CN102010527B - 壳聚糖纳米粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种壳聚糖纳米颗粒及其制备方法。该纳米颗粒是由壳聚糖和聚丙烯酸合成的壳聚糖纳米颗粒，其特征在于该纳米颗粒粒径大小在150-200nm，偏差为±20nm的球形粒子，表面电位为：40～60mv。本发明制备的壳聚糖纳米粒可在年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病视网膜变性、青光眼、白内障等眼科疾病等方面有很好的应用。且制备工艺简单，生产成本低，所得的壳聚糖纳米粒稳定性好，能进一步满足生产和应用的需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
壳聚糖(Chitosan)是重要的一类天然生物降解高分子材料，是甲壳素的衍生物，来源于甲壳类动物（如虾、蟹）、昆虫和其他无脊椎动物外壳中的甲壳质，也存在于真菌酵母的细胞壁内，是自然界中惟一含游离氨基碱性基的阳离子可食性动物纤维。它的分子结构与纤维素相似，是由氨基葡萄糖通过糖苷键连接而成的直链高分子，包含氨基葡萄糖共聚物和N—乙酰氨基葡萄糖。壳聚糖已被证明具有许多优良特性：无毒性、助渗作用、生物粘附性、良好的组织相容性、生物降解性、易被制备成微颗粒和纳米颗粒。另外，由于它还有抗癌、降血脂等保健作用品。自20世纪80年代以来，国内外形成了甲壳素、壳聚搪等多糖类生物医用材料的开发研究热潮。
随着壳聚糖在生物医药领域的广泛应用，越来越多的人热衷于微胶囊及纳米微球的研究。大颗粒的壳聚糖微球主要用于药物的长效释放；小颗粒壳聚糖微球以及磁微球可包覆抗癌药剂，用于特定区域的药物释放。壳聚糖以其优良的生物相容性和生物降解性，已尝试用于鼻腔药物传递系统；制成包埋酶、蛋白质和细胞的微胶囊等。此外，壳聚糖还具有直接抑制肿瘤细胞的作用，有研究显示载铜离子壳聚糖纳米粒及壳聚糖纳米粒均有剂量依赖性抑制肿瘤细胞增殖作用。浓度50ug/ml壳聚糖纳米粒或者载铜离子壳聚糖纳米粒与多种肿瘤细胞分别共培养24小时，肿瘤细胞增殖抑制率为67%～90% (Qi Lifeng，Xu Zirong, Jiang Xia, Li Yan,Wang Minqi. Cytotoxic activities of chitosan nanoparticles and copper-loaded nanoparticles. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2005(15):(1397–1399)。研究者认为，壳聚糖纳米粒表面电荷度高是其产生细胞毒性的主要原因。现在许多眼科疾病的发生发展与细胞凋亡过程相关，例如：年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病视网膜变性、青光眼、白内障等，但目前还没有报道壳聚糖纳米粒应用于这些眼科疾病方面。
目前有很多方法可以制备壳聚糖微球：水油共混法 (H. Onishi, J. Shimoda and Y. Machida, Chitosan-drug conjugate microsheres: preparation and drug release properties of microspheres composed of the conjugate of 2′- or 3′-(4-carboxy-butyryl)-5-fluorouridine with chitosan. Drug Dev Ind Pharm,1996,22 (5):457–463; M.Fwu-Long, K.Chih-Yang, S.Shin-Shing, L.Sung-Tao,C. Shon-Foun,The study of gelation kinetics and chain relaxation properties of glutaraldehyde-cross-linked chitosan gel and their effects on microspheres preparation and drug release. Biomaterials , 2000,41: 389–396)、乳滴联合技术(中国发明专利：壳聚糖药物载体及其制法和应用，公开号：CN1903367A)、喷溅烘干法（P. He, S.S. Davis and L. Illum , Chitosan microspheres prepared by spry drying. Int J Pharm 1999, 187: 53–65）。通常这些制备过程比较复杂，而且需要有机溶剂或表面活性剂。另外，这些技术制备而得的微球粒径较大，限制了某些给药途径，比如静脉注射。本发明提出的离子交联滴入法操作简单，条件温和，不需要高温、有机溶剂、表面活性剂或其他实验技术；而且容易得到满足生物医学应用要求的壳聚糖纳米粒。
