CN102066574A - 利用非天然核苷酸扩增dna的过程 - Google Patents

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Abstract

这个公开的发明讲述通过模板和引物与DNA聚合酶和非标准核苷酸的三磷酸的相互作用来扩增寡核苷酸的过程，这里的非标准核苷酸可以形成碱基配对并且具有标准的沃森-克里克几何结构，但是，非标准核苷酸碱基对之间的氢键模式不同于标准的碱基对A:T和G:C之间的氢键模式。因此，本发明涉及核苷酸类似物及其衍生物，当它们被嵌入到DNA和RNA中时，增加可复制的核苷酸数目超出天然DNA和RNA中的四种核苷酸。本发明还涉及到聚合酶将非标准核苷酸的三磷酸类似物和衍生物嵌入寡核苷酸中，更具体地说，聚合酶和非标准核苷酸的三磷酸支持聚合酶链反应(PCR)，包括PCR产品中含有多个非标准核苷酸单位。本发明中提供的例子表明这一过程使用6-氨基-5-硝基-3-(1′-β-D-2′-脱氧呋喃型)-2(1氢)-吡啶酮来实施非标准“小碱基”的给-给-受(pyDDA)氢键模式，和2-氨基-8-(1′-β-D-2′-脱氧呋喃型)-咪唑[1，2-α]-1，3，5-三嗪-4(8氢)-烷来实施“大碱基”的受-受-给(puAAD)氢键模式。

Description

利用非天然核苷酸扩增DNA的过程
相关应用的相关文献：这个应用于2009年6月17日向美国临时专利局要求了优先日期61/132225。
背景技术：
1.创新的领域
此发明应用于聚合酶链反应(PCR)复制寡核苷酸(oligonucleotides)的程序中，在这些寡核苷酸(oligonucleotides)中嵌入了核苷酸类似物(“非天然的核苷酸”)，这些非天然的核苷酸形成含有特殊氢键的碱基对，这些氢键模式不同于天然核苷酸(A，T，G和C)中的氢键。本发明同时涉及了一下几个方面，寡核苷酸(oligonucleotides)中嵌入了多个非天然的核苷酸，这些非天然的核苷酸处于相邻和非相邻的位置，将这些由非天然的核苷酸形成的寡核苷酸(oligonucleotides)作为引物应用于巢式PCR(Nested PCR)中。
2.创新过程说明
天然的寡核苷酸与其互补的寡核苷酸结合是根据著名的碱基配对规则(沃森和克里克碱基配对规则)，在这个规则中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)配对(或尿嘧啶，在RNA中为U)，同时鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。在这个创新过程说明中，“DNA”，“寡核苷酸(oligonucleotides)”，或“核酸(nucleicacid)”被理解为包括DNA和RNA，以及其他的衍生物如糖环被修饰的衍生物，例如2’-氧-甲基和2’，3’-二脱氧核苷(2’，3’-dideoxynucleoside)的衍生物，其中碱基有一个附属物，而这些核酸及其类似物是非线性拓扑结构，包括树枝状，梳状结构，纳米结构，并进行附属物或类似物标记(如荧光，管能集团，或有键合理的，如生物素)。此外，在此发明中的“聚合酶”包括所有的DNA聚合酶，所有的RNA聚合酶和所有的反转录酶。
这些配对规则致使寡核苷酸与其互补的寡核苷酸能够特异性地杂交，这一特性使寡核苷酸作为探针广泛的应用于实验室和医学诊断中，同时寡核苷酸作为遗传信息指导蛋白质的合成，在其他领域也有广泛的应用。这种配对也被使用在其他的方面，例如(但不局限于)，捕捉寡核苷酸到珠子上、基因芯片上(arrays)，和其他的固相载体上，让核酸能够形成发夹结构，分子信标，催化剂，并且支持其他的功能，如荧光剂，猝灭剂，结合剂/捕获剂，和催化剂，并作为复杂的结构，包括树枝状和纳米结构，支架结构用于引导化学反应。
此外，碱基配对规则也是酶合成寡核苷酸的基础。在这里，酶利用核苷三磷酸为建筑块以一条寡核苷酸为模板，形成一个具有互补序列的寡核苷酸。这是生命系统复制的基础，也是酶合成和核苷酸复制的基础，如基于DNA和RNA聚合酶的聚合酶链反应(PCR)，以及涉及酶的合成，链接，剪切，固定化和释放等等。
沃森--克里克配对规则可以理解为两种产品的互补性规则：(1)大小的互补性配对(一个大的嘌呤配对一个小的嘧啶)和(2)氢键互补配对(氢键给于体配对氢键受体)。然而，美国专利5432272，5965364，6001983，6037120，6140496，6627456，和6617106中提到，依据沃森--克里克配对规则可以形成多达12个碱基并组成6个相互独立的碱基对。其中，四个天然的碱基形成两对“标准”的天然碱基对，其他八个非天然的碱基形成四对“非天然的”碱基对，并且可能成为一个“人工扩展的基因信息系统”(″artificially expanded geneticinformation system″(AEGIS))的一部分。
为了系统化的命名氢键排列模式，小的核苷酸(pyrine)的氢键模式依照其英文的前缀被指定为“py”。在前缀之后是从碱基的大沟到小沟，氢键受体为(A)、供体为(D)。因此，无论是胸腺嘧啶(Thymine)和尿嘧啶(Uracil)均采用了标准的氢键模式pyADA。标准的碱基胞嘧啶(Cytosine)采用了标准氢键模式pyDAA。大的核苷酸(purine)的氢键模式依照其英文的前缀被指定为“pu”。同样地，在前缀之后是从碱基的大沟到小沟，氢键受体为(A)、供体为(D)。因此，标准的碱基腺嘌呤(Adenine)和鸟嘌呤(guanine)分别采用了标准的氢键模式puDA-和puADD。
