CN100365012C - 采用超顺磁性硅壳纳米颗粒静电吸附分离蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于静电吸附原理，利用带电荷的超顺磁性硅壳纳米颗粒分离蛋白质的方法。本发明主要涉及两种超顺磁性硅壳纳米颗粒：带有负电荷的超顺磁性纯硅壳纳米颗粒和带有正电荷的超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒。通过控制溶液pH值，利用前者实现对目标碱性蛋白质(细胞色素C)的分离提取，利用后者实现对目标酸性蛋白质(牛血清白蛋白)的分离提取。与传统的分离技术相比较，该方法将分离和富集结合于一体，利用超顺磁性硅壳纳米颗粒较大的比表面积，提高了分离过程中颗粒与蛋白质分子间的作用速度，并且通过颗粒的超顺磁性降低了操作强度。该方法具有廉价、快速、简便等优点，在一般的实验条件下即可实现。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料的应用领域和纳米生物学领域，尤其涉及到超顺磁性硅壳纳米颗粒在生物医学研究中对蛋白质静电吸附分离技术的应用开发。
背景技术
近年来，随着人类基因组计划的完成，解析庞大的人类基因组信息，开展蛋白质组学的研究，获取蛋白质表达水平上的数据倍受研究者的关注与重视。作为蛋白质组学研究的前提和基础，蛋白质的分离纯化具有非常重要的生物学意义。目前人们利用蛋白质分子大小不同建立了凝胶过滤、胶体电泳、超滤等方法，利用蛋白质分子所带电荷不同发展了离子交换层析、凝胶电泳、等电点沉淀等方法，利用蛋白质分子极性不同发展了反相色谱、疏水色谱、盐析等方法，利用蛋白质分子的亲和作用发展了亲和层析等方法。这些方法用于蛋白质分离时均存在一定的不足之处，例如凝胶过滤法所用凝胶一般需要做复杂的预处理，要求有一定的操作技术，保存也要求有真空低温的条件以防止凝胶变性；离子交换层析法的离子交换柱的预处理比较繁琐；亲和层析法对蛋白质的分离仍然存在非专一性吸附等等。随着超顺磁性硅壳纳米颗粒制备技术的发展，基于超顺磁性硅壳纳米颗粒发展起来的生物分离方法为蛋白质的分离提供了新的技术与手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，基于静电吸附原理，提供一种价廉、快速、简便的采用超顺磁性硅壳纳米颗粒静电吸附分离蛋白质的方法。
本发明的技术方案是采用两种带不同电荷的超顺磁性硅壳纳米颗粒，即以Fe3O4为内核，二氧化硅为外壳的带负电荷的超顺磁性纯硅壳纳米颗粒和以Fe3O4为内核，氨基化二氧化硅为外壳的带正电荷的超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒。带负电荷的超顺磁性纯硅壳纳米颗粒与带正电荷的碱性蛋白质通过静电吸附作用形成超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-碱性蛋白质复合物，在外加磁场的作用下实现超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-碱性蛋白质复合物的分离，再利用解离液将结合在超顺磁性纯硅壳纳米颗粒上的碱性蛋白质解离下来，实现对碱性蛋白质的分离；带正电荷的超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒与带负电荷的酸性蛋白质通过静电吸附作用形成超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-酸性蛋白质复合物，在外加磁场的作用下实现超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-酸性蛋白质复合物的分离，再利用解离液将结合在超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒上的酸性蛋白质解离下来，实现对酸性蛋白质的分离。
本发明中所采用的两种纳米颗粒热稳定性好、颗粒均匀，并且两种纳米颗粒的zeta电位都会随所在溶液pH值的改变而呈现有规律的变化。本发明研究了在不同pH值的溶液中，超顺磁性纯硅壳纳米颗粒和超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒zeta电位和对酸碱蛋白质吸附的变化趋势，以及在吸附过程中盐离子强度对分离的干扰情况，从而找出蛋白质吸附、解离条件的变化规律，并分别成功应用于牛血清白蛋白(酸性蛋白质，pI 4.6)和细胞色素C(碱性蛋白质，pI 10.6)在混合蛋白质溶液中的分离与纯化。其中每克超顺磁性纯硅壳纳米颗粒可以吸附分离36毫克细胞色素C，每克超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒可以吸附分离53毫克牛血清白蛋白。所用超顺磁性硅壳纳米颗粒经过洗脱处理后，还可以重复使用。
