CN102007218A - 一种利用自裂解蛋白lntein纯化重组目标蛋白的方法和试剂盒 - Google Patents

一种利用自裂解蛋白lntein纯化重组目标蛋白的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用自裂解蛋白Intein纯化重组目标蛋白的方法，包括：在宿主细胞中重组表达融合蛋白，所述融合蛋白包括目标蛋白结构域、自裂解Intein以及一个或多个疏水颗粒结合结构域，其中所述自裂解Intein位于所述目标蛋白结构域和所述一个或多个疏水颗粒结合结构域之间；使所述融合蛋白从宿主细胞中释放出来，加入疏水颗粒并进行孵育；收集孵育后的疏水颗粒并加入裂解液，使所述融合蛋白中的自裂解Intein发生断裂；分离除去所述疏水颗粒，从而获得含有基本上纯化的所述目标蛋白的溶液。本发明还提供了用于进行上述方法的试剂盒。

Description

一种利用自裂解蛋白 Intein纯化重组目标蛋白的方法和试剂盒. 技术领域
[0001 ] 本发明涉及重组蛋白的纯化， 更具体地说， 本发明涉及利 用自裂解蛋白 Intein纯化重组目标蛋白的方法和试剂盒。 背景技术
[0002] 目前， 蛋白表达技术已经得到有效的开发， 大部分寡肽和 多肽产品都可以生产。 然而， 这些产品往往需要进一步的纯化才能应 用， 比如生物学中的各种酶类， 临床应用的各种蛋白药物等。 传统的 蛋白纯化需要多个层析分离步骤， 往往需要针对不同的蛋白作出不同 的优化方案， 而且每一步都是比较费时费力的， 相对价格也比较贵， 而且多步的分离纯化必将导致目标蛋白产量大大降低， 蛋白活性也会 受到不同程度的影响。
[0003] 目前已经商品化的亲和纯化系统， 虽然大大简化了纯化的 步骤， 但是往往需要给目标蛋白加上多余的亲和标记片段， 比如六组 氨酸标记（6 His-tag )等。 部分可以去除标记的纯化系统， 也是需要昂 贵的蛋白酶来把亲和吸附片段从目标蛋白上切割下来， 然而所得到的 目标蛋白中必将混杂着这种蛋白酶， 它的去除又需要另外的分离步骤。 而且， 蛋白酶可能在目标蛋白内部产生非特异性切割， 导致目标蛋白 失活 ( Guan C. et al., Gene 67 ( 1987) 21 -30; Martinez et al., Biochem. J. 306 ( 1995) 589-597 ) 。
[0004] NEB 公司 ( New England Biolabs, 240 County Road, Ipswich, MA 01938-2723, United States )生产的 IMPACT-TWIN系统和 IMPACT-CN系统， 引入了称为 Intein的自裂解蛋白， 它可以在 25 °C、 pH 6.0-7.0或者 4 °C、 pH 8.0-8.5、 40 mM巯基乙醇存在的情况下， 诱导 自身与目标蛋白的断裂分离，从而获得纯化的蛋白（ Evans T. C. et al., J. Biol. Chem. 274 ( 1999) 1 8359- 18363; Evans T. C. et al. , J. Biol. Chem. 274 ( 1999) 3923-3926; Mathys S. et al., Gene 23 1 (1999) 1 - 13; Southworth M. W. et al., Biotechniques 27 (1999) 1 10-121 . ) 。 此系统避 免了蛋白纯化方法中的大部分缺点， 但是纯化所用到的几丁质层析柱 依然比较昂贵， 而且纯化效率相对较低， 不利于大规模生产。 [0005] 聚羟基脂肪酸酯（ Polyhydroxyalkanoates, 简称 PHA )是许 多微生物在非平衡生长 （如缺乏氮、 氧、 磷、 镁等） 条件下合成的一 种细胞内碳源和能源的贮藏性聚合物 ( Doi et al" Microbial. 69 (2002) 2498-2504; Anderson et al. , Microb. Rev. , 54 (1990) 450-472; Lee et al., Biotech. Bioeng. , 49 ( 1996) 1 -14 ) 。 它以不溶性脂肪颗粒的形式存在于 各种 PHA生产菌细胞内。 研究发现， PHA颗粒表面还包被着一层单层 膜结构， 由 PHA合酶 ( PHA synthase, PhaC ) 、 PHA降解酶 （ PHA depolymerase, PhaZ ) 、 颗粒结合蛋白 ( granule associated protein, PhaP/phasin ) 、 调控蛋白 ( repressor protein, autoregulator, PhaR )和单 层磷脂膜等组成 ( Steinbuchel et al. , Can. J. Microbiol. 41 (1995) 94-105; York et al., J. Bacteriol. 183 ( 1002) 2394-2397; Yamada et al., J. Bacteriol. 1 89 (2007) 1 1 18-1 127 ) 。
[0006] PHA 颗粒已经在很多经典的蛋白表达菌中成功生产， 比 ^口大肠^ 菌 ( Escherichia coli ) ( Fidler et al., FEMS Microbiol. Rev. 9 (1992) 23 1 -235 ) ； S良酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae ) ( Leaf et al., Microbiology 142 (1996) 1 169- 1 180 ) 和毕赤酵母 ( Pichia pastoris ) ( Poirier et al., FEMS Microbiol. Lett. 207 (2002) 97-102 ) 等。 只要把含 有 PHA合成相关基因的质粒转入这些菌中， PHA颗粒都能被不同程度 的合成出来。
[0007] Banki等发明了一种基于 PHA颗粒的蛋白纯化系统，它的 出现给蛋白纯化带来新的福音， 将蛋白纯化系统向着低成本生产迈出 了关键性的一步。 它将含有聚羟基丁酸酯 （ polyhydroxybutymte, PHB ) 合成基因的质粒与含有 PPPI:M ( Phasin-Phasin-Phasin-Intein-MBD ) ( Maltose Binding Domain, 简称 MBD , 麦芽糖结合蛋白的麦芽糖结合 区域） 的质粒同时转入大肠杆菌 co/， 利用 Phasin吸附 PHA颗粒的 能力， 使表达出的 PPPI:M融合蛋白结合在细胞内的 PHA颗粒上， 在 超声波破壁后， 经过蔗糖梯度离心获得纯净的 PHA颗粒， 然后在 pH 6.0、 18-23 °C的条件下诱导自裂解蛋白 Intein与 MBD的断裂分离， 再 次离心，上清液中即为较高纯度的目标蛋白（Banki et al, Protein Sci. 14 (2005) 1387- 1395; Banki et al., 美国专利公开号 US2006/0141570A 1；在 此通过援引的方式将其全部内容引入本文） 。 该方法最大的优点是可 以规模化生产纯化蛋白， 避免了使用昂贵的亲和柱和蛋白酶， 大大降 低了纯化所需费用。 但是， 该方法需要在同一宿主细胞中表达 PHA和 融合蛋白， 融合蛋白与 PHA颗粒的结合是在原核细菌体内完成的， 操 作比较复杂， 而且能够生产 PHA的菌株是有限的， 这就在一定程度上 限制了该方法的应用范围。 另外， 该方法需要通过蔗糖梯度离心获得 纯净的 PHA颗粒， 这无疑增加了操作难度和纯化成本； 而且用于临床 的蛋白药物大都属于真核细胞的蛋白质， 需要翻译后修饰才能表现其 活性， 而能够生产 PHA的真核细菌， 比如酵母， 其 PHA产量很低， 达不到高效分离蛋白的目的。 以上因素限制了该系统的应用， 特别是 在药物开发中的应用。
