CN102068446B - 三萜皂苷化合物在制备抗病原微生物药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种三萜皂苷化合物在制备抗病原微生物药物中的应用，特别是在制备抗结核病、抗麻风病药物中的应用，其中，所述三萜皂苷化合物为由以下化学通式表示的三萜皂苷化合物：在以下化学通式中：R₁、R₂和R₃中的任意两个为甲基，且另一个为氢原子；R₄为由五或六元单糖，或由所述五或六元单糖形成的二糖，或所述单糖或二糖的醛酸衍生物形成的糖苷基；R₅为氢原子，或者为由五或六元单糖，或由所述五或六元单糖形成的二糖，或所述单糖或二糖的醛酸衍生物形成的取代基。根据本发明，提供了具有明显的抗病原微生物作用的药物。

Description

三萜皂苷化合物在制备抗病原微生物药物中的应用

技术领域

本发明涉及三萜皂苷化合物在制备抗病原微生物药物中的应用，特别是涉及在制备抗结核病、抗麻风病药物中的应用。

背景技术

中药是中医防治疾病、健康保健的物质基础和载体，蕴含了丰富的科学内涵和极高的实用价值。随着人类医疗保健事业的不断发展和中医药走向世界的态势日趋明显，对中医药资源的社会需求出现了前所未有的增长，供需矛盾日渐突出。合理开发和保护中药资源，实现中药资源的可持续利用已成为中国政府和中医药行业的基本共识。

从野生动植物中发现和寻找新结构、新化合物已成为一种趋势。这些都在不同程度上加大了中药资源的压力。加上长期以来对合理开发利用中药资源的认识缺陷，不少地区在不同程度上对中药资源进行了掠夺式的过度采收、采猎，致使到目前，很多中药资源濒临灭绝。因此，如何正确有效的利用中药用动植物资源，如何保证中药资源的可持续开发和利用等方面的问题亟待解决。

三萜皂苷类化合物是存在于多种药用植物中的一类具有三萜结构主体并在3位羟基和28位羧基上分别通过糖苷键和酯键连接有糖链的皂苷化合物。例如从地乌的根茎中分离得到多种具有齐墩果酸主体结构的三萜皂苷，并发现这些化合物具有一定的抗癌活性(张兰天等，中国中药杂志，第33卷第14期，2008年7月：1696-1699)。中国专利申请公开CN101528209A中公开了从多种植物中提取的齐墩果烷型三萜皂苷化合物在改善记忆和学习能力方面的用途。

目前三萜皂苷的来源主要从植物中获得，而中药资源短缺，原生态原料药材无法满足供应，期望能用化学合成方法作为解决中药资源短缺，保护中药药材资源的有效途径。而且，通过化学合成技术，合成其药用活性成分，应是解决植物资源匮乏的重要手段之一。且用化学合成技术合成具有不受资源限制、更适合相关药品工业化生产的优势。本申请的发明人曾经以齐墩果酸和单糖为原料成功合成了地乌皂苷W3(中国专利申请公开CN101100482A)。然而，天然存在的三萜皂苷类化合物通常连接有多条多糖链，且每条糖链通常有三个以上的糖。这样的结构使这类化合物的合成异常复杂，副产物多，最终收率较低，难以进行大规模产业化应用。

此外，三萜皂苷类化合物在其他疾病方面的应用还鲜有研究。

抗结核、抗麻风与抗病原微生物有关。在世界卫生组织推荐的标准抗结核化疗方案中，异烟肼、利福平、吡嗪酰胺是不可替代的一线抗结核药。随着化疗时间的推移，抗结核药物的不良反应也随之有增加，其中以肝脏毒性反应最为显著。但近年来对于抗结核药物肝脏毒性发生机理没有一个系统的报导，众说不一。期待具有抗结核作用且毒副作用低的药物。

虽然麻风现代麻风联合化疗(MDT)取得了很好的成绩，但由于对所用药物中有的出现了耐药，甚至对氨苯砜(DDS)和利福平(RFP)双重耐药，加之氯法齐明(B663)内服而皮肤染色、丙硫/乙硫的肝毒性等，所以抗麻风新药的筛选非常必要。筛选抗麻风药物最好是了解麻风杆菌(ML)的生理学及其代谢，寻找及合成干扰其代谢及抑制酶活性的化合物。我国中药资源丰富，近年来的研究表明其中不少有抗结核和抗感染的作用，且中药一般毒副作用较小，不但吸收好，传统制作方法亦较简单。这是其它国家所不具备的条件，具有一定的特色。

发明内容

本发明是为了至少部分解决上述问题而提出的。

本发明的一个目的在于提供一种三萜皂苷化合物在制备抗病原微生物药物中的应用，其中，所述三萜皂苷化合物为由以下化学通式I表示的三萜皂苷化合物：

化学通式I

在以上化学通式I中，R₁、R₂和R₃中的任意两个为甲基，且另一个为氢原子，R₄可为由五或六元单糖，或由所述五或六元单糖形成的二糖，或所述单糖或二糖的醛酸衍生物形成的糖苷基，R₅可为氢原子，或者可为由五或六元单糖，或由所述五或六元单糖形成的二糖，或所述单糖或二糖的醛酸衍生物形成的取代基。

