www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html；
www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html；
www.isac-net.org/sites_geo.html；
aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html；
baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html；
www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/；
www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/INTRO.html；
www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html；imgt.cnusc.fr：8104/；
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antibody.bath.ac.uk/；abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html；
www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem-inar/Slide01.html；
www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/；
www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；
www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-umanisation/TAHHP.html；
www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；
www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；
www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo-ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html；
www.jerini.de/fr roducts.htm；www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Dept.Health(1983)中，各自完全在此并入作为参考。如本领域中所知的，这样的输入序列可用于降低免疫原性或减少、增加或改变结合、亲和力、结合速率、解离速率、抗体亲抗原性、特异性、半衰期或任何其他合适的特性。
人构架区中的构架区残基可为来自CDR供体抗体的相应的残基所取代以改变优选改善抗原结合。这些构架取代通过本领域公知方法得以鉴定，如通过建模CDR和构架区残基的相互作用以鉴定对于抗原结合是重要的构架区残基，并进行序列比较以鉴定在特定位置的稀有构架区残基(参见如Queen等，美国专利号5,585,089；Riechmann等，Nature332：323(1988)，其全文在此并入作为参考)。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的且为本领域技术人员所熟悉。计算机程序是可获得的，其图解并展示了所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些直观信息的检查容许分析残基在候选免疫球蛋白序列起作用中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原能力的残基。这样，可由共有和输入序列选择出FR残基并进行组合，以便获得期望的抗体特性例如增加的针对靶抗原的亲和力。一般而言，CDR残基是直接且最实质上涉及影响抗原结合的。可使用多种本领域已知的技术来人源化抗体，例如但不限于那些描述于Jones等，Nature 321：522(1986)；Verhoeyen等，Science 239：1534(1988))，Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901(1987)，Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151：2623(1993)，Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等，PNAS91：969-973(1994)；国际申请公开号WO 91/09967、PCT/：US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755；WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP 229246、EP 592,106；EP 519,596，EP 239,400，美国专利号5,565,332、5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5814476、5763192、5723323、5,766886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539、4,816,567中的方法，包括在其中所引用的参考文献在内，各自完全在此并入作为参考。
C.抗体和产生抗体的细胞系的产生
如上所述，优选地，本发明的抗-Aβ(1-42)球聚体抗体具有减少或中和如通过几种本领域已知的体外和体内测定的任一种所测定的Aβ(1-42)球聚体活性的高能力(如参见以下实施例)。
在某些实施方案中，抗体包含重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗体可包含轻链恒定区，κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。优选地，抗体包含κ轻链恒定区。或者，抗体部分可例如是Fab片段或单链Fv片段。
本领域已知在Fc部分中氨基酸残基的取代改变了抗体效应子功能(Winter等，美国专利号5,648,260和5,624,821)。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、补体依赖细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。取决于治疗对象，有时这些效应子功能对于治疗性抗体是合乎需要的，但在其他情况下可能是不必要的或甚至有害的。某些人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3，通过分别结合FcγRs和补体C1q介导ADCC和CDC。新生儿Fc受体(FcRn)是确定抗体循环半衰期的关键成分。在又一个实施方案中，在抗体的恒定区中，例如在抗体的Fc区中至少一个氨基酸残基被取代，使得该抗体的效应子功能被改变。
一个实施方案提供了一种其中本发明的抗体或抗体部分被衍生化至或连接至另一种功能分子(如另一种肽或蛋白)的标记的结合蛋白。例如，本发明的标记的结合蛋白可通过将本发明的抗体或抗体部分(通过化学偶合、遗传融合、非共价缔合或其他方式)功能性连接至一种或更多种其他分子实体而得以衍生，所述分子实体例如另一种抗体(如双特异性抗体或双抗体)、可检测试剂、细胞毒性剂、药物制剂和/或可介导抗体或抗体部分与另一种分子(例如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标签)缔合的蛋白或肽。
本发明的抗体或抗体部分可用包括荧光化合物的有用的可检测试剂来衍生化。作例证的荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。抗体还可用可检测的酶来衍生化，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等。当抗体用可检测的酶来衍生化时，通过添加酶用于产生可检测的反应产物的额外试剂来检测。例如，当该可检测试剂辣根过氧化物酶存在时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺产生可检测到显色反应产物。抗体亦可用生物素来衍生化，并且可通过间接测定抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的结合来检测。
本发明的另一个实施方案提供了一种结晶的结合蛋白。优选地，本发明涉及如本文中披露的完整的抗-Aβ(1-42)球聚体抗体及其片段的晶体，以及包含这样的晶体的制剂和组合物。在一个实施方案中，与该结合蛋白的可溶性对应物相比，结晶的结合蛋白具有更长的体内半衰期。在另一个实施方案中，结合蛋白在结晶后保留生物活性。
可根据本领域已知方法以及如在国际申请公开号WO 02/072636(在此并入作为参考)中所披露的方法产生本发明的结晶的结合蛋白。
本发明的另一个实施方案提供了一种糖基化结合蛋白，其中抗体或其抗原结合部分包含一个或更多个糖类残基。新生体内蛋白产生可经历进一步的加工，被称为翻译后修饰。具体而言，糖(糖基)残基经酶添加，一种被称为糖基化的过程。所得到的具有共价连接的寡糖侧链的蛋白被称为糖基化蛋白或糖蛋白。抗体是在Fc区以及可变区中具有一个或更多个碳水化合物残基的糖蛋白。Fc区中的碳水化合物残基对Fc区的效应子功能具有重要影响，对抗体的抗原结合或半衰期具有最小影响(R.Jefferis，Biotechnol.Prog.21(2005)，pp.11-16)。与此相反，可变区的糖基化可对抗体的抗原结合活性具有影响。可变区中的糖基化可对抗体结合亲和力具有负效应，可能归结于空间位阻(Co，M.S.，等，Mol.Immunol.(1993)30：1361-1367)，或引起增加的针对抗原的亲和力(Wallick，S.C.，等，Exp.Med.(1988)168：1099-1109；Wright，A.，等，EMBO J.(1991)10：27172723)。
本发明的一个方面涉及产生其中结合蛋白的O-或N-联糖基化位点业已突变的糖基化位点突变体。本领域技术人员可使用标准的公知技术产生这样的突变体。产生既保留生物活性但又具有增加的或减少的结合活性的糖基化位点突变体是本发明的另一个目的。
在又一个实施方案中，本发明抗体或抗原结合部分的糖基化是改良的。例如，可制备一种去糖基化抗体(即抗体缺少糖基化)。糖基化可被改变例如以增加抗体对抗原的亲和力。这样的碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列中的一个或更多个糖基化位点得以实现。例如，可进行一个或更多个氨基酸取代，导致一个或更多个可变区糖基化位点消除从而消除在该位点的糖基化。这样的去糖基化可增加抗体针对抗原的亲和力。这样的方法进一步详述于国际申请公开号WO 03/016466A2，以及美国专利号5,714,350和6,350,861中，各自以其全文在此并入作为参考。
此外或可选地，可制备具有改变的糖基化类型的本发明的修饰的抗体，例如具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖化抗体或具有增加的平分GlcNAc结构的抗体。这样的改变的糖基化模式已被证明增加抗体的ADCC能力。这样的碳水化合物修饰可通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体得以实现。具有改变的糖基化机制的细胞业已在本领域中描述并可用作宿主细胞，在其中表达本发明的重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体。参见例如Shields，R.L.等(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740；Umana等(1999)Nat.Biotech.17：176-1和欧洲专利号：EP 1,176,195；国际申请公开号WO 03/035835和WO99/5434280，各自全文在此并入作为参考。
蛋白糖基化取决于目标蛋白的氨基酸序列以及其中表达该蛋白的宿主细胞。不同的生物体可产生不同的糖基化酶(如糖基转移酶和糖苷酶)，并且具有不同的可利用底物(核苷酸糖)。由于这样的因素，取决于其中表达特定蛋白的宿主系统，蛋白糖基化模式以及糖基残基组成可不同。在本发明中有用的糖基残基包括但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙酰氨基葡萄糖和唾液酸。优选地，糖基化结合蛋白包含使得糖基化模式是人的糖基残基。
本领域技术人员知道不同的蛋白糖基化可产生不同的蛋白特性。举例来说，与在哺乳动物细胞例如CHO细胞系中表达的相同蛋白相比，在微生物宿主例如酵母中产生以及利用酵母内源性途径糖基化的治疗蛋白的疗效可能降低。这样的糖蛋白还可在人中是免疫原性的并在施用后显示减少的体内半衰期。人和其他动物中特定的受体可识别特定的糖基残基并促进蛋白从血流中快速清除。其他不利作用可包括蛋白折叠、溶解性、对蛋白酶的敏感度、运输、转运、区室化、分泌、为其他蛋白或因子所识别、抗原性或变应原性的改变。因此，专业人员可能更喜欢治疗蛋白具有特定的糖基化组成和模式，例如与人细胞或预期的受试动物的物种特异性细胞中产生的糖基化组成和模式相同或至少类似的糖基化组成和模式。
可通过遗传修饰宿主细胞以表达异源糖基化酶，从而实现表达不同于宿主细胞的糖基化蛋白的糖基化蛋白。使用本领域已知技术，专业人员可产生显示人蛋白糖基化的抗体或其抗原结合部分。例如，酵母菌株已被遗传修饰以表达非天然存在糖基化酶，使得在这些酵母菌株中产生的糖基化蛋白(糖蛋白)显示与动物细胞，尤其是人细胞的糖基化蛋白相同的蛋白糖基化(美国专利申请公开号20040018590和20020137134以及国际申请公开号WO 05/100584A2)。
在本说明书中术语“多价结合蛋白”用于指包含两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。多价结合蛋白优选被工程化以具有三个或更多个抗原结合位点，以及通常不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”指一种能结合两种或更多种相关或不相关靶标的结合蛋白。当在本文中使用时，双可变区(DVD)结合蛋白是包含两个或更多个抗原结合位点并且是四价或更多价结合蛋白的结合蛋白。这样的DVDs可以是单特异性的，即能结合一种抗原，或多特异性的，即能结合两种或更多种抗原。包含两条重链DVD多肽和两条轻链DVD多肽的DVD结合蛋白称为DVD Ig。DVD Ig的每一半包含一条重链DVD多肽和一条轻链DVD多肽以及两个抗原结合位点。每个结合位点包含具有总共6个涉及每个抗原结合位点的抗原结合的CDR的重链可变区和轻链可变区。DVD结合蛋白和制备DVD结合蛋白的方法披露于美国专利申请号11/507,050并在此并入作为参考。
本发明的一个方面涉及一种包含能结合Aβ(1-42)球聚体的结合蛋白的DVD结合蛋白。优选地，该DVD结合蛋白能结合Aβ(1-42)球聚体以及第二种靶标。
除结合蛋白之外，本发明还涉及一种特异于上述本发明结合蛋白的抗-独特型(抗-Id)抗体。抗-Id抗体是一种识别通常与另一种抗体的抗原结合域相关的独特的决定簇的抗体。可通过可通过制备用结合蛋白或其含CDR区或免疫动物制备抗-Id。经免疫的动物会识别并应答于免疫抗体的独特型决定簇并产生抗-Id抗体。抗-Id抗体还可用作“免疫原”来诱导另一动物中的免疫应答，产生所谓的抗-抗-Id抗体。
此外，本领域技术人员应当理解可使用通常被工程化以表达各种糖基化酶的宿主细胞文库表达目标蛋白，使得文库的成员宿主细胞产生具有不同的糖基化模式的目标蛋白。然后，专业人员可选择并奋力具有特定的新糖基化模式的目标蛋白。优选地，具有特别选择的新糖基化模式的蛋白显示改善或改变的生物学性质。
D.抗-Aβ(1-42)抗体的应用
产生于它们结合Aβ(1-42)球聚体的能力，使用常用的免疫测定法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组化，本发明的抗-Aβ(1-42)球聚体抗体或其部分可用于检测Aβ(1-42)球聚体(如在生物样品例如血清、全血、CSF、脑组织或血浆中)。因此，本发明提供了一种检测生物样品中Aβ(1-42)球聚体的方法，包括将生物样品与本发明的抗体或抗体部分接触并检测抗体(或抗体部分)结合Aβ(1-42)球聚体或未结合的抗体(或抗体部分)，由此检测生物样品中的Aβ(1-42)球聚体。用可检测物质直接或间接标记抗体以利于检测结合或未结合的抗体。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质实例包伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；合适的发光物质的实例包括鲁米诺；以及合适的放射性物质的实例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
