CN102026723B - 样品支持物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了卡片状基材或板的形式，优选用于分析读数装置的一种样品支持物例如显微镜载片。样品支持物包含至少一个孔、优选多个孔，用于接受待分析样品。该至少一个孔完全贯穿基材，其尺寸使得利用样品的表面张力对抗重力将样品保持在至少一个孔中。任选地，基材包含第一个上部基材和第二个下部基材，它们一起封埋了多孔膜。作为另一种选择，样品支持物包含与第一个上部基材的顶面相连的第一个盖子和/或与第二个下部基材的底面相连的第二个盖子。此外，提供了在分析读数装置中使用这种样品支持物的方法，包括下列步骤：用样品和试剂混合物填充样品支持物的至少一个孔；将样品支持物插入到分析读数装置中；以及使用分析读数装置分析样品支持物的至少一个孔中的样品和试剂混合物。

Description

样品支持物及其使用方法
技术领域
本发明涉及用于分析检验例如DNA/RNA定量、蛋白定量和临床检验的样品支持物或样品板及其使用方法。具体来说，本发明涉及用于执行这种检验的分析读数装置、例如光学读数装置或电化学读数装置的样品支持物。
发明背景
对于分析检验来说，通过例如移液器将多个样品施加到平的卡片状基材上并通过分析读数装置在这种平的卡片状样品支持物上分析样品，是已知的。此外，用于分析检验的样品支持物采取微量滴定板或微孔板的形式，也是已知的。微量滴定板是平的板，具有多个用作小试管的“孔”。微量滴定板典型地具有排列成矩形矩阵的6、24、96、384或甚至1536个样品孔。微量滴定板的每个孔典型情况下容纳几十纳升到几毫升之间的液体。
本发明的目的是提供新的样品支持物以及使用这种样品支持物的方法。
发明简述
根据本发明，提供了卡片状基材的形式，具有至少一个、优选多个用于接受至少一种待分析样品的孔的样品支持物或样品板、例如塑料或玻璃显微镜载片。该至少一个孔完全贯穿基材，其尺寸使得利用样品的表面张力对抗重力将样品保持在至少一个孔中。换句话说，在优选为圆形孔的情况下，其直径被构造成使得样品由于在限定孔的基材的内表面与样品之间作用的毛细力(表面张力)而保留在孔中。
这样的样品支持物或样品板特别适用于使用分析读数装置分析样品的方法中，例如可以从德国Stockach的ESE GmbH公司获得的“ESE-Quant侧向流读数装置”(“ESE-Quant Lateral Flow Reader”)。本发明的其他优选实施方案限定在相关的从属权利要求中，并在下面更详细地描述。
附图简述
图1a示意显示了本发明的样品支持物的实施方案的主视图。
图1b示意显示了图1a的样品支持物沿着线A-A的横截面图。
图2a示意显示了本发明的样品支持物的优选实施方案的横截面图。
图2b示意显示了本发明的样品支持物的另一个优选实施方案的横截面图。
图3显示了特别适合与本发明的样品支持物一起使用的分析读数装置的透视图。
图4a到4d显示了使用本发明的样品支持物和图3中显示的分析读数装置获得的结果。
优选实施方案的详细描述
本发明的样品支持物或样品板的第一个实施方案以主视图显示在图1a中。显示了样品支持物10具有以阵列形式排列在样品支持物10中的6个孔15，其中三个孔的直径比另外三个孔的直径大些。孔15完全贯穿样品支持物10，正如可以从图1b中沿着线A-A获得的横截面图所看到的。本领域技术人员从下面的详细描述将会认识到，本发明不限于图1a中显示的孔15的数量、尺寸、形状和排列。例如，本发明的样品支持物可以具有6个以下的孔例如只有一个孔，或具有6个以上的孔例如10个孔。在优选实施方案中，所有孔15具有同样的直径，并且是圆柱或圆形的。优选情况下，样品支持物10的尺寸与用于显微镜的常规载片相同，例如下面的维度：7.6cm(长度)x2.6cm(宽度)x0.1cm(高度或厚度)。考虑到了取决于所使用的样品体积，较大的样品支持物可以具有高达10cm的厚度。但是，对于大多数应用来说，厚度优选在0.5到5mm之间的范围内。对于给定样品体积来说，较大的样品支持物10厚度和较小的孔直径导致被照射样品的高度增加。这具有下述优点，即下面描述的分析读数装置能够执行吸收测量、比色测量、使用反射的测量等。此外，对于给定的体积来说，孔中样品高度的增加，由于样品的表面积较小而导致蒸发较少。