此处的中心思想是氢键模式不同于采用该氢键模式的有机分子。因此，鸟苷(Guanos ine)采用puADD氢键模式。同样地，还有7-位脱氮鸟苷(7-deazaguanosine)，3，7-位脱氮鸟苷(3，7-dideazaguanosine)，和许多其他嘌呤和嘌呤类似物，包括那些含有功能性支链的类似物，如生物素，荧光集团，并猝灭集团。至于选择那一种有机分子来实现特定的非天然氢键模式取决于该氢键模式的各种具体的应用。
美国专利5432272和其后续的专利曾经涵盖了具有pyDDA氢键模式的非天然的碱基。但是，在以后的应用中遇到了一些问题，包括碱基的异构化[Voe96a，b]，氧化[Von95]，和分解。因此，Benner博士发明了一种新的具有pyDDA氢键模式的非天然核苷
“6-amino-5-nitro-3-(1’-beta-D-2’-deoxyribofuranosyl)-2(1H)-pyridone(dZ)”。5-硝基的引入可以有效地防止富电子杂环的氧化和异构化。当pyDDA(dZ)与puAAD(dP)形成一种新的碱基对，并用这种新的碱基对(dZ:dP)来替换天然双螺旋DNA中的dC:dG碱基对后，所得的非天然双螺旋DNA比天然的DNA有更高的热稳定性[Yan06]。这一发明已经被美国专利保护(US PatentApplication 11/372400)，该专利申请的内容已经被公布发表[Hut03]。
虽然含有dZ:dP碱基对的非天然双螺旋DNA比天然的DNA有更高的热稳定性，但是，这对碱基能否作为聚合酶的底物还不清楚。因为，聚合酶有其已知的特异性[Hor95]，这就意味着要确定一个特定的非标准氢键模式能否被聚合酶接受，必须经过试验来确定。
因此，有必要通过实验表明该聚合酶可以接纳dZ和dP。在专利申请的优先日期前的一年内，我们通过实验证明含有单个dZ和dP的寡核苷酸能够被DNA聚合酶复制，结果请见文章[Yan07]。但是，在该文章中的实验条件下[Yan07]，dZ和dP经过若干轮PCR被聚合酶Taq和Deep Vent(exo-)复制后，部分dZ:dP被dC:dG所替换。这种替换的机制可能是通过dZ:dG和dC:dP的错配。
技术领域
本发明涉及PCR扩增寡核苷酸的进程(图1)，被扩增的寡核苷酸序列中含有一个或多个非相邻的非天然核苷酸，该扩增是在巢式PCR中进行的(nested PCR)[Bro97]。
附图简要说明
图1、一组含有不同氢键模式的杂环化合物。在本专利中所使用的杂环化合物被标记为dZ和dP；
图2、巢式PCR的示意图，人工扩展基因信息系统(AEGIS)中的核苷与天然的核苷被嵌入PCR的引物中(primers)形成嵌合式的PCR引物。该嵌合式的PCR引物包含两部分，标示部分(该部分由非天然的核苷组成)和特异的底物结合部分(该部分由天然的核苷组成)，用低浓度的嵌合式的PCR引物启动PCR扩增，可以显著地减少PCR中的非特异性扩增。当嵌合式的引物在前几轮PCR中被耗尽后，后续的PCR扩增将通过高浓度的含有非天然核苷的外部标记引物进行；
图3、凝胶电泳放射自显影图展示举例1中的PCR产物。左手边：天然核苷组成的引物PCR扩增后所得的产物。右手边：含有非天然核苷(dP)的引物PCR扩增后所得的产物；
图4、凝胶电泳放射自显影图展示举例2中的巢式PCR产物；
图5、凝胶电泳放射自显影图展示举例3中，以含有相邻dZs的寡核苷酸为模版的引物延伸的产物；
图6、凝胶电泳放射自显影图展示举例4中的引物延伸的产物；
图7、凝胶电泳放射自显影图展示举例5中的PCR产物；
图8、凝胶电泳放射自显影图展示两种巢式PCR的产物。由非天然核苷酸(AEGIS)组成的引物所得的PCR产物(右手边)比天然核苷酸组成的引物所得的PCR产物(左手边)更清晰。
发明内容
化合物6-氨基-5-硝基-3-(1’-β-D-2’-脱氧呋喃型)-2(1氢)-吡啶酮(dZ)的phosphoramidite衍生物，以及三聚磷酸和硫代三聚磷酸的合成已经被申报在美国专利11.372400里了[Hut03]。与dZ配对的碱基dP(2-氨基-8-(1’-β-D-2’-脱氧呋喃型)-咪唑[1，2-α]-1，3，5-三嗪-4(8氢)-烷(氢键模式puAAD)及其衍生物的合成在[Hut03][Yan06]已经报道。虽然任何一种图1中所示的核苷酸，均可能用在PCR的引物中，但是，在本发明中dZ和dP是其中的首选。
以本专利申请的优先权日期起不到一年之前，我们发表了PCR扩增包含一个dP或一个dZ的寡核苷酸的方法[Yan07]。然而，先前的技术表明，经过多重PCR循环之后，PCR产物中的dP和dZ被部分丢失了。本发明的核心是首次将非天然的核苷酸dP和(或)dZ嵌入到PCR的引物中，形成“嵌合式的引物”(chimericprimers)。嵌合式的引物包含两部分，5-末端部分和3-末端部分。5-末端部分由含有dP和(或)dZ的非天然寡核苷酸组成，该部分用于标记3-末端部分且不接触寡核苷酸的目标底物。3-末端部分是由天然的寡核苷酸组成，该部分核苷酸的序列与被扩增的目标底物的序列互补。以嵌合式的引物进行PCR扩增可以采用嵌套的方式[Bro97]，其中任何非天然核苷酸的损失将会在后续的PCR循环中得以恢复。在巢式PCR的前几轮扩增中，嵌合式的引物会被消耗掉，后续的PCR扩增将由含有非天然核苷酸的“外部引物”(external primers)来继续。