作为标记抗体的替代方案，可通过利用标记有可检测物质的重组Aβ(1-42)球聚体标准样品和未标记的抗-Aβ(1-42)球聚体抗体的竞争免疫测定法在生物流体中检测Aβ(1-42)球聚体。在该测定中，将生物样品、标记的重组Aβ(1-42)球聚体标准样品和抗-Aβ(1-42)球聚体抗体相混合，并测定结合未标记的抗体的标记的重组Aβ(1-42)球聚体标准样品的量。生物样品中Aβ(1-42)球聚体的量与结合抗-Aβ(1-42)球聚体抗体的标记的rAβ(1-42)球聚体标准样品的量成反比。
本发明的抗体和抗体部分优选能在体外和体内都中和Aβ(1-42)球聚体活性。因此，这样的本发明的抗体和抗体部分可用于例如在包含Aβ(1-42)球聚体的细胞培养物、具有与本发明的抗体交叉反应的Aβ(1-42)球聚体的人个体或其他哺乳动物个体中抑制Aβ(1-42)球聚体活性。在一个实施方案中，本发明提供了一种抑制Aβ(1-42)球聚体活性的方法，包括将Aβ(1-42)球聚体与本发明的抗体或抗体部分接触，使得Aβ(20-42)球聚体活性受抑制。例如，在包含或怀疑包含Aβ(1-42)球聚体的细胞培养物中，可添加本发明的抗体或抗体部分到该培养物中以抑制培养物中的Aβ(1-42)球聚体活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种降低个体，优选患有其中Aβ(1-42)球聚体活性是有害的疾病或病症(如淀粉样变性例如阿尔茨海默病)的个体中Aβ(1-42)球聚体活性的方法。因此，本发明提供了的降低患有这样的疾病或病症的个体中Aβ(1-42)球聚体活性的方法，该方法包括向个体施用本发明的抗体或抗体部分，使得个体中Aβ(1-42)球聚体活性得以降低。优选地，Aβ(1-42)球聚体是人Aβ(1-42)球聚体，和个体是人个体。或者，个体可以是表达本发明的抗体能结合的Aβ(1-42)球聚体的哺乳动物。更进一步，个体可以是已将Aβ(1-42)球聚体导入其中的哺乳动物(如通过施用Aβ(1-42)球聚体或通过表达Aβ(1-42)球聚体转基因)。为了治疗目的，本发明的抗体可施用于人个体。此外，为了兽医用途或作为人疾病的动物模型，本发明的抗体可施用于表达该抗体能结合的Aβ(1-42)球聚体的非人哺乳动物。关于后者，这样的动物模型可用于评价本发明的抗体的治疗效能(如测试给药剂量和时程)。
当在本文中使用时，术语“其中Aβ(1-42)球聚体活性是有害的病症”意在包括这样的疾病和其他病症，其中患该病症的个体中Aβ(1-42)球聚体的存在已表明或被怀疑是造成该病症的病理生理学或是有助于该病症恶化的因素。因此，其中Aβ(1-42)球聚体活性是有害的病症是一种其中Aβ(1-42)球聚体活性的降低预计能缓解该病症的某些或全部症状和/或进展的病症。这样的病症可例如通过患该病症的个体的生物流体中Aβ(1-42)球聚体浓度增加(如个体的血清、脑组织、血浆、脑脊液等中Aβ(1-42)球聚体浓度增加)而得以证实，其可例如使用如上所述的抗-Aβ(1-42)球聚体抗体来进行检测。可用本发明的抗体治疗的病症的非限制性的实例包括那些在以下与本发明的抗体的药物组合物有关的节中讨论的那些病症。
D.药物组合物
本发明还提供了包含本发明的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体的药物组合物。该包含本发明抗体的药物组合物用于但不限于诊断、检测或监测病症，用于预防、治疗、处理或改善病症或其一种或更多种症状，和/或用于研究。在一个具体的实施方案中，组合物包含一种或更多种本发明的抗体。在另一个实施方案中，该药物组合物包含一种或更多种本发明的抗体以及一种或更多种用于治疗其中Aβ(1-42)球聚体活性是有害的病症的不同于本发明的抗体的预防或治疗剂。优选地，该预防或治疗剂已知用于或业已或目前用于预防、治疗、处理或改善病症或其一种或更多种症状。根据这些实施方案，组合物可进一步包含载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的抗体和抗体部分可掺入适于施用于个体的药物组合物中。通常，该药物组合物包含本发明的抗体或抗体部分和药学上可接受的载体。当在本文中使用时，“药学上可接受的载体”包括任何以及所有的生理学上相容的的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的实例包括一种或更多种水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的组合。在多数情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药学上可接受的载体可进一步包含少量增加抗体或抗体部分的货架期或有效性的助剂例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。
已知多种递药系统并可用于施用一种或更多种本发明的抗体或一种或更多种本发明的抗体和用于预防、处理、治疗或改善病症或其一种或更多种症状的预防剂或治疗剂的组合，如包囊入脂质体、微粒、微囊剂、能表达抗体或抗体片段的重组细胞、受体介导的胞吞(参见如Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))、构建作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核酸等。施用本发明预防剂或治疗剂的方法包括但不限于肠胃外给药(如真皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下给药)、硬膜外给药、瘤内给药和粘膜给药(如鼻内和口服进入)。此外，可使用肺部给药，如通过利用吸入器或喷雾器；以及具有气雾剂(aerosolizing agent)的制剂。参见如美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；以及国际申请公开号WO92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，各自全文在此并入作为参考。在一个实施方案中，使用Alkermes
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肺部施药技术(Alkermes，Inc.，Cambridge，MA)施用本发明的抗体、联合治疗或本发明的组合物。在一个具体的实施方案中，肌内、静脉内、肿瘤内、经口、鼻内、肺部或皮下施用本发明的预防或治疗剂。预防或治疗剂可通过任何方便的途径施用，例如通过输注或弹丸注射、通过经上皮或皮肤粘膜内衬(如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收以及可与其他生物活性剂一起施用。给药可以是全身性或局部的。
在一个具体的实施方案中，可期望将本发明的预防或治疗剂局部施用于需要治疗的区域；这可通过例如且不限于局部输注、注射或借助于植入物而得以实现，所述植入物是多孔或非多孔材料，包括膜和基质，例如sialastic膜、聚合物、纤维状基质(如
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)或胶原基质。在一个实施方案中，将有效量的一种或更多种本发明的抗体拮抗剂局部施用于个体患部以预防、治疗、处理和/或改善病症或其症状。在另一个实施方案中，将有效量的一种或更多种本发明的抗体与有效量的一种或更多种不同于本发明的抗体的治疗(如一种或更多种预防或治疗剂)联合局部施用于个体患部以预防、治疗、处理和/或改善病症或其一种或更多种症状。
在另一个实施方案中，预防剂或治疗剂可以控制释放或持续释放系统的方式递送。在一个实施方案中，泵可用于实现控制或持续释放(参见Langer，出处同上；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：20；Buchwald等，1980，Surgery 88：507；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，聚合材料可用于实现本发明治疗剂的控制或持续释放(参见如Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise(编)，CRC Pres.，Boca Raton，FL(1974)；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(编)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；还参见Levy等，1985，Science 228：190；During等，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71：105)；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；国际申请公开号WO99/15154；和国际申请公开号WO 99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的实例包括但不限于聚(2-羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚(甲基丙烯酸)，聚乙醇酸交酯(PLG)，聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、丙交酯乙交酯共聚物(PLGA)和聚原酸酯。在一个优选的实施方案中，用于持续释放制剂中的聚合物是惰性的是惰性的、不含可浸出杂质的、贮藏稳定的、无菌的以及生物可降解的。在又一个实施方案中，控制或持续释放系统可置于预防或治疗目标的附近，因此仅需要一小部分的全身剂量(参见如Goodson，在MedicalApplications of Controlled Release中，出处同上，vol.2，pp.115-138(1984))。
控制释放系统讨论于Langer(1990，Science 249：1527-1533)的评述中。任何本领域技术人员所知的技术都可用于产生包含一种或更多种本发明治疗剂的持续释放制剂。参见如美国专利号4,526,938、国际申请公开号WO 91/05548、国际申请公开号WO 96/20698，Ning等，1996，″Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer XenograftUsing a Sustained-Release Gel，″Radiotherapy & Oncology 39：179-189，Song等，1995，″Antibody Mediated Lung Targeting of Long-CirculatingEmulsions，″PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology50：372-397，Cleek等，1997，″Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGFAntibody for Cardiovascular Application，″Pro.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854和Lam等，1997，″Microencapsulation ofRecombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery，″Proc.Int′l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，各自以其全文在此并入作为参考。
在一个具体的实施方案中，在本发明的组合物是编码预防剂或治疗剂的核酸的情况下，通过将该核酸构建作为合适的核酸表达载体的一部分并施用其使之成为细胞内的，如通过利用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)、或通过直接注射、或通过利用微粒轰击(如基因枪；Biolistic，Dupont)、或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被、或通过将其与已知进入细胞核的同源框-样肽相连接施用(参见如Joliot等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)，从而其可体内施用以促进其编码的预防剂或治疗剂的表达。或者，可将核酸导入细胞内并整合入宿主细胞DNA中用于同源重组表达。
配制本发明的药物组合物以与其预期给药途径所相容。给药途径的实例包括但不限于肠胃外给药，如静脉内、真皮内、皮下、经口、鼻内(如吸入)、透皮(如局部)、转化粘液质和直肠给药。在一个具体的实施方案中，根据用于适合于静脉内、皮下、肌内、经口、鼻内或局部给药于人类的药物组合物的常规方法配制组合物。通常，用于静脉给药的组合物是处于无菌等渗含水缓冲液中的溶液。需要时，组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因以缓解注射部位处疼痛。
如果本发明的组合物要局部施用，则该组合物可配制为软膏剂、霜剂、透皮贴剂、洗剂、凝胶剂、洗发剂、喷雾剂、气雾剂、溶液、乳剂或本领域技术人员公知的其他剂型。参见如Remington′s PharmaceuticalSciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第19版，MackPub.Co.，Easton，PA(1995)。对于不可喷雾的局部剂型，通常使用包含与局部施用相容的载体或一种或更多种赋形剂并具有优选大于水的动态粘度的粘稠至半固体或固体剂型。适合的剂型包括不限于溶液、混悬剂、乳剂、霜剂、软膏剂、粉剂、搽剂、油膏剂等，如果需要的话，其是已灭菌的或与助剂(如防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)混合用于影响各种性质例如渗透压。其他合适的局部剂型包括可喷射的气溶胶制剂，其中活性成分优选与固态或液态惰性载体相混合，被封装在具有加压挥发物(如气体推进剂，例如氟里昂)的混合物或压挤瓶中。如果需要的话，还可将保湿剂或润湿剂添加到药物组合物和剂型中。这样的附加组分的实例是本领域公知的。
如果本发明的方法包括鼻内施用组合物，该组合物可以气溶胶形式、喷雾、烟雾或滴剂形式配制。具体而言，根据本发明供使用的预防或治疗剂可借助于合适的推进剂(如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)，从而方便地于加压包装或喷雾器中以气溶胶喷雾形式递送。在加压气溶胶的情况下，可通过提供阀门来递送已计量的量从而确定剂量单位。用于吸入器或吹入器的胶囊剂和药筒(由例如明胶组成的)可被配制包含化合物和合适的粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物。
如果本发明的方法包含口服给药，则组合物可以口服片剂、胶囊剂、扁囊剂、软胶囊剂、溶液、混悬剂等的形式配制。可通过常规方法使用药学上可接受的赋形剂例如粘合剂(如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(如马铃薯淀粉或淀粉羟基乙酸钠)；或润湿剂(如十二烷基硫酸钠)制备片剂或胶囊剂。片剂可通过本领域众所周知的方法进行包衣。用于口服给药的液体制剂可采用但不限于溶液、糖浆剂或混悬剂的形式，或它们可作为干燥产品存在用于在使用前与水或其他合适的赋形剂化合。可通过常规方法使用药学上可接受的添加剂例如助悬剂(如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水赋形剂(如扁桃油、含油酯类、乙醇或分馏的植物油)；和防腐剂(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)制备这样的液体制剂。该制剂还可包含合适的缓冲盐类、芳香剂、着色剂和甜味剂。用于口服给药的制剂可合适地配制用于预防剂或治疗剂的缓慢释放、控制释放或持续释放。
本发明的方法可包括用气雾剂配制的组合物的肺部给药，如通过利用吸入器或喷雾器。参见如美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；以及国际申请公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，各自以其全文并入作为参考。在一个具体的实施方案中，使用Alkermes