其中，优选R₁、R₂都为甲基，且R₃为氢原子，或R₁和R₂中的任意一个为甲基、另一个为氢原子，且R₃为甲基。

R₄优选为选自由L-鼠李糖、D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷、D-葡萄糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-核糖和D-葡萄糖醛酸中的一种形成的糖苷基，最优选为L-鼠李糖或D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷形成的糖苷基；R₅优选为氢原子，或为选自由L-鼠李糖、D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷、D-葡萄糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-核糖和D-葡萄糖醛酸中的一种形成的取代基，最优选为氢原子、L-鼠李糖基或D-木糖基；当R₅为由上述糖或其衍生物形成的取代基时，R₄和R₅可相同或不同。

优选R₁、R₂都为甲基，且R₃为氢原子，R₄为L-鼠李糖，R₅为氢原子。

优选R₁、R₂都为甲基，且R₃为氢原子，R₄为L-鼠李糖，R₅为L-鼠李糖。

优选R₁、R₂都为甲基，且R₃为氢原子，R₄为D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷形成的糖苷基，R₅为氢原子。

优选R₁、R₂都为甲基，且R₃为氢原子，R₄为D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷形成的糖苷基，R₅为L-鼠李糖。

本发明的第二目的在于提供一种抗病原微生物药物组合物，包含有效量的上述化学通式I的三萜皂苷化合物，为液体制剂、注射剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、片剂、栓剂、膏剂、凝聚剂、膜剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释与控释剂、经皮给药系统、靶向制剂、粉剂、锭剂或扁囊剂。

所述抗病原微生物药物组合物的给药途径为口服、注射、直肠或胃肠外给药以及外用局部给药。

优选载体为淀粉，制成胶囊剂口服给药。

所述抗病原微生物药物组合物为抗结核病药物组合物或抗麻风病药物组合物。

根据本发明，提供了具有明显的抗病原微生物作用的药物。

具体实施方式

以下结合具体实施方式详细地说明本发明的各个方面。

化学通式I的三萜皂苷化合物

本发明提供由以下化学通式I表示的三萜皂苷化合物。

化学通式I

在以上化学通式I中，R₁、R₂和R₃中的任意两个为甲基，且另一个为氢原子。也就是说，以齐墩果酸结构(即：R₁、R₂都为甲基，且R₃为氢原子)或熊果酸结构(即：R₁和R₂中的任意一个为甲基、另一个为氢原子，且R₃为甲基)为主体结构。

R₄(即3位羟基上的取代基)可为由五或六元单糖，或由所述五或六元单糖形成的二糖，或所述单糖或二糖的醛酸衍生物形成的糖苷基。R₄优选为选自由L-鼠李糖、D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷、D-葡萄糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-核糖和D-葡萄糖醛酸中的一种形成的糖苷基，最优选为L-鼠李糖或D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷形成的糖苷基。

R₅(即28位羧基上的取代基)可为氢原子，或者可为由五或六元单糖，或由所述五或六元单糖形成的二糖，或所述单糖或二糖的醛酸衍生物形成的取代基。R₅优选为氢原子，或为选自由L-鼠李糖、D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷、D-葡萄糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-核糖和D-葡萄糖醛酸中的一种形成的取代基，最优选为氢原子、L-鼠李糖基或D-木糖基。当R₅为由上述糖或其衍生物形成的取代基时，R₄和R₅可相同或不同。

本发明的三萜皂苷化合物可以为以下化学式I-1～I-4所示的化合物。

化学式I-1：齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖

化学式I-2：齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖28-O-α-L-吡喃鼠李糖苷

化学式I-3：齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷

化合物I-4：齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷28-O-α-L-吡喃鼠李糖苷

本发明人惊奇地发现，上述三萜皂苷化合物虽然结构简单得多，但具有与天然三萜皂苷化合物几乎相同的药用效果，即可以用于治疗痴呆症，特别是老年痴呆症，阿尔茨海默病等；还可用于癌症的治疗。进一步的研究显示，本发明的化学通式I所示的三萜皂苷化合物在治疗高血压，由病原微生物引起的疾病(如结核病、麻风病等)，以及自身免疫性疾病(如移植排斥、支气管哮喘、HBV、肾病综合症、甲亢阴虚、系统性红斑狼疮等)方面也具有令人满意的效果。与本发明化合物相关的医药用途将在下面详细说明。

此外，本发明的化学通式I所示的三萜皂苷化合物与植物中存在的天然三萜皂苷化合物相比具有简单得多的结构，从而使其合成制药的产业化应用成为可能。以下将更具体地说明本发明三萜皂苷化合物的合成方法。