在本专利申请的优先权日期之前的所有文献报道中，没有任何的文献曾经报道过或者预测过，聚合酶能够扩增含有多个非天然核苷酸的寡核苷酸[Hor95]。本专利中的第一个关键的发现是，成功地PCR扩增包含多个dP和多个dZ的寡核苷酸，这一发现在本申请的优先权日期以前没有任何的文献报道。此外，我们在此首次发现，某些DNA聚合酶能够复制多个相邻的dZ和邻近的dP。第三个发现是，将dP和(或)dZ嵌入“嵌合式的引物”和“外部引物”中，并用这些引物进行巢式PCR，可以提到PCR的专一性、得到更干净的PCR产物。这一结果超出了我们和本研究领域的预测。鉴于以上的结果，我们在此声明，用含有dZ和dP的引物进行PCR的技术是一种有用的，可以申请专利的发明。
具体实施方式
实例1、含有dZ和dP的巢式PCR
这个例子表明，含有dZ和dP的嵌合式引物能够进行PCR扩增。以下的寡核苷酸的合成是通过常规的phosphoramidite的方法。这里列出来两个反方向的嵌合式引物(R-36-Std和R-36-Nest)，他们的碱基序列大致上相同，唯一不同的是，在R-36-Nest的5-末端，不与模板互补的序列中的一些G被P所替代：
R-36-Std：3’-CCATGGTAGCTATGCGCAACGCTAGCGAGGAAGGAC-5’-P32序列编号1
R-36-Nest：3’-CCATGGTAGCTATGCGCAACPCTAPCGAPGAAPGAC-5’-P32序列编号2
两个正方向的嵌合式引物(F-34-Std和F-34-Nest)：他们之间的差别与两个反方向嵌合式引物的差别类似。
5’-CTAPGACPACGPACTPCCCATGGGAGACCGCGGT-3’(F-34-Nest)序列编号5
5’-CTAGGACGACGGACTGCCCATGGGAGACCGCGGT-3’(F-34-Std)序列编号6一对互补的模板序列：
Temp-R-47：5’-CCATGGGAGACCGCGGTGGGCCCGGCCGGGTACCATCGATACGCGTT-3’序列编号3
Temp-F-47：3’-GGTACCCTCTGGCGCCACCCGGGCCGGCCCATGGTAGCTATGCGCAA-5’序列编号4
嵌合式引物中下划线部分(3-末端)的序列是与模板的序列互补。非下划线部分(5-末端)是标记部分，其序列中包含非天然的核苷酸。在另外的实验中，嵌合式和非嵌合式的引物被用于下列的条件中：
Figure BPA00001278673400061
凝胶电泳鉴定PCR的产物(图3)。这些结果表明，含多个dP的嵌合式引物能够进行PCR检测工作。
实例2、
这个实验证明了使用dZ和dP在外部引物中(external primers)进行巢式PCR的可行性[Bro97]，如图2所示。下面的寡核苷酸的合成均按照phosphoramidite的方法来制备。这些寡核苷酸被分别用于以下三组巢式PCR中。
在第一种巢式PCR中，只使用外部引物，其中一个正向引物包含dP(F-17-Nest)，另一个不包含(F-17-Std)：
32P-5’-CTAPGACPACGPACTPC-3’F-17-Nest序列编号7
32P-5’-CTAGGACGACGGACTGC-3’F-17-Std序列编号8
同时，两个反向引物中，一个包含dP(R-17-Nest)，另一个不包含(R-17-Std)：
R-17-Std：3’-CGCTAGCGAGGAAGGAC-5’序列编号9
R-17-Nest：3’-CPCTAPCGAPGAAPGAC-5’序列编号10
在PCR中被扩增的模板(Temp-R-81)是一个含有81个碱基的模板，其中间部分的序列为Temp-R-47：
Temp-R-81：序列编号9
5’-CTAGGACGACGGACTGCCCATGGGAGACCGCGGTGGGCCCGGCCGGGTACCATCGATACGCGTTGCGATCGCTCCTTCCTG-3’
以上这些寡核苷酸被用在实验A中，操作程序如下：
Figure BPA00001278673400071
Figure BPA00001278673400081
如图4所示(Figure4，A-Std Lane)，含有天然核苷酸的引物(F-17-Std和R-17-Std)扩增模板(Temp-R-81)后，在凝胶电泳中产生了预期的PCR产物。与之相反，含有dP的引物(F-17-Nest和R-17-Nest)不能扩增模板(Temp-R-81)，如图4(Figure4，A-AEGIS)所示。
在另一组巢式PCR实验中，其实验操作程序如下：
Figure BPA00001278673400082
Figure BPA00001278673400091
备注(Note)：1 x standard Taq Reaction Buffer(10mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl2，pH 8.3at 25℃).