[0008] PHA 降解酶 （PhaZ ) 包含两个功能区域， 底物结合区域 ( substrate binding domain, 简称 SBD )和催化区域 ( catalytic domain )。 研究发现， 这两个区域由中间的 linker区域隔开，各自行使自己的功能 ( Hisano et al., J. Mol. Biol. 356 (2006) 993- 1004 ) 。 Lee等将 PhaZ的 SBD与绿色荧光蛋白 EGFP融合表达， 并成功将其固定化于 PHB微球 颗粒上（ Lee et al , Anal. Chem. 77 (2005) 5755-5759 )。这就暗示着 PhaZ 的 SBD也可能是一种好的吸附标记。
[0009] PHA合成的调控蛋白 PhaR,能够在 PHA颗粒形成前结合 在 ½尸基因和其自身基因 的启动子区域， 从而抑制两个基因的 表达。 随着 PHA颗粒的慢慢形成， 调控蛋白 PhaR就从启动子上掉下 来， 又结合到 PHA 颗粒上 （Maehara et al., J. Bacteriol. 1 84 (2002) 3992-4002 ) 。 基因的突变研究发现， 调控蛋白 PhaR也存在两个 独立的功能区域， DNA 结合区域和底物结合区域（Yamada et al., J. Bacteriol. 1 89 (2007) 1 1 18-1 127 ) 。 PhaR除了可以吸附在 PHB表面外， 还可以吸附在聚乙烯、 聚苯乙烯和聚乳酸的表面 （Yamashita et al., Biomacromolecules, 7 (2006) 2449-2454 ) , 说明 PhaR与 PHB的结合是 非特异性的， 可能只是简单的疏水性相互作用的结果。
[0010] 因此， 操作简便、 价格低廉并适合规模化生产的重组蛋白 纯化方法依然值得期待。 发明内容
[001 1 ] 本发明的一个目的是克服现行的蛋白纯化系统中步骤繁 瑣、 操作困难、 耗费昂贵以及只能小量纯化的缺点， 避免亲和层析柱 和蛋白酶等高价材料的使用， 开发一种快速、 高效、 廉价并可以规模 化生产的蛋白纯化系统。
[0012] 因此，本发明一方面提供了一种用于纯化重组目标蛋白的 方法， 包括以下步骤：
(1) 在宿主细胞中重组表达融合蛋白， 所述融合蛋白包括目标蛋白 结构域、 自裂解 Intein以及一个或多个疏水颗粒结合结构域， 其中所述 自裂解 Intein 位于所述目标蛋白结构域和所述一个或多个疏水颗粒结 合结构域之间；
(2) 使所述融合蛋白从所述宿主细胞中释放出来， 以获得含有所述 融合蛋白的溶液；
(3) 向所述溶液中加入疏水颗粒， 并在允许所述融合蛋白与所述疏 水颗粒结合的条件下进行孵育；
(4) 从所述溶液中收集孵育后的疏水颗粒；
(5) 向所述疏水颗粒中加入裂解液， 并在足以使所述融合蛋白中的 自裂解 Intein发生断裂的条件下处理所述疏水颗粒；
(6) 分离除去所述疏水颗粒， 以获得含有基本上纯化的所述目标蛋 白的溶液。
[0013] 在步骤 (4)之后还可以包括任选的对所述疏水颗粒进行洗 涤的步骤。
[0014] 本发明另一方面提供了一种用于纯化重组目标蛋白的试 剂盒， 包括： 用于在宿主细胞中重组表达融合蛋白的表达载体， 所述 融合蛋白包括目标蛋白结构域、自裂解 Intein以及一个或多个疏水颗粒 结合结构域，其中所述自裂解 I nte i n位于所述目标蛋白结构域和所述一 个或多个疏水颗粒结合结构域之间； 以及疏水颗粒。
[0015] 本发明的方法克服了 Banki等基于 PHA颗粒的蛋白纯化 系统的局限性。 在本发明的方法中， PHA 的生产和融合蛋白的表达分 开， 既可以在原核细胞内表达原核蛋白， 也可以在真核细胞内表达真 核蛋白， 然后在体外将融合蛋白与疏水颗粒结合， 这就大大扩展了这 种纯化方法的应用范围。 本发明利用聚苯乙烯、 聚乙烯、 聚乳酸等常 见的疏水性材料来制作疏水颗粒， 由于这些材料较为廉价， 而且容易 获得， 因此可以使该纯化方法得到更广泛的应用。 附图说明
[0016] 图 1 显示了利用亲脂蛋白为吸附标记的重组蛋白纯化技 术流程。
[0017] 图 2 显示了大肠杆菌原核表达的融合蛋白的质粒基因图 谱。 其中， T7 promotor表示 T7启动子， T7 terminator表示 T7终止子， SD sequence表示核糖体结合位点 （SD序列） ， lac operator表示乳糖 操纵子的操纵基因， laql表示抑制蛋白表达基因， Ssp DnaB intein表示 来自 Synechocystis species PCC6803的 intein。
[001 8] 图 3 显示了毕赤酵母真核表达的融合蛋白的质粒基因图 谱。 其中， origin表示复制起点， α-factor表示 α-因子， ORM 1表示人 αΐ -酸' )·生糖蛋白， Mth RIR1 intein 表示来自 Methanothermobacter thermautotrophicus的 intein。
[0019] 图 4显示了 3-羟基丁酸 -3-羟基己酸共聚酯（PHBHHx )疏 水颗粒的扫描电镜图。
[0020] 图 5 显示了疏水颗粒结合结构域由两个不同的颗粒结合 蛋白 Phasin构成的质粒 pP'PI-EGFP的图谱。
[0021 ] 图 6显示了利用质粒 pPI-EGFP纯化绿色荧光蛋白（ EGFP ) 的 SDS-PAGE 电泳图。 M: 蛋白分子量标准； 1 : 未诱导全菌； 2 : 诱 导全菌； 3 : 菌体破碎后上清； 4: 与颗粒结合后上清； 5 : 蛋白结合后 颗粒； 6: 第一次洗出液； 7: 笫二次洗出液； 8: Intein断裂后颗粒； 9: 目标蛋白 EGFP。
[0022] 图 7显示了 pPI-lacZ的盾粒图 i普。
[0023] 图 8 显示了利用质粒 pPI-lacZ 纯化 β-半乳糖苷酶 ( β-galactidase ) 的 SDS-PAGE 电泳图。 Μ: 蛋白分子量标准； 1 : 未 诱导全菌； 2 : 诱导全菌； 3 : 菌体破碎后上清； 4: 与颗粒结合后上清； 5 : 蛋白结合后颗粒； 6 : 第一次洗出液； 7: 第二次洗出液； 8: Intein 断裂后颗粒； 9: 目标蛋白 P-galactidase。
[0024] 图 9显示了 pPI-phaC的质粒图讲。
[0025] 图 10显示了利用质粒 pPI-phaC纯化 PHA合酶 （ PhaC ) 的 SDS-PAGE 电泳图。 M: 蛋白分子量标准； 1 : 未诱导全菌； 2 : 诱 导全菌； 3 : 菌体破碎后上清； 4: 与颗粒结合后上清； 5 : 蛋白结合后 颗粒； 6 : 第一次洗出液； 7: 第二次洗出液； 8: Intein断裂后颗粒； 9: 目标蛋白 PhaC。
[0026] 图 1 1显示了 pRI-EGFP的质粒谱图。
[0027] 图 12 显示了利用质粒 pRI-EGFP 纯化绿色荧光蛋白 ( EGFP ) 的 SDS-PAGE 电泳图。 M: 蛋白分子量标准； 1 : 未诱导全 菌； 2: 诱导全菌； 3 : 结合后上清； 4: 第一次洗出液； 5: 洗涤 1 次 后颗粒； 6: 第二次洗出液； 7: 洗涤 2次后颗粒； 8: 目标蛋白 EGFP; 9: 断裂后颗粒。
[0028] 图 13显示了 pSBDI-EGFP的质粒图谱。
[0029] 图 14显示了 pPI-taq的质粒图谱。
[0030] 图 15显示了 pPI-malE的质粒图谱。
[0031] 图 16 显示了利用质粒 pPI-malE 纯化麦芽糖结合蛋白 ( maltose binding protein, MBP ) 的 SDS-PAGE电泳图。 M: 蛋白分子 量标准； 1 : 未诱导全菌； 2: 诱导全菌； 3 : 菌体破碎后上清； 4: 与 颗粒结合后上清； 5: 蛋白结合后颗粒； 6: 洗出液； 7: Intein断裂后 颗粒； 8: 目标蛋白 MBP。
[0032] 图 17显示了 pPI-GST的质粒图谱。
[0033] 图 18显示了 pPI-luc的质粒图语。
[0034] 图 19 显示了 PHA 合酶 （ PhaC ) 作为吸附标记的质粒 pCI-EGFP的图谱。