发明内容
本发明的目的之一在于提供了一种亲水性带正电荷壳聚糖纳米颗粒。
本发明的目的之二在于提供该纳米颗粒的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种由壳聚糖和聚丙烯酸合成的壳聚糖纳米颗粒，其特征在于该纳米颗粒粒径大小在150-200 nm，偏差为±20 nm的球形粒子，表面电位为：40～60 mv。
上述的壳聚糖的分子量为80 kDa，脱乙酰度>90.0%，粘度<100 cps。
上述的聚丙烯酸的分子量为100k Da
上述纳米颗粒的粒径在150～200 nm的球形粒子。
上述的纳米颗粒的表面电位为：40～60 mv。
一种制备上述的壳聚糖纳米颗粒的方法，其特征在于该方法依的具体步骤为：
a.将壳聚糖溶于浓度为1 w/v％的冰醋酸溶液中，配制成浓度为0.1～0.6 mg/ml壳聚糖溶液；
b.将浓度为0.01%～0.06 w/v %的聚丙烯酸溶液逐滴加入到步骤a所得壳聚糖溶液中，搅拌下形成乳白色混悬液，其中壳聚糖和聚丙烯酸质量比为3:1～10:1；
c.在步骤b所得的乳白色混悬液过滤，所得固体静置陈化24小时，即得到壳聚糖纳米颗粒。
上述的搅拌速度为：180～200 rpm。
本发明的优点在于：
（1）本发明的制备方法简单，可操作性强，能进一步满足生产和应用的需求。
（2）本发明制备的壳聚糖纳米颗粒具有良好的物理化学稳定性。
（3）本发明中制备的壳聚糖纳米颗粒粒径小，带正电荷，这增强了其在有生物阳离子存在时的稳定性，也因可以与带负电的生物膜性结构有很好的交互反应，使其用于抗肿瘤治疗方面。
本发明制备的壳聚糖纳米粒可在年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病视网膜变性、青光眼、白内障等眼科疾病等方面有很好的应用。且制备工艺简单，生产成本低，所得的壳聚糖纳米粒稳定性好，能进一步满足生产和应用的需求。
附图说明
图1 壳聚糖纳米粒扫描电镜图。
图2壳聚糖纳米粒粒径分布图。横坐标为粒径大小，纵坐标为粒度数百分比。
图3壳聚糖纳米粒拉曼图谱。横坐标为拉曼位移，以波数表示，纵坐标为拉曼光强。
图4实施例 1不同配比的壳聚糖和聚丙烯酸制备的壳聚糖纳米粒粒径比较。
图5实施例2不同酸碱度的缓冲液孵化壳聚糖纳米粒粒径比较。
图6实施例3放置不同时间的壳聚糖纳米粒粒径比较。1. 1天；2. 10天；3. 20天；3. 30天；3. 60天。
图7实施例3放置不同时间的壳聚糖纳米粒表面电位比较。1. 1天；2. 10天；3. 20天；3. 30天；3. 60天。
图8壳聚糖纳米粒杀伤人晶状体上皮细胞的MTT检测图。1. 空白细胞；2. 150 nm的壳聚糖纳米粒；3. 180 nm的壳聚糖纳米粒。
图9壳聚糖纳米粒成形范围。其中X, 澄清液体; √,乳液悬液; ↓沉淀。
具体实施方式
以下实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1 使用不同配比的壳聚糖/聚丙烯酸制备壳聚糖纳米粒
1．壳聚糖溶液/聚丙烯酸溶液的制备：
a.将壳聚糖配制成浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/ml 的醋酸溶液；
b.聚丙烯酸（PAA）配制成浓度分别为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06% 的水溶液。
c.壳聚糖纳米粒的制备：按照体积比为1:5的比例分别将上述聚丙烯酸溶液逐滴加入壳聚糖溶液中。具体说，就是将1 ml PAA (分子量为100 kDa) 水溶液逐滴加入5 ml壳聚糖溶液中（分子量为80 kDa的壳聚糖溶解在1％(w/v)的醋酸溶液），同时磁性搅拌，形成乳白色混悬液。所得乳白色混悬液用滤纸过滤，过滤好的混悬液静置24小时。
结果如图9所示，壳聚糖纳米粒成形范围为：壳聚糖和聚丙烯酸质量比为3:1～10:1，只有在这个范围才能得到稳定的壳聚糖纳米粒。如图4所示，PAA浓度一定时，随着壳聚糖醋酸溶液浓度增加，制备的壳聚糖纳米粒粒径增加；壳聚糖浓度一定时，随着PAA浓度增加，壳聚糖纳米粒粒径减小。
实施例2 使用不同酸碱度的缓冲液孵化壳聚糖纳米粒
a.按照为1:5的体积比分别将1 ml 0.02% PAA (分子量为100 kDa) 水溶液逐滴加入5 ml 0.2 mg/ml的壳聚糖溶液中（分子量为80 kDa的壳聚糖溶解在1％(w/v)的醋酸溶液），同时磁性搅拌，形成乳白色混悬液。所得乳白色混悬液用滤纸过滤，过滤好的混悬液静置24小时。
b.配制不同酸碱度的缓冲液，使其pH=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,9。