在实验B中，采用F-34-Std和R-36-Std作为嵌合式引物，当用不含dP的外部引物进行PCR扩增时，得到了预期的扩增产物。相反地，以含有dP的寡核苷酸作为外部引物，则得不到扩增产物。这些结果分别如图4中的B-Std和B-AEGIS所示。同样地，在实验C中，F-34-Nest和R-36-Nest被作为嵌合式引物，当用不含dP的天然寡核苷酸作为外部引物进行PCR扩增时，得不到预期的扩增产物。然而，以含有dP的寡核苷酸作为外部引物时，则可以得到扩增产物。这些结果分别如图4中的C-Std和C-AEGIS所示。这些实验结果表明，DNA聚合酶能够以含有dZ和dP的非天然寡核苷酸为引物进行PCR扩增，该PCR中含有六种核苷(dA，dT，dG，dC，dZ，和dP)。上述结果同时证明含有dZ和dP的PCR扩增与常规的PCR有正交性的关系。
实例3、以含有相邻dZ的寡核苷酸为模板进行引物延伸
众所周知，聚合酶有很强的特异性和强烈的邻位碱基影响效应[Hor95]，因此，聚合酶能否PCR扩增含有多个相邻的dZ和dP的非天然寡核苷酸还不清楚。为了进一步探索这个问题，我们进行了下面的实验，以含有多个相邻dZ的寡核苷酸为模板，筛选合适的聚合酶能够高效、专一的将dPTP嵌入模板中的dZ。实验条件如下：[dATP]＝[dCTP]＝[dTTP]＝100microM)，dGTP(5microM to 100microM)，or dPTP(5microM to 100microM)at pH7.0 or 7.5。
引物(R-19-S)和模板(R-36-Nest-6Z)分别如下：
R-19-S：5’-GGTACCATCGATACGCGTT-3’序列编号11
R-36-Nest-6Z：3’-CCATGGTAGCTATGCGCAAGTZZTTZZTCGZTAGZG-5’序列编号12
5`-端放射性标记(32P)的引物R-19-S(2pmole，终浓度50nM)与模板R-36-Nest-6Z(3pmole，终浓度75nM)的混合溶液被加热到95℃并持续5分钟，然后慢慢的将温度降到室温。dATP，dTTP，dCTP(4nmole，终浓度100microM)和dGTP(终浓度10microM)，或者dPTP(终浓度10microM)被加入到上述的溶液中。反应混合物被加热到72℃并持续30秒钟，紧接着加入被筛选的聚合酶和其相应的反应缓冲液，反应的终体积为40微升。4分钟后，取出10微升的反应溶液与10微升的淬灭剂(PAGE loading/quench buffer，10mM EDTA in formamide)混合。以上的样品用14％PAGE(7M urea)凝胶电泳进行分离，所得的凝胶用MolecularImager软件进行分析。以上的实验结果显示(图示5)Vent和Deep Vent聚合酶比Taq聚合酶效果更好。这可能是由于Vent和Deep Vent具有核酸外切酶的活性。
实例4、以含有相邻dP的寡核苷酸为模板，测试dZTP与dP的配对
为了比较不同的DNA聚合酶(Taq，Vent(exo+)，and DV(exo+))将dZTP与dP配对的效率和保真性。5`-端放射性标记(32P)的引物T7-Y-RS-S16(0.2pmole的放射性标记引物加上4pmole的非标记引物，终浓度70nM)与模板T7-PP-Temp(6pmole，终浓度100nM)的混合溶液被加热到95℃并持续5分钟，然后慢慢的将温度降到室温。dATP，dTTP，dCTP，dGTP(每种核苷酸的终浓度0.1mM)和dZTP(终浓度0.1mM)，被加入到上述的溶液中。反应混合物被降温到4℃并保持60秒钟后，接下来加入被筛选的聚合酶(Taq(2.5units)，Vent(exo+，2units)，or Deep Vent(exo+，2units)和其相应的反应缓冲液，反应的终体积为60微升。反应温度被升高到72℃，在适当的时间段(1，2，4，8，and 16min)取出7微升的反应溶液与10微升的淬灭剂(PAGE loading/quench buffer，10mM EDTA in formamide)混合。以上的样品用16％PAGE(7M urea)凝胶电泳进行分离，所得的凝胶用MolecularImager软件进行分析。
以下是所用的寡核苷酸：
阴性对照实验(-)(Negative control)：dNTPs(each 0.1mM)
T7-Y-RS-S16：3’-GAAAT*CACTCCCAATTAAGCG-5’序列编号13
T7-PP-Temp：
5’-GCGTAATACGACTCACTATAGACGAPPCTACTTTAGTGAGGGTTAATTCGC-3’序列编号14
阳性对照实验(+)(Positive control(+))：dNTP(each 0.1mM)，and dZTP(0.1mM)
T7-Y-RS-S16：3’-GAAAT*CACTCCCAATTAAGCG-5’序列编号15
T7-PP-Temp：
5’-GCGTAATACGACTCACTATAGACGAPPCTACTTTAGTGAGGGTTAATTCGC-3’
序列编号16