[0035] 图 20 显示了疏水颗粒结合结构域由三个颗粒结合蛋白 Phasin构成的质粒 pPPPI-EGFP的图谱。
[0036] 图 21 显示了疏水颗粒结合结构域由两个不同亲脂蛋白 Phasin和 PhaZ的 SBD构成的质粒 pPSI-EGFP的图谱。
[0037] 图 22-图 27显示了序列 1到序列 10的核苷酸序列。 具体实施方式
[0038] 本发明一方面提供了一种用于纯化重组目标蛋白的方法， 包括以下步骤：
(1) 在宿主细胞中重组表达融合蛋白， 所述融合蛋白包括目标蛋白 结构域、 自裂解 Intein以及一个或多个疏水颗粒结合结构域， 其中所述 自裂解 Intein 位于所述目标蛋白结构域和所述一个或多个疏水颗粒结 合结构域之间； (2) 使所述融合蛋白从所述宿主细胞中释放出来， 以获得含有所述 融合蛋白的溶液；
(3) 向所述溶液中加入疏水颗粒， 并在允许所述融合蛋白与所述疏 水颗粒结合的条件下进行孵育；
(4) 从所述溶液中收集孵育后的疏水颗粒；
(5) 向收集的所述疏水颗粒中加入裂解液， 并在足以使所述融合蛋 白中的自裂解 Intdn发生断裂的条件下处理所述疏水颗粒；
(6) 分离除去所述疏水颗粒， 以获得含有基本上纯化的所述目标蛋 白的溶液。
[0039] 在步骤 (4)之后还可以包括任选的对所述疏水颗粒进行洗 涤的步骤。
[0040] 融合蛋白的重组表达可以通过将包含编码所述融合蛋白 的核酸的表达载体导入宿主细胞中并培养所述宿主细胞来进行。 在融 合蛋白表达后， 可以通过超声波破碎和 /或溶菌酶处理宿主细胞来使融 合蛋白从所述宿主细胞中释放出来。
[0041 ] 宿主细胞可以源自原核生物， 也可以原自真核生物。 适合 用于本发明的典型的原核生物包括但不限于大肠杆菌 Escherichia col" 罗氏真养杆菌 Ralstonia eutwpha、 假单胞菌属 Pseudomonas spp.、 芽孑包 杆菌属 Bacillus spp.等， 典型的真核生物包括但不限于酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 毕赤酵母 Pichia pastoris等。
[0042] 本文所用的术语"目标蛋白"是指通过本发明的蛋白纯化 方法所要获得的蛋白。 特别适合于本发明的目标蛋白包括： 例如， 绿 色荧光蛋白、 β-半乳糖苷酶、 人 αΐ -酸性糖蛋白、 taq DNA聚合酶、 谷 胱甘肽 S 转移酶等。 本发明的方法特别适合于治疗性蛋白的纯化， 例 如人酸性成纤维细胞生长因子 aFGF、 胰岛素、 白介素等。
[0043] 本文所用的术语"自裂解 Intein"、 "Intein，，、 "自裂解蛋白 Intein"可以互换使用， 是指一种蛋白质剪接元件， 起到翻译后修饰的作 用。 在蛋白纯化应用中， 往往 巴它放在目标蛋白结构域和亲和标记蛋 白结构域之间， 它可以与目标蛋白和亲和标记蛋白融合表达， 然后通 过控制温度、 pH值、 盐浓度和 /或巯基浓度， 诱导 Intein 自裂解， 释放 目标蛋白， 而 Intein 与亲和标记蛋白的融合片段依然吸附在固相介质 上， 因此达到纯化目标蛋白的目的。 常用的 Intein—般可以分别从自身 的 N端或者 C端自裂解。 适用于本发明的自裂解 Intein包括但不限于 Ssp DnaB mini-intein, Mxe GyrA intein、 Mth RIR1 intein和 See VMA 1 intein等。
[0044] 本发明中用到的自裂解蛋白 Intein可以是从目标蛋白 N末 端切割的 Intein , 如 Ssp DnaB mini-intein ( Wu et al.， Biochim. Biophys. Acta. 1387 (1998) 422-432 ) 等， 也可以是从目标蛋白 C 末端切割的 Intein , 如 Mxe GyrA intein ( Telenti et al.， J. Bacteriol. 179 ( 1997) 6378-6382 ) 、 Mth RIR1 intein ( Smith et al.， J. Bioteriol. 179 ( 1997) 7135-7155 )等。 C端裂解的 Intein对温度和 pH值比较敏感， 当温度升 高到 25 °C , 或者 pH值从 8.5降到 6.0时， Intein可以有效地断裂。 较 小的 pH值变化也避免了一些因 pH值改变带来的蛋白变性现象的发生 ( Chong S. et al" Gene 192 (1997 ) 。 N端裂解的 Intein更加值得推荐， 因为它的断裂需要巯基化合物作为引发剂， 可以得到有效的控制， 可 以达到 95%的断裂 ( Chong S. et al. , Nucleic Acids Research, 22 (1998) 5109-51 15 ) 。
[0045] 特别适用于本发明的 Intein 包括 N 端切割的 Ssp DnaB mini-intein, 可以在 pH6.0-7.0 和 /或 18-25 °C的条件下发生自裂解， C 端切割的 Mth RIR1 Intein. Mxe GyrA Intein , 可以在 pH8.5 , 40 mM巯 基存在的条件下发生自裂解。 其他的 Intein在 NEB公司的 Intein数据 库里有详细的说明 （ http：〃 www.neb.com/neb/inteins.html， 2008年 5月 9 日访问） 。
[0046] 在诱导 Intein自裂解时加入的裂解液可以是水、 緩冲溶液 或者含有巯基化合物的水性溶液等， 本领域技术人员可以根据 Intein 的种类合理选择所使用的裂解液。 例如， 对于 Ssp DnaB mini-intein, 一种优选的裂解液为 20mM Tris-Cl , 500mM NaCl , 1 mM EDTA , pH 6.0-7.0; 对于 Mth RIR1 Intein, 一种优选的裂解液为 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 40 mM DTT, pH8.0-8.5。
[0047] 本文所用的术语 "疏水颗粒结合结构域"是指融合蛋白中 能够与疏水颗粒紧密结合的部分。本发明的"疏水颗粒结合结构域 "可以 是完整的疏水颗粒结合蛋白， 例如颗粒结合蛋白 （ Phasin/PhaP )、 PHA 合酶（ PhaC )、 PHA降解酶（ PhaZ )、调控蛋白（ PhaR )、脂肪酶（ lipase )； 也可以是疏水颗粒结合蛋白的底物结合区域， 例如 PHA降解酶的底物 结合区域 ( substrate binding domain of PhaZ, ZSBD ) 、 PhaR的底物结 合区域 ( substrate binding domain of PhaR, RSBD ) 。
[0048] 本发明的"疏水颗粒结合结构域"的数目可以是一个， 也可 以是二个、 三个或更多个。 在具有多个疏水颗粒结合结构域的情况下， 这些结构域之间可以相同， 也可以不同， 例如 Phasin-Phasin、 Phasin-Phasin-Phasin 、 ZSBD-ZSBD-ZSBD 、 RSBD-RSBD-RSBD 、 PhaC-PhaC-PhaC、 Phasin-ZSBD、 ZSBD-RSBD、 Phasin-ZSBD-RSBD 等。 不受任何特定理论的约束， 结构域数目的增加有可能使得与疏水 颗粒之间的结合更为紧密， 从而提高所获得的目标蛋白的纯度。
[0049] 优选地，多个疏水颗粒结合结构域之间通过连接肽 (linker) 连接。 合适的连接肽可以是任何柔软的短肽， 它可以保证两边的蛋白 可以正确折叠成活性形式，例如 pTWIN2中的 linked， Asn Asn Gly Asn Asn Gly Leu Glu Leu Arg Glu Ser Gly ( Evans T. C. et al, J. Biol. Chem. 274 ( 1999) 1 8359- 18363 ) 。