化学通式I的三萜皂苷化合物的合成方法

以上化学通式I所示的三萜皂苷化合物采用汇聚式半合成方法来制备。本文所称的“半合成方法”是指以可商购的齐墩果酸或熊果酸，以及所需的五或六元糖为起始原料进行的合成。本文所称的“汇聚式方法”是指分别对齐墩果酸或熊果酸，以及所要连接的糖进行非反应位点的活性基团保护，并对要进行反应的位点进行活性基团取代，然后进行糖苷化或酯化反应，反应完成后去保护以得到终产物。

以上化学通式I所示的三萜皂苷化合物的合成方法具体包括以下步骤：

步骤1：对所述五或六元糖或其衍生物的羟基进行保护；使三氯乙腈或硫醇与经羟基保护的糖或其衍生物的半缩醛羟基进行反应，得到化合物A备用；

步骤2：使三苯基氯甲烷与齐墩果酸或熊果酸进行反应，得到化合物B备用；

步骤3：使至少一种化合物A与化合物B进行反应，并用醇钠脱保护，得到R ₅ 为氢原子的化学通式I的化合物；或者

使至少一种化合物A与化合物B进行反应，并用乙酸脱保护后，再与步骤1中制备的至少一种化合物A进行反应，然后用甲醇钠脱保护，其中，所述至少一种化合物A可以相同或不同。

下面分别详细说明各个步骤。

步骤1：制备化合物A(糖或其衍生物的羟基保护及其半缩醛羟基的活化取代)

所述糖或其衍生物是准备要连接到上述化学通式I的3位羟基或28位羧基上以便形成R₄和/或R₅取代基。糖或其衍生物的种类如上所述，这里不再赘述。优选羟基保护基团为苄基和/或乙酰基。具体地，可采用苯甲酰氯(BzCl)或乙酸酐(Ac₂O)与糖或其衍生物进行反应，但不限于此。

对于L-鼠李糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-核糖或D-葡萄糖醛酸，优选采用苄基进行羟基保护，其优点在于产物的收率高，易于形成晶体。

对于D-葡萄糖或D-木糖，优选用乙酰基进行羟基保护，其优点在于产物的收率高，易于形成晶体。

接着，使三氯乙腈(Cl₃CCN)或硫醇(R’SH，R’为C₁-C₆的烷基)与经羟基保护的糖或其衍生物的半缩醛羟基进行反应，得到产物A，即三氯乙酰亚胺酯类化合物或硫醚类化合物。硫醇可以是例如乙硫醇(EtSH)、丙硫醇、异丙硫醇等。

优选，对于L-鼠李糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-核糖或D-葡萄糖醛酸，采用苄基进行羟基保护后用三氯乙腈与半缩醛羟基进行反应，便于合成反应时容易脱去该位置的保护，使后续反应能顺利进行。

优选，对于D-葡萄糖或D-木糖，用乙酰基进行羟基保护后用硫醇与半缩醛羟基进行反应，便于后续合成反应能顺利脱去保护而进行反应。

本步骤中可制备多种糖及其衍生物的化合物A，以便分别连接到主体化合物的3位和28位；或者在3位和28位中的至少一个位置上形成二糖。

步骤2：制备化合物B(齐墩果酸或熊果酸的羧基保护)

使三苯基氯甲烷与齐墩果酸或熊果酸进行反应，在28位羧基上形成三苯甲酯，从而得到化合物B。

步骤3：制备化学通式I的化合物

1、制备R ₅ 为氢原子的化合物(3位羟基的取代)

使化合物A与化合物B进行反应，用醇钠脱保护，得到R₅为氢原子的化学通式I的化合物。

此时，由于化合物A的羟基以及化合物B的羧基已经被非活性基团保护，因而只有化合物A的半缩醛羟基与化合物B的三位羟基进行反应，生成糖苷键。该反应在低温(约零度)、氮气保护的条件下得到偶联产物，实现了糖(或其衍生物)与羟基偶联的可行性。

如果需要在3位羟基处连接一个二糖，则在使化合物A与化合物B反应完成后不进行脱保护，将产物分离纯化后继续与另外的化合物A进行反应。反应完成后再用醇钠脱保护，从而得到3位羟基处连接一个二糖的化学通式I的化合物。

在制备化合物I-4时，上述反应以2位羟基的木糖硫苷与齐墩果酸偶联选择性得到β构型的产物，再连接另一个糖到木糖的2位，实现了1，2连接的二糖选择性的以β构型的方式与主体化合物3位羟基连接。从而，在反应中，使构象不稳定的α构型趋于更稳定的三个平伏键，一个直立键的β构型木糖合成物。

此外，脱保护采用醇钠，例如甲醇钠、乙醇钠等。因脱保护时反应条件温和，从而确保了中间产物酯基产物的稳定性。

2、制备R ₅ 为糖或其衍生物形成的取代基的化合物

使化合物A与化合物B进行反应，用乙酸脱保护，得到化合物C；再使化合物C与步骤1制得的化合物A(可与上步反应中的化合物A相同，也可不同)进一步反应，并用醇钠脱保护，得到R₅为糖或其衍生物的化学通式I的化合物。