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肺部施药技术(Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass.)施用本发明的抗体、联合治疗和/或本发明的组合物。
本发明的方法可包括通过注射(如通过弹丸注射或连续输注)施用配制用于肠胃外给药的组合物。用于注射的制剂可以带有附加防腐剂的单位剂量形式(如处于安瓿或多剂量容器中)存在。该组合物可采取这样的形式例如处于含油或含水载体中的混悬剂、溶液或乳剂，并可包含配制用剂例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以粉末形式存在用于在使用前与合适的载体(如无菌无热原水)重建。本发明的方法可额外包含施用配制为长效制剂的组合物。这样的长效剂型可通过植入(如皮下或肌内)或通过肌内注射施用。因此，例如，组合物可与合适的聚合或疏水材料(如作为处于可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂一起配制，或作为微溶的衍生物(如作为微溶盐类)。
本发明的方法包括施用配制为中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐类包括那些与阴离子如那些来自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子形成的盐类，以及那些与阳离子如那些来自的钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的阳离子形成的盐类。
通常，组合物的成分单独提供或以单位剂型形式混合在一起提供，例如作为处于密闭容器例如标示活性剂的量的安瓿或小药囊(sachette)中的干燥的冻干粉或无水浓缩物。在给药方式是输注的情况下，组合物可用含无菌药用级水或盐水的输液瓶进行配药。在给药方式是注射的情况下，可提供注射用无菌水或盐水安瓿，使得成分可在施用前得以混合。
具体而言，本发明还提供了一种或更多种本发明的预防或治疗剂或药物组合物封装于标示该剂的量的密闭容器例如安瓿或小药囊(sachette)中。在一个实施方案中，一种或更多种本发明的预防或治疗剂或药物组合物作为处于密闭容器中的干燥的无菌冻干粉或无水浓缩物提供并可重建(如用水或盐水)至合适的浓度用于施用于个体。优选地，一种或更多种本发明的预防或治疗剂或药物组合物作为处于密闭容器中的无菌冻干粉提供，单位剂量为至少5mg，更优选至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少75mg或至少100mg。本发明的冻干的预防或治疗剂或药物组合物应当处于其原始容器中贮藏在2℃-8℃，以及本发明的预防或治疗剂或药物组合物应当在重建后的1周内，优选5天内、72小时内、48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、5小时内、3小时内或1小时内施用。在一个可选择的实施方案中，一种或更多种本发明的预防或治疗剂或药物组合物以处于标示该剂数量和浓度的密闭容器中的液体形式提供。优选地，液体形式的给药组合物以至少0.25mg/ml，更优选至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml或至少100mg/ml处于密闭容器中提供。液体形式应当处于其原始容器中贮藏在2℃-8℃。
本发明的抗体和抗体部分可掺入适合于肠胃外给药的药物组合物中。优选地，抗体或抗体部分被制备为包含0.1-250mg/ml抗体的可注射溶液。所述可注射溶液可由处于火石玻璃药瓶或琥珀玻璃药瓶、安瓿或载药注射器中的液体或冻干剂型组成。缓冲剂可以是L-组氨酸(1-50mM)，最佳5-10mM，pH5.0-7.0(最佳pH6.0)。其他合适的缓冲剂包括但不限于琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。0-300mM浓度的氯化钠可用调节溶液张度(对于液体剂型，最佳150mM)。对于冻干剂型，可包括冷冻保护剂，主要是0-10％蔗糖(最佳0.5-1.0％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冻干剂型，可包括填充剂，主要是1-10％甘露糖醇(最佳2-4％)。稳定剂可用于液体和冻干剂型中，主要是1-50mML-甲硫氨酸(最佳5-10mM)。其他合适的填充剂包括甘氨酸、精氨酸，可包括0-0.05％聚山梨醇酯-80(最佳0.005-0.01％)。额外的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。作为可注射的溶液制备用于肠胃外给药的包含本发明的抗体和抗体部分的药物组合物可进一步包含用作佐剂的试剂，例如那些用于增加治疗蛋白(如抗体)吸收或分散的试剂。特别有用的佐剂是透明质酸酶，例如
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(重组人透明质酸酶)。向可注射的溶液中添加透明质酸酶提高了肠胃外给药，特别是皮下给药后的人生物利用度。其还容许更大的注射部位体积(即大于1ml)，具有更小的疼痛和不适，以及最小的注射部位反应发生率。(参见国际申请公开号WO 04/078140和美国专利申请公开号US2006104968，在此并入作为参考)。
本发明的组合物可具有多种剂型。这些剂型包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(如可注射和可输注的溶液)、分散液或混悬剂、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的剂型取决于预期的给药类型和治疗应用。通常，组合物优选以可注射的或可输注的溶液形式给予，例如类似于用于使用其他抗体的人被动免疫接种的那些组合物的组合物。优选的给药途径为肠胃外(如静脉内、皮下、腹膜内或肌内)给药。在一个优选的实施方案中，通过静脉输注或注射施用抗体。在另一个优选的实施方案中，通过肌内或皮下注射施用抗体。
在制备和贮藏条件下，治疗组合物通常应当是无菌且稳定的。组合物可配制为溶液、微乳剂、分散剂、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。可通过将需要量的活性物质(即抗体或抗体部分)掺入合适的溶剂(根据需要具有一种上述列举成分或其组合)中，接着过滤灭菌，从而制备无菌可注射溶液。通常通过将活性物质掺入包含基础分散介质和需要的其他以上列举成分的无菌载体中制备分散剂。就用于制备无菌可注射溶液的无菌冻干粉而言，优选的制备方法是真空干燥和喷雾干燥，由之前其无菌过滤的溶液产生了活性成分外加任何额外所需成分的粉末。可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散剂情况下维持所需的颗粒尺寸或通过利用表面活性剂，从而可以保持溶液适当的流动性。通过将延迟吸收剂如单硬脂酸盐和明胶包括入组合物中，可以实现可注射组合物的延长吸收。
尽管对于诸多治疗应用优选的给药途径/方式为皮下注射、静脉注射或输注，但是本发明的抗体可通过多种本领域技术人员已知的方法施用。本领域技术人员应当理解给药途径和/或方式取决于所期望的结果而变。在某些实施方案中，可用保护活性物质免于快速释放的载体制备该活性物质，例如，控制释放制剂包括植入物、透皮膏剂以及微囊包埋释放系统。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物如乙二醇二乙酸酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。许多用于制备这样的制剂的方法是具有专利权的或为本领域技术人员所公知。参见如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，编，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分可经口施用，例如与惰性稀释剂或可吸收的食用载体一起施用。该化合物(以及其他成分，如果需要的话)还可包封于硬或软壳明胶胶囊中、压制成片或直接掺入个体饮食中。为了口服治疗给药，可将化合物与赋形剂混合并以可摄食片剂、口含片、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等形式使用。为通过不同于肠胃外给药施用本发明的化合物，可能需要用阻止其失活的材料包衣化合物或与该化合物共同施用。
补充的活性物质也可掺入组合物中。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分与一种或更多种具有治疗其中Aβ(1-42)活性是有害的病症用途的附加治疗剂共同配制和/或共同施用。例如，本发明的抗-Aβ(1-42)抗体或抗体部分可与一种或更多种结合其他靶标的附加抗体(如结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)共同配制和/或共同施用。此外，一种或更多种本发明的抗体可与两种或更多种上述治疗剂相结合。这样的联合治疗可有利地利用较低剂量的所施用的治疗剂，从而避免了与各种单一疗法相关的可能的毒性或并发症。
在某些实施方案中，针对Aβ(1-42)的抗体或其片段与本领域已知的半衰期延长媒介物相连接。这样的媒介物包括但不限于Fc区、聚乙二醇和葡聚糖。这样的媒介物描述于例如美国专利申请序列号09/428,082和公布的国际申请公开号WO 99/25044中，其在此为了任何目的并入作为参考。
在一个具体的实施方案中，施用包含编码本发明的抗体或其他本发明预防剂或治疗剂的核苷酸序列的核酸序列以经由基因治疗来治疗、预防、处理或改善病症或其一种或更多种症状。基因治疗指通过向个体施用表达的或可表达的核酸而执行的治疗。在本发明的该实施方案中，核酸产生了介导预防或治疗效果的它们编码的本发明的抗体或预防剂或治疗剂。
根据本发明，任何本领域中可得到的用于基因治疗的方法皆可使用。关于基因治疗方法的综述，参见Goldspiel等，1993，ClinicalPharmacy 12：488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，Science260：926-932(1993)；以及Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；May，1993，TIBTECH 11(5)：155-215。可使用的在重组DNA技术领域中公知的方法描述于Ausubel等(编)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；和Kriegler，GeneTransfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)中。各种基因治疗方法的详细描述披露于美国专利申请公开号US20050042664A1中，其在此并入作为参考。
本发明的抗体或其抗原结合部分可用于单独或联合治疗诸如如下的疾病：甲抗胰蛋白酶缺乏症、C1-抑制剂缺乏血管性水肿、抗凝血酶缺乏血栓栓塞性疾病、库鲁病、Creutzfeld-Jacob病/羊瘙痒症、牛绵状脑病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、家族致命性失眠症、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调、Machado-Joseph萎缩、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩、额颞痴呆、镰状细胞贫血、不稳定性血红蛋白包含体溶血、药物性包含体溶血、帕金森氏病、全身性AL型淀粉样变性、小结节性AL淀粉样变性、全身性AA淀粉样变性、前列腺淀粉样、血液透析淀粉样变性、遗传性(冰岛人)大脑血管病、亨廷顿病、家族性内脏淀粉样、家族性内脏多神经病、家族性内脏淀粉样变性、老年全身性淀粉样变性、家族性淀粉样神经病、家族性心脏淀粉样、阿尔茨海默病、唐氏综合征、甲状腺髓样癌和2型糖尿病(T2DM)。优选地，本发明的抗体可用于治疗淀粉样变性例如阿尔茨海默病和唐氏综合征。
应当明白本发明的抗体或其抗原结合部分可单独使用，或与一种或更多种附加药剂如治疗剂(例如小分子或生物制剂)联合使用，所述附加药剂为本领域技术人员根据其预期用途所选择的。例如，该附加药剂可以是治疗剂，例如胆固醇酶抑制剂(如他克林、多奈哌齐、利斯的明或加兰他敏)、部分NMDA受体阻断剂(如美金刚)、葡糖胺聚糖模拟物(如Alzhemed)、γ分泌酶抑制剂或别构调节剂(如R-氟比洛芬)、黄体生成素阻断促性腺激素释放激素激动剂(如亮丙瑞林)、5-羟色胺5-HT1A受体拮抗剂、螯合剂、神经元选择性L-型钙离子通道阻断剂、免疫调节剂、淀粉样蛋白原纤维形成抑制剂或淀粉样蛋白沉积抑制剂(如M266)、另一种抗体(如bapineuzumab)、5-HT1a受体拮抗剂、PDE4抑制剂、组胺激动剂、高级聚糖化终产物受体蛋白、PARP刺激物、5-羟色胺6受体拮抗剂、5-HT4受体激动剂、人类固醇、增强神经元代谢的葡萄糖摄取刺激物、选择性CB1拮抗剂、苯并二吖庚因受体部分激动剂、淀粉样蛋白β产生拮抗剂或抑制剂、淀粉样蛋白β沉积抑制剂、NNRα-7部分拮抗剂、细胞因子抑制剂、TNF拮抗剂(如Humira和Remicade)、TNF受体融合蛋白(如Enbrel)、治疗靶向PDE4、RNA翻译抑制剂、毒蕈碱性激动剂、神经生长因子受体激动剂、NGF受体激动剂和基因治疗调节剂(即那些目前公认的、或将来被公认的对治疗通过本发明抗体所治疗的疾病或病症有用处的药剂)。该附加药剂还可以是一种赋予归因于治疗组合物的益处的药剂，例如影响组合物粘度的药剂。
应当进一步理解要被包括在本发明中的组合是那些对于它们的预期用途有用的组合。如上所列的剂是为了例证的目的并不意在限制。作为本发明一部分的组合可以是本发明的抗体和至少一种选自如下列表的附加药剂。组合还可包括多于一种的附加药剂，如两种或三种附加药剂，如果该组合是这样的话，则所产生的组合物可执行其预期功能。
本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或抗体部分。“治疗有效量”指在剂量和必需的一段时间上能有效地达到期望的治疗效果的一种量。抗体或抗体部分的治疗有效量可为本领域技术人员所确定，并可随诸如个体病状、年龄、性别和体重以及抗体或抗体部分在个体中引发期望应答的能力的因素而改变。治疗有效量还是一种其中抗体或抗体部分的治疗有益效果超过任何毒性或有害效果的量。“预防有效量”指在剂量和必需的一段时间上能有效地达到期望的预防效果的一种量。通常，由于在疾病发作前或疾病早期将预防剂量用于个体，因此预防有效量应当小于治疗有效量。
可调节给药方案以提供最佳的期望应答(如治疗或预防应答)。例如，可施用单次大剂量，可在一段时间内施用几个分剂量或可如治疗状况急需所要求的依比例减少或增加剂量。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以方便施用并实现剂量的一致性。当在本文中使用时，剂量单位形式指适合作为单一剂量用于要被治疗的哺乳动物个体的物理上分离的单位；每个单位包含经计算以产生期望疗效的预定量的活性物质以及必需的药物载体。对于本发明剂量单位形式，其规格支配且直接取决于(a)活性物质的独特特性和所要达到的特定治疗或预防效果，和(b)在配制这样的活性物质用于个体敏感性治疗的领域中的固有局限性。
对于本发明的抗体或抗体部分的治疗或预防有效量，一个作例证的、非限制性的范围是0.1-20mg/kg，更优选1-10mg/kg。应当指出剂量值可随要被缓解的病症的类型和严重程度而改变。应当进一步理解对于任何具体个体，根据个体需要以及施用或监督组合物施用的人员的专业判断，特定的给药方案应随时间过去而调节，以及在此所列的剂量范围仅作为例证而不意在限制所请求保护的组合物的范围或实践。
对于本领域技术人员能容易明白的是在此描述的本发明方法的其他适合的修饰和改变是显而易见的，并且可使用合适的等价物来进行这样的修饰和改变而不背离本发明或在此披露的实施方案的范围。现已详细描述本发明，其将通过下列实施例得以更清楚的理解，所包括的实施例仅为举例说明的目的而不意在限制本发明。
实施例I
人源化抗-AB(1-42)球聚体单克隆抗体的产生和分离
该实施例描述了抗-A-β抗体的人源化。基本上根据Queen，C.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)的方法实施鼠单克隆抗体8F5(Mu8F5)的人源化。首先，鉴定与Mu8F5VH或VL氨基酸序列具有高同源性的人V片段。其次，将互补决定区(CDR)序列连同对于维持CDR结构是重要的构架氨基酸嫁接入经选择的人构架序列中。此外，将发现在相应的V区亚组中稀有的人构架氨基酸用共有氨基酸取代以降低潜在的免疫原性。在人肾细胞系293T/17中表达所得到的人源化单克隆抗体(Hu8F5)。利用使用了纯化的8F5抗体的竞争性结合测定法，Hu8F5对人A-β的亲和力被证明与Mu8F5相当。