[0050] 优选地， 自裂解 Intein与所述一个或多个疏水颗粒结合结 构域之间通过连接肽连接。 不受任何特定理论的约束， 发明人认为通 过连接肽连接有助于保证各部分蛋白折叠成正确的三维结构。
[0051 ] 优选地， 自裂解 Intein与目标蛋白结构域之间直接连接。
[0052] 在本发明一个优选实施方案中， 所述目标蛋白结构域、 自 裂解 Intein以及至少一个疏水颗粒结合结构域在同一个阅读框中。
[0053] 本发明的亲脂蛋白、 自裂解蛋白和目标蛋白组成的融合蛋 白在微生物体内优选地以可溶性蛋白形式存在， 这通常会使得纯化过 程更为方便。
[0054] 本文所用的术语 "疏水颗粒"是指由疏水材料形成并具有 疏水表面的颗粒。 本发明的疏水颗粒并不限于任何特定的形状， 可以 为球形、 卵形、 橄榄形、 方形或不规则的形状， 只要能够实现与疏水 颗粒结合结构域的紧密结合即可。 疏水颗粒的收集和 /或分离通常可以 通过离心和 /或过滤来进行。
[0055] 本发明的疏水颗粒可以按照乳液制备 ( Sanders et al. , J. Am. Chem. Soc. 1 16 (1993) 2695-2702 ) 或者单体聚合 （Yang et al., Journal of Magnetism and Magnetic Materials 293 (2005) 1 87-192 ) 的方 法制备。 [0056] 例如， 一种典型的疏水颗粒的制备方法如下：
(1) 油相溶液： 将疏水性高分子材料（PHA、 PCL、 PMMA等）按 5% ( w/v ) 溶解于氯仿中；
(2) 水相溶液.' 将表面活性剂（ 10mM油酸钠、 1% w/v的 PVA等） 溶解到水中；
(3) 将水相溶液倒入油相溶液中， 油相与水相的体积比为 20: 1， 超声成乳液（输出功率 50%，工作 1秒，间隙 1秒，总时间 10-30分钟）；
(4) 用旋转蒸发仪除去乳液中的氯仿， 即为需要的疏水颗粒乳液， 室温保存， 用时离心取沉淀的颗粒即可。
[0057] 例如， 本发明特别优选的 3-羟基丁酸 -3-羟基己酸共聚酯 ( PHBHHx ) 颗粒的扫描电镜图见图 4。
[0058] 本发明的疏水颗粒的尺寸没有特定的要求，原则上颗粒粒 径越小， 与蛋白质的接触面积越大， 单位质量的颗粒能够承载的蛋白 就越多， 但同时可能会增加离心收集颗粒的难度。
[0059] 用于制备本发明的疏水颗粒的材料可以是具有较好脂溶 性的疏水高分子材料， 也可以是能够通过单体聚合的方式形成微颗粒 的疏水高分子材料。 合适的具体的疏水性材料包括： 聚乙烯、 聚乙烯 醇、 聚苯乙烯、 聚乳酸、 聚己内酯、 聚丙烯、 聚曱基丙烯酸曱酯、 聚 氯乙烯等疏水性高分子材料， 特别是聚羟基丁酸酯、 羟基丁酸和羟基 戊酸共聚物、 羟基丁酸和羟基己酸共聚物、 聚羟基辛酸酯、 聚羟基庚 酸酯、 聚羟基癸酸酯、 羟基丁酸和羟基辛酸共聚物、 羟基丁酸羟基戊 酸和羟基己酸共聚物等疏水性 PHA材料。 聚羟基丁酸酯、 羟基丁酸和 羟基戊酸共聚物是特别优选的疏水性 PHA材料。
[0060] 在本发明一个特别优选的实施方案中，疏水颗粒中包裹有 磁性颗粒。 在这种情况下， 疏水颗粒的收集和 /或分离可以便捷地通过 使用磁铁来进行， 从而大大简化了纯化工艺。 在一个优选实施方案中， 所述疏水颗粒包含超顺磁磁粉组成的核心 , 该核心外面包被着疏水材 料。 在一个特别优选实施方案中， 所述超顺磁磁粉为 Fe304磁粉。 本发 明中所述的磁粉应具有较高的磁感应系数。
[0061] 在本发明一个特别优选的实施方案中， 结合液的成分为 Tris-Cl , 10 mM, pH 8.5; 洗涤液的成分为 Tris-CL, 10 mM, pH 6.5。
[0062] 本文所用的术语 "任选 "表示 "可有可无"或"非必需 "等含 义。"任选的洗涤步骤"是指可以有该洗涤步骤，也可以没有该洗涤步骤， 这可以由本领域技术人员根据情况进行选择。
[0063] 本文所用的术语"基本上纯化的 "目标蛋白是指根据分子 生物学领域的常规分析手段和通常标准， 本领域技术人员能够确定所 述目标蛋白是纯的。 例如， 在使用色谱例如 HPLC分析目标蛋白纯度 时， 蛋白纯度在 90 %以上， 优选 95 %以上； 或者， 在使用 SDS-PAGE 分析目标蛋白纯度时， 杂蛋白的条带几乎不可见， 按照分子生物学的 通常标准可以被认为不存在。
[0064] 本发明的重组蛋白可以按照以下代表性的方案进行纯化：
1 )用大肠杆菌等原核表达系统或者毕赤酵母等真核表达系统表达 生产本发明的含有目标蛋白的融合蛋白；
2 ) 通过溶菌酶或者超声波等方法裂解菌体， 并离心收集上清液；
3 ) 将上清液与疏水颗粒或包裹有磁性颗粒的疏水颗粒共同孵育， 使融合蛋白结合到疏水颗粒表面；
4 ) 用离心或磁铁收集疏水颗粒， 洗涂几次；
5 ) 加入裂解液孵育适当的时间；
6 ) 用离心或磁铁使颗粒沉淀， 收集上清液， 此上清液即为具有较 高纯度的目标蛋白溶液。
[0065] 本发明另一方面提供了一种用于纯化重组目标蛋白的试 剂盒， 包括： 用于在宿主细胞中重组表达融合蛋白的表达载体， 所述 融合蛋白包括目标蛋白结构域、自裂解 Intein以及一个或多个疏水颗粒 结合结构域，其中所述自裂解 Intein位于所述目标蛋白结构域和所述一 个或多个疏水颗粒结合结构域之间； 以及疏水颗粒。
[0066] 所述试剂盒还可以包括用于容纳裂解液的容器。 当疏水颗 粒中包裹有磁性颗粒， 所述试剂盒还可以包括磁铁， 用于收集和 /或分 离疏水颗粒。
[0067] 下面将结合实施例对本发明进行更为具体的描述。这些实 施例仅仅是出于更好地解释本发明的目的， 不以任何形式构成对本发 明保护范围的限制。
[0068] 实验中所用到的菌种和质粒见表 1， 限制性内切酶均购自 NEB公司， DNA聚合酶 2xPfu Master Mix购自北京天根生物技术有限 公司， 用于小于 4kb 的片段基因的克隆， PrimeSTAR HS DNA Polymerase购自 Takara公司，用于长片段基因的克隆， DNA ligation Ver. 2.0购自 Takara公司， 其他生化试剂购自上海生物工程有限公司， 聚合 酶链式反应、 DNA连接、 酶切及其它基因操作方法参考 《分子克隆实 验指南》 （Sambrook等， 1989) 。 实施例 1 颗粒结合蛋白 Phasin、 自裂解蛋白 Intein 和绿色荧光蛋白 EGFP的融合体的制备及 EGFP的分离纯化 一、 融合表达质粒 pPI-EGFP (图 2 ) 和 pP'PI-EGFP (图 5 ) 的构建， 分另1 J用于表达 phasin-intein-EGFP ό々融合蛋白和 phasin' -phasin- intein-EGFP的融合蛋白
[0069] 我们在质粒 pTWINl的基础上进行改造，构建所需要的表 达质粒。在 pPI-EGFP的构建中， 首先用 PCR获得颗粒结合蛋白 phasin 的表达基因 phaP 序^ 1 ,见图 22 ),phaP\是以 Aeromo扁 hydrophila 4AK4的基因组为模板， PCR获得， PCR反应条件： 94°C, 3分钟； （94 。C, 30秒； 55°C， 30秒； 72°C, 22秒） 重复 30次； 72°C， 5分钟； HOLD 4°C。 然后 PCR获得 pTWINl质粒中的 CBD1 以外片段， PCR 反应条件为 94°C, 3分钟； （94°C, 30秒； 55。C , 30秒； 72°C, 7分 10秒） 重复 30次； 72°C, 5分钟； HOLD 4°C。 平末端连接； 尸 1片 段和 pTWINl质粒中的 CBD1 以外片段， 不改变其他任何序列， 然后 在限制性酶切位点 Xho\和 B纖 HI之间插入绿色荧光蛋白基因 EGFP, EGFP是以质粒 pEGFP-Nl为模板， PCR获得， PCR反应条件： 94°C， 3分钟； （94°C， 30秒； 55°C, 30秒； 72°C, 45秒） 重复 30次； 72 V, 5分钟； HOLD4°C。 在质粒 pP'PI-EGFP的构建中， 将另外一种颗 粒结合蛋白 phasin，的表达基因 phaP2 (序列 2, 见图 22) 插入到质粒 pPI-EGFP的 Nde\位点即可。其中， phaP2是以 Ralstonia eutropha H 16 的基因组为模板， PCR获得， PCR反应条件： 94°C, 3分钟； （94°C, 30秒； 55°C, 30秒； 72°C, 35秒） 重复 30次； 72°C， 5分钟； HOLD 4°C。 最终构建后的质粒送往 invitrogen公司测序验证序列的正确性。 为方便基因操作， 根据需要在 PCR的引物中添加相应的酶切位点， 所 需引物见表 2。 二、 蛋白表达
