CN102071142B - 利用三氯甲烷筛选杨桃细菌性斑点病菌拮抗菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用三氯甲烷对筛选杨桃细菌性斑点病菌拮抗菌的方法，该方法采用先对菌株培养一段时间，让其成分在培养基中释放代谢物质，而后通过三氯甲烷将其熏死，再接上病原菌培养，观察其生长情况。此法可用于病原细菌有效稳定的筛选，为杨桃细菌性斑点病害的生物防治奠定基础，提供可靠的技术和理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用三氯甲烷筛选杨桃细菌性斑点病菌拮抗菌的方法，属于农作物病害生物防治技术的领域。
背景技术
杨桃细菌性斑点病是由杨桃细菌性斑点病原细菌（Pseudomonas syringae）侵染引起的一种病害。杨桃(Averrhoa carambola L．)系酢浆草科，属于热带、亚热带常绿乔木果树。在我国广东、海南等省普遍栽种。近年，在广东、海南两省一些杨桃种植园或苗圃发现一种导致严重落叶的叶斑病，切取叶片病斑组织作显微镜检查，发现有细菌溢流，认为是一种细菌性病害，当时该病害在国内外尚未见报道，因此，有必要对该病害进行研究，为防治该病提供理论依据（文衍堂，黄智辉，1995）。在台湾，本病害于1997年11月在苗栗县卓兰镇首次被发现，经过全台湾主要杨桃产区调查结果，目前仅在栗县卓兰镇、台中县东势镇、石冈乡、新社乡、南投县国姓乡及彰化县员林镇等地发生。
杨桃细菌性斑点病全年发生，可感染叶片、枝条以及果实，但以叶片最为严重。叶片患病时，初期产生暗绿色水浸状斑点。以后扩大为紫红色的斑点，病斑周围有明显的黄色晕环，严重时叶片黄化并提前落叶。枝条患病时，呈暗褐色坏疽斑点。果实患病时，初期产生紫褐色大小不一的坏疽病斑，病斑周围有黄色晕环，严重时果实畸形。该病的传染途径：患病的叶片、枝条以及果实为主要感染源，病原菌可借由雨水飞溅传播，并经由气孔以及伤口侵入感染，因此，春雨、梅雨以及台风季节本病发生较为严重。
传统的防治方法是利用化学药品经行喷洒，常用药品为73%锌波尔多可湿性粉剂，85%碱性氯化铜可湿性粉剂，68.8%多保链霉素可湿性粉剂，4-4式波尔多液73%可湿性粉剂，以及40%铜快得宁可湿性粉剂等。但这些化学制剂容易在果实上残留，对人体有一定的危害性，同时在土壤里也有一定的残留量。为解决农药带来的影响，各国学者都在研究如何采用生物防治来替代药物防治。其中最常见的就是采用无害的拮抗菌对病原菌进行抑制，从而抵抗该病的发生，提高农作物的产量，实现无农药残留。
目前常用的拮抗菌筛选方法是：采用试管混菌平板涂布法初筛后再用管碟法（赵丽先，2004）复筛，用琼脂移块法筛选，滤纸片法，对峙培养法等。但这些方法耗时较长，将拮抗菌与病原菌同时接入培养基时，有时会由于病原菌的生长较快而盖过拮抗菌，还可能在拮抗菌未释放出抑制物时，就已被病原菌盖过。
发明内容
针对现有技术中杨桃细菌性斑点病菌拮抗菌筛选所需时间长，筛选效果不稳定等问题，本发明提供了一种利用三氯甲烷筛选杨桃细菌性斑点病菌拮抗菌的方法，该方法易于操作、耗时较短且结果较稳定。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案包括：先对试样菌株进行培养，而后通过三氯甲烷进行熏蒸，再接上病原菌培养，然后根据抑菌圈大小筛选拮抗菌。
具体步骤如下：
（1）菌株培养
用接种环将试样菌株接种在NA培养基平板的中央，28℃条件下倒扣培养72h；菌株分别接3个皿进行平行筛选；
（2）杨桃细菌性斑点病菌的培养
将杨桃细菌性斑点病菌接种于200mL LB液体培养基中，在28℃，160r/min条件下振荡培养，培养24h后用无菌水调整至浓度为108cfu/mL的杨桃细菌性斑点病菌菌液；
（3）三氯甲烷熏蒸