材料和方法
人源化：
如Queen，C.，等，同前所概述的进行抗体V区的人源化。基于序列同源性选择用作用于Mu8F5的CDR的接纳体的人V区构架。计算机程序ABMOD和ENCAD(Levitt，M.，J.Mol.Biol.168：595-620(1983))用于构建可变区的分子模型。将被预测与CDR接触的人源化V区中的氨基酸用Mu8F5的相应残基取代。将发现在相同的V区亚组中稀有的人源化V区中的氨基酸改变为共有氨基酸以消除潜在的免疫原性。
依照所公布的方法，使用大约30条长度在大约20-40个碱基的重叠的合成寡核苷酸设计重链和轻链可变区基因(Rouillard，J.-M.，等，核酸sRes.32：W176-W180(2004))。退火寡核苷酸并用PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)装配，产生全长产物。使用PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene)通过聚合酶链反应(PCR)扩增所得到的产物。凝胶纯化PCR扩增片段，并克隆入pCR4Blunt-TOPO载(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)中。在序列确认后，用MluI和XbaI消化Hu8F5VH和Hu8F5VL，凝胶纯化，并分别亚克隆入修饰型pVg1.D.Tt(Cole，M.S.，等，J.Immunol.159：3613-3621(1997)；参见如下)和pVk(Co，M.S.，等，J.Immunol.148：1149-1154(1992))中。通过限制性酶切作图验证最终的质粒。通过核苷酸测序验证重链和轻链可变区的序列。
位点定向诱变
遵循厂商推荐，使用QuikChange II位点定向诱变试剂盒(Stratagene)进行合成的V-基因的位点定向诱变。为在Hu8F5VH基因序列中产生W47L突变，设计一对都含有期望突变的合成的寡核苷酸引物。使用诱变引物5’W47L(5’-CTG GCA AGG GCC TGG AGC TGG TGG CCAGCA TCA ACA GCA AC-3’)(SEQ ID NO：31)和3’W47L(5’-GTT GCTGTT GAT GCT GGC CAC CAG CTC CAG GCC CTT GCC AG-3’)(SEQID NO：32)。遵循厂商推荐进行PCR程序，在95℃温育30秒，然后18个95℃持续30秒、55℃持续1分钟和68℃持续1分钟的循环，接着在68℃温育7分钟。通过PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene)延伸各自与载体对应链互补的寡核苷酸引物，无需引物移位。由此引起的PCR反应产生了包含交错切口的突变的质粒，其用特异于甲基化和半甲基化的DNA的DpnI核酸内切酶处理来消化亲代DNA模板并选择包含突变的合成的DNA。然后，将整合期望突变的带切口载体DNA转化入大肠杆菌(E.coli)菌株TOP10化学感受态细胞(Invitrogen)中。用MluI和XbaI消化经序列验证的小量制备DNA，并将所得到的包含突变的Hu8F5VH基因限制酶切片段亚克隆入如下所述的修饰的pVg1.D.Tt表达载体中。
表达载体的修饰
将表达质粒pVg1.D.Tt中的人γ-1恒定区基因的同种异型由G1m(z，a)修饰成z，非-a同种异型。重叠序列延伸PCR法(Higuchi，R.，在“PCRTechnology：Principles and Applications for DNA Amplification”中，Stockton Press，New York(1989)，pp.61-70)用于产生氨基酸取代D356E和L358M(根据Kabat，E.A.，等，“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，第5版，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的EU索引进行编号)，使用了诱变引物356E358M-A(5’-CCA TCC CGG GAGGAG ATG ACC AAG AAC-3’)(SEQ ID NO：33)和356E358M-B (5’-GTTCTT GGT CAT CTC CTC CCG GGA TGG-3’)(SEQ ID NO：34)。第一轮PCR对于左侧片段使用外侧引物g1-5(5’-CCA CAT GGA CAG AGGCCG-3’)(SEQ ID NO：35)和356E358M-B，以及对于右侧片段使用外侧引物mc-124(5’-AGG GCA GCG CTG GGT GC-3’)(SEQ ID NO：36)和356E358M-A。使用扩增高保真(Expand High Fidelity)PCR系统(RocheDiagnostics Corporation，Indianapolis，IN)通过在95℃下温育5分钟，然后是35个95℃持续30秒、60℃持续30秒和72℃持续1分钟的循环，接着在72℃温育10分钟，进行PCR反应。使用外侧引物g1-5和mc-124通过在95℃下温育5分钟，然后是35个95℃持续30秒、60℃持续30秒和72℃持续90秒的循环，接着在72℃温育7分钟，进行第二轮PCR以将如上所述的左侧和右侧片段相结合。在用SfiI和EagI消化后，将所得到的限制酶切片段亚克隆入在铰链和CH2外显子之间的内含子中包含NheI限制酶切位点的修饰形式的pVg1.D.Tt表达载体中。
还通过使用了上述质粒作为模板的位点定向诱变产生对γ-1恒定区基因的下铰链区(lower hinge region)的突变。为产生氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat，E.A.，等，同前.的EU索引编号的)，使用了诱变引物5′L234A L235A(5’-CAT CTC TTC CTC AGC ACC TGA AGC CGCGGG GGG ACC GTC AGT CTT CCT-3’)(SEQ ID NO：37)和3′L234AL235A(5’-AGG AAG ACT GAC GGT CCC CCC GCG GCT TCA GGTGCT GAG GAA GAG ATG-3’)(SEQ ID NO：38)。如上所述，使用QuikChange II位点定向诱变试剂盒(Stratagene)，通过在95℃下温育30秒，然后是18个95℃持续30秒、55℃持续1分钟和68℃持续1分钟的循环，接着在68℃下温育7分钟，进行PCR步骤。在用DpnI消化后，用PCR产物的小的部分转化大肠杆菌(E.coli)菌株TOP10化学感受态细胞(Invitrogen)。用NheI和EagI消化质粒，并将所得到的限制酶切片段亚克隆入上述在铰链和CH2外显子之间的内含子中包含NheI位点的修饰的pVg1.D.Tt表达载体中。通过核苷酸测序验证突变。
瞬时转染
在7.5％CO2培养箱中于37℃下，在含10％胎牛血清(FBS)(HyClone，Logan，UT)、0.1mM MEM非必需氨基酸(Invitrogen)和2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)的DMEM(BioWhittaker，Walkersville，MD)，以下简称为293培养基中维持人肾细胞系293T/17(美国典型培养物保藏中心，Manassus，VA)。为了在瞬时转染后表达和纯化单克隆抗体，在含2％低-IgGFBS(HyClone)、0.1mM MEM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺的DMEM，以下简称为低-IgG 293培养基中培养293T/17细胞。
遵循厂商推荐，使用脂质转染胺2000(Invitrogen)进行293T/17细胞的瞬时转染。每次转染在T-175烧瓶的50ml 293培养基中铺大约2x107个细胞并生长过夜至汇合。次日，将35μg轻链质粒和35μg重链质粒与3.75ml杂交瘤-SFM(HSFM)(Life Technologies，Rockville，MD)相混合。在单独的试管中，混合175μl脂质转染胺2000试剂和3.75ml HSFM并在室温下温育5分钟。轻柔地将3.75ml脂质转染胺2000-HSFM混合物与3.75ml DNA-HSFM混合物混合并在室温下温育20分钟。抽出覆盖293T/17细胞的培养基并用低-IgG 293培养基置换，然后将脂质转染胺-DNA络合物逐滴添加到细胞上，通过涡旋轻柔混合，并在收获上清液前，在7.5％CO2培养箱中于37℃下温育细胞7天。
通过ELISA测定抗体表达
通过夹心式ELISA测定Hu8F5抗体的表达。在4℃下，用100μl/孔的1∶1000稀释的处于0.2M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH 9.4中的AffiniPure山羊抗-人IgG Fcγ-链特异性多克隆抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA)包被MaxiSorpELISA平板(Nunc Nalge International，Rochester，NY)过夜，用洗涤缓冲液(含0.1％Tween 20的PBS)洗涤，并用300μl/孔的处于TBS中的SuperBlock封闭缓冲液(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)在室温下封闭1小时。在用洗涤缓冲液洗涤后，含Hu8F5的样品在ELISA缓冲液(含1％BSA和0.1％Tween 20的PBS)中适当稀释并施加100μl/孔于ELISA平板上。作为标准样品，使用人源化的IgG1/κ抗体daclizumab(PDL BioPharma，Inc.)。在于室温下温育平板1小时并用洗涤缓冲液洗涤后，使用100μl/孔的1∶1000稀释的HRP-缀合的山羊抗-人κ轻链特异性多克隆抗体(Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham，AL)检测结合的抗体。在于室温下温育1小时并用洗涤缓冲液洗涤后，通过添加100μl/孔的ABTS过氧化物酶底物/过氧化物酶溶液B(KPL，Inc.，Gaithersburg，MD)进行显色。在于室温下温育7分钟后，通过添加50μl/孔的2％草酸终止显色。使用VersaMax酶标仪(Molecular DevicesCorporation，Sunnyvale，CA)在415nm处读出吸光度。
纯化8F5抗体
通过离心收获来自瞬时转染的培养物上清液并进行无菌过滤。通过添加1/50体积的1M柠檬酸钠，pH7.0调节经过滤的上清液的pH。上清液跑用20mM柠檬酸钠，150mM NaCl，pH7.0预平衡的1ml HiTrap蛋白A HP柱(GE Healthcare Bio-Sciences Corporation，Piscataway，NJ)。用相同的缓冲液洗涤柱子，并用20mM柠檬酸钠，pH3.0洗脱结合的抗体。在通过添加1/50体积的1.5M柠檬酸钠，pH6.5中和后，使用15mlAmicon Ultra-15离心过滤机装置(30,000道尔顿MWCO)(MilliporeCorporation，Bedford，MA)将合并的抗体级分浓缩至～0.5-1.0mg/ml。然后使用带有HT Tuffryn膜的0.2μm Acrodisc注射式滤器(Pall Corporation，East Hills，NY)过滤灭菌样品。经在280nm处测定吸光度(1mg/ml＝1.4A280)，通过UV光谱学测定纯化的抗体的浓度。
竞争性ELISA
用100μl/孔的5.0μg/ml处于PBS中的人A-β寡聚体抗原(1-42)(Abbott Biosciences Corporation，Worcester，MA)在4℃下包被MaxiSorp ELISA板(Nalge Nunc International)过夜，用洗涤缓冲液(含0.1％Tween 20的PBS)洗涤，并用340μl/孔的处于PBS中的SuperBlock封闭缓冲液(Pierce Chemical Company)在室温下封闭1小时。在用洗涤缓冲液洗涤后，添加100μl/孔的处于5％Superblock封闭缓冲液(处于PBS中)中的生物素化Mu8F5(1.0μg/ml终浓度)和竞争抗体(Mu8F5或Hu8F5，起始于27μg/ml终浓度并连续稀释3-倍)的混合物，一式三份。作为非竞争对照，使用100μl/孔的处于PBS中的5％Superblock封闭缓冲液。在于室温下温育平板2小时并用洗涤缓冲液洗涤后，使用100μl/孔的处于5％Superblock封闭缓冲液(处于PBS中)中的1μg/ml HRP-缀合的链霉抗生物素蛋白(Pierce Chemical Company)检测结合的抗体。在于室温下温育30分钟并用洗涤缓冲液洗涤后，通过添加100μl/孔的ABTS过氧化物酶底物/过氧化物酶溶液B(KPL)进行显色。在于室温下温育5分钟后，通过添加50μl/孔的2％草酸终止显色。在415nm处读出吸光度。
结果：
人源化
为了Mu8F5可变区的人源化，本发明中提供的一般方法如下。首先，借助于计算机程序ABMOD和ENCAD(Levitt，M.，J.Mol.Biol.168：595-620(1983))构建Mu8F5可变区的分子模型。其次，基于针对人V和J片段序列的同源性搜寻，选择VH片段YSE’CL(Mariette，X.，等，Eur.J.Immunol.23：846-851(1993))和J片段JH4(Ravetch，J.V.，等，Cell 27：583-591(1981))以提供构架用于Hu8F5重链可变区。对于Hu8F5轻链可变区，使用VL片段TR1.37’CL(Portolano，S.，等，J.Immunol.151：2839-2851(1993))和J片段JK4(Hieter，P.A.，等，J.Biol.Chem.257：1516-1522(1982))。在Mu8F5VH和接纳体人YSE’CL及JH4片段之间的构架氨基酸的同一性为80％，与此同时在Mu8F5 VL和接纳体人TR1.37’CL及JK4片段之间的同一性为86％。
在计算机模型中被认为与CDR有效接触的构架位置处，来自小鼠V区的氨基酸取代了原始的人构架氨基酸。对于重链1型和2型，在残基49和98处进行这样的取代，以及对于重链2型在残基47处额外进行这样的取代(图7)。对于轻链，在残基50处进行取代(图8)。在相应的人V区亚组中的它们的相应位置处仅仅出现的稀有构架残基为处于那些位置处的人共有氨基酸所取代。在重链的残基13和78处(图4)和轻链的残基1和2处(图5)进行这样的取代。
表达Hu8F5抗体
将编码人源化VH或VL的基因设计作为包含信号肽、剪接供体信号和合适的限制性内切酶位点的小外显子，用于随后克隆入哺乳动物表达载体中。VH和VL小外显子中的剪接供体信号分别来源于相应的人种系JH和JK序列。阿伯特生物研究中心(Abbott Bioresearch Center)提供了人源化的VH和VL小外显子中的信号肽序列。通过组装重叠合成的寡核苷酸以及PCR构建Hu8F5VH和VL基因。用于合成人源化重链可变区的引物1-28示于表A中。用于合成人源化轻链可变区的引物1-29示于表B中。
人源化VHv1、VHv2和VL小外显子的DNA序列和推导的氨基酸序列分别示于图6、7和8中。分别将所得到的V基因片段克隆入修饰形式的pVg1.D.Tt和pVk中(图9)。
如材料和方法中所描述的，生成产生Hu8F5的瞬时转染子。对于Hu8F5的产生，通过ELISA分析瞬时转染的293T/17细胞的培养物上清液。通常观察到大约30-50μg/ml的表达水平。如材料和方法中所描述的，使用蛋白A琼脂糖柱从排出的(exhausted)培养物上清液中纯化Hu8F5 IgG1/κ单克隆抗体。在非还原条件下的SDS-PAGE分析显示Hu8F5抗体具有约150-160kDa的分子量。在还原条件下的分析显示Hu8F5抗体由具有约50kDa分子量的重链和具有约25kDa分子量的轻链组成。抗体的纯度看起来大于95％。
Hu8F5抗体的结合特性
如材料和方法中所描述的，通过竞争性ELISA分析Hu8F5对人A-β寡聚体抗原(1-42)的亲和力。代表性的结果示于图10。Mu8F5和Hu8F5都以浓度依赖方式与生物素化Mu8F5竞争。如表C所示，使用计算机软件GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)获得的Mu8F5、Hu8F5v1和Hu8F5v2的IC50平均值分别为5.08、6.36和6.99μg/ml。Hu8F5v1和Hu8F5v2与人A-β寡聚体抗原(1-42)的结合相当于Mu8F5。这些结果清楚地显示小鼠抗-A-β单克隆抗体8F5的人源化是成功的：Hu8F5保留针对人A-β寡聚体抗原(1-42)的全部结合亲和力。