化合物A与B进行反应后用乙酸可脱去主体结构28位羧基上的三苯甲基，而不会使糖羟基上的保护基脱去。这样可使产物，化合物C的28位羧基继续与其他化合物A进行反应。

如果在主体结构的3位和28位的任何一个位点要连接一个二糖，则可依据与前述相同的方式，用相同或不同的化合物A进行连续反应，之后再脱保护。相信本领域的普通技术人员在此前描述的教导下并结合下面的具体实施例，能够理解和实施连接二糖的制备方法，此处就不再赘述。

以下以齐墩果酸作为主体结构，根据合成实施例对本发明进行更具体的说明，但是本发明不被以下合成实施例所限定。本领域的普通技术人员应理解，在本发明的化学通式I的三萜皂苷化合物中，是以主体结构中3位羟基和28位羧基为反应位点，因此，下述合成实施例中的齐墩果酸均可被熊果酸所替代。

实施例1齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖的合成

以天然产物α-L-吡喃鼠李糖(化合物1，购自科博思生物科技有限公司)和齐墩果酸(化合物5，购自西安冠宇生物技术有限公司)作为起始原料。按照以下图示的反应路线进行合成。

具体来说将化合物1(α-L-吡喃鼠李糖)20g在冰浴下搅拌，取苯甲酰氯(BzCl)75ml溶于作为溶剂I的吡啶(Pyr)150ml中，缓慢滴入上述溶液中，室温下搅拌过夜，用薄层色谱检测反应完全后，减压浓缩，柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)纯化分离，得到化合物2(33.8g)。将化合物2溶于四氢呋喃(THF)和甲醇(四氢呋喃/甲醇＝1/3)的混合溶剂中，通入氨气，用薄层色谱检测反应完全后，减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)纯化分离，得到化合物3(17.6g)。

在氮气保护下将化合物3溶于作为溶剂II的二氯甲烷(DCM)(用氢化钙干燥过的二氯甲烷)100ml中，加入三氯乙腈26ml和1，8二氮杂双环[5，4，0]十一碳烯-7(DBU)2.6ml，室温搅拌过夜，然后减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)纯化分离，得到化合物4(14.6g)。

将化合物5(齐墩果酸，10g)加入四氢呋喃(油浴86℃去水的四氢呋喃55ml)中，加入1，8二氮杂双环[5，4，0]十一碳烯-7(DBU)5ml和三苯基氯甲烷(CCNCl₃)7.4g，在100℃搅拌回流，反应过夜，用薄层色谱检测反应完全后，减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝7/1)纯化分离，得到化合物6(7.5g)。

氮气保护下将化合物4(2.3g)和化合物6(3g)溶于作为溶剂II的二氯甲烷60ml中，冰盐浴下加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯(TMSOTf)100μl，搅拌反应1.5～2.0小时后，用薄层色谱检测反应完全后，加入三乙胺中和反应体系，加入二氯甲烷500ml稀释、用饱和的碳酸氢钠洗涤、分液漏斗分离二氯甲烷部分并用无水硫酸钠干燥并减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)纯化分离，得到化合物7(1.6g)。

将化合物7溶于甲醇钠的甲醇溶液中，室温下搅拌，反应5～10小时，薄层色谱检测反应完全后，以酸性离子交换树脂中和反应体系至中性，滤去树脂，减压浓缩，用淋洗液为去离子水的Bio-gel P₂凝胶色谱柱(美国Bio-Rad公司)纯化得到化合物8，即为目标化合物，齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖(0.82g，白色固体，产率为73％)。

用Bruker ARX-400在CDCl₃中测得¹H和¹³C核磁共振谱，化学位移以Me₄Si为内标，以ppm为单位表示。Mass在JEOL JMS-700质谱仪上检测。

[α]_D ²⁵+7.8°(c 1，H₂O)；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ0.72(s，6H，2CH₃)，0.87(s，9H，3CH₃)，1.09(s，3H，CH₃)，1.10(s，3H，CH₃)，2.74(dd，1H，J 3.9，10.8Hz，H-18of oleanolic acid)，3.01(dd，1H，J 3.5，9.7Hz，H-3 of oleanolicacid)，3.17(m，1H)，3.40(m，1H)，3.49(m，1H)，3.62(br s，1H)，4.52(d，1H)，4.58(s，1H)，4.70(m，2H)，5.16(br s，1H，H-12ofoleanolic acid)，12.05(s，1H).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)：δ178.7，143.9，121.6，103.0，87.6，72.2，70.8，70.8，68.6，54.7，47.1，45.8，45.5，41.4，40.9，38.8，38.6，37.9，36.4，33.4，32.9，32.4，32.2，30.5，28.0，27.3，25.7，25.0，23.5，23.0，22.7，17.9，17.8，16.9，16.5，15.2.Anal.Calcd for C₃₆H₅₈O₇：C，71.72；H，9.70；Found：C，71.90；H，9.82。