以上的实验结果显示，三种酶的表现依次为Deep Vent(exo+)＞Vent(exo+)＞Taq。另外，具有外切酶活性的聚合酶比没有外切酶活性的聚合酶更好(notreported in[Yan07]).在阴性对照实验中(不含有dZTP)，Deep Vent(exo+)和Vent(exo+)仅仅错配少量的dCTP或dTTP与模板中的第一个dP.然而，Taq则可以错配dCTP或dTTP与模板中两个连续的dP，并且可以继续延伸引物。
实例5、PCR扩增含有多个相邻dP和dZ的寡核苷酸
为了比较含有一个和两个相邻dP的寡核苷酸PCR扩增的结果，我们制备了以下的寡核苷酸：
T7-Z-RS-S16：5’-GCGTAATACGACTCAC*TATAG-3’序列编号17
(Template-A)
T7-G-51-Std：
5’-GCGTAATACGACTCACTATAGACGAGCGTACTTTAGTGAGGGTTAATTCGC-3’序列编号18
(Template-B)
T7-P-Temp：5’-GCGTAATACGACTCACTATAGACGAPCGTACTTTAGTGAGGGTTAATTCGC-5’序列编号19
(Template-C)
T7-PP-Temp：5’-GCGTAATACGACTCACTATAGACGAPPCTACTTTAGTGAGGGTTAATTCGC-3’序列编号20
T7-Y-RS-S16：3’-GAAAT*CACTCCCAATTAAGCG-5’序列编号21
实验条件如下：
缓冲液的组分：ThermoPol Reaction Buffer(20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，pH 8.0at at 25℃).
PCR循环的程序：one cycle of 95℃ for 15min；26 cycles of 95℃ for 20s，(55℃ for 30s，72℃ for 1min or 2min；72℃ for 5min；then storedat 4℃.
以上的实验结果如图7所示。所有的PCR均产生相应的扩增产物。模板A(Template-A)的序列是天然的核苷酸。模板B(Template-B)的核苷酸序列中含有一个dP。模板C(Template-C)的核苷酸序列中含有两个相邻的dPs。
实例6、含有AEGIS(dZ和dP)的引物能够有效地抑制PCR中的引物二聚化
为了证明如果以dP或dZ替代引物中部分的dG或dC，则可以抑制PCR中的引物二聚化。我们做了以下的对比试验，以含有17个天然碱基的寡核苷酸为引物5’-CAGGAAGGAGCGATCGC-3’(序列编号35)，该引物的3’-端故意设计成含有8个碱基可以自身形成二聚体的序列(下划线部分，其Tm＝32℃)。在常规的PCR条件下，正如所料，该引物迅速地形成了引物二聚体。与此相反，分别以dP或dZ替代引物中部分的dG或dC，得到两个非天然的寡核苷酸序列，5’-CAGGAAGGAGCPATCPC-3’(序列编号36)和5’-CAGGAAGGAGZGATZGC-3’(序列编号37)，在相同的PCR条件下，即使经过45个PCR循环，以上两种含有dP和dZ的引物均没有形成二聚体。
实例7、筛选更好的DNA聚合酶并且优化PCR扩增的条件
为了得到更好的DNA聚合酶，该酶能够更高效的利用含有dPs和dZs的引物，在巢式PCR中高效的复制和扩增模板第物。我们用Real-time PCR分别测试了一下几种聚合酶的效率：Taq，9°N，Deep Vent(both exo+and exo-)，Vent(bothexo+and exo-)，Phusion，and Herculase。聚合酶具有较高的PCR效率能够产生更多的PCR产物同时能够在较早的PCR循环中生产更强的荧光信号。实验结果显示，在含有核酸外切酶活性的聚合酶中Phusion具有最高的PCR效率；在没有核酸外切酶活性的聚合酶中Deep Vent(exo-)具有最高的PCR效率。
Phusion DNA聚合酶与其他单一的酶相比，在复制长链模板时有更高的精确度和速度。此外，Phusion的错误率比Taq低50倍，比Vent和Deep Vent低6倍。因此，Phusion DNA聚合酶被作为首选的聚合酶，并用于进一步的优化引物中含有dP的巢式PCR。在含有六种核苷酸的PCR中，复制时的错误主要来自dGTP与模板中dZs的错配或dZTP与模板中dGs的错配。这样的错配具有pH依赖性，当反应缓冲液的pH值较低时，配对错误率将会下降。
为了确定一个首选的pH值使PCR同时具有高效率和高保真度，我们设计了三种类型的巢式PCR(A型、B型和C型)，三种PCR分别在四种不同pH的缓冲液中进行(Phusion HF Buffer，pH＝7.0，7.5，8.0和8.5)。PCR扩增的过程用含有荧光染料的实时PCR进行检测。“A型”巢式PCR中含有标准的外部引物以及嵌合式的引物和四种标准的核苷酸三磷酸(dNTPs)。实时PCR显示巢式PCR的扩增效率随着缓冲液pH的降低而升高。经过30个PCR循环后，每个PCR扩增产物的长度经过琼脂糖(3％)凝胶分析鉴定，不同pH的缓冲液(7.0，7.5，8.0和8.5)对PCR产物的熔化温度(约91.49±0.5℃)没有明显的影响。