样品支持物10(或更具体来说其基材)可以由玻璃、塑料、金属等制成。有利情况下，样品支持物10(或其至少某些区域)可以由在利用光学读数装置与样品支持物10和位于其孔15中的样品所进行的测量中能够用作光学参比物或标准材料的材料制成。例如，样品支持物10的材料的光学性质，能够使样品支持物10在被适合的激发辐射照射时发出某些确定波长的荧光，和/或吸收某些确定波长的辐射，例如UV和/或可见光范围内的辐射。适合的材料是例如发荧光矿物质例如红宝石、萤石、绿松石、琥珀、蓝宝石、锆石等。本领域技术人员将会认识到，包含具有确定光学性质、可以用作光学读数装置的参比或标准的材料的样品支持物10(或至少其区域)，提供了可以不必在样品支持物的一个孔中使用“外部”参比物例如样品标准品就能获得更精确结果的优点。
孔15通过连续或一步添加样品和试剂混合物进行填充。孔15的尺寸使得相应的液体、即样品和试剂混合物通过其中的表面张力和毛细力被支撑。正如可以从图1a中的阴影区域看到的，两个较大直径的孔15填充有样品和试剂混合物。
本领域技术人员将会认识到，取决于填充在孔15中的样品和试剂混合物的物理性质，孔的直径必须足够小，使得样品和试剂混合物的表面张力将阻止样品和试剂混合物由于重力而以液滴形式从孔中落出或滴出。优选情况下，孔的直径在0.1-10mm的范围内。更优选情况下，在0.5-3.0mm范围内。
对于某些应用来说，限定孔15的基材的内表面可以是亲水或疏水表面(即比基材更亲水或疏水)，可能是有利的。为此，这些限定孔15的内表面可以用由亲水或疏水材料制成的层涂层。
在图2a显示的另一个实施方案中，样品支持物20基本上由夹心状排列的三个部分构成，即具有孔的第一基材22、多孔膜24和具有孔的第二基材26。第一基材22的孔以及在形状、尺寸和排列上与第一基材22的孔对应的第二基材26的孔，一起限定了完全贯穿基材的孔25(中间具有膜24)。多孔膜24可以作为试剂(例如完全干透的试剂)的载体。多孔膜24允许在填充过程中排出空气并使液体从第一基材22的一个孔通过多孔膜24到达第二基材26的相应的孔。多孔膜24也可以用作溶液的过滤介质(例如过滤细胞或血体或其他组分)。多孔膜24也可以阻断照射辐射例如可见光或UV到达第二基材26的孔，或可以用于测量依赖于时间和温度或其他参数通过孔迁移的颗粒。或者或此外，膜可以包含传导元件、疏水材料或亲水材料。图2a中显示的样品支持物20的第一基材22和第二基材26与多孔膜24结合并被完全分离。但是，本领域技术人员将会认识到，第一基材22和第二基材26也可以形成包埋有多孔膜24的单一部件。
在图2b中显示的样品支持物30的另一个实施方案中，膜或盖子31、37可用于覆盖图1b和2b中显示的样品支持物顶面和/或底面的孔35。这些膜或盖子31、37对于光学、电化学或其他测量技术来说可以是透明的，和/或可以包含疏水或亲水材料。
上面描述的样品支持物10、20、30的孔15、25、35也可以用作反应容器，例如用于核酸扩增和诊断检验、ELISA等。代替利用移液器手动或使用自动装填孔15、25、35，也可以简单地通过将样品支持物10、20、30浸没在液体中来填充孔15、25、35。
上述样品支持物10、20、30极好地适用于图3中显示的并在国际专利申请PCT/EP2008/001468中更详细描述的光学测量装置或分析读数装置50，所述专利申请在此以其全文引为参考。测量装置50包含单片电光学模块52，它包含用于执行测量的光学和电子部件。该模块52在上面提到的PCT/EP2008/001468中进行了更详细的描述，是按照共聚焦原理而不是离轴几何原理设计的。装置的共聚焦光学元件使得它对样品的机械不均衡性不敏感，并确保了共聚焦设计的最高信号和最低背景的固有特征。
此外，读数装置50包含用于接收样品支持物56的槽54，所述样品支持物56可以对应于任一上述样品支持物10、20、30。
样品支持物56可以插入到槽54中，并可以相对于模块52移动。此外，模块52可以相对于样品支持物56移动。
此外，读数装置50提供有用于控制测量的键座58和用于显示测量结果的显示器60。
读数装置50可以通过吸收法、反射法、发光法或荧光测定法测量颜色强度或荧光强度或化学发光强度或其他信号例如电化学信号。传感器和样品载片嵌在读数装置中，该读数装置是独立装置，包括机壳、工业设计、电子元件、光学元件、所有必需的机械部件、显示器、存储器、电池、与USB端口的结点、打印机、条形码读取器和任选的无线数据传输。它具有用于装置控制和数据解释的固件。校正曲线可以保存在内部存储器中。读数装置50可以与外部计算机相连并通过其进行操作。样品支持物(载片)可以通过抽屉状托架插入到读数装置中，孔的填充可以直接发生在位于该托架中的样品支持物上。一旦样品支持物滑入读数装置中后，读数装置逐步或高速扫描样品。结果直接显示在读数装置的显示器60上和/或与读数装置50相连的用于处理和分析结果的PC的外部监测器上。
