CN102058616A - 索拉胶作为制备预防和治疗便秘药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种索拉胶作为制备预防和治疗便秘药物的应用，索拉胶可直接服用或混于食物中服用，索拉胶在人体肠道中吸水膨胀而不被肠道吸收，增加了粪便的体积，刺激了胃肠的蠕动，提高粪便的数量、重量和含水率，加快排便，改善便秘情况。索拉胶的制备操作简便，工艺简单，成本低，适宜于工业化生产；索拉胶具有强大的吸水能力，能够有效地刺激肠胃的蠕动，改善便秘情况的同时具有安全无毒的优点。

Description

索拉胶作为制备预防和治疗便秘药物的应用

技术领域

本发明涉及土壤杆菌Agrobacterium sp.ZX09的代谢产物（中文名：索拉胶，英文名：Salecan），特别是索拉胶在预防和治疗便秘中的应用。

背景技术

便秘不是病，是由多种病理因素引起的一种临床常见症状。由于正常的排便习惯差异很大，摄食种类及习惯、生活习惯、环境因素、精神状态都可以影响排便习惯。所以，迄今为止，都很难给便秘下一个确切的定义。

国际上有关功能性胃肠病，包括慢性便秘，在诊断、病理生理学以及治疗方面相继推出罗马Ⅰ（1994年）和罗马Ⅱ（2000年）标准。便秘可以简单的描述为以下三种障碍中的任何一项：排便次数的减少，排便困难或排便过硬。由于便秘很少导致住院或死亡，因此它对健康的危害常被忽视。国内陆续有一些便秘流行病学方面的报道，普遍认为年龄、性别、职业、文化程度、心理障碍、滥用泻药、不良排便习惯等是便秘的危险因素。由于便秘严重影响患者的生活质量，严重者可引起心脑血管意外。便秘还是肛肠病发病的诱因。宿便堆积在肠道里，压迫肠壁，使肠粘膜受伤，肠蠕动变慢。另外宿便产生的毒素被肠道吸收，通过血液循环到达人体的各个部位，导致面色晦暗、皮肤粗糙、痤疮、肥胖等。特别是中老年人由于生理性衰退，肠道蠕动能力下降。因此早期预防和合理治疗会减轻便秘带来的严重后果。

目前，市场上有4大类的治疗便秘药物。刺激性泻药，药物本身在体内的代谢产物能够刺激肠壁，使肠蠕动加强而促进排便，代表药物有比沙可啶、双醋酚汀，这类药物作用强烈，只能临时应用。润滑性泻药，能润滑并刺激肠壁，软化大便，使粪便易于排出，例如开塞露，但易产生依赖性，不宜长期使用。渗透性泻剂，使肠内容积的渗透压升高，能吸收大量水分并阻止肠道吸收水分，使肠中容积增大，刺激肠壁，反射性的增加肠蠕动而导泻，代表药物有硫酸镁，乳果糖，但有器官疾病的人禁用，时常引起胃肠胀气和肠绞痛。还有一类是容积性泻药，吸水后增加容积，轻度刺激肠蠕动，抵达结肠后被肠道内细菌酵解，增加肠内渗透压和阻止肠内水分吸收，增强导泻作用，此类药物有羧甲基纤维素、车前子，但由于其作用力较弱，临床已少应用（郑丽华,贾兰斯. 治疗便秘药物的合理选择. 中国临床医生杂, 2007(4)）。

索拉胶是一种土壤杆菌Agrobacterium sp. ZX09分泌产生的胞外多糖，结构为β-葡聚糖（中国专利，201010146371.2）（Xiu A, Kong Y, Zhou M, Zhu b, Wang S, Zhang J. October 15 2010. The chemical and digestive properties of a soluble glucan from Agrobacterium sp. ZX09. Carbohydrate Polymers, Vol. 82, No. 3, 623-628）。经过急性毒理学和慢性毒理学的评价，该胶无毒安全。它具有强大的吸水能力，且在人体肠道中不被吸收的性质。