表A
Figure GPA00001010821000711
Figure GPA00001010821000731
表B
Figure GPA00001010821000732
Figure GPA00001010821000741
Figure GPA00001010821000751
表C
  抗体   Expt.1   Expt.2   Expt.3   平均   S.D.
  Mu8F5   4.58   4.87   5.81   5.08   0.64
  Hu8F5v1   6.28   6.85   5.93   6.36   0.47
  Hu8F5v2   6.29   8.12   6.56   6.99   0.99
人源化抗体VH和VL片段的组装
通过退火覆盖整个序列的重叠的寡核苷酸组装用于人源化设计的VH和VL基因片段。简言之，将VH或VL片段的整个编码链分成一系列的60条核苷酸寡聚体，每条寡聚体都被设计成能具有与两条相应的下链寡聚体重叠的30个核苷酸。下链寡聚体的总和同样覆盖了整个序列。总之，寡核苷酸充满了整个双链DNA片段。
在该程序的第一步中，通过在37℃下在100μl反应物中将各自浓度为3nM的7条上链和7条下链寡聚体组合在一起30分钟，寡核苷酸被激酶化(kinased)(New England Biolabs cat#201S)。然后用苯酚/氯仿萃取激酶化的寡聚体、沉淀并重悬于100μl NEB连接酶缓冲液中。
在该程序的第二步中，通过PCR仪中的控制冷却槽(ramp)在90分钟的时间内加热至95℃然后缓慢地冷却至20℃退火寡核苷酸。
在该程序的第三步中，添加1μl连接酶(NEB cat#202S)到退火的寡聚体中以便将它们连接在一起以形成VH和VL片段的链。通过加热至65℃持续10分钟灭活连接酶。
在第四步中，用Klenow酶(NEB cat#212S)补平被组装片段的末端，并在克隆入人重链和轻链盒式载体之前凝胶纯化DNA。
实施例II
竞争性ELISA
以下方案用于实施竞争性ELISA测定：
起初，用处于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5μg/mL浓度的A-β抗原(1-42)包被平板(1块平板/实验)过夜。次日，弃去上清液，并用340mLSuper Block缓冲液(Pierce，Rockford，IL)封闭平板45分钟。然后倒空平板，并添加1μg/mL浓度的生物素化7C6或5F7小鼠抗体(体积＝100μL)。添加27μg/mL-0.11μg/mL浓度的其他抗体(小鼠或人源化的)(体积＝50μL)。接着温育平板2小时并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤5X时间。添加中性抗生物素蛋白HRP作为第二试剂(稀释1∶20,000；体积＝100μL)。然后温育平板30分钟并洗涤5X时间。接着添加TMB底物(Invitrogen，Carlsbad，CA)(体积＝100μL)。然后温育平板4分钟。接着用2N硫酸(体积-100μL)终止反应。在450nm波长处通过分光光度计读板。结果示于图3。
具体而言，就人源化抗体与生物素化小鼠抗体竞争(以及抑制其结合信号)的能力而论，图3说明了人源化抗体(即8F5hum8，HUM8)与小鼠亲本的等效性。因此，人源化抗体保留其结合能力。
实施例III
8F5hum8与Aβ(1-42)原纤维的结合
由于产生的8F5hum8抗体抗可溶性球聚体，因此假定8F5hum8不应结合沉积的斑块或原纤维物质。因此，如以下实施例中所描述的测试8F5hum8对聚合的Aβ原纤维悬浮液的结合：
-制备Aβ(1-42)原纤维：
将1mg Aβ(1-42)(Bachem Inc.，目录号：H-1368)溶解于500μl 0.1％NH4OH水溶液中(Eppendorf管)，并在室温下搅拌样品1分钟，然后在10000g下离心5分钟。将上清液移液入新的Eppendorf管中并根据Bradford蛋白浓度测定法(BIO-RAD Inc.测定程序)测定Aβ(1-42)浓度。
用300μl 20mM NaH2PO4；140mM NaCl；pH7.4，接着2％HCl中和100μl该新配制的Aβ(1-42)溶液以调节pH7.4。在37℃下温育样品又20小时并离心(10分钟，10000g)。弃去上清液并在涡旋混合器上于1分钟搅拌下用400μl 20mM NaH2PO4；140mM NaCl；pH7.4重悬原纤维沉淀，然后离心(10分钟，10000g)。在弃去上清液后，重复该重悬操作，并通过又一次离心(10分钟，10000g)分离最终的原纤维悬浮液。再次弃去上清液并在涡旋混合器上于1分钟搅拌下将最终的沉淀重悬于380μl20mM NaH2PO4；140mM NaCl；pH7.4中。将样品的等分部分贮藏在-20℃冰箱中。
将80μl原纤维悬浮液与320μl 20mM NaH2PO4；140mM NaCl；0.05％Tween 20；pH7.4缓冲液混合并在室温下搅拌5分钟，然后超声处理(20秒)。在离心(10分钟，10000g)后，于涡旋混合器中在搅拌下用190μl20mM NaH2PO4；140mM NaCl；0.05％Tween 20；pH7.4重悬沉淀。
-抗体与Aβ(1-42)原纤维的结合
将该原纤维悬浮液的10μl等分部分与如下温育：
a)10μl 20mM Na Pi；140mM NaCl；pH7.4
b)10μl 0.1μg/μl mMAb 6E10 Signet Inc.Cat.#9320，处于20mMNaH2PO4；140mM NaCl；pH7.4中
c)10μl 0.1μg/μl mMAb 8F5hum8，处于20mM Na Pi；140mM NaCl；pH7.4中
d)10μl 0.1μg/μl mMAb IgG2a，处于20mM Na Pi；140mM NaCl；pH7.4中
在37℃下温育样品20小时。最终离心样品(在10000g下10分钟)。收集含未结合的抗体级分的上清液并与20μl SDS-PAGE样品缓冲液混合。沉淀级分于涡旋混合器中在1分钟搅拌下用50μl 20mM NaH2PO4；140mM NaCl；pH7.4缓冲液洗涤，然后离心(10分钟，10000g)。最终的沉淀重悬于20μl 20mM Na Pi；140mM NaCl；0.025％Tween 20；pH7.4缓冲液中并溶解于20μl SDS-PAGE缓冲液中。
-SDS-PAGE分析
在98℃下加热上清液和重悬的沉淀样品5分钟，并在下列条件下加载到18％Tris/甘氨酸凝胶上：
SDS-样品缓冲液：0.3g SDS；0.77g DTT；4ml 1M Tris/HCl pH6.8；8ml甘油；1ml1％溴酚蓝乙醇溶液；添加水至50ml，18％Tris/甘氨酸凝胶：Invitrogen Inc.，No.：EC6505BOX
电泳缓冲液：7.5g Tris；36g甘氨酸；2.5gSDS；加水至2.5l
PAGE在20mA下跑胶。用考马斯蓝R250染色凝胶。
结果：
SDS-PAGE的考马斯染色指示了对于抗体8F5hum8，在原纤维悬浮液的上清液中主要存在抗体的重链和轻链(泳道3，图2a)，残留的原纤维悬浮液沉淀显示了非常少的抗体物质，同时还显示了在4.5kDa处的部分解聚的Aβ。与8F5hum8相反，较与原纤维结合的级分(泳道6，图2a)，其它抗-Aβ抗体并不显露出可溶性级分(6E10，泳道5，图2a)。作为用于非特异性结合以及该方法固有背景的参照，非特异性抗体IgG2a用作内对照。并不针对任何形式的Aβ肽的IgG2a抗体显示了对Aβ原纤维一定的非特异性结合。
由SDS-PAGE分析通过测定与原纤维结合和上清液级分中抗体重链的反射密度值，评价对原纤维型Aβ的相对结合，并根据下列公式进行计算：
与原纤维结合的Ab级分＝RD原纤维级分x100％/(RD原纤维级分+RD上清液 级分)。
获得了下列值：
  抗体   与原纤维结合的Ab级分
 6E10   91％
 8F5hum8   20％
 IgG2a   9％
这些数据显示与标准抗体6E10相比，8F5hum8的结合明显减少。
实施例IV
通过斑点印迹测定的与AB(1-40)和AB(1-42)单体制备物相比8F5HUM8 优先结合球聚体
为测试8F5hum8的选择性，Aβ(1-42)单体以及新配制的Aβ(1-40)被用作单体的替代品。通过斑点印迹免疫测定研究相对Aβ(1-42)单体和Aβ(1-40)单体的寡聚体选择性。在该实验中，与Aβ(1-42)单体和Aβ(1-40)单体相比，8F5hum8显示优先结合Aβ(1-42)球聚体(和已知抗体4G8相比，该抗体与8F5hum8定位相似区域，但来源于用线性肽Aβ(17-24)免疫(Abcam Ltd.，Cambridge，MA))。
斑点印迹法描述
1)制备Aβ抗原：
a)制备Aβ(1-42)球聚体：
将9mg Aβ(1-42)Fa.Bachem溶解于1.5ml HFIP(1.1.1.3.3.3六氟-2-丙醇)中并在37℃下温育1,5小时。在SpeedVac中蒸发溶液并悬浮于396μl DMSO中(5mM Aβ储液)。在超声水浴中超声处理样品20秒，振荡10分钟并在-20℃下贮藏过夜。
用4.5ml PBS(20mM NaH2PO4；140mM NaCl；pH7,4)稀释样品并添加0.5ml 2％SDS-水溶液(0.2％SDS含量)。混合物在37℃下温育7小时，用16ml H2O稀释并在37℃下进一步温育16小时。此外，在3000g下离心Aβ(1-42)球聚体溶液20分钟。通过30KDa centriprep将上清液浓缩至0.5ml。在6℃下将该浓缩物对5mM NaH2PO4；35mM NaCl；pH7.4透析过夜。接着，在10000g下离心Aβ(1-42)球聚体浓缩物10分钟。然后等分上清液并贮藏在-20℃下。
b)制备HFIP预处理的单体Aβ(1-42)：
在1.7ml Eppendorff管中，将3mg人Aβ(1-42)，(Bachem Inc)目录号H-1368溶解于0.5ml HFIP(6mg/ml suspension)中，并在37℃下振荡(Eppendorff热混合器，1400rpm)1.5小时直至获得澄清溶液。在快速真空浓缩器(speed vac concentrator)中干燥样品(1.5小时)并重悬于13.2μlDMSO中，振荡10秒，然后超声浴超声处理(20秒)并振荡(如在Eppendorff热混合器中，1400rpm)10分钟。
添加6ml 20mM NaH2PO4；140mM NaCl；0.1％Pluronic F68；pH7.4并在室温下搅拌1小时。在3000g下离心样品20分钟。弃去上清液并将沉淀溶解于0.6ml 20mM NaH2PO4；140mM NaCl；1％Pluronic F68；pH7.4中。添加3.4ml水并在室温下搅拌1小时，然后在3000g下离心20分钟。在-20°下贮藏8×0.5ml的上清液等分部分。
c)制备单体Aβ(1-40)：
在Eppendorff管中，将1mg人Aβ(1-40)(Bachem Inc)目录号H-1194悬浮于0.25ml HFIP(4mg/ml suspension)中。在37℃下振荡该管(如在Eppendorff热混合器中，1400rpm)1.5小时以得到澄清溶液，然后在快速真空浓缩器中干燥(1.5小时)。将样品再溶解于46μl DMSO(21.7mg/ml溶液)中，振荡10秒，接着在超声浴中超声处理20秒。在振荡10分钟后(如在Eppendorff热混合器中，1400rpm)，在-20℃下贮藏样品供进一步使用。
2)斑点印迹：材料和步骤：
用于斑点印迹的材料：
Aβ-标准样品：
在20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH7.4+0.2mg/ml BSA中Aβ抗原的连续稀释物
1)100pmol/μl
2)10pmol/μl
3)1pmol/μl
4)0,1pmol/μl
5)0,01pmol/μl
硝酸纤维素：
电转移印迹(Trans-Blot)转移介质，无污染硝酸纤维膜(0.45μm)；BIO-RAD
抗-小鼠-AP：
目录号：AP326A(Chemicon)
抗-人-AP：
目录号：A3313(Sigma)
检测试剂：
NBT/BCIP；目录号：11697471001；Roche)
牛血清白蛋白(BSA)：
目录号：A-7888(SIGMA)
封闭试剂：
5％低脂乳TBS溶液
缓冲溶液：
TBS
25mM Tris/HCl缓冲液pH7.5
+150mM NaCl
TTBS
25mM Tris/HCl-缓冲液pH7.5
+150mM NaCl
+0.05％Tween 20
PBS+0.2mg/ml BSA
20mM NaH2PO4缓冲液pH7.4
+140mM NaCl
+0.2mg/ml BSA
抗体溶液I：
0.2μg/ml抗体，稀释于20ml1％低脂乳TBS溶液中
抗体溶液II：
1∶5000稀释
对于小鼠抗体4G8，抗-小鼠-AP溶于1％低脂乳TBS溶液中，或对于人源化抗Aβ球聚体抗体8F5hum8，抗-人-AP溶于1％低脂乳TBS溶液中
斑点印迹步骤：
1)将1μl每种不同的Aβ-标准样品(以它们的5种连续稀释物)印在硝酸纤维膜上，彼此相距大约1cm。
2)在室温(RT)下，风干硝酸纤维膜上的Aβ-标准样品斑点至少10分钟(＝斑点印迹)。
3)封闭：
在室温下用30ml 5％低脂乳TBS溶液温育斑点印迹16小时。
4)洗涤：
弃去封闭溶液并在室温下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。
5)抗体溶液I：
弃去洗涤缓冲液并在室温下用抗体溶液I温育斑点印迹2小时。
6)洗涤：
弃去抗体溶液I并在室温下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。弃去洗涤液并在室温下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。弃去洗涤液并在室温下用20ml TBS振荡温育斑点印迹10分钟。
7)抗体溶液II：
弃去洗涤缓冲液并在室温下用抗体溶液II温育斑点印迹1小时。
8)洗涤：
弃去抗体溶液II并在室温下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。弃去洗涤液并在室温下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。弃去洗涤液并在室温下用20ml TBS振荡温育斑点印迹10分钟。
9)显影：
弃去洗涤液。用由1片NBT/BCIP(Roche)溶解于20mL H2O中5分钟制成的显影溶液显影斑点印迹。通过用H2O剧烈洗涤斑点印迹终止显影。利用斑点强度的光密度分析(GS800光密度计(BioRad)和软件包Quantity one，4.5.0版(BioRad))进行定量评价。仅评价10pmol Aβ抗原的斑点。
通过斑点印迹法Aβ单体对Aβ球聚体区别对待的结果：8F5hum8 对4G8的比较。
在PBS中以100pmol/μl-0.01pmol/μl的范围制备Aβ(1-42)球聚体、Aβ1-42单体和Aβ1-40单体的连续稀释物。将1μl的每种样品点在硝酸纤维膜上。小鼠单克隆抗体4G8(0.2μg/ml)用于使用作为第二抗体的偶联碱性磷酸酶的抗-小鼠IgG和染色试剂NBT/BCIP(Roche Diagnostics，Mannheim)的检测。人源化单克隆抗体8F5hum8(0.2μg/ml)用于使用作为第二抗体的偶联碱性磷酸酶的抗-人IgG和染色试剂NBT/BCIP(RocheDiagnostics，Mannheim)的检测。通过光密度计(GS 800，Biorad，Hercules，CA，USA)在10pmol抗原浓度下，以其密度(反射密度＝RD)分析检测信号。在该浓度下，对于每一Aβ-形式，所测得的反射密度处于光密度计检测的线性范围内。结果示于下表中：
Figure GPA00001010821000831
Aβ1-40单体和Aβ1-42单体的抗-Aβ-抗体的区别对待。该区别对待区别对待被计算为Aβ1-42球聚体分别与Aβ1-42单、Aβ1-40单体的检测信号的比率。
具体而言，以上结果表明与定位于Aβ(17-24)(即线性序列)的市售抗-Aβ(1-42)抗体4G8相比，8F5hum8显示不同的结合分布图。更具体地说，与Aβ42单体相比8F5hum8显示了优先结合球聚体(参见表格第4列，对于8F5hum8，Aβ(1-42)球聚体/Aβ(1-42)单体比率为1.6，与之相比4G8的比率为0.42)，以及与Aβ40相比优先结合球聚体(参见表格第5列，对于8F5hum8，Aβ(1-42)球聚体/Aβ(1-40)单体比率为59.0，与之相比4G8的比率为10.0)。如上所述，在使用8F5hum8情况下，这些两个较标准的4G8改善的结合选择性应当导致产生更小的副作用(如斑块结合)。
序列表
<110>阿伯特实验室
 