通常希望在例如几分钟内执行DNA和蛋白的快速定量。常规的荧光检验需要20分钟或更长时间才能获得稳定信号，这是因为荧光染料必须与DNA或蛋白结合。此外，在小体积例如1到2μl的情况下，在这种时间长度中的蒸发不能忽略。根据本发明，可以通过向样品加入抑制蒸发的试剂来防止这种蒸发对检验的不利影响。
最小化或避免样品蒸发的试剂可以是吸湿性化合物例如聚乙二醇、二乙二醇、甘油、MgCl2、LiCl、CaCl2、Ca(NO3)2、ZnCl2和其他有机和无机化合物例如醇类和胺类等。
此外或可替选地，可以在处理测量信号时考虑蒸发对测量的影响。换句话说，通过使用蒸发的校正和/或模型，以及样品中的靶浓度随着时间升高而引起的相应信号增加，可以获得“真实的”信号。就此而言，对于DNA和蛋白测量来说，随时间变化的校正曲线是必需的。但是，信号也随着添加的蒸发抑制剂以及样品中DNA和蛋白的混合比例而变化。这些混合比例是未知的并应该确定。为此可以使用已知混合比例的校正曲线。
因为使用读数装置同时测量一个以上样品是可能的，因此例如利用移液器操作不同样品所需的时间可能耽误测量，使得信号随着时间而增加。因此，本发明的装置允许确定施加第一个样品的时间点(打开托架和时间测量的起点)。然后施加样品(一个或多个)。最后关闭带有样品的托架(时间测量的终点)。因此，可以确定使用移液器操作样品所需的总时间，并可以从第一个到最后一个样品外推时间延迟。利用储存在装置中的不同混合比例的不同校正曲线，可以为每个时间点确定信号校正因子。结果对于读数装置的应用例如DNA-蛋白制备、法医应用等来说足够准确和灵敏。
通常情况下，相应的样品(加上试剂混合物)将不会占据由孔15、25、30提供的全部相应空间。根据本发明，有可能利用读数装置50确定样品支持物10、20、30的孔中的样品和试剂混合物体积。给定孔中的液体(样品加试剂混合物)形成了弯液面，其中液体的垂直厚度朝向孔壁处一般比其中间更大(由于该区域中的毛细力和表面张力)。弯液面的形状(由例如孔中央的峰值强度与其壁处的峰值强度的比例来确定)可用于确定液体体积。通过测定蒸发的液体(即样品和试剂混合物)的表面积，给定孔的样品和试剂混合物体积的确定可用于将蒸发的影响考虑在内。
图4a显示了下述实例在蒸发10分钟后测量到的示例性弯液面：使用Fluoroprofile测定法(Sigma-Aldrich)进行蛋白测定。孔直径：1mm，体积：1μl；值的单位为μg/ml，传感器焦距：6mm，激发/发射470nm/625nm。弯液面显示为“双峰”。在A、B、C、D、E和F处的信号分别对应于空白、100μg/ml、25μg/ml、6μg/ml、1μg/ml和空孔。本领域技术人员将会认识到，为了分辨由弯液面引起的双峰结构，光学读数装置的分辨率必需小于孔的直径。
图4b显示了使用Fluoroprofile测定法(Sigma-Aldrich)进行蛋白测定的结果。孔直径：1mm，体积：1μl；值的单位为μg/ml，传感器焦距：6mm，激发/发射470nm/625nm。在A、B、C、D、E和F处的信号分别对应于空白、100μg/ml、25μg/ml、6μg/ml、1μg/ml和空孔。
图4c显示了使用Quant-iT PicoGreen双链DNA测定试剂盒进行的DNA定量的结果。体积1μl，传感器焦距：6mm，激发/发射470nm/520nm。在A、B、C、D、E和F处的信号分别对应于50μg/ml、5μg/ml、0.5μ/ml、50ng/ml和5ng/ml。图4d显示了图4c的一部分的特写图。
本发明提供了下列优点：样品支持物的背景最小化或没有影响结果；可以同时测量多个样品；能够在孔中容易地操作和混合试剂；容易无气泡地填充孔；对于客户和制造商来说成本低；作为可消耗品的用后可丢弃的样品支持物(带有孔的载片)；不污染分析读数装置，不需清洁；样品体积小；高灵敏度；通过附加的试剂混合物成分最小化样品体积的蒸发；可以在延长的时期内测量；如果需要样品可以重复使用；没有样品的定位错误；可以使用广范围的样品粘度/组成；不同孔之间极小的光学串扰；即使载片落下样品仍保留在孔中；液滴形状很大程度上不依赖于样品的表面张力/粘度(样品不漂浮在表面上)。