早在上世纪四十年代，就由图伦大学Diluzio博士从酵母细胞壁中分离出β-葡聚糖。在国际上已有研究报道说，β- 葡聚糖和它的衍生物具有多种生物活性，比如抗氧化剂，抗病毒，抗肿瘤，是激活免疫细胞的钥匙（Sener,G., Toklu,H. Z.,&Cetinel, S. 2007.β-Glucanprotects against chronicnicotine-induced oxidative damage in rat kidney and bladder. Environmental Toxicology and Pharmacology, 23, 25–32）。长时间食用含β-葡聚糖的食物能够降低人的血脂和肝脂（Robert Nicolosi, Stacey J Bell, Bruce R Bistrian, Isaac Greenberg, R Armour Forse and George L Blackburn. August 1999.Plasma lipid changes after supplementation with ß-glucan fiber from yeast. American Journal of Clinical Nutrition, Vol. 70, No. 2, 208-212）。经特殊步骤萃取且不含内毒素的β-葡聚糖在美国FDA已认定是一种安全的物质，可添加在一般食品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新结构的、吸水能力强的、不被人体肠道吸收的β-葡聚糖索拉胶在制备预防或治疗便秘药物方面的应用。

实现本发明目的的技术解决方案为：索拉胶作为制备预防和治疗便秘药物的应用，索拉胶可直接服用或混于食物中服用，索拉胶在人体肠道中吸水膨胀而不被肠道吸收，增加了粪便的体积，刺激了胃肠的蠕动，提高粪便的数量、重量和含水率，加快排便，改善便秘情况。

本发明与现有技术相比，其显著优点：（1）菌种的培养操作简便，工艺简单，培养基为全合成培养基，成份明确，成本低，适宜于工业化生产；（2）索拉胶产量大，提取方法简便，可直接溶于冷水；（3）索拉胶不被肠道吸收，具有强大的吸水能力，能够有效地刺激肠胃的蠕动，提高粪便的数量、重量和含水率，改善便秘情况：（4）通过慢性毒理学评价，索拉胶安全无毒。

附图说明

图1是各组小鼠粪便重量图。

图2是各组小鼠粪便数量图。

图3是各组小鼠粪便中含水率图。

图4是各组小鼠胃蠕动图。

图5是各组小鼠肠道蠕动图。

图6是各组小鼠粪便中索拉胶含量图。

图7是各组小鼠体重变化图。

图8是各组小鼠器官肝、脾、心重图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

本发明索拉胶作为制备预防和治疗便秘药物的应用，索拉胶可直接服用或混于食物中服用，疗程为单次或多次，视症状轻重，索拉胶在人体肠道中吸水膨胀而不被肠道吸收，增加了粪便的体积，刺激了胃肠的蠕动，提高粪便的数量、重量和含水率，加快排便，改善便秘情况。以实验小鼠来说，剂量最佳服用量为 300mg/kg左右，人类最佳服用量较实验小鼠为低。

索拉胶结构通式为：

→{3)-beta-D-Glup-(1→3)-[beta-D-Glup-(1→3)-beta-D-Glup-]3-alpha-D-Glup-(1→3)-alpha-D-Glup-(1｝n→

上述结构中的n基指具有100~10000个葡萄糖基相连的聚合物,本发明化合物是其中n为100 ~200的化合物。

利用土壤杆菌ZX09生产索拉胶，其步骤如下：

a、配置培养液：NaH2PO4 0.25‰-2‰, KNO3 1.5‰-4.5‰, CaCl2 0.05‰-0.2‰, MgCl2 0.15‰-0.55‰, FeSO4·7H2O 0.004‰-0.013‰, MnSO4 0.001‰-0.004‰, ZnCl2 0.004‰-0.008‰, NaCl 0-8%, 蔗糖 1%-5%，H2O 1000 mL，pH 5.5-11。