c.将上述制得的壳聚糖纳米粒子，分别在pH=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,9的缓冲液中孵化24 小时。
如图5结果显示，壳聚糖纳米粒子在3.0-7.0的pH值范围的溶液中都很稳定，而其壳聚糖纳米粒子的粒径随pH值增加而增加。但在pH 2以下的溶液中几分钟就溶解了，而在pH值大于9的溶液中则容易有沉淀析出。
实施例3 放置不同时间的壳聚糖纳米粒
a.将壳聚糖配制成浓度0.2 mg/ml 的醋酸溶液，聚丙烯酸（PAA）配制成浓度分别为0.02% 的水溶液。
b.将1 ml 0.02% PAA (分子量为100 kDa) 水溶液逐滴加入5 ml 0.2 mg/ml的壳聚糖溶液中（分子量为80 kDa的壳聚糖溶解在1％(w/v)的醋酸溶液）。
c.同时磁性搅拌，形成乳白色混悬液。
d.将其分别放置1天，10天，20天，30天，60天。
如图6，7结果显示，在60天之内壳聚糖纳米粒的粒径和表面电位变化趋势几乎完全一致，一定程度上可以说明，该方法制备的壳聚糖纳米粒体系较为稳定，适用于生物体系之中。
实施例4 壳聚糖纳米粒对人晶状体上皮细胞（Human Lens Epithelial Cell, HLECs）的杀伤作用
一、细胞的培养：本发明所用人晶状体上皮细胞来源于第二军医大学附属长征医院，所用培养液为含体积分数为 10% 的胎牛血清和 1％的青霉素－链霉素的 DMEM 培养液。所用细胞在 37 ℃，在体积分数为 5 % CO2 的饱和湿度培养箱中培养，实验选用对数生长期细胞。
1．MTT检测细胞死亡率
a.收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞密度为5×103—1×104/孔，每孔加入100 ul。
b.5% CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底，加入壳聚糖纳米粒混悬液，每孔100ul。
c.5% CO2，37℃孵育24小时，倒置显微镜下观察。
d.吸去96孔板中的培养液，每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4h。
e.每孔加入100ul二甲基亚砜（DMSO），置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
f.根据以下公式计算细胞抑制率：抑制率=（对照—给药）/(对照—本底)×100%。
如图8所示壳聚糖纳米粒混悬液孵育过的细胞死亡率明显大于对照组，此结果表明壳聚糖纳米药物可以杀伤人晶状体上皮细胞，有望用于年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病视网膜变性、青光眼、白内障等眼科疾病等方面的治疗。
本发明中，壳聚糖纳米粒的形貌通过场发射扫描电镜观察，粒度和电势用动态激光光散射法检测。结果参见图1、图2和图3。由场发射扫描电子显微镜测定表明由离子交换法制备的壳聚糖纳米粒呈现良好的形貌，而且分散均匀（图1）；由激光粒度仪分别检测壳聚糖纳米粒的粒径以及表面电位，其平均粒径和表面电位分别为：180 nm，+58.1 mv（图2）；由激光拉曼光谱仪检测壳聚糖纳米粒的拉曼图谱（图3），其结果显示纳米粒中含有壳聚糖和聚丙烯酸成分。
本发明还提供了壳聚糖纳米粒的应用，即将该壳聚糖纳米粒用于人晶状体上皮细胞的凋亡。将上述壳聚糖纳米粒加入到对数生长期的人晶状体上皮细胞（Human Lens Epithelial Cell, HLECs）（人晶状体上皮细胞来源于第二军医大学附属长征医院），继续培养24小时，用MTT检测其对人晶状体上皮细胞的杀伤率，发现其对人晶状体上皮细胞的杀伤率大于90%。
Claims (2)
1.一种壳聚糖纳米颗粒的制备方法，该壳聚糖纳米颗粒由壳聚糖和聚丙烯酸合成，其颗粒粒径大小在150-200 nm，偏差为±20 nm的球形粒子，表面电位为：40～60 mV，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.将壳聚糖溶于浓度为1 w/v％的冰醋酸溶液中，配制成浓度为0.1～0.6 mg/ml壳聚糖溶液；
b.将浓度为0.01%～0.06 w/v %的聚丙烯酸溶液逐滴加入到步骤a所得壳聚糖溶液中，搅拌下形成乳白色混悬液，其中壳聚糖和聚丙烯酸质量比为3:1～10:1；
c.将步骤b所得的乳白色混悬液过滤，所得固体静置陈化24小时，即得到壳聚糖纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于所述的搅拌速度为：180～200 rpm。
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