在本说明书的文本中引用了几份文件。在本文中引用的每份文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指南等)，无论是上文还是下文中的，在此都以其全文引为参考。本文中没有一处将被解释为承认本发明无权利用先前发明而在时间上早于这些公开内容。

Claims (16)

1.用于分析读数装置(50)中的样品支持物(10，20，30)，所述样品支持物(10，20，30)包括：
具有至少一个孔(15，25，35)的用于接受待分析的样品的基材，其中至少一个孔(15，25，35)完全贯穿基材，其尺寸使得利用样品的表面张力将样品保持在至少一个孔(15，25，35)中，所述表面张力作用在限定孔的基材的内表面与样品之间，其中基材包含第一个上部基材(22，32)和第二个下部基材(26，36)，它们一起封埋了多孔膜(24，34)，第一个基材的孔以及在形状、尺寸和排列上与第一个基材的孔对应的第二个基材的孔一起限定了完全贯穿基材的孔(25)，中间具有多孔膜，其中样品支持物(30)还包括与第一个上部基材(32)的顶面相连的第一个盖子(31)和与第二个下部基材(36)的底面相连的第二个盖子(37)以分别覆盖样品支持物的顶面和底面上的孔，其中样品支持物适合于通过将样品支持物浸没在液体中来填充孔。
2.权利要求1的样品支持物(10，20，30)，其中所述分析读数装置是光学或电化学读数装置。
3.权利要求1到2任一项的样品支持物(10，20，30)，其中多孔膜(24，34)和/或第一个盖子(31)和/或第二个盖子(37)由亲水材料或疏水材料制成。
4.权利要求1到2任一项的样品支持物(10，20，30)，其中基材由玻璃、塑料、金属、红宝石、萤石、绿松石、琥珀、蓝宝石、或锆石制成。
5.权利要求1到2任一项的样品支持物(10，20，30)，其中至少一个孔(15，25，35)具有圆形形状。
6.权利要求1到2任一项的样品支持物(10，20，30)，其中限定至少一个孔(15，25，35)的基材的内表面是优选被亲水材料覆盖的亲水表面。
7.权利要求1到2任一项的样品支持物(10，20，30)，其中限定至少一个孔(15，25，35)的基材的内表面是疏水表面。
8.权利要求7的样品支持物(10，20，30)，其中所述疏水表面被疏水材料覆盖。
9.权利要求1到2任一项的样品支持物(10，20，30)，其中样品支持物(10，20，30)包括多个孔(15，25，35)，其中多个孔(15，25，35)的一部分的直径比多个孔(15，25，35)的另外一部分的直径更大。
10.权利要求1到2任一项的样品支持物(10，20，30)，其中至少一个孔(15，25，35)的直径在0.1-10mm的范围内。
11.权利要求10的样品支持物(10，20，30)，其中至少一个孔(15，25，35)的直径在0.5-3.0mm的范围内。
12.在分析读数装置(50)中使用权利要求1到9任一项的样品支持物(10，20，30)的方法，所述方法包括下列步骤：
用样品和试剂混合物填充样品支持物(10，20，30)的至少一个孔(15，25，35)；
将样品支持物(10，20，30)插入到分析读数装置(50)中；以及
使用分析读数装置(50)分析样品支持物(10、20、30)的至少一个孔(15，25，35)中的样品和试剂混合物。
13.权利要求12的方法，包括向至少一个孔(15，25，35)添加抗蒸发剂的另一个步骤，以最小化或避免沉积在样品支持物(10、20、30)的至少一个孔(15，25，35)中的样品的蒸发，所述抗蒸发剂选自聚乙二醇、二乙二醇、甘油、MgCl2、LiCl、CaCl2、Ca(NO3)2、ZnCl2和其他有机和无机化合物。
14.权利要求13的方法，其中所述其他有机和无机化合物是醇或胺。
15.权利要求12的方法，其中利用分析读数装置(50)分析样品支持物(10、20、30)的至少一个孔(15，25，35)中的样品和试剂混合物的步骤，通过使用蒸发的校正和/或模型将蒸发的影响考虑在内。
16.权利要求15的方法，其中分析样品支持物(10、20、30)的至少一个孔(15，25，35)中的样品和试剂混合物的步骤，还包括测定至少一个孔(15，25，35)中的样品和试剂混合物的体积，以便可以使用体积将蒸发的影响考虑在内。
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