b、将培养液加热110-121℃灭菌15-30分钟；

c、向冷却至30-37℃的培养液内加入100-200µL平皿菌落液

d、28 ℃~30 ℃发酵24-48h形成种子培养液；

e、向冷却至30-37℃的培养液内加入3%-5%的种子培养液

f、在28 ℃~30 ℃发酵48~72 h；

h、向发酵液内注入超过两倍体积的乙醇或丙酮，50-70°C抽真空干燥得到索拉胶粗品。

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1：索拉胶粗品的制备

配置培养液，NaH2PO4 0.25g, KNO3 1.5 g, CaCl2 0.05g, MgCl2 0.15g, FeSO4·7H2O 0.004 g, MnSO4 0.001 g, ZnCl2 0.004 g, NaCl 10g, 蔗糖 10 g，H2O1000 mL，pH 5.5，将培养液加热121℃灭菌15分钟，冷却至30℃接入菌落液200µL，28℃培养24h，为种子液。向灭过菌的培养液中加入3%的种子培养液，发酵48h。在该发酵液中加入两倍体积的乙醇，50℃抽真空干燥即得到索拉拉胶粗品。

实施例2：索拉胶粗品的制备

配置培养液，NaH2PO4 2g, KNO34.5 g, CaCl2 0.2g, MgCl2 0.55g, FeSO4·7H2O 0.013 g, MnSO4 0.004 g, ZnCl2 0.008 g, NaCl 80g, 蔗糖 50 g，H2O1000 mL，pH 10，将培养液加热121℃灭菌30分钟，冷却至37℃接入菌落液200µL，30℃培养24h，为种子液。向灭过菌的培养液中加入5%的种子培养液，发酵48h。在该发酵液中加入两倍体积的丙醇，70℃抽真空干燥即得到索拉胶粗品。

实施例3：索拉胶粗品的制备

配置培养液，NaH2PO4 1g, KNO32 g, CaCl2 0.1g, MgCl2 0.3g, FeSO4·7H2O 0.008 g, MnSO4 0.003 g, ZnCl2 0.006 g, NaCl 30g, 蔗糖 30 g，H2O1000 mL，pH 7，将培养液加热121℃灭菌20分钟，冷却至32℃接入菌落液200µL，30℃培养24h，为种子液。向灭过菌的培养液中加入4%的种子培养液，发酵48h。在该发酵液中加入两倍体积的丙醇，60℃抽真空干燥即得到索拉拉胶粗品。

实施例4：索拉胶对便秘模型小鼠的实验研究

将索拉胶粗品按灌胃剂量溶解在蒸馏水中。48只C57BL/6J雄鼠购于上海，饲养在23±1℃，12小时光照—12小时黑暗循环的动物房。一周后开始实验。将小鼠随机分为6组，每组8只。CK为正常对照组，vehicle为便秘对照组，Salecan-vL为极低剂量组（灌胃索拉胶粗品的剂量为200mg/kg），Salecan-L为低剂量组（灌胃索拉胶粗品的剂量为300mg/kg），Salecan-M为中剂量组（灌胃索拉胶粗品的剂量为500mg/kg），Salecan-H为高剂量组（灌胃索拉胶粗品的剂量为1,000mg/kg）。按组别分别灌胃试剂（CK组和vehicle组给予蒸馏水）。1小时后，继续给小鼠灌胃盐酸洛哌丁胺（5mg/kg）水溶液（CK组给予蒸馏水）。然后将小鼠单独饲养，食物和水自由摄取。收集8小时内各只小鼠的粪便，统计数量和重量。再将粪便置于104℃烘箱烘48小时至恒重，测其粪便的含水率。

还是将48只C57BL/6J雄鼠饲养在23±1℃，12小时光照—12小时黑暗循环的动物房。一周后开始实验。将小鼠随机分为6组，每组8只。CK为正常对照组，vehicle为便秘对照组，Salecan-vL为极低剂量组（灌胃索拉胶粗品的剂量为200mg/kg），Salecan-L为低剂量组（灌胃索拉胶粗品的剂量为300mg/kg），Salecan-M为中剂量组（灌胃索拉胶粗品的剂量为500mg/kg），Salecan-H为高剂量组（灌胃索拉胶粗品的剂量为1,000mg/kg）。按组别分别灌胃试剂（CK组和vehicle组给予蒸馏水）。1小时后，继续给小鼠灌胃盐酸洛哌丁胺（5mg/kg）水溶液（CK组给予蒸馏水）。20分钟后，继续给小鼠灌胃同体积的酚红指示剂（每50ml含25mg酚红和5g阿拉伯树胶）。20分钟后，断颈处死小鼠。开腹，取出胃和小肠。