反应中所述的溶剂I为吡啶或者三乙胺；溶剂II为二氯甲烷、乙腈、甲苯或者它们的混合物。

实施例2齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖28-O-α-L-吡喃鼠李糖苷的合成

以实施例1中得到的化合物7和化合物4作为起始原料。按照以下图示的反应路线进行合成。

将实施例1中得到的化合物8(8g)，加入80％乙酸20ml，在70℃下搅拌2小时后，用薄层色谱检测反应完全后，减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝7/1)纯化分离，得到化合物9(6.4g)。

氮气保护下将化合物9(4g)和化合物4(2.3g)溶于作为溶剂II的二氯甲烷100ml中，室温搅拌下加入N-碘代丁二酰亚胺1.1g，降温至-40℃～-50℃，加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯100μl，-35℃～-45℃下搅拌1.5～2.0小时后，用薄层色谱检测反应完全后，加入三乙胺中和反应体系，然后加入二氯甲烷500ml稀释、用饱和的碳酸氢钠洗涤、分液漏斗分离二氯甲烷部分，用无水硫酸钠干燥并减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝7/1)纯化分离，得到化合物10(5.1g)。

将化合物10(2g)溶于甲醇钠的甲醇溶液中，室温下搅拌，室温反应5～10小时，薄层色谱检测反应完全，以酸性离子交换树脂中和反应体系至中性，滤去树脂，减压浓缩，用淋洗液为去离子水的Bio-gel P₂凝胶色谱柱(美国Bio-Rad公司)纯化得到化合物11，即为目标化合物，齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖28-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(1.6g，白色固体，产率为72％)。

用Bruker ARX-400在CDCl₃中测得¹H和¹³C核磁共振谱，化学位移以Me₄Si为内标，以ppm为单位表示。Mass在JEOL JMS-700质谱仪上检测。

[α]_D ²⁵+11°(c 1.5，H₂O)；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ0.79-1.91(m，49H)，2.90(dd，1H，J 4.1，12.8Hz，H-18of oleanolic acid)，3.09(dd，1H，J 4.2，11.3Hz，H-3of oleanolic acid)，3.35(t，1H，J 6.9，12.0Hz)，3.43(t，1H，J 9.5Hz)，3.61-3.72(m，4H)，3.75(br s，1H)，3.82(br s，1H)，4.72(d，1H，J 2.1Hz，H-1)，5.31(br s，1H，H-12of oleanolic acid)，5.92(d，1H，J 2.3Hz，H-1).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)：δ175.3，143.6，122.7，103.1，93.6，87.8，72.4，71.8，71.4，71.1，71.0，70.9，69.9，68.8，55.2，47.3，46.9，45.7，41.6，41.5，38.4，36.7，33.5，33.1，32.8，32.5，30.8，28.3，27.35，25.98，26.0，25.3，23.7，23.4，22.8，18.2，18.1，17.3，16.8，15.5.Anal.Calcd for C₄₂H₆₈O₁₁：C，67.35；H，9.15；Found：C，67.60；H，9.08。

实施例3齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷的合成

以天然产物β-D-吡喃木糖(化合物1，购自郑州天健生物技术有限公司)，β-D-葡萄糖(化合物9，购自北京格莱蒙特国际贸易有限公司)和齐墩果酸(化合物12，购自西安冠宇生物技术有限公司)作为起始原料。按照以下图示的反应路线进行合成。

具体来说将化合物1(β-D-吡喃木糖)20g溶于作为溶剂I的吡啶200ml中，加入乙酸酐81.6ml，室温下搅拌反应2～4小时，薄层色谱检测反应完全后，浓缩，柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)纯化分离，得到化合物2(38克)。将化合物2(38g)在氮气保护下溶于作为溶剂II的二氯甲烷200ml中，并加入溴化氢100ml，室温下搅拌反应1～2小时，薄层色谱检测表明反应完全后，减压浓缩，用柱色谱纯化分离(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)，得到化合物3(20克)。

将化合物3(20g)在氮气保护下加入2，6-二甲基吡啶(2，6-lutidine)10ml，乙硫醇(EtSH)8.8ml和硝基甲烷74.1ml，室温下搅拌反应过夜，薄层色谱检测表明反应完全，减压浓缩，用柱色谱纯化分离(石油醚/乙酸乙酯＝2/1)，得到化合物4(15.4g)。

将化合物4(15.4g)溶于作为溶剂III的甲醇中，室温下搅拌，加入甲醇钠的甲醇溶液，使pH值在9到11之间，室温反应2～4小时，薄层色谱检测反应完全后，浓缩，用柱色谱纯化分离(石油醚/乙酸乙酯＝2/1)，得到油状化合物5(10.2g)，将化合物5(10.2g)溶于作为溶剂I的吡啶150ml中，冰水浴下搅拌，取苯甲酰氯12.1ml溶于作为溶剂I的吡啶12ml中，缓慢滴入上述溶液中，室温下搅拌3～6小时，薄层色谱检测表明反应完全后，减压浓缩，用柱色谱纯化分离(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)，得到化合物6(15.5g)。