本发明与传统的分离技术相比较的优势在于，它将分离和富集结合于一体，利用超顺磁性硅壳纳米颗粒较大的比表面积，提高了分离过程中纳米颗粒与蛋白质分子间的作用速度，并且通过纳米颗粒的超顺磁性降低了操作强度。该方法具有廉价、快速、简便等优点，在一般的实验条件下即可实现。
附图说明
图1为在不同的pH值的溶液中，两种超顺磁性硅壳纳米颗粒的zeta电位变化图；
图中：(a)为超顺磁性纯硅壳纳米颗粒，(b)为超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒。
图2为超顺磁性纯硅壳纳米颗粒对牛血清白蛋白(酸性蛋白质，pI 4.6)和细胞色素C(碱性蛋白质，pI 10.6)的混合溶液中细胞色素C的分离电泳佐证图；
电泳图中各泳道分别为：1、牛血清白蛋白，2、细胞色素C，3、原始牛血清白蛋白和细胞色素C的混合溶液，4、磁分离后剩余的蛋白质溶液，5、解离所得蛋白质溶液。
图3为超顺磁性纯硅壳纳米颗粒对牛血清白蛋白(酸性蛋白质，pI 4.6)、免疫球蛋白G(碱性蛋白质，pI 8.0)和细胞色素C(碱性蛋白质，pI 10.6)的混合溶液中细胞色素C的分离电泳佐证图；
电泳图中各泳道分别为：1、免疫球蛋白G，2、牛血清白蛋白，3、细胞色素C，4、原始免疫球蛋白G、牛血清白蛋白和细胞色素C的混合溶液，5、磁分离后剩余的蛋白质溶液，6、解离所得蛋白质溶液。
图4为超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒对牛血清白蛋白(酸性蛋白质，pI 4.6)和细胞色素C(碱性蛋白质，pI 10.6)的混合溶液中牛血清白蛋白的分离电泳佐证图；
电泳图中各泳道分别为：1、细胞色素C，2、牛血清白蛋白，3、原始细胞色素C和牛血清白蛋白的混合溶液，4、磁分离后剩余的蛋白质溶液，5、解离所得蛋白质溶液。
图5为超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒对牛血清白蛋白(酸性蛋白质，pI 4.6)、免疫球蛋白G(碱性蛋白质，pI 8.0)和细胞色素C(碱性蛋白质，pI 10.6)的混合溶液中牛血清白蛋白的分离电泳佐证图；
电泳图中各泳道分别为：1、细胞色素C，2、牛血清白蛋白，3、免疫球蛋白G，4、原始细胞色素C、牛血清白蛋白和免疫球蛋白G的混合溶液，5、磁分离后剩余的蛋白质溶液，6、解离所得蛋白质溶液。
具体实施方式
针对不同等电点的蛋白质，选择合适的纳米颗粒，通过控制溶液的pH值，改变纳米颗粒的zeta电位和蛋白质的带电量，从而控制纳米颗粒与蛋白质的静电作用，实现蛋白质分离。如图1(a)所示，当纳米颗粒所在溶液的pH＞7.0时，超顺磁性纯硅壳纳米颗粒的zeta电位小于-30mV，此时超顺磁性纯硅壳纳米颗粒分散均匀，对带正电荷的碱性蛋白质的吸附能力大。当纳米颗粒所在溶液的2.5＜pH＜5.0时，超顺磁性纯硅壳纳米颗粒带有绝对值很小的负zeta电位或者带有正的zeta电位，对带正电荷的碱性蛋白质吸附能力很小或者有排斥作用。所以我们一般选择在pH＞7.0的溶液中，利用超顺磁性纯硅壳纳米颗粒吸附带有正电荷的碱性蛋白质，选择在2.5＜pH＜5.0的溶液中，对被吸附的碱性蛋白质进行解离。如图1(b)所示，当纳米颗粒所在溶液的pH＜7.0时，超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒的zeta电位大于30mV，此时超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒分散性好，对带负电荷的酸性蛋白质吸附能力大。当纳米颗粒所在溶液的9.0＜pH＜12时，超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒带有很小的正zeta电位或者带有负的zeta电位，此时超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒对带负电荷的酸性蛋白质吸附能力很小或者有排斥作用。所以我们选择在pH＜7.0溶液中，利用超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒吸附带有负电荷的酸性蛋白质，选择在12＞pH＞9.0的溶液中，对被吸附的目标酸性蛋白质进行解离。
目标碱性蛋白质的分离：选择超顺磁性纯硅壳纳米颗粒，在7.0＜pH＜pI目标碱性蛋白质的碱性溶液中对目标碱性蛋白质进行吸附。在7.0＜pH＜pI目标碱性蛋白质的碱性溶液中，超顺磁性纯硅壳纳米颗粒带有负zeta电位，此时目标碱性蛋白质带有正电荷，二者静电吸附形成纳米颗粒-碱性蛋白质复合物，在外加磁场的作用下分离出该复合物。用相应pH值的碱性溶液对纳米颗粒-碱性蛋白质复合物清洗三次。然后在2.5＜pH＜5.0的酸性溶液中，对纳米颗粒-碱性蛋白质复合物进行解离，磁分离回收超顺磁性纯硅壳纳米颗粒，所得溶液即纯化的目标碱性蛋白质溶液。