[0070] 1. 将构建好的表达质粒转化入 co/ BL21 (DE3), 挑单 菌落于 20 ml LB培养基（Amp, 100 g/ml ) , 37°C培养过夜， 即为种 子液。
[0071] 2. 按 1%接种量， 取 2 ml种子液加入 200 ml LB培养基 (Amp, 100 g/ml) , 37°C培养至 OD600为 0.4-0.6, 加入 IPTG至终浓 度为 0.5 mM, 15°C诱导过夜。 三、 菌体收集与菌体破碎
[0072] 1. 离心收集菌体， 加入 20 ml蒸馏水洗涤一次， 再次离 心收集菌体。
[0073] 2. 加入 20 ml 结合液（ Tris-CL, 10 mM, pH 8.5 ) 混匀， 置于水上。
[0074] 3. 超声破碎 （50%输出功率， 工作 1秒， 间隙 2秒， 时 间约 10分钟， 至菌体呈半透明状） 。
[0075] 4. 离心收集上清 （ 11000 rpm, 4°C, 30min ) , 上清 -20
°C保存。 四、 结合实验
[0076] 1. 取 20 ml PHBHHx疏水颗粒乳液， 11000 rpm离心 10 分钟， 收集颗粒。
[0077] 2. 加入 2ml蛋白上清， 用枪头吹散， 重新悬浮颗粒， 可 稍 漩涡混匀。
[0078] 3.4°C静置 1-4小时。 五、 洗涤与裂解
[0079] 1. 结合后的颗粒用 10 1结合液（丁1^-0^ 101111^ 118.5) 洗涤 2次， 注意每次要用枪吹散颗粒， 然后稍微漩涡混匀。
[0080] 2. 再用 2 ml裂解液 （Tris-CL, 10 mM, pH 6.5 ) 洗涤 1 次。
[0081] 3. 加入 l ml裂解液， 用枪混匀， 25°C静置 12-36小时， 诱 导 Intein断裂。 [0082] 4. 离心收集上清液，此上清液即为具有较高纯度的目标蛋 白溶液， SDS-PAGE电泳图见图 6。
[0083] 结果表明可以得到较纯的目标蛋白 EGFP。 实施例 2 颗粒结合蛋白 Phasin、 自裂解蛋白 Intein和 ( β-galactosidase, β-gal ) 的融合体的制备及 β-半乳糖苷酶的分离纯化 一、融合表达质粒 pPI-lacZ(图 7)的构建， 用于表达 phasin-intein-p-gal 融合蛋白。
[0084] β-半乳糖苷酶的编码基因 / cZ (序列 3, 见图 23 ) , 是以 co/ S17-1的基因组为模板， PCR获得， PCR反应条件： 94°C， 3分 钟； （94°C， 30秒； 55°C, 30秒； 72°C, 3分 10秒） 重复 30次； 72 V, 5分钟； HOLD4°C。 将该基因插入质粒 pPI-EGFP的 ^^ GIA8a HI 位点即可。 所需引物见表 2。 二、 表达与纯化步骤同实施实例 1 的步骤二至五。 所使用的疏水颗粒 为聚乳酸 ( polylactic acid, PLA ) 。 SDS-PAGE电泳图见图 8。
[0085] 结果表明可以得到较纯的目标蛋白 p-galactosidase。 实施例 3 颗粒结合蛋白 Phasin、 自裂解蛋白 Intein和 PHA合酶 PhaC 的融合体的制备及 PhaC的分离纯化 一、融合表达质粒 pPI-phaC(图 9)的构建，用于表达 phasin-intein-PhaC 融合蛋白。
[0086] /^C基因（序歹 'J 4， 见图 24 )是以 Ralstonia eutropha HI 6 的基因组为模板， PCR获得， PCR反应条件： 94°C, 3分钟； （94°C, 30秒； 55。C, 30秒； 72 °C, 1分 50秒） 重复 30次； 72°C， 5分钟； HOLD 4°C。 然后将该基因插入质粒 pPI-EGFP的 BsrGl/Bamm位点即 可。 所需引物见表 2。 二、 表达与纯化步骤同实施实例 1 的步骤二至五。 所使用的疏水颗粒 为 3-羟基丁酸 -3-羟基戊酸共聚酯 （ poly-3-hydroxybutyrate-co- 3-hydroxyvalerate, PHBV ) 。 SDS-PAGE电泳图见图 10。
[0087] 由于 PHA合成酶 PhaC也具有很强的颗粒结合能力，诱导 Intein断裂后的 PhaC都结合到疏水性颗粒表面， 所以未能得到纯化出 的目的蛋白 PhaC。 实施例 4 抑制蛋白 PhaR、 自裂解蛋白 Intein和绿色荧光蛋白 EGFP 的融合体的制备和 EGFP的分离纯化 一、融合表达质粒 pRI-EGFP(图 11 )的构建，用于表达 PhaR-intein-EGFP 融合蛋白。
[0088] phaR基因（序列 5 , 见图 22 )是以 Ralstonia eutropha HI 6 的基因组为模板， PCR获得， PCR反应条件： 94°C, 3分钟； （94°C, 30秒； 55°C, 30秒； 72°C, 25秒） 重复 30次； 72°C, 5分钟； HOLD 4 °C。 以质粒 pPI-EGFP为模板 , 扩增 phasin以外片段 IE , PCR反应条 件： 98°C, 2分钟； （98°C, 10秒； 55°C， 10秒； 72°C， 7分 10秒） 重复 30次； 72 °C, 5分钟； HOLD4°C， 并以 Bgni和 Hn Ul双酶切位 点连接 和 IE片段。 所需引物见表 2。 二、 表达与纯化步骤同实施实例 1 的步骤二至五。 所使用的疏水颗粒 为聚 3-羟基丁酸酯 （PHB) 。 SDS-PAGE电泳图见图 12。
[0089] 结果表明可以得到较纯的目标蛋白 EGFP。 实施例 5 PHA降解酶 PhaZ的底物结合区域（ ZSBD ) 、 自裂解蛋白 Intein和目标蛋白 EGFP的融合体的制备 一、 融合表达质粒 pSBDI-EGFP ( 图 13 ) 的构建， 用于表达 ZSBD-intein-EGFP融合蛋白。
[0090] ZSBD基因（序歹 'J 6,见图 22 )是以 Ralstonia eutropha HI 6 的基因组为模板， PCR获得， PCR反应条件： 94°C， 3分钟； （94°C， 30秒； 55°C, 30秒； 72°C， 20秒） 重复 30次； 72°C, 5分钟； HOLD 4°C。 以质粒 pPI-EGFP为模板， 扩增 phasin以外片段 IE, PCR反应条 件： 98°C, 2分钟； （98°C， 10秒； 55°C， 10秒； 72°C, 7分 10秒） 重复 30次； 72 °C, 5分钟； HOLD4°C, 并以 和 /m/III双酶切位 点连接 ZSBD和 IE片段。 所需引物见表 2。 二、 表达与纯化步骤同实施实例 1 的步骤二至五。 所使用的疏水颗粒 为聚己内酯 （ polycaprolacton, PCL ) 。
[0091] 结果表明可以得到较纯的目标蛋白 EGFP。 实施例 6 真核表达体系 Pichia pastoris Gl 15表达 PHA颗粒结合蛋白 Phasin、 自裂解蛋白 Intein和 human al-acid glycoprotein ( ORMl )的融 合体的制备及 ORMl分离纯化 一、 酵母表达质粒 pSIOP (图 3 )的构建， 用于表达 ORMl-intein-phasin 融合蛋白。