在氮气保护下将化合物6(15.5g)溶于作为溶剂II的二氯甲烷100ml中，加入氯化锌(1M/L)5ml，冰水浴下搅拌3～6小时后减压浓缩，用柱色谱纯化分离(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)，得到化合物7(15g)。

将化合物7(15g)溶于作为溶剂II的二氯甲烷与作为溶剂IV的甲醇的混合液中(1∶1，150ml)，冰水浴下加入乙酰氯20ml，1小时后撤冰浴，室温下搅拌3～6小时，薄层色谱检测反应完全后，减压浓缩，用柱色谱纯化分离(石油醚/乙酸乙酯＝6/1)，得到化合物8(12g)。

将化合物9(β-D-葡萄糖)25g加入无水乙酸钠(22.5g)和乙酸酐(100ml)并在150℃油浴锅中搅拌，回流，反应半小时后，用薄层色谱检测反应完全后，萃取浓缩，重结晶得到化合物10(35g)，取10g溶于50ml二氯甲烷，在冰水浴下加入乙硫醇2.85ml，三氟化硼乙醚9.7ml，搅拌反应1小时，用薄层色谱检测反应完全后，萃取浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝2/1)纯化分离，得到化合物11(7g)。

将化合物12(齐墩果酸，10g)加入四氢呋喃(油浴86℃去水的四氢呋喃55ml)中，加入1，8二氮杂双环[5，4，0]十一碳烯-7(DBU)5ml和三苯基氯甲烷7.4g，在100℃搅拌回流，反应过夜，用薄层色谱检测反应完全后，减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝7/1)纯化分离，得到化合物13(7.5g)。

氮气保护下将化合物8(4g)和化合物13(5.8g)溶于作为溶剂II的二氯甲烷100ml，室温搅拌下加入N-碘代丁二酰亚胺(NIS)2.2g，降温至-40℃～-50℃，加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯200μl，-35℃～-45℃下搅拌1.5～2.0小时后，用薄层色谱检测反应完全后，加入三乙胺中和反应体系，然后加入二氯甲烷500ml稀释、用饱和的碳酸氢钠洗涤、分液漏斗分离二氯甲烷部分，用无水硫酸钠干燥并减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝7/1)纯化分离，得到化合物14(7.1g)。

氮气保护下将化合物14(4.4g)和化合物11(2g)溶于作为溶剂II的二氯甲烷50ml，室温搅拌下加入N-碘代丁二酰亚胺1.1g，降温至-40℃～-50℃，加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯100μl，-35℃～-45℃下搅拌1.5～2.0小时后，用薄层色谱检测反应完全后，加入三乙胺中和反应体系，然后加入二氯甲烷500ml稀释、用饱和的碳酸氢钠洗涤、分液漏斗分离二氯甲烷部分，用无水硫酸钠干燥并减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝7/1)纯化分离，得到化合物15(3.6g)。

将化合物15(3.6g)溶于甲醇钠的甲醇溶液中，室温下搅拌，室温反应5～10小时，薄层色谱检测反应完全，以酸性离子交换树脂中和反应体系至中性，滤去树脂，减压浓缩，用淋洗液为去离子水的Bio-gel P₂凝胶色谱柱(美国Bio-Rad公司)纯化得到化合物16，即为目标化合物，齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷(1.2g，白色固体，产率为72％)。

用Bruker ARX-400在CDCl₃中测得¹H和¹³C核磁共振谱，化学位移以Me₄Si为内标，以ppm为单位表示。Mass在JEOL JMS-700质谱仪上检测。

[α]_D ²⁵+7.2°(c 1，H₂O)；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ0.35，0.82，0.88，0.90，0.91，1.11，1.29(7s，7×3H，7CH₃)，2.83(dd，1H，J 4.1，13.0Hz，H-18ofoleanolic acid)，3.25(dd，1H，J 4.4，11.6Hz，H-3of oleanolic acid)，3.66-4.87(m，28H)，4.82(d，1H，J 7.3Hz，H-1of Xyl)，4.98(d，1H，J 7.8Hz，H-1ofGlc)，5.20-5.25(m，12H)，5.29(t，1H，J 3.2，H-12of oleanolic acid).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)：δ176.4，144.0，122.8，104.8，101.8，95.6，88.4，79.5，78.6，78.0，77.1，76.4，75.3，74.0，72.7，72.3，70.7，69.7，69.1，66.9，56.0，48.0，46.9，46.1，42.0，41.6，39.8，36.9，33.9，33.0，32.4，30.7，27.9，28.2，26.0，23.7，23.6，23.3，17.4，17.0，15.6.Anal.Calcd for C₄₁H₆₆O₁₂：C，65.57；H，8.86；Found：C，65.57；H，8.86。