B型巢式PCR与A型巢式PCR基本类似，唯一不同的是在反应体系中包括dZTP。通过比较B型反应中每个PCR扩增产物的熔化温度与A型反应中相应PCR产物的熔化温度，我们就可以得到不同pH值对dZTP与dG错配的影响。总体而言，B型反应中PCR产物的熔化温度随着反应缓冲液pH值的下降而升高。例如，在pH值为8.5时，B型PCR扩增产物的Tm比A型PCR产物的Tm低3.75±0.05℃；在pH值为7.0时，B型PCR扩增产物的Tm比A型PCR产物的Tm低0.29±0.05℃。C型巢式PCR的扩增条件与B型巢式PCR的条件相同，所不同的是PCR引物中含有非天然的核苷酸dP。与pH值对B型反应的影响相似，C型反应中PCR产物的熔化温度随着pH值的下降而升高(即意味着dZTP与dG的错配率随着pH值的降低而降低)。然而，与B型巢式PCR不同的是，C型巢式PCR产物的Tm均高于B型PCR相应产物的Tm(约3.6℃)，这主要归功于C型巢式PCR产物中含有热稳定性较高的Z:P碱基对。
对B型巢式PCR在四种不同pH值时所得的PCR产物进行克隆并且检测其序列。结果显示，dZTP对模板中dG的错配是微不足道的，这一错配并不影响PCR扩增产物被克隆和被传统的方法测序(Sanger Method)。
例8、含有AEGIS的外部引物在巢式PCR中可以得到更干净的多元PCR产物
为了显示含有dP的外部引物在巢式PCR中可以提高多元PCR的效率，我们将该巢式PCR用于复制、扩增人类基因组DNA中与癌症相关的三个基因：TOP1，HBEGF，和MYC。
在这个实验中使用的寡核苷酸序列是：
Top-F-External  5’-TPTAPATTTPTATPTATPTATPAT-3’序列编号22
Top-F-Chimeric  5’-TPTAPATTTPTATPTATPTATPATGACAGCCCCGGATGAGAAC-3’序列编号23
TOP-R-Chimeric  3’-GTTAGCTCGACAACGTTAAGAACAPAGGPAAATPACTCPCA-5’序列编号24
Universal-R-4P  3’-CAPAGGPAAATPACTCPCA-5’序列编号25
HBE-F-External  5’-AAAPTATAPTAAPATPTATAPTAG-3’序列编号26
HBE-F-Chimeric  5’-AAAPTATAPTAAPATPTATAPTAGCCCCAGTTGCCGTCTAGGA-3’序列编号27
HBE-R-Chimeric  3’-TTCACGGTTTGTCTCATACAGGCCAPAGGPAAATPACTCPCA-5’序列编号28
Universal-R-4P  3’-CAPAGGPAAATPACTCPCA-5’序列编号29
MYC-F-External  5’-GTATTTPAPTAAPTAATTPATTPA-3’序列编号30
MYC-F-Chimeric  5’-GTATTTPAPTAAPTAATTPATTPATCCTCCTTATGCCTCTATCAT-3’序列编号31
MYC-R-Chimeric  3’-CCTGAGAACTAGTTTCGCGCCCAPAGGPAAATPACTCPCA-5’序列编号32
Universal-R-4P  3’-CAPAGGPAAATPACTCPCA-5’序列编号33
以上外部引物的核苷酸序列源自于路明克斯公司(Luminex)设计的通用的标记序列，这些外部引物均有独特的核苷酸序列，为了避免引物之间的交叉杂化，并且他们有大致相同的熔化温度。以上嵌合式引物的设计如下，将通用的外部引物连接到内部引物的5-末端，此处的内部引物(可以是正向的或反向的)用于扩增特定的基因片段，其他三个外部引物，也被连接到相应的基因特异的内部引物上，每个外部引物与内部引物的组合是经过引物设计软件(OligoAnalyzer3.1)优化过，并遵循多重PCR引物设计的一般原则-尽量避免引物间的交叉杂化和形成发夹引物的结构。
在人类基因组DNA中的三种癌症基因，分别用含有天然的(标准的)和含有dP的非天然的引物进行巢式PCR扩增。PCR条件中包含七种不同的退火温度，用Phusion作为聚合酶。如图8所示，含有天然引物的标准巢式PCR在所测试的退火温度范围内得到杂乱的PCR结果(图8左侧)：在较低退火温度(从53.4℃至58.8℃)时，产生了大量的引物二聚体(长度约为40个核苷酸)；在较高的退火温度(从61.5℃至65.5℃)时，PCR产生了非特异性的产物(产物长度大于预期的PCR产物长度)同时伴随着引物二聚体的消失。
然而，与标准的巢式PCR相比，含有dP的巢式PCR在所有的退火温度下均产生了预期的PCR产物，同时只有少量的非特异性的产物(图8右侧)。比较两个控制反应A和B(不含基因组DNA)，在标准巢式PCR中，控制反应A产生了大量的引物二聚体(通过标准的外部引物形成了长度约为40个核苷酸的二聚体)和长度大于预期PCR产物的非特异性的产物，这可能是因为引物二聚体的进一步二聚所造成。在控制反应B(含有dP的巢式PCR)中没有产生引物二聚体和非特异性的PCR产物，只有少量含有dP的嵌合引物二聚体的形成。这种二聚体的形成可以通过进一步降低含dP嵌合引物的浓度而消除。我们进一步证实，在不同的pH值(8.5，8.0和7.5)时，含有dP的巢式PCR比标准的巢式PCR有更好的效率和专一性。