[0092] 在质粒 pGAPZaA的基础上进行改造，先将 尸基因（序 列 2 )插入 KpnVXba 双酶切位点， 将 ORM1基因 （序列 7， 见图 25 ) 插入 Nsi Kpd双酶切位^, 然后将 Intein基因插入^/?«1酶切位点， 所 得质粒即为 pSIOP。 /? 尸基因是以 Ralstonia eutropha H 6的基因组为 模板， PCR获得， PCR反应条件： 94°C， 3分钟； （94°C, 30秒； 55 °C, 30秒； 72 °C, 35秒）重复 30次； 72 °C, 5分钟； HOLD4°C。 Intein 是以 pTWINl为模板， PCR获得， PCR反应条件： 94°C， 3分钟； （94 °C, 30秒； 55°C, 30秒； 72°C, 30秒） 重复 30次； 72°C， 5分钟； HOLD 4°C。 human al-acid glycoprotein ( ORMl )基因从人类肝脏 cDNA 文库 PCR获得， PCR反应条件： 94°C, 3分钟； （94°C, 30秒； 55°C, 30秒； 72°C, 36秒） 重复 30次； 72°C, 5分钟； HOLD 4°C。 所需引 物见表 2。 二、 蛋白表达
[0093] 1. 将构建好的表达质粒电转化入尸 c/na/?ostor^GS115， 涂于含有 100 g/ml Zeocin的 YPDS培养平板上。挑单菌落于 20 ml YPD 培养基 （Zeocin, 100 g/ml ) , 30°C培养至 OD600为 1左右， 即为种 子液。
[0094] 2. 按 1%接种量，取 2 ml种子液加入 200 ml YPD培养基， 30°C培养 2-3天。 三、 结合实验
[0095] 1. 离心收集培养基上清 lOOOrpm, 4°C, 30min ) , 上 清 -20°C保存。
[0096] 2. 取 20 ml PHB疏水颗粒乳液， 11000 rpm离心 10分钟， 收集颗粒。
[0097] 3. 加入 2 ml蛋白上清， 用枪头吹散， 重新悬浮颗粒， 可 稍敖漩涡混匀。
[0098] 4.4°C静置 1-4小时。 四、 洗涤与裂解
[0099] 1. 结合后的颗粒用 10 ml结合液洗涂 2次， 注意每次要 用枪吹散颗粒， 然后稍微漩涡混匀。
[0100] 2. 再用 2 ml裂解液（ Tris-CL， 10 mM, pH 6.5 ) 洗涤 1 次。
[0101] 3. 加入 l ml裂解液， 用枪混匀， 25°C静置 12-36小时， 诱导 Intein断裂。
[0102] 4. 离心收集上清液， 此上清液即为具有较高纯度的目标 蛋白溶液。
[0103] 结果表明可以得到较纯的目标蛋白 0RM1。 实施例 Ί 颗粒结合蛋白 Phasin、 自裂解蛋白 Intein和 taq DNA聚合酶 的融合体的制备及 taq DNA聚合酶的分离纯化 一、 融合表达质粒 pPI-taq (图 14 ) 的构建， 用于表达 phasin-intein-taq 融合蛋白。
[0104] 将 Taq酶基因（序列 8 ,见图 26 )PCR获得后插入 pPI-EGFP 的 和 Sa HI位点， PCR反应条件： 94°C， 3分钟； （94°C, 30 秒； 55°C, 30秒； 72°C, 2分 30秒）重复 30次； 72°C, 5分钟； HOLD 4°C。 由于 taq基因内部有 BamHI酶切位点， 在设计引物时改用 BamHl 的同尾酶 5g/II。 所需引物见表 2。 二、 表达与纯~化步骤同实施实例 1 的步骤二至五。 所使用的疏水颗粒 为聚乙烯 ( polyethylene, PE ) 。
[0105] 结果表明可以得到较纯的目标蛋白 taqDNA聚合酶。 实施例 8 颗粒结合蛋白 Phasin、 自裂解蛋白 Intein和目标蛋白麦芽糖 结合蛋白 MBP的融合体的制备及 MBP的分离纯化 一、融合表达质粒 pPI-malE(图 15 )的构建，用于表达 phasin-intein-MBP 融合蛋白。
[0106] malE 基因 （编码 MBP 蛋白， 序列 9, 见图 25 ) 是以 pMAL-C2x为模板， PCR获得， PCR反应条件： 94 °C, 3分钟； （94 °C， 30秒； 55°C, 30秒； 72°C, 1分 10秒） 重复 30次； 72°C, 5分 钟； HOLD 4°C。 然后将 malE基因插入 pPI-EGFP的 BsKH和 Bamlil 位点。 所需引物见表 2。 SDS-PAGE电泳图见图 16。
二、 表达与纯化步骤同实施实例 1 的步骤二至五。 所使用的疏水颗粒 为 PHBHHx。
[0107] 结果表明可以得到较纯的目标蛋白 MBP。 实施例 9 颗粒结合蛋白 Phasin、 自裂解蛋白 Intein和谷胱甘肽 S转移 酶 （GST) 的融合体的制备及 GST的分离纯化 一、融合表达质粒 pPI-GST(图 17 )的构建，用于表达 phasin-intein-GST 融合蛋白。
[0108] GST基因 （序列 10, 见图 27)是以 pGEX-4T3为模板， PCR获得， PCR反应条件： 94°C， 3分钟； （94°C， 30秒； 55°C， 30 秒； 72°C, 40秒）重复 30次； 72°C, 5分钟； HOLD4°C。 然后将 GST 基因插入 pPI-EGFP的 BsrGl和 Baml 位点。 所需引物见表 2。
二、 表达与纯化步骤同实施实例 1 的步骤二至五。 所使用的疏水颗粒 为 PHB。 [0109] 结果表明可以得到较纯的目标蛋白 GST。 实施例 10 颗粒结合蛋白 Phasin、 自裂解蛋白 Intein 和发光素酶 luciferase的融合体的制备及 luciferase的分离纯化 一、 融合表达质粒 pPI-luc (图 18) 的构建， 用于表达 phasin-intein- luciferase融合蛋白。
[0110] Luc基因 （序列 11， 见图 27)是以 OI和 iW2HI双酶切 下质粒 pGL-promotor的 luc基因部分。 然后将 luc基因插入 pPI-EGFP 的相应位点。 二、 表达与纯化步骤同实施实例 1 的步骤二至五。 所使用的疏水颗粒 为聚苯乙烯 （ polystyrene, PS ) 。
[0111] 结果表明可以得到较纯的目标蛋白 ludferase。 实施例 11 PHA合成酶 PhaC、自裂解蛋白 Intein和绿色荧光蛋白 EGFP 的融合体的制备及 EGFP的分离纯化 一、融合表达盾粒 pCI-EGFP(图 19)的构建，用于表达 PhaC-intein-EGFP 融合蛋白。
[0112] /?/wC基因 （序歹l 4 )是以 Ralstonia eutropha H16的基因 组为模板， PCR获得， PCR反应条件： 94 °C, 3分钟； （94°C， 30秒； 55°C, 30秒； 72°C, 1分 50秒） 重复 30次； 72°C, 5分钟； HOLD 4 °C。 然后插入质粒 pRI-EGFP的 和^ z HI位点。 由于 phaC基因 内部有 酶切位点， 在设计引物的时候用 Sg/II的同尾酶 Sa HI代 替 g/II。 所需引物见表 2。
二、 表达与纯化步骤同实施实例 1 的步骤二至五。 所使用的疏水颗粒 为聚丙玲 ' ( polypropylene, PP ) 。
[0113] 结果表明可以得到较纯的目标蛋白 EGFP。 实施例 12 三个颗粒结合蛋白 Phasin与自裂解蛋白 Intein和绿色荧光 蛋白 EGFP融合体的制备及 EGFP的分离纯化 一、 融合表达质粒 pPPPI-EGFP ( 图 20 ) 的构建， 用于表达 phasin-phasin-phasin-intein-EGFP融合蛋白。