反应中所述的溶剂I为吡啶或者三乙胺；溶剂II为二氯甲烷、乙腈、甲苯或者它们的混合物；溶剂III为甲醇或者乙醇。

实施例4齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷28-O-α-L-吡喃鼠李糖苷的合成

以实施例3中得到的化合物15和化合物8作为起始原料。按照以下图示的反应路线进行合成。

将实施例3中得到的化合物15(4g)，加入80％乙酸20ml，在70℃下搅拌2小时后，用薄层色谱检测反应完全后，减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝7/1)纯化分离，得到化合物17(3.1g)。

氮气保护下将化合物17(2g)和化合物8(0.9g)溶于作为溶剂II的二氯甲烷50ml，室温搅拌下加入N-碘代丁二酰亚胺0.7g，降温至-40℃～-50℃，加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯76μl，-35℃～-45℃下搅拌1.5～2.0小时后，用薄层色谱检测反应完全后，加入三乙胺中和反应体系，然后加入二氯甲烷500ml稀释、用饱和的碳酸氢钠洗涤、分液漏斗分离二氯甲烷部分，用无水硫酸钠干燥并减压浓缩，用柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝7/1)纯化分离，得到化合物18(1.9g)。

将化合物18(1.9g)溶于甲醇钠的甲醇溶液中，室温下搅拌，室温反应5～10小时，薄层色谱检测反应完全，以酸性离子交换树脂中和反应体系至中性，滤去树脂，减压浓缩，用淋洗液为去离子水的Bio-gel P₂凝胶色谱柱(美国Bio-Rad公司)纯化得到化合物19，即为目标化合物，齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷28-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(0.9g，白色固体，产率为72％)。

用Bruker ARX-400在CDCl₃中测得¹H和¹³C核磁共振谱，化学位移以Me₄Si为内标，以ppm为单位表示。Mass在JEOL JMS-700质谱仪上检测。

[α]_D ²⁵+6°(c 1.2，H₂O)；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ0.38，0.89，0.91，0.93，0.98，1.13，1.26，1.31(8s，8×3H，8CH₃)，2.89(dd，1H，J 3.8.，11.2Hz，H-18of oleanolic acid)，3.34(dd，1H，J 4.7，11.7Hz，H-3of oleanolic acid)，3.57-4.89(m，32H)，4.88(d，1H，J 7.5Hz，H-1of Xyl)，5.11(d，1H，J 7.8Hz，H-1ofGlc)，5.26-5.29(m，14H)，5.32(t，1H，J 3.2，H-12of oleanolic acid)，6.53(br s1H，H-1of Rha).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)：δ177.8，172.3，170.8，162.5，158.3，151.6，149.3，145.2，143.1，139.6，133.8，128.7，125.3，122，9，114.3，111.2，108.3，102.1，98.6，92.3，86.7，79.4，73.5，69.3，62.1，58.8，52.2，48.3，43.2，40.5，38.6，35.4，33.8，31.6，29.7，26.5，25.7，23.6，22.4，21.3，20.1，19.8，18.7，16.4，15.8，15.2，14.5.Anal.Calcd for C₄₇H₇₆O₁₆：C，62.93；H，8.54；Found：C，63.11；H，8.66。

化学通式I的三萜皂苷化合物在制备抗病原性微生物的药物中的用途

本发明的化学通式I的三萜皂苷化合物具有明显的抗病原微生物作用。还可以将有效量的本发明的化学通式I的三萜皂苷化合物与药学领域常规的药物载体混合制成液体制剂、注射剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、片剂、栓剂、膏剂、凝聚剂、膜剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释与控释剂、经皮给药系统、靶向制剂、粉剂、锭剂、扁囊剂等，所述药物载体例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等；另外还可以在药物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。可以通过口服、注射、直肠或胃肠外给药以及外用局部给药的方式施用于需要这种治疗的患者。在本申请中优选载体为淀粉，剂型为胶囊，口服给药。

实施例5三萜皂苷的抗结核实验研究

1受试药物

三萜皂苷1(实施例1中得到的齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖)，三萜皂苷2(实施例3中得到的齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷)90％。

2方法

体内抗结核实验研究：

(1)建立小鼠结核病模型：

感染菌种与菌量：首先测定结核分枝杆菌H37Rv标准株感染ICR小鼠(ICR小鼠，雌雄各半，体重：18～20g。由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，许可证号均为：SCXK(鄂)2004-0007。)后半数死亡时间(timeof fifty percent suivival，ST₅₀)为15天(d)，选用该菌株感染ICR小鼠。每只小鼠尾静脉注射1mg菌量。

感染途径：取改良罗氏培养基上生长良好的结核分枝杆菌H37Rv标准株用磨菌器制备成细菌悬液，再用含0.05％吐温80的灭菌生理盐水稀释至所需浓度5mg/ml，每只小鼠尾静脉注射0.2ml(1mg菌量，约10⁷CFU)。