胃剪碎后加入25ml 0.1N NaOH匀浆。然后每5ml匀浆液中加0.5ml 的20%（w/v）三氯乙酸。3000rpm离心20分钟后，取出上清液，每1ml上清液加入4ml 0.5N NaOH。用分光光度计在560nm测其吸光值。取一只小鼠在灌胃酚红指示剂后立即断颈处死的胃部吸光值作为Y，其他小鼠胃部吸光值作为X，则按公式得到了gastric emptying(GE)=(1-X/Y)*100%

小肠取出后，测量其总长为L和上端到食物前进的最前端为d，按公式就得到了small intestinal transt (SIT)=L/d*100%

实施例5：索拉胶肠道吸收实验研究

将40只C57BL/6J小鼠分为4组：Salecan-vL, Salecan-L, Salecan-M, Salecan-H。各组分别通过灌胃给予不同剂量的索拉胶粗品水溶液，分别为：200mg/kg， 300m/kg， 500mg/kg， 1,000mg/kg。每只小鼠分别饲养，自由摄取食物和水，然后收集各只小鼠8小时内的粪便。每份样品取0.5g左右的样重，加6M HCl研磨后转移到20ml的尖头分析管中，并定容至8ml。然后置于100℃水浴加热0.5小时使索拉胶多糖水解成单糖。冷却至室温后用6M NaOH中和至中性，用蒸馏水定容至20ml。取其1ml于离心管离心，用血糖仪测其上清液即可得到单糖的含量（见图6）。

实施例6：索拉胶慢性毒理学实验研究

将索拉胶粗品研磨至粉状，按5%的比例添加的到动物饲料中，捏成饼状。40只ICR小鼠购于南京，其中20雄鼠和20只雌鼠。将小鼠分为4组：CKm(雄鼠正常对照组)，CKf（雌鼠正常对照组），GLm（雄鼠索拉胶组），GLf（雌鼠索拉胶组）。前两组喂以正常饲料，后两组喂以含5%索拉胶粗品的饲料。连续喂养3个月，期间跟踪小鼠的体重。3个月后，将小鼠断颈处死，取其器官肝、脾、心，测其重量。与正常组比较，判断索拉胶的慢性毒理。

索拉胶粗品成分见表1。将48只C57BL/6J小鼠分为6组：control, vehicle, Salecan-vL, Salecan-L, Salecan-M, Salecan-H。各组分别通过灌胃给予样品。1小时后，灌胃洛哌丁胺造便秘模型（见表2）。每只小鼠单独饲养，食物和水均自由摄取。分别收集每只小鼠在8小时内的粪便，统计个数（见图1）和重量（见图2）。然后将粪便置于104±1℃烘箱，烘48小时至恒重，计算其粪便的含水率（见图3）。

表1索拉胶粗品成分表

索拉胶粗品	每100g/g
		β-葡聚糖	77.2
蛋白质	6.2
		水分	5.2
灰分	10.3

[0033]

表2各组小鼠灌胃试剂种类和剂量表

表3是索拉胶粗品的物理化学性质表

characteristic	Value
		Molecular mass	1.53*105g/mol
Viscosity (2% w/v)	215Pa·s
		Steady rehology	Share-thinning behavior
Dymatical rehology	G’ > G’’, pseudoplastic fluid
		Water holding capacity	9.7g H2O/g

将48只C57BL/6J小鼠分为6组：control, vehicle, Salecan-vL, Salecan-L, Salecan-M, Salecan-H。各组分别通过灌胃给予试剂。1小时后，灌胃洛哌丁胺造便秘模型。20分钟后，均给予同体积的酚红指示剂。20分钟后，断颈处死。打开腹部，取出胃和小肠。分别测得胃蠕动（见图4）和肠道蠕动（见图5）快慢情况。

将40只C57BL/6J小鼠分为4组：Salecan-vL, Salecan-L, Salecan-M, Salecan-H。各组分别通过灌胃给予不同剂量的索拉胶粗品水溶液。收集8小时内的粪便。用血糖试纸法测得粪便中索拉胶的含量（见图6）。