<120>结合Aβ(1-42)球聚体的人源化抗体及其应用
 
<130>8906US01
 
<140>尚未分配
<141>2008-05-29
 
<150>60/940,931
<151>2007-05-30
 
<160>112
 
<170>PatentIn 3.3版
 
<210>1
<211>112
<212>PRT
<213>智人
 
<400>1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
         35                  40                  45
Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
     50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
 
<210>2
<211>113
<212>PRT
<213>智人
 
<400>2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
  1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
             20                  25                  30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
         35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
     50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
 65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
                 85                  90                  95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg
 
<210>3
<211>336
<212>DNA
<213>智人
 
<400>3
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggca tgtcttgggt tcgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggaatt ggtcgcaagc atcaatagta atggtggtag cacctattat 180
ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga acagtctgag ggctgaggac acagccgtgt attactgtgc aagtggtgac 300
tactggggcc aaggcaccct tgtcacagtc tcctca                           336
 
<210>4
<211>339
<212>DNA
<213>智人
 
<400>4
gatattgtga tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca ctcctggaga accagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta tatagtaatg gagacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgtgggagtt tattactgct ctcaaagtac acatgttcct 300
tggacgttcg gtggaggcac caaggtagaa atcaaacgg                        339
 
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<400>5
Ser Tyr Gly Met Ser
  1               5
 
<210>6
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<400>6
Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
  1               5                  10                  15
Gly
 
<210>7
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<400>7
Ser Gly Asp Tyr
  1
 
<210>8
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<400>8
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His
  1               5                  10                  15
 
<210>9
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<400>9
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
  1               5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
 
<400>10
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr
  1               5
 
<210>11
<211>5
<212>PRT
<213>智人
 
<400>11
Ser Tyr Gly Met Ser
  1               5
 
<210>12
<211>17
<212>PRT
<213>智人
 
<400>12
Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
  1               5                  10                  15
Gly
 
<210>13
<211>4
<212>PRT
<213>智人
 
<400>13
Ser Gly Asp Tyr
  1
 
<210>14
<211>16
<212>PRT
<213>智人
 
<400>14
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His
  1               5                  10                  15
 
<210>15
<211>7
<212>PRT
<213>智人
 
<400>15
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
  1               5
 
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>智人
 
<400>16
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr
  1               5
 
<210>17
<211>30
<212>PRT
<213>智人
 
<400>17
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
             20                  25                  30
<210>18
<211>14
<212>PRT
<213>智人
 
<400>18
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
  1               5                  10
 
<210>19
<211>31
<212>PRT
<213>智人
 
<400>19
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
  1               5                  10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
             20                  25                  30
 
<210>20
<211>11
<212>PRT
<213>智人
 
<400>20
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
  1               5                  10
 
<210>21
<211>23
<212>PRT
<213>智人
 
<400>21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
  1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
             20
 
<210>22
<211>15
<212>PRT
<213>智人
 
<400>22
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
  1               5                  10              15
 
<210>23
<211>32
<212>PRT
<213>智人
 
<400>23
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
  1               5                  10                  15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
             20                  25                  30
 
<210>24
<211>11
<212>PRT
<213>智人
 
<400>24
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
  1               5                  10
 
<210>25
<211>330
<212>PRT
<213>智人
<400>25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Phe Leu Ala Pro Ser Ser Lys
  1               5                  10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
             20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
         35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
     50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
 65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                 85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            1801                 85                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
 
<210>26
<211>330
<212>PRT
<213>智人
 
<400>26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
  1               5                  10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
             20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
         35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
     50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
 65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                 85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
 
<210>27
<211>105
<212>PRT
<213>智人
 
<400>27
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
  1               5                  10                  15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
             20                  25                  30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
         35                  40                  45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Ser Thr Tyr
     50                  55                  60
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
 65                  70                  75                  80
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
                 85                  90                  95
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
            100                 105
 
<210>28
<211>105
<212>PRT
<213>智人
 
<400>28
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
  1               5                  10                  15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
             20                  25                  30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
         35                  40                  45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
     50                  55                  60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
 65                  70                  75                  80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
                 85                  90                  95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
            100                 105
 
<210>29
<211>42
<212>PRT
<213>智人
 
<400>29
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
  1               5                  10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
             20                  25                  30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
         35                  40
 
<210>30
<211>40
<212>PRT
<213>智人
 
<400>30
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
  1               5                  10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
             20                  25                  30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
         35                  40
 
<210>31
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
 
<400>31
ctggcaaggg cctggagctg gtggccagca tcaacagcaa c                   41
 
<210>32
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
 
<400>32
gttgctgttg atgctggcca ccagctccag gcccttgcca g                   41
 
<210>33
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
 
<400>33
ccatcccggg aggagatgac caagaac                                  27
 
<210>34
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
 
<400>34
gttcttggtc atctcctccc gggatgg                                       27
 
<210>35
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
 
<400>35
ccacatggac agaggccg                                                18
 
<210>36
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
 
<400>36
agggcagcgc tgggtgc                                                 17
 
<210>37
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
 
<400>37
catctcttcc tcagcacctg aagccgcggg gggaccgtca gtcttcct              48
<210>38
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
 
<400>38
aggaagactg acggtccccc cgcggcttca ggtgctgagg aagagatg              48
 
<210>39
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>39
agacgctgtt gccttatacg cgtccaccat ggagttcg                        38
 
<210>40
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>40
acagccagct caggccgaac tccatggtgg acg                             33
 
<210>41
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<400>41
gcctgagctg gctgttcctg gtggccatcc                                       30
 
<210>42
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>42
actgcacgcc cttcaggatg gccaccagga                                       30
 
<210>43
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>43
tgaagggcgt gcagtgcgag gtgcagctgg                                       30
 
<210>44
<211>29
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<400>98
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<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
 
<400>99
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<212>PRT
<213>智人
<400>100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val
         35                  40                  45
Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
     50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<212>PRT
<213>智人
 
<400>101
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
     50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
 
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<211>112
<212>PRT
<213>智人
 
<400>102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
         35                  40                  45
Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
     50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
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<212>PRT
<213>智人
 
<400>103
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Val
             20                  25                  30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Phe Thr Ile
         35                  40                  45
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
     50                  55                  60
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Arg Gly
 65                  70                  75                  80
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212>PRT
<213>智人
 
<400>104
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
  1               5                  10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
             20                  25                  30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
         35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
     50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
 65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
                 85                  90                  95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
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<213>智人
 
<400>105
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
  1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
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         35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
     50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
 65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
                 85                  90                  95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>106
<211>80
<212>PRT
<213>智人
 
<400>106
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
  1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
             20                  25                  30
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
         35                  40                  45
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
     50                  55                  60
Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
 65                  70                  75                  80
 
<210>107
<211>427
<212>DNA
<213>智人
 
<220>
<221>CDS
<222>(12)..(404)
 