(2)动物分组及用药：

方法：取小鼠75只随机分为5组，每组15只雌雄各半；三萜皂苷1组(200mg/kg体重)，三萜皂苷2组(150mg/kg体重)，异烟肼组(100mg/kg体重)，于建立模型当日灌胃给药0.5ml，模型空白对照组和正常对照组给予等量生理盐水，每日一次，连续4周，观察动物一般情况，死亡日期及解剖观察，计算各组动物的半数死亡时间(ST50)，因药物疗效好而动物死亡未达到半数的用药组用存活率表示。

3结果

体内抗结核实验研究：实验结果如表1所示，从表1中可以看出，三萜皂苷组小鼠半数死亡时间ST50(21d)与模型空白对照组小鼠ST50(15d)相比明显延长；三萜皂苷组、异烟肼组小鼠存活率与模型空白对照组小鼠存活率相比均具有显着差异(P＜0.01)；发病死亡小鼠取病变肺组织病理切片检查及抗酸染色均观察到典型结核结节及抗酸杆菌；以上说明三萜皂苷显示出良好的体内抗结核作用，而低剂量抗结核作用更明显。

表1各组小鼠半数死亡时间(d)及存活率

与模型空白组比较，*P＜0.01。

实施例6三萜皂苷在正常小鼠体内的抗麻风菌活性

1受试药物

三萜皂苷1(实施例1中得到的齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖)，三萜皂苷2(实施例3中得到的齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷)90％。

2方法

在无菌条件下，剥离传代裸鼠(湖北省实验动物研究中心(合格证号：SCXK(鄂)2003-0005))的足垫。匀浆制取麻风菌悬液，经适当低速离心后，取上清液用大头针法对菌悬液计数菌量。稀释后在每只小鼠双后足垫接种。0.03ml菌悬液(含1.0×10⁴条麻风菌)，然后将小鼠分为对照组(喂普通饲料)、三萜皂苷1组以200mg/kg每周管饲5次、三萜皂苷2组以150mg/kg每周管饲5次和利福平组以10mg/kg每周管饲1次。每组动物除对照组20只外，其余均为12只。

小鼠接种麻风菌81天时按方案管饲给药，每月根据小鼠体重变化调整给药量，至对照组小鼠足垫内麻风菌繁殖到＞10^5.0条/足垫时，各治疗组停药，继续喂普通饲料(给药60天)。停药时及以后定期分别处死各组2-3只小鼠，检查各组小鼠足垫中麻风菌菌量。比较治疗组和对照组小鼠足垫内麻风菌达到10^5.5条/足垫的时间，其差值为治疗组麻风菌推迟生长时间。如推迟生长时间大大超过投药时间，则认为该药有不完全杀菌活性。

3结果

对照组和各治疗组小鼠足垫内麻风菌生长情况见表2。停药时检查，各治疗组小鼠足垫内均未找到麻风菌，而对照组小鼠足垫内麻风菌出现繁殖。第2次检查(停药35天)，各治疗组小鼠足垫内均未找到麻风菌。在第3次足垫检查(停药65天)三萜皂苷组出现麻风菌生长，但菌量偏低，以后渐繁殖到＞10⁵条/足垫。通过计算，推迟麻风菌生长时间156天。提示该浓度三萜皂苷在每周管饲5次时有不完全杀菌活性，利福平10mg/kg每周管饲1次时，直到实验结束，小鼠足垫内均未检出麻风菌，显示该药强大的杀菌活性。

表2对照组和各治疗组小鼠足垫内麻风菌生长情况

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (3)

1.一种三萜皂苷化合物在制备抗病原微生物药物中的应用，其中，所述三萜皂苷化合物为由以下化学通式I表示的三萜皂苷化合物：

化学通式I

在以上化学通式I中：R₁和R₂都为甲基，且R₃为氢原子；R₄为由五或六元单糖，或由所述五或六元单糖形成的二糖形成的糖苷基；R₅为氢原子，或者为由五或六元单糖，或由所述五或六元单糖形成的二糖形成的糖苷基，

所述抗病原微生物为抗结核病。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，R₄为选自由L-鼠李糖、D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷、D-葡萄糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-木糖和D-核糖中的一种形成的糖苷基；R₅为氢原子，或为选自由L-鼠李糖、D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷、D-葡萄糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-木糖和D-核糖中的一种形成的取代基；当R₅为由上述糖形成的取代基时，R₄和R₅相同或不同。

3.根据权利要求1所述的应用，其中，R₁、R₂都为甲基，且R₃为氢原子，R₄为L-鼠李糖，R₅为氢原子；R₁、R₂都为甲基，且R₃为氢原子，R₄为L-鼠李糖，R₅为L-鼠李糖；R₁、R₂都为甲基，且R₃为氢原子，R₄为D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷形成的糖苷基，R₅为氢原子；或者R₁、R₂都为甲基，且R₃为氢原子，R₄为D-葡萄糖-(1→2)-D-木糖苷形成的糖苷基，R₅为L-鼠李糖。