将索拉胶粗品磨成粉末状，添加到小鼠饲料中，恋雪喂养ICR雌、雄小鼠3个月。期间跟踪小鼠的体重（见图7）。3个月后，将小鼠断颈处死，取器官肝、脾和心称重（见图8），评价其是否有毒。

试验结果表明：

1. 索拉胶具有增加粪便的功能。灌胃索拉胶之后，小鼠粪便的重量明显高于vehicle组粪便的重量。而且Salecan-L组粪便重是最大的。粪便重一方面取决于粪便的数量，还取决于粪便的含水率。索拉胶具有较强的吸水能力，能吸收10倍自重的水，而且在肠道不能被吸收，刺激了胃肠的蠕动，加快排便（见图1）。

2.索拉胶具有增加粪便数量的功能。灌胃索拉胶之后，小鼠粪便的数量明显高于vehicle组粪便的数量。而且Salecan-L组粪便数量是最大的。粪便的数量反映出排便的快慢和难易。索拉胶在肠道中吸水膨胀，增加了粪便的体积，刺激了胃肠的蠕动，加快排便（见图2）。

3.索拉胶具有提高粪便含水率的功能。灌胃索拉胶之后，小鼠粪便的含水率明显高于vehicle组粪便的含水率。而且粪便的含水率随着索拉胶剂量的上升而上升。从而也验证了索拉胶不能吸收，能在肠道吸水。还能从数据中看出，高剂量的索拉胶不会引起腹泻，粪便成型还是正常的（见图3）。

4.索拉胶具有刺激胃蠕动的的功能。GE(%)反应胃部蠕动情况，值越大，说明胃蠕动的越快。灌胃索拉胶之后，小鼠胃部蠕动明显快于vehicle组的胃部蠕动。而且胃部蠕动随着索拉胶剂量的上升而加快。也验证了索拉胶吸水膨胀的能力。

5. 索拉胶具有刺激肠道蠕动的的功能。SIT(%)反应肠道蠕动情况，值越大，说明肠道蠕动的越快。灌胃索拉胶之后，小鼠肠道蠕动明显快于vehicle组的肠道蠕动。而且Salecan-L组肠道蠕动是最快的。原因可能是，索拉胶吸水膨胀，增加了粪便的体积，刺激了肠道蠕动，但过高的剂量也会对肠道产生负担。

6. 索拉胶不能被肠道吸收。粪便中不存在单糖，因为单糖会被微生物摄取掉，血糖仪测得的单糖均源于粪便中残留索拉胶的酸水解产物，所以血糖仪测得值可以反映出索拉胶在粪便中的量。值越大，说明索拉胶的量越多。从实验结果可以看到，随着索拉胶剂量的升高而升高。说明索拉胶不嫩被肠道吸收，随粪便被排出体外。

7. 对于正常的小鼠，索拉胶粗品也不会造成腹泻或其他不良反应。因为索拉胶粗品结构类似于燕麦葡聚糖，具有保持肠道健康，预防便秘的作用。

8.索拉胶是安全无毒的。通过慢性毒理学的评价，喂有5%索拉胶粗品的小鼠，无论是体重还是重要器官的重，与正常饲养的小鼠均没有区别。可见服用索拉胶粗品是安全无副作用的

结构决定性质。索拉拉胶具有改善便秘症状的原因，应该是由其本身的结构决定。该胶是一种β-葡聚糖，聚合度高、分支多决定了其不宜被体内分解吸收。多羟基又决定了它良好的吸水性。经吸水溶胀后，它具有很高的粘稠度，它可以吸收水分，增大粪便的体积，刺激胃肠的蠕动，进而使得排便变得顺畅。

Claims (1)

1.一种索拉胶作为制备预防和治疗便秘药物的应用，其特征在于：索拉胶可直接服用或混于食物中服用，索拉胶在人体肠道中吸水膨胀而不被肠道吸收，增加了粪便的体积，刺激了胃肠的蠕动，提高粪便的数量、重量和含水率，加快排便，改善便秘情况。

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