<400>107
acgcgtccac c atg gag ttc ggc ctg agc tgg ctg ttc ctg gtg gcc atc 50
             Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile
               1               5                  10
ctg aag ggc gtg cag tgc gag gtg cag ctg gtg gag agc ggc ggc ggc  98
Leu Lys Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
     15                  20                  25
ctg gtg cag cct ggc ggc agc ctg cgc ctg agc tgc gcc gcc agc ggc  146
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
 30                  35                  40                  45
ttc acc ttc agc agc tac ggc atg agc tgg gtg cgc cag gcc cct ggc  194
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
                 50                  55                  60
aag ggc ctg gag tgg gtg gcc agc atc aac agc aac ggc ggc agc acc  242
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr
             65                  70                  75
tac tac cct gac agc gtg aag ggc cgc ttc acc atc agc cgc gac aac  290
Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
         80                  85                  90
gcc aag aac acc ctg tac ctg cag atg aac agc ctg cgc gcc gag gac  338
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
     95                 100                 105
acc gcc gtg tac tac tgc gcc agc ggc gac tac tgg ggc cag ggc acc  386
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
110                 115                 120                 125
ctc gtc acc gtc tcc tca ggtgagtcct cacaacctct aga                427
Leu Val Thr Val Ser Ser
                130
 
<210>108
<211>131
<212>PRT
<213>智人
 
<400>108
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
  1               5                  10                  15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
             20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
         35                  40                  45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
     50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
 65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
                 85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
        115                 120                 125
Val Ser Ser
    130
 
<210>109
<211>427
<212>DNA
<213>智人
 
<220>
<221>CDS
<222>(12)..(404)
 
<400>109
acgcgtccac c atg gag ttc ggc ctg agc tgg ctg ttc ctg gtg gcc atc 50
             Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile
               1               5                  10
ctg aag ggc gtg cag tgc gag gtg cag ctg gtg gag agc ggc ggc ggc  98
Leu Lys Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
     15                  20                  25
ctg gtg cag cct ggc ggc agc ctg cgc ctg agc tgc gcc gcc agc ggc  146
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
 30                  35                  40                  45
ttc acc ttc agc agc tac ggc atg agc tgg gtg cgc cag gcc cct ggc  194
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
                 50                  55                  60
aag ggc ctg gag ctg gtg gcc agc atc aac agc aac ggc ggc agc acc  242
Lys Gly Leu Glu Leu Val Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr
             65                  70                  75
tac tac cct gac agc gtg aag ggc cgc ttc acc atc agc cgc gac aac  290
Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
         80                  85                  90
gcc aag aac acc ctg tac ctg cag atg aac agc ctg cgc gcc gag gac  338
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
     95                 100                 105
acc gcc gtg tac tac tgc gcc agc ggc gac tac tgg ggc cag ggc acc  386
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
110                 115                 120                 125
ctc gtc acc gtc tcc tca ggtgagtcct cacaacctct aga                427
Leu Val Thr Val Ser Ser
                130
 
<210>110
<211>131
<212>PRT
<213>智人
 
<400>110
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
  1               5                  10                  15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
             20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
         35                  40                  45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
     50                  55                  60
Glu Leu Val Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
 65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
                 85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
        115                 120                 125
Val Ser Ser
    130
 
<210>111
<211>438
<212>DNA
<213>智人
 
<220>
<221>CDS
<222>(12)..(413)
 
<400>111
acgcgtccac c atg gac atg cgc gtg cct gcc cag ctg ctg ggc ctg ctg 50
             Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu
               1               5                  10
ctg ctg tgg ttc cct ggc agc cgc tgc gac atc gtg atg acc cag agc  98
Leu Leu Trp Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser
     15                  20                  25
cct ctg agc ctg cct gtg acc cct ggc gag cct gcc agc atc agc tgc  146
Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
 30                  35                  40                  45
cgc agc agc cag agc ctg gtg tac agc aac ggc gac acc tac ctg cac  194
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His
                 50                  55                  60
tgg tac ctg cag aag cct ggc cag agc cct aag ctg ctg atc tac aaa  242
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys
             65                  70                  75
gtg agc aac cgc ttc agc ggc gtg cct gac cgc ttc agc ggc agc ggc  290
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
         80                  85                  90
agc ggc acc gac ttc acc ctg aag atc agc cgc gtg gag gcc gag gac  338
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
     95                 100                 105
gtg ggc gtg tac tac tgc agc cag agc acc cac gtg cct tgg acc ttc  386
Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe
110                 115                 120                 125
ggc ggc ggc acc aaa gtg gag atc aaa cgtaagtgca ctttcctaat ctaga 438
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                130
 
<210>112
<211>134
<212>PRT
<213>智人
 
<400>112
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
  1               5                  10                  15
Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser
             20                  25                  30
Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
         35                  40                  45
Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu
     50                  55                  60
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
 65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
                 85                  90                  95
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Thr Lys Val Glu Ile Lys
    130

Claims (106)