在新的皿盖中倒入3mL三氯甲烷，将已培养的菌株平板倒扣在皿盖上，熏蒸8-10min，将皿盖打开，弃去余液；
（4）接病原菌菌液
将杨桃细菌性斑点病菌菌液涂布于熏蒸过的菌株平皿上，28℃倒扣培养48h，观察抑菌圈，根据抑菌圈大小筛选拮抗菌。
抑菌圈大小为抑菌圈外径扣去培养的拮抗菌的半径，抑菌圈越大说明拮抗效果越好，平行实验误差大小不大于0.25cm。平行实验结果稳定。一般情况下，抑菌圈≥2.2抑菌效果较好。
本发明采用先对拮抗菌培养一段时间，让其成分在培养基中释放代谢物质，而后通过三氯甲烷将其熏死，再接上病原菌培养，观察其生长情况。该方法能为杨桃细菌性斑点病菌的拮抗菌筛选提供快速有效的方法，为杨桃细菌性斑点病害的生物防治奠定有利的实验基础，对进一步研究该病害的生物防治方法有十分重要的意义。
本发明有益效果：本发明方法适用于杨桃细菌性斑点病菌以及其他病原细菌的拮抗菌的快速筛选，对于杨桃细菌性斑点病害的生物防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极的效果：
1、效果稳定：本发明对杨桃细菌性斑点病菌拮抗菌的筛选结果稳定，重复性较好。
2、操作简便快速：应用本发明方法，对病原细菌拮抗菌的筛选，所用仪器药品简单，操作简易，一般整个筛选过程5天便可以观察结果。专用于对杨桃细菌性斑点病菌等病原细菌的拮抗细菌进行筛选，操作简易、快速，能在较短时间内筛选出其拮抗细菌，效果稳定。
附图说明
图1为实施例1所筛选的杨桃细菌性斑点病菌拮抗菌的抑菌圈大小图。
具体实施方式
实施例1
（1）对可能的拮抗菌的培养
用接种环将试样菌株ZB-77、ZB-80、ZB-82、ZB-88、ZB-95、ZB-142、ZB-178接种在NA培养基平板的中央，28℃条件下倒扣培养72h；菌株分别接3个皿进行平行筛选；
（2）杨桃细菌性斑点病菌的培养
将杨桃细菌性斑点病菌接种于200mL LB液体培养基中，28℃，160r/min振荡培养，培养24h后将用无菌水调整至浓度为108cfu/mL的菌液；
（3）利用三氯甲烷熏蒸已培养的拮抗菌
在新的皿盖中倒入3mL三氯甲烷，将已培养的试样菌株平板倒扣在皿盖上，熏蒸8-10min，将皿盖打开，弃去余液；
（4）接病原菌菌液
将稀释过的杨桃细菌性斑点病菌菌液涂布于熏蒸过的试样菌株平皿上，28℃倒扣培养48h，观察抑菌圈。抑菌圈大小平均值分别为：ZB-77为1.8cm、ZB-80为1.5cm、ZB-82为2.9cm、ZB-88为2.25cm、ZB-95为2.95cm、ZB-142为1.9cm、ZB-178为1.3cm。由图1可见ZB-82、ZB-88、ZB-95的抑菌圈较大、且清晰，抑菌效果较好。上述涉及菌株均保藏在福建省农业科学院植物保护研究所分子病理实验室。
Claims (1)
1.一种利用三氯甲烷筛选杨桃细菌性斑点病菌拮抗菌的方法，其特征在于：
所述方法采用先对试样菌株进行培养，而后通过三氯甲烷进行熏蒸，再接上病原菌培养，然后根据抑菌圈大小筛选拮抗菌,具体步骤如下：
（1）菌株培养
用接种环将试样菌株接种在NA培养基平板的中央，28℃条件下倒扣培养72h；菌株分别接3个皿进行平行筛选；
（2）杨桃细菌性斑点病菌的培养
将杨桃细菌性斑点病菌接种于200mL LB液体培养基中，在28℃，160r/min条件下振荡培养，培养24h后用无菌水调整至浓度为108cfu/mL的杨桃细菌性斑点病菌菌液；
（3）三氯甲烷熏蒸
在新的皿盖中倒入3mL三氯甲烷，将已培养的菌株平板倒扣在皿盖上，熏蒸8-10min，将皿盖打开，弃去余液；
（4）接病原菌菌液
将杨桃细菌性斑点病菌菌液涂布于熏蒸过的菌株平皿上，28℃倒扣培养48h，观察抑菌圈，根据抑菌圈大小筛选拮抗菌。
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