[0114] 以 pRI-EGFP为基础进行改造， 首先在 Bglll/Hindlll之间 插入 phaP2 ( phaP+l QX ) 片段， 然后在 Bg 位点插入 phaP\ ( phaP+\m x ) ， 在 Hindlll位点插入；? /wt尸 3 ( phaP ) 。 phaP\、 phaP2 和 /7 ^尸 3是以质粒 pPI-EGFP为模板， PCR获得， 片段长度相差很小， 采用相同的 PCR反应条件： 94°C， 3分钟； （94°C, 30秒； 55°C, 30 秒； 72°C, 25秒） 重复 30次； 72°C, 5分钟； HOLD 4°C。 所需引物 见表 2。 二、 表达与纯化步骤同实施实例 1 的步骤二至五。 所使用的疏水颗粒 为聚曱基丙烯酸甲酯 （ polymethylmethacrylate, PMMA ) 。
[0115] 结果表明可以得到较纯的目标蛋白 EGFP。 实施例 13 颗粒结合蛋白 Phasin、 PHA降解酶的底物绑定区域 ZSBD、 自裂解 Intein和绿色荧光蛋白 EGFP融合体的制备及 EGFP的分离纯化 一、 融合表达质粒 pPSI-EGFP ( 图 21 ) 的构建， 用 于表达 phasin-ZSBD-intein-EGFP融合蛋白。
[0116] 以 pRI-EGFP为基础进行改造， 首先在 Bgl丽 indlU之间 插入 phaP ( phaP+linkQT )片段， 然后在 fiindlll位点插入 ZSBD。 phaP 是以质粒 pPI-EGFP为模板， PCR获得， PCR反应条件： 94 °C, 3分 钟； （94°C, 30秒； 55°C, 30秒； 72°C， 25秒） 重复 30次； 72°C, 5 分钟； HOLD4°C。 SBD基因是以质粒 pRI-EGFP为模板， PCR获得， PCR反应条件： 94°C, 3分钟； （94°C, 30秒； 55°C， 30秒； 72°C, 20秒） 重复 30次； 72°C, 5分钟； HOLD4°C。 所需引物见表 2。 二、 表达与纯化步骤同实施实例 1 的步骤二至五。 所使用的疏水颗粒 为聚氯乙烯 ( polyvinyl chloride, PVC )
[0117] 结果表明可以得到较纯的目标蛋白 EGFP。 [01 18] 本文中所涉及的参考文献， 包括专利文件、 学术论文、 出 版物等， 均以引用的方式将其全部内容包括在本文中。
[01 19] 应当理解， 在不偏离本发明的精神和范围的情况下， 本领 域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进， 而 这些均被认为落入了本发明的保护范围。
[0120] 表 1 菌种和质粒
菌种和质粒 相关特性 来源或参考文献 菌种
E. co// XL 1 -Blue recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR 17 Stratagene
supE44 relAl lac [F' proAB lacIqZ
ΔΜ15 TnlO (Tetr)]
E. coli SI 7-1 recA pro hsdR RP4-2-Tc::Mu-Km:: Tn7 ATCC NO.47055
E. coli BL21 (DE3) E. coli B F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) Stratagene
gal λ(ϋΕ3)
Aeromonas hydrophila 清华大学微生物 4AK4 实验室保藏
Ralstonia eutropha H16 清华大学微生物 实验室保藏
Pichia pastoris GS115 Invitrogen 质粒
pTWINl 含有 Ssp DnaB mini intein和 Mxe GyrA New England mini intein的基因 Biolabs, NEB pGEX-4T3 含有谷胱甘肽 （GST) 的基因 GE healthcare life sciences pGL-promotor 含有荧光素酶 ( luciferase ) 的基因 Promega pMAL-c2x 含有麦芽糖结合蛋白 （MBP ) 的基因 Biolabs, NEB pGAPZaA 酵母表达质粒 Invitrogen
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P1R CCCAAGCTTTCCGGACTCGCGCAGTTCG
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pPPPI-EGFP phaPX GCTTTACC
P2R GAAGATCTTCCGGACTCGCGCAGTTCG
CCCAAGCT ATGAATATGGACGTGATCAAGA
P3F
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P3R CCCAAGCTTGGCCTTGCCCGTGCTCTTCT
GAAGATCTATGAATATGGACGTGATCAAGA
P 1F
phaP GCTTTACC
pPSI-EGFP P2R CCCAAGCTTTCCGGACTCGCGCAGTTCG
SF CCCAAGCTTATGGTCGAGGGCGATGCGGAT
ZSBD
SR CCCAAGCTTCCTGGTGGCCGAGGCCT

Claims (30)

  1. 权 利 要 求
    1. 一种用于纯化重组目标蛋白的方法， 包括以下步骤：
    (1 ) 在宿主细胞中重组表达融合蛋白， 所述融合蛋白包括目标蛋白 结构域、 自裂解 Intein以及一个或多个疏水颗粒结合结构域， 其中所述 自裂解 Intein 位于所述目标蛋白结构域和所述一个或多个疏水颗粒结 合结构域之间；
    (2) 使所述融合蛋白从所述宿主细胞中释放出来， 以获得含有所述 融合蛋白的溶液；
    (3) 向所述溶液中加入疏水颗粒， 并在允许所述融合蛋白与所述疏 水颗粒结合的条件下进行孵育；
    (4) 从所述溶液中收集孵育后的疏水颗粒；
    (5) 向所述疏水颗粒中加入裂解液， 并在足以使所述融合蛋白中的 自裂解 Intein发生断裂的条件下处理所述疏水颗粒；
    (6) 分离除去所述疏水颗粒， 以获得含有基本上纯化的所述目标蛋 白的溶液。
  2. 2. 权利要求 1的方法， 其中在步骤 (4)之后还包括任选的对所述疏 水颗粒进行洗涤的步骤。
  3. 3. 权利要求 1的方法， 其中所述宿主细胞源自原核生物。
  4. 4. 权利要求 3的方法， 其中所述原核生物选自由 Escherichia coli、 Ralstonia eutropha » Pseudomonas spp.、 Bacillus spp.构成的组。
  5. 5. 权利要求 1的方法， 其中所述宿主细胞源自真核生物。
  6. 6. 权利要求 5 的方法， 其中所述真核生物选自由 Saccharomyces cerevisiae、 Pichia pastoris构成的组。
  7. 7. 权利要求 1 的方法， 其中所述自裂解 Intein选自由 Ssp DnaB mini-intein、 Mxe GyrA intein, Mth RIR1 intein和 See VMA1 intein构成 的组。
  8. 8. 权利要求 1 的方法， 其中所述疏水颗粒结合结构域选自由 Phasin、 PhaZ、 PhaR、 PhaC、 lipase , ZSBD和 RSBD构成的组。
  9. 9. 权利要求 1 的方法， 其中所述疏水颗粒结合结构域的数目为 1 个、 2个或 3个。
  10. 10. 权利要求 1的方法，其中所述多个疏水颗粒结合结构域不完全 相同。
  11. 1 1. 权利要求 1的方法，其中所述一个或多个疏水颗粒结合结枸域 选自 由 Phasin-Phasin、 Phasin-Phasin-Phasin、 ZSBD-ZSBD-ZSBD、 RSBD-RSBD-RSBD PhaC-PhaC-PhaC, Phasin-ZSBD, ZSBD-RSBD、 Phasin-ZSBD-RSBD构成的组。
  12. 12. 权利要求 1的方法，其中所述多个疏水颗粒结合结构域之间通 过连接肽连接。