1.一种结合蛋白，包含：a)结合淀粉样蛋白-β(1-42)球聚体的抗原结合域，所述抗原结合域包含至少一个包含选自如下的氨基酸序列的CDR：
CDR-H1.X1-X2-X3-X4-X5(SEQ ID NO：5)，其中：
X1是S；
X2是Y；
X3是G；
X4是M；和
X5是S，
CDR-H2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17(SEQ ID NO：6)，其中：
X1是S；
X2是I；
X3是N；
X4是S；
X5是N；
X6是G；
X7是G；
X8是S；
X9是T；
X10是Y；
X11是Y；
X12是P；
X13是D；
X14是S；
X15是V；
X16是K；和
X17是G，
CDR-H3.X1-X2-X3-X4(SEQ ID NO：7)，其中：
X1是S；
X2是G；
X3是D；和
X4是Y，
CDR-L1.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16
(SEQ ID NO：8)，其中：
X1是R；
X2是S；
X3是S；
X4是Q；
X5是S；
X6是L；
X7是V；
X8是Y；
X9是S；
X10是N；
X11是G；
X12是D；
X13是T；
X14是Y；
X15是L；和
X16是H，
CDR-L2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO：9)，其中：
X1是K；
X2是V；
X3是S；
X4是N；
X5是R；
X6是F；和
X7是R，
以及
CDR-L3.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO：10)，其中：
X1是S；
X2是Q；
X3是S；
X4是T；
X5是H；
X6是V；
X7是P；
X8是W；和
X9是T，
以及2)包含至少一条选自如下的接纳体序列的人接纳体构架：SEQID NO.：17、SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：19、SEQ ID NO.：20、SEQ IDNO.：21、SEQ ID NO.：22、SEQ ID NO.：23和SEQ ID NO.：24。
2.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述至少一个CDR包含选自如下的氨基酸序列：
SEQ ID NO.：11、SEQ ID NO.：12、SEQ ID NO.：13、SEQ ID NO.：14、SEQ ID NO.：15和SEQ ID NO.：16。
3.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含至少3个CDR。
4.根据权利要求3的结合蛋白，其中所述至少3个CDR是选自由如下组成的可变域CDR组：
Figure FPA00001010820900041
5.根据权利要求4的结合蛋白，两个可变域CDR组。
6.根据权利要求5的结合蛋白，其中所述两个可变域CDR组是VH8F5 CDR组&VL 8F5 CDR组。
7.根据权利要求3的结合蛋白，进一步包含人接纳体构架。
8.根据权利要求4的结合蛋白，进一步包含人接纳体构架。
9.根据权利要求5的结合蛋白，进一步包含人接纳体构架。
10.根据权利要求6的结合蛋白，进一步包含人接纳体构架。
11.根据权利要求7的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包含选自如下的氨基酸序列选：
SEQ ID NO.：17、SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：19、SEQ IDNO.：20、SEQ ID NO.：21、SEQ ID NO.：22、SEQ ID NO.：23和SEQ IDNO.：24。
12.根据权利要求8的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包含选自如下的氨基酸序列：
SEQ ID NO.：17、SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：19、SEQ IDNO.：20、SEQ ID NO.：21、SEQ ID NO.：22、SEQ ID NO.：23和SEQ IDNO.：24。
13.根据权利要求9的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包含选自如下的氨基酸序列：
SEQ ID NO.：17、SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：19、SEQ IDNO.：20、SEQ ID NO.：21、SEQ ID NO.：22、SEQ ID NO.：23和SEQ IDNO.：24。
14.根据权利要求10的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包含选自如下的氨基酸序列：
SEQ ID NO.：17、SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：19、SEQ IDNO.：20、SEQ ID NO.：21、SEQ ID NO.：22、SEQ ID NO.：23和SEQ IDNO.：24。
15.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含至少一个具有选自：SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2的氨基酸序列的可变域。
16.根据权利要求15的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含两个可变域，其中所述两个可变域具有选自：SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2的氨基酸序列。
17.根据权利要求7的结合蛋白，其中所述人接纳体构架在关键残基处包含至少一个构架区氨基酸取代，所述关键残基选自：
邻接CDR的残基；
糖基化位点残基；
稀有残基；
能与Aβ(1-42)球聚体相互作用的残基；
能与CDR相互作用的残基；
规范残基；
在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；
游标区中的残基；和
在Chothia-定义的可变重链CDR1与Kabat-定义的第一重链构架之间重叠区中的残基。
18.根据权利要求10的结合蛋白，其中所述人接纳体构架在关键残基处包含至少一个构架区氨基酸取代，所述关键残基选自：
邻接CDR的残基；
糖基化位点残基；
稀有残基；
能与Aβ(1-42)球聚体相互作用的残基；
能与CDR相互作用的残基；
规范残基；
在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；
游标区中的残基；和
在Chothia-定义的可变重链CDR1与Kabat-定义的第一重链构架之间重叠区中的残基。
19.根据权利要求16的结合蛋白，其中所述人接纳体构架在关键残基处包含至少一个构架区氨基酸取代，所述关键残基选自：
邻接CDR的残基；
糖基化位点残基；
稀有残基；
能与Aβ(1-42)球聚体相互作用的残基；
能与CDR相互作用的残基；
规范残基；
在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；
游标区中的残基；和
在Chothia-定义的可变重链CDR1与Kabat-定义的第一重链构架之间重叠区中的残基。
20.根据权利要求7的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包含至少一个构架区氨基酸取代，其中构架区的氨基酸序列至少65％同一于所述人接纳体构架的序列并包含至少52个相同于所述人接纳体构架的氨基酸残基。
21.根据权利要求10的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包含至少一个构架区氨基酸取代，其中构架区的氨基酸序列至少65％同一于所述人接纳体构架的序列并包含至少52个相同于所述人接纳体构架的氨基酸残基。
22.根据权利要求16的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包含至少一个构架区氨基酸取代，其中构架区的氨基酸序列至少65％同一于所述人接纳体构架的序列并包含至少52个相同于所述人接纳体构架的氨基酸残基。
23.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含至少一个具有选自：SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2的氨基酸序列的可变域，以及与原纤维形式相比所述结合蛋白优先结合Aβ(1-42)球聚体的可溶性形式。
24.根据权利要求23的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含两个可变域，其中所述两个可变域具有氨基酸序列：SEQ ID NO.：1和SEQ IDNO.：2。
25.根据权利要求20的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含至少一个具有选自：SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2的氨基酸序列的可变域，以及与原纤维形式相比所述结合蛋白优先结合Aβ(1-42)球聚体的可溶性形式。
26.根据权利要求21的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含至少一个具有选自选自：SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2的氨基酸序列的可变域。
27.根据权利要求22的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含至少一个具有选自选自：SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2的氨基酸序列的可变域。
28.根据权利要求1的结合蛋白，其中结合蛋白结合Aβ(1-42)球聚体，以及与原纤维形式相比所述结合蛋白优先结合Aβ(1-42)球聚体的可溶性形式。
29.根据权利要求4的结合蛋白，其中结合蛋白结合Aβ(1-42)球聚体，以及与原纤维形式相比所述结合蛋白优先结合Aβ(1-42)球聚体的可溶性形式。
30.根据权利要求6的结合蛋白，其中结合蛋白结合Aβ(1-42)球聚体，以及与原纤维形式相比所述结合蛋白优先结合Aβ(1-42)球聚体的可溶性形式。
31.根据权利要求7的结合蛋白，其中结合蛋白结合Aβ(1-42)球聚体，以及与原纤维形式相比所述结合蛋白优先结合Aβ(1-42)球聚体的可溶性形式。
32.根据权利要求11的结合蛋白，其中结合蛋白结合Aβ(1-42)球聚体，以及与原纤维形式相比所述结合蛋白优先结合Aβ(1-42)球聚体的可溶性形式。
33.根据权利要求15的结合蛋白，其中结合蛋白结合Aβ(1-42)球聚体，以及与原纤维形式相比所述结合蛋白优先结合Aβ(1-42)球聚体的可溶性形式。
34.根据权利要求17的结合蛋白，其中结合蛋白结合Aβ(1-42)球聚体，以及与原纤维形式相比所述结合蛋白优先结合Aβ(1-42)球聚体的可溶性形式。
35.根据权利要求20的结合蛋白，其中结合蛋白结合Aβ(1-42)球聚体，以及与原纤维形式相比所述结合蛋白优先结合Aβ(1-42)球聚体的可溶性形式。
36.根据权利要求23的结合蛋白，其中结合蛋白结合Aβ(1-42)球聚体，以及与原纤维形式相比所述结合蛋白优先结合Aβ(1-42)球聚体的可溶性形式。
37.根据权利要求28的结合蛋白，其中结合蛋白调节Aβ(1-42)球聚体的生物学功能。
38.根据权利要求33的结合蛋白，其中结合蛋白调节Aβ(1-42)球聚体的生物学功能。
39.根据权利要求36的结合蛋白，其中结合蛋白调节Aβ(1-42)球聚体的生物学功能。
40.根据权利要求28的结合蛋白，其中结合蛋白中和Aβ(1-42)球聚体。
41.根据权利要求33的结合蛋白，其中结合蛋白中和Aβ(1-42)球聚体。
42.根据权利要求36的结合蛋白，其中结合蛋白中和Aβ(1-42)球聚体。
43.根据权利要求28的结合蛋白，其中所述结合蛋白对所述靶标具有选自如下的解离常数(KD)：至多约10-7M、至多约10-8M、至多约10-9M、至多约10-10M、至多约10-11M、至多约10-12M和至多约10-13M。
44.根据权利要求33的结合蛋白，其中所述结合蛋白对所述靶标具有选自如下的解离常数(KD)：至多约10-7M、至多约10-8M、至多约10-9M、至多约10-10M、至多约10-11M、至多约10-12M和至多约10-13M。
45.根据权利要求35的结合蛋白，其中所述结合蛋白对所述靶标具有选自如下的解离常数(KD)：至多约10-7M、至多约10-8M、至多约10-9M、至多约10-10M、至多约10-11M、至多约10-12M和至多约10-13M。
46.根据权利要求36的结合蛋白，其中所述结合蛋白对所述靶标具有选自如下的解离常数(KD)：至多约10-7M、至多约10-8M、至多约10-9M、至多约10-10M、至多约10-11M、至多约10-12M和至多约10-13M。
47.一种包含权利要求1-46任一项的所述结合蛋白的抗体构建体，所述抗体构建体进一步包含连接多肽或免疫球蛋白恒定域。
48.根据的权利要求47抗体构建体，其中所述结合蛋白选自：
免疫球蛋白分子，
单克隆抗体，
嵌合抗体，
CDR-嫁接抗体，
人源化抗体，
Fab，
Fab’，
F(ab’)2，
Fv，
二硫键连接的Fv，
scFv，
单区抗体，
双抗体，
多特异性抗体，
双重特异性抗体，
同种型抗体，
突变的抗体，
双可变区抗体
和
双特异性抗体。
49.根据权利要求47的抗体构建体，其中所述结合蛋白包含选自如下的重链免疫球蛋白恒定域：
人IgM恒定域，
人IgG1恒定域，
人IgG2恒定域，
人IgG3恒定域，
区，
人IgG4恒定域，
人IgE恒定域，
和
人IgA恒定域。
50.根据权利要求47的抗体构建体，包含具有选自如下的氨基酸序列的免疫球蛋白恒定域：SEQ ID NO.：25、SEQ ID NO.：26、SEQ IDNO.：27和SEQ ID NO.：28。
51.一种包含权利要求47-50任一项所述的抗体构建体的抗体缀合物，所述抗体缀合物进一步包含选自如下的剂：免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。
52.根据的权利要求51抗体缀合物，其中所述剂是显像剂，选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。
53.根据权利要求52的抗体缀合物，其中所述放射性标记选自：3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。
54.根据权利要求51的抗体缀合物，其中所述剂是治疗剂或细胞毒素剂，选自：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗-血管发生剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素和细胞凋亡剂。
55.根据权利要求49的抗体构建体，其中所述结合蛋白具有人糖基化模式。
56.根据权利要求51的抗体缀合物，其中所述结合蛋白具有人糖基化模式。
57.根据权利要求3的结合蛋白，其中所述结合蛋白以晶体形态存在。
58.根据权利要求47的抗体构建体，其中所述抗体构建体以晶体形态存在。
59.根据权利要求51的抗体缀合物，其中所述抗体构建体以晶体形态存在。
60.根据权利要求57的结合蛋白，其中所述晶体是无载体药物控制释放晶体。
61.根据权利要求58的抗体构建体，其中所述晶体是无载体药物控制释放晶体。
62.根据权利要求59的抗体缀合物，其中所述晶体是无载体药物控制释放晶体。
63.根据权利要求57的结合蛋白，其中与所述结合蛋白的可溶性对应物相比所述结合蛋白具有更长的体内半衰期。
64.根据权利要求58的抗体构建体，其中与所述抗体构建体的可溶性对应物相比所述抗体构建体具有更长的体内半衰期。
65.根据权利要求59的抗体缀合物，其中与所述抗体缀合物的可溶性对应物相比所述抗体缀合物具有更长的体内半衰期。
66.根据权利要求57的结合蛋白，其中所述结合蛋白保留生物活性。
67.根据权利要求58的抗体构建体，其中所述抗体构建体保留生物活性。
68.根据权利要求59的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物保留生物活性。
69.一种编码结合蛋白的分离的核酸分子，其中所述结合蛋白的所述可变重链的氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有至少70％同一性。
70.一种编码结合蛋白的分离的核酸分子，其中所述结合蛋白的所述可变轻链的氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有至少70％同一性。
71.一种编码权利要求1-46任一项的结合蛋白氨基酸序列的分离的核酸分子。
72.一种编码权利要求47-50任一项的抗体构建体氨基酸序列的分离的核酸分子。
73.一种编码权利要求51-53任一项的抗体缀合物氨基酸序列的分离的核酸分子。
74.一种包含权利要求71-73任一项的所述核酸分子的载体。
75.一种包含权利要求74的所述载体的宿主细胞。
76.权利要求75的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
77.根据权利要求76的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
78.根据权利要求75的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
79.根据权利要求78的宿主细胞，其中所述真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞.
80.根据权利要求79的宿主细胞，其中所述动物细胞选自哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞。
81.根据权利要求80的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
82.根据权利要求80的宿主细胞，其中所述宿主细胞是COS。
83.根据权利要求80的宿主细胞，其中所述真菌细胞是酵母细胞。
84.根据权利要求83的宿主细胞，其中所述酵母细胞是酿酒酵母。
85.根据权利要求80的宿主细胞，其中所述昆虫细胞是Sf9。
86.一种产生能结合Aβ(1-42)球聚体的蛋白的方法，包括在足以产生能结合Aβ(1-42)球聚体的结合蛋白的时间和条件下，培养权利要求75-85任一项的宿主细胞。
87.一种根据权利要求86的方法产生的分离的蛋白。
88.一种用于释放结合蛋白的组合物，所述组合物包含：
(a)一种制剂，其中所述制剂包含根据权利要求57-68任一项的结晶的结合蛋白和组分；以及
(b)至少一种聚合物载体。
89.根据权利要求88的组合物，其中所述聚合物载体是至少一种选自如下的聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(酯肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸乙醇酸共聚物)或PLGA、聚(b-羟基丁酸酯)、聚(已内酯)、聚(二氧杂环己酮)；聚(乙二醇)、聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚[(有机)膦腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、马来酸酐-烷基乙烯醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、海藻酸盐、纤维素及纤维素衍生物、胶原蛋白、血纤蛋白、明胶、透明质酸、低聚糖、糖胺聚糖、硫酸多糖、它们的混合物和共聚物。
90.根据权利要求87的组合物，其中所述组分选自白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
91.一种治疗怀疑患有淀粉样变性的哺乳动物的方法，包括以足以实现所述治疗的量向哺乳动物施用权利要求88的所述组合物。
92.一种包含权利要求1的结合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
93.权利要求91的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体起佐剂作用，用于增加所述结合蛋白的吸收或分散。
94.权利要求92的药物组合物，其中所述佐剂是透明质酸酶。
95.权利要求91的药物组合物，进一步包含至少一种用于治疗其中Aβ(1-42)球聚体的存在是有害的病症的附加治疗剂。
96.权利要求95的方法，其中所述至少一种附加治疗剂选自胆固醇酶抑制剂、TNF拮抗剂、细胞因子拮抗剂、部分NMDA受体阻断剂、糖胺聚糖模拟物、γ分泌酶抑制剂或别构调节剂、黄体生成素阻断促性腺激素释放激素激动剂、5-羟色胺5-HT1A受体拮抗剂、螯合剂、神经元选择性L-型钙离子通道阻断剂、免疫调节剂、淀粉样蛋白原纤维形成抑制剂或淀粉样蛋白沉积抑制剂、PDE4抑制剂、组胺激动剂、高级聚糖化终产物受体蛋白、PARP刺激物、5-羟色胺6-受体拮抗剂、5-HT4受体激动剂、人类固醇、增强神经元代谢的葡萄糖摄取刺激物、选择性CB1拮抗剂、苯并二吖庚因受体部分激动剂、淀粉样蛋白β产生拮抗剂或抑制剂、淀粉样蛋白β沉积抑制剂、NNRα-7部分拮抗剂、治疗靶向PDE4、RNA翻译抑制剂、毒蕈碱性激动剂、神经生长因子受体激动剂、NGF受体激动剂和基因治疗调节剂。
97.一种降低Aβ(1-42)球聚体活性的方法，包括将Aβ(1-42)球聚体与权利要求1的结合蛋白接触，使得Aβ(1-42)球聚体活性降低。
98.一种降低患有其中Aβ(1-42)球聚体是有害的病症的人个体中人Aβ(1-42)球聚体活性的方法，包括向该人个体施用权利要求1的结合蛋白，使得该人个体中的人Aβ(1-42)球聚体活性降低。
99.一种通过以足以实现所述治疗的量向个体施用权利要求1的结合蛋白，治疗个体的其中Aβ(1-42)球聚体活性是有害的疾病或病症的方法。
100.权利要求99的方法，其中所述疾病或病症选自甲抗胰蛋白酶缺乏症、C1-抑制剂缺乏血管性水肿、抗凝血酶缺乏血栓栓塞性疾病、库鲁病、Creutzfeld-Jacob病/羊瘙痒症、牛绵状脑病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、家族致命性失眠症、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调、Machado-Joseph萎缩、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩、额颞痴呆、镰状细胞贫血、不稳定性血红蛋白包含体溶血、药物性包含体溶血、帕金森氏病、全身性AL型淀粉样变性、小结节性AL淀粉样变性、全身性AA淀粉样变性、前列腺淀粉样、血液透析淀粉样变性、遗传性(冰岛人)大脑血管病、亨廷顿病、家族性内脏淀粉样、家族性内脏多神经病、家族性内脏淀粉样变性、老年全身性淀粉样变性、家族性淀粉样神经病、家族性心脏淀粉样、阿尔茨海默病、唐氏综合征、甲状腺髓样癌和2型糖尿病(T2DM)。
101.一种治疗患有其中Aβ(1-42)球聚体是有害的病症的患者的方法，包括在施用至少一种第二药剂之前、同时或之后施用权利要求1的结合蛋白的步骤，其中所述至少一种第二药剂选自胆固醇酶抑制剂、部分NMDA受体阻断剂、糖胺聚糖模拟物、TNF拮抗剂、细胞因子拮抗剂、γ分泌酶抑制剂或别构调节剂、黄体生成素阻断促性腺激素释放激素激动剂、5-羟色胺5-HT1A受体拮抗剂、螯合剂、神经元选择性L-型钙离子通道阻断剂、免疫调节剂、淀粉样蛋白原纤维形成抑制剂或淀粉样蛋白沉积抑制剂、PDE4抑制剂、组胺激动剂、高级聚糖化终产物受体蛋白、PARP刺激物、5-羟色胺6-受体拮抗剂、5-HT4受体激动剂、人类固醇、增强神经元代谢的葡萄糖摄取刺激物、选择性CB1拮抗剂、苯并二吖庚因受体部分激动剂、淀粉样蛋白β产生拮抗剂或抑制剂、淀粉样蛋白β沉积抑制剂、NNRα-7部分拮抗剂、治疗靶向PDE4、RNA翻译抑制剂、毒蕈碱性激动剂、神经生长因子受体激动剂、NGF受体激动剂和基因治疗调节剂。
102.权利要求101的方法，其中所述胆固醇酶抑制剂选自他克林、多奈哌齐、利斯的明和加兰他敏。
103.权利要求101的方法，其中所述部分NMDA受体阻断剂是美金刚。
104.根据权利要求98的方法，其中所述施用于个体是通过至少一种选自如下的方式进行的：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、大肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、含服、舌下、鼻内和透皮。
105.一种在怀疑患有阿尔茨海默病的患者中诊断该疾病的方法，包括步骤：
a.从所述患者分离生物样品；
b.在足以形成球聚体/结合蛋白复合物的时间和条件下，将所述生物样品与权利要求1的所述结合蛋白接触；和
c.检测所述样品中所述球聚体/结合蛋白复合物的存在，所述复合物的存在指示在所述患者中诊断了阿尔茨海默病。
106.一种在怀疑患有阿尔茨海默病的患者中诊断该疾病的方法，包括步骤：
a.从所述患者分离生物样品；
b.在足以形成球聚体/结合蛋白复合物的时间和条件下，将所述生物样品与权利要求1的所述结合蛋白接触；
c.在足以使得所述缀合物与已结合的结合蛋白结合的时间和条件下，添加缀合物至所得到的球聚体/结合蛋白复合物，其中所述缀合物包含连接有能产生可检测的信号的信号产生化合物的抗-结合蛋白抗体；和
d.通过检测所述信号产生化合物产生的信号，检测其可存在于所述生物样品中的所述结合蛋白的存在，所述信号指示在所述患者中诊断了阿尔茨海默病。
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