这一结果完全超出了意料。将人工扩展的基因密码子(AEGIS)嵌入巢式PCR的引物中，可以提高多元PCR的专一性，得到更干净的PCR产物。这一结果源自于，即使设计再好的天然PCR引物，理论上讲，都可能在基因组中找到与之部分互补的非特异性基因片段，因此在PCR扩增中得到非特异性的产物。
被引用的文献：
[Bro97]Brownie，J.，Shawcross，S.，Theaker，J.，Whitcombe，D.，Ferrie，R.，Newton，C.，Little，S.(1997).The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.Nucleic Acids Res.25，3235-3241
[Hor95]Horlacher，J.，Hottiger，M.，Podust，V.N.，Hübscher，U.，Benner，S.A.(1995)Expanding the genetic alphabet：Recognition by viral and cellular DNApolymerases of nucleosides bearing bases with non-standard hydrogenbonding patterns.Proc.Natl.Acad.Sci.，92，6329-6333
[Hut03]Hutter，D.and Benner，S.A.(2003)Expanding the genetic alphabet.Non-epimerizing nucleoside with the pyDDA hydrogen bonding pattern.J.Org.Chem.，68，9839-9842
[Swi89]Switzer，C.Y.，Moroney，S.E.，Benner，S.A.(1989)Enzymaticincorporation of a new base pair into DNA and RNA.J.Am.Chem.Soc.111，8322-8323
[Voe96a]Voegel，J.J.，Benner，S.A.(1996)Synthesis and characterization ofnon-standard nucleosides and nucleotides bearing the acceptor-donor-donorpyrimidine analog 6-amino-3-methylpyrazin-2-one.Helv.Chim.Acta 79，1863-1880
[Voe96b]Voegel，J.J.，Benner，S.A.(1996)Synthesis，molecular recognition andenzymology of oligonucleotides containing the non-standard base pairbetween 5-aza-7-deaza-iso-guanine and 6-amino-3-methylpyrazin-2-one，adonor-acceptor-acceptor purine analog and an acceptor-donor-donorpyrimidine analog.Helv.Chim.Acta 79，1881-1898
[Voe93]Voegel，J.J.，von Krosigk，U.，Benner，S.A.(1993)Synthesis andtautomeric equilibrium of 6-amino-5-benzyl-3-methylpyrazin-2-one.Anacceptor-donor-donor nucleoside base analog.J.Org.Chem.58，7542-7547
[Von95]von Krosigk，U.，Benner，S.A.(1995)pH-independent triple helix formationby an oligonucleotide containing a pyrazine donor-donor-acceptor base.J.Am.Chem.Soc.117，5361-5362
[Yan06]Yang，Z.，Hutter，D.，Sheng，P.，Sismour，A.M.and Benner，S.A.(2006)Artificially expanded genetic information system.A new base pair with analternative hydrogen bonding pattern.Nucleic Acids Res.，34，6095-6101.
[Yan07]Yang，Z.，Sismour，A.M.，Sheng，P.，Puskar，N.L.，Benner，S.A.(2007)Enzymatic incorporation of a third nucleobase pair.Nucl.Acids Res.35，4238-4249.