  13. 13. 权利要求 1的方法， 其中所述自裂解 Intein与所述一个或多个 疏水颗粒结合结构域之间通过连接肽连接。
  14. 14. 权利要求 1的方法， 其中所述自裂解 Intein与所述目标蛋白结 构域之间直接连接。
  15. 15. 权利要求 1的方法， 其中所述目标蛋白结构域、 自裂解 Intein 以及至少一个疏水颗粒结合结构域在同一个阅读框中。
  16. 16. 权利要求 1的方法，其中所述重组表达是通过将包含编码所述
    ^进行的。' 、 、 、
  17. 17. 权利要求 1的方法， 其中所述疏水颗粒由选自聚乙浠、 聚乙烯 醇、 聚苯乙烯、 聚乳酸、 聚己内酯、 聚丙烯、 聚甲基丙婦酸曱酯、 聚 氯乙烯构成的组的疏水性高分子材料形成。
  18. 18. 权利要求 1的方法， 其中所述疏水颗粒由选自聚羟基丁酸酯、 羟基丁酸和羟基戊酸共聚物、 羟基丁酸和羟基己酸共聚物、 聚羟基辛 酸酯、 聚羟基庚酸酯、 聚羟基癸酸酯、 羟基丁酸和羟基辛酸共聚物、 羟基丁酸羟基戊酸和羟基己酸共聚物构成的组的疏水性 PHA 材料形 成。
  19. 19. 权利要求 1 的方法， 其中所述疏水颗粒的收集和 /或分离通过 离心和 /或过滤进行。
  20. 20. 权利要求 1的方法， 其中所述疏水颗粒中包裹有磁性颗粒。
  21. 21. 权利要求 1的方法，其中所述疏水颗粒中包含超顺磁磁粉组成 的核心， 该核心外面包被着疏水材料。
  22. 22. 权利要求 21的方法， 其中所述超顺磁磁粉为 Fe<sub>3</sub>0<sub>4</sub>磁粉。
  23. 23. 权利要求 20的方法， 其中所述疏水颗粒的收集和 /或分离通过 4吏用磁铁来进行。
  24. 24. 一种用于纯化重组目标蛋白的试剂盒， 包括：
    用于在宿主细胞中重组表达融合蛋白的表达载体， 所述融合蛋白 包括目标蛋白结构域、自裂解 Intein以及一个或多个疏水颗粒结合结构 域，其中所述自裂解 Intein位于所述目标蛋白结构域和所述一个或多个 疏水颗粒结合结构域之间； 以及 .
    疏水颗粒。
  25. 25. 权利要求 24的试剂盒， 其中所述疏水颗粒由选自聚乙烯、 聚 乙烯醇、 聚苯乙烯、 聚乳酸、 聚己内酯、 聚丙婦、 聚曱基丙烯酸甲酯、 聚氯乙烯构成的组的疏水性高分子材料形成。
  26. 26. 权利要求 24的试剂盒， 其中所述疏水颗粒由选自聚羟基丁酸 酯、 羟基丁酸和羟基戊酸共聚物、 羟基丁酸和羟基己酸共聚物、 聚羟 基辛酸酯、 聚羟基庚酸酯、 聚羟基癸酸酯、 羟基丁酸和羟基辛酸共聚 物、 羟基丁酸羟基戊酸和羟基己酸共聚物构成的组的疏水性 PHA材料 形成。
  27. 27. 权利要求 24的试剂盒，其中所述疏水颗粒中包裹有磁性颗粒。
  28. 28. 权利要求 24的试剂盒， 其中所述疏水颗粒中包含超顺磁磁粉 组成的核心， 该核心外面包被着疏水材料。
  29. 29. 权利要求 28的试剂盒， 其中所述超顺磁磁粉为 Fe<sub>3</sub>0<sub>4</sub>磁粉。
  30. 30. 权利要求 24的试剂盒， 其中还包括磁铁。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2618632T3 (es) 2011-09-28 2017-06-21 Zera Intein Protein Solutions, S.L. Inteínas divididas y usos de éstas
US20140073022A1 (en) * 2012-09-10 2014-03-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Production of polyhydroxyalkanoates with a defined composition from an unrelated carbon source

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060141570A1 (en) * 2004-11-16 2006-06-29 Wood David W Intein-mediated protein purification using in vivo expression of an aggregator protein
US20060263432A1 (en) * 2003-05-02 2006-11-23 Canon Kabushiki Kaisha Polyhydroxyalkanoate-containing magnetic structure, and manufacturing method and use thereof

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4177177A (en) * 1976-03-26 1979-12-04 El Aasser Mohamed S Polymer emulsification process
AU8951191A (en) * 1990-10-29 1992-05-26 Dekalb Plant Genetics Isolation of biological materials using magnetic particles
US6337215B1 (en) * 1997-12-01 2002-01-08 International Business Machines Corporation Magnetic particles having two antiparallel ferromagnetic layers and attached affinity recognition molecules
CN1635119A (zh) * 2003-12-25 2005-07-06 张小如 一种生产老年性痴呆致病物质淀粉样变多肽β(Aβ)的方法及其产物
WO2005095969A1 (ja) * 2004-03-30 2005-10-13 Universal Bio Research Co., Ltd. 反応性色素結合磁性粒子及びタンパク質分離精製法
CN1817902A (zh) * 2006-03-07 2006-08-16 山西大学 一种重组蝎昆虫毒素及其可溶性表达和纯化方法
CN100365012C (zh) * 2006-07-04 2008-01-30 湖南大学 采用超顺磁性硅壳纳米颗粒静电吸附分离蛋白质的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060263432A1 (en) * 2003-05-02 2006-11-23 Canon Kabushiki Kaisha Polyhydroxyalkanoate-containing magnetic structure, and manufacturing method and use thereof
US20060141570A1 (en) * 2004-11-16 2006-06-29 Wood David W Intein-mediated protein purification using in vivo expression of an aggregator protein

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOROWITZ, DM 等: "AMORPHOUS, BIOMIMETIC GRANULES OF POLYHYDROXYBUTYRATE: PREPARATION, CHARACTERIZATION, AND BIOLOGICAL IMPLICATIONS", 《JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》 *

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