Figure IPA00001278673000021
Figure IPA00001278673000031
Figure IPA00001278673000041
Figure IPA00001278673000051
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Figure IPA00001278673000311
Figure IPA00001278673000341

Claims (11)

1.一个扩增寡核苷酸序列的过程，这一过程包括上述的寡核苷酸序列与一个正向的嵌合引物和一个反向的嵌合引物在水溶液中的接触，这其中，正向嵌合引物的核苷酸序列与被扩增的寡核苷酸3′-端一个区域的序列是互补的，反向嵌合引物的核苷酸序列与被扩增的寡核苷酸5′-端一个区域的序列是相同的，同时正向和反向嵌合引物与被扩增的寡核苷酸接触的序列的5′-端均含有一个独特的寡核苷酸标记序列，该标记序列中包含至少一个非标准的核苷酸，该非标准的核苷酸的碱基选自图1中所示的碱基结构，将上述被扩增的寡核苷酸与正向和反向嵌合引物组成的混合物与酶和三磷酸核苷作用，此处的酶包括DNA聚合酶，RNA聚合酶，和逆转录酶，该酶能够接受和复制含有非标准核苷酸的嵌合引物。
2.根据权利要求1所述的过程中，所提及的核苷选自一组包含以下结构的类似物。
Figure FPA00001278673300011
3.根据权利要求1中所述的酶包含Phusion，Vent和Deep Vent。
4.根据权利要求1中所述pH值被调节为了优化扩增产物双链的退火温度。
5.根据权利要求4中所述pH值介于6.5到7.5之间。
6.根据前述权利要求1中所述过程中，多个片段被同时扩增。
7.一个扩增寡核苷酸序列的过程，这一过程包括上述的寡核苷酸序列与一个正向的引物和一个反向的引物在水溶液中的接触，这其中，正向引物的核苷酸序列与被扩增的寡核苷酸3′-端一个区域的序列是互补的，反向引物的核苷酸序列与被扩增的寡核苷酸5′-端一个区域的序列是相同的，并且这三种核苷酸序列的混合物与酶和三磷酸核苷作用，此处的酶包括DNA聚合酶，RNA聚合酶，和逆转录酶，该酶能够接受和复制上述的引物和含有至少两个非标准核苷酸的寡核苷酸序列，该非标准的核苷酸的碱基选自一组包含以下结构的类似物。
8.根据权利要求7中所述的酶包含Phusion，Vent和Deep Vent。
9.根据权利要求7中所述pH值被调节为了优化扩增产物双链的退火温度。
10.根据权利要求9中所述pH值介于6.5到7.5之间。
11.根据权利要求7中所述非标准的核苷酸在被扩增的寡核苷酸中是相邻的。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114213489A (zh) * 2021-12-07 2022-03-22 山东大学 一种磷酰胺类脱氧核苷酸及其应用
CN114790471A (zh) * 2021-01-26 2022-07-26 华南理工大学 一种非天然核酸水凝胶及其制备方法与应用

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10865431B1 (en) * 2008-06-17 2020-12-15 Steven A Benner Polymerase incorporation of non-standard nucleotides
EP3150619B1 (en) 2009-05-21 2019-09-18 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Universal tags with non-natural nucleobases
EP2491146B1 (en) * 2009-10-23 2017-09-20 Luminex Corporation Amplification primers with non-standard bases for increased reaction specificity
US10415088B1 (en) * 2009-12-16 2019-09-17 Steven A Benner In vivo conversion of nucleosides in plasmid DNA
US10513704B2 (en) * 2010-12-15 2019-12-24 Steven A Benner Binding and catalytic molecules built from L-DNA with added nucleotides
ES2683707T3 (es) 2012-05-02 2018-09-27 Ibis Biosciences, Inc. Secuenciación de ADN
US10106837B1 (en) * 2014-02-05 2018-10-23 Steven A Benner Processes for point of care detection of DNA and RNA
US9802975B2 (en) 2014-06-10 2017-10-31 Agilent Technologies, Inc. Protecting groups for “Z nucleotide” and methods thereof
WO2016030899A1 (en) 2014-08-28 2016-03-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of treating amyotrophic lateral scleroses
EP3294280A1 (en) 2015-05-11 2018-03-21 Yeda Research and Development Co., Ltd. Citrin inhibitors for the treatment of cancer
EP3331546B1 (en) 2015-08-03 2023-10-04 Biokine Therapeutics Ltd. Cxcr4 inhibitor for the treatment of cancer
IL263184A (en) 2018-11-21 2020-05-31 Yarden Yosef Method of treating cancer and compositions for same
EP4228637A1 (en) 2020-10-15 2023-08-23 Yeda Research and Development Co. Ltd Method of treating myeloid malignancies

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2425747C (en) 2000-10-14 2012-01-24 Eragen Biosciences, Inc. Solid support assay systems and methods utilizing non-standard bases
US8053212B1 (en) 2004-08-28 2011-11-08 Steven Albert Benner Non-standard nucleoside analogs with reduced epimerization

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114790471A (zh) * 2021-01-26 2022-07-26 华南理工大学 一种非天然核酸水凝胶及其制备方法与应用
CN114790471B (zh) * 2021-01-26 2023-08-18 华南理工大学 一种非天然核酸水凝胶及其制备方法与应用
CN114213489A (zh) * 2021-12-07 2022-03-22 山东大学 一种磷酰胺类脱氧核苷酸及其应用

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