目标酸性蛋白质的分离：选择超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒，在pI酸性蛋白质＜pH＜7.0的酸性溶液中对目标酸性蛋白质进行吸附。在pI酸性蛋白质＜pH＜7.0的酸性溶液中，超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒带有正zeta电位，此时目标酸性蛋白质带有负电荷，二者静电吸附形成纳米颗粒-酸性蛋白质复合物，在外加磁场的作用下分离出该复合物。用相应pH值的酸性溶液对纳米颗粒-酸性蛋白质复合物清洗三次。然后在9.0＜pH＜12的碱性溶液中，对纳米颗粒-酸性蛋白质复合物进行解离，磁分离回收超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒，所得溶液即纯化的目标酸性蛋白质溶液。
具体实施步骤：
A、超顺磁性纯硅壳纳米颗粒对目标碱性蛋白质的分离
1、混合蛋白质溶液pH值的调节：室温下，调节混合蛋白质溶液的pH值大于7.0，而小于目标碱性蛋白质的等电点pH值。此时超顺磁性纯硅壳纳米颗粒带有负电荷，而目标碱性蛋白质带有正电荷。
2、超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-目标碱性蛋白质复合物的形成：以每毫升混合蛋白质溶液中加入3.0mg的超顺磁性纯硅壳纳米颗粒的比例，向混合蛋白质溶液中加入超顺磁性纯硅壳纳米颗粒，于15～25℃室温下，充分混匀并培育0.50～2.0小时，形成超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-目标碱性蛋白质复合物。
3、超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-目标碱性蛋白质复合物的分离收集：利用超顺磁性硅壳纳米颗粒的超顺磁性，在外加磁场作用下对复合物进行分离，收集超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-目标碱性蛋白质复合物，并用盐离子强度小于0.50mol/L的与步骤1中所调pH值相同的碱性溶液对该复合物进行清洗。
4、超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-目标碱性蛋白质复合物的解离：以每毫升混合蛋白质溶液磁分离所得超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-目标碱性蛋白质复合物中加入1.0mL解离液的比例，向超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-目标碱性蛋白质复合物中加入2.5＜pH＜5.0的酸性溶液作为解离液，于15～25℃室温下，充分振荡解离0.50～2.0小时，将目标碱性蛋白质从超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-目标碱性蛋白质复合物中洗脱下来。
5、超顺磁性纯硅壳纳米颗粒的回收：在外加磁场的作用下，将超顺磁性纯硅壳纳米颗粒从解离液中分离回收，所得溶液即纯化的目标碱性蛋白质溶液。
如果混合蛋白质溶液中的目标碱性蛋白质太多，可以在上清溶液中进行多次纳米颗粒吸附磁分离，最终可以实现目标碱性蛋白质的完全分离。
B、超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒对目标酸性蛋白质的分离
1、混合蛋白质溶液pH值的调节：室温下，调节混合蛋白质溶液的pH值小于7.0，而大于目标酸性蛋白质的等电点pH值。此时超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒带有正电荷，而目标酸性蛋白质带有负电荷。
2、超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-目标酸性蛋白质复合物的形成：以每毫升混合蛋白质溶液中加入3.0mg超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒的比例，向混合蛋白质溶液中加入超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒，于15～25℃室温下，充分混匀并培育0.50～2.0小时，形成超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-目标酸性蛋白质复合物。
3、超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-目标酸性蛋白质复合物的分离收集：利用超顺磁性硅壳纳米颗粒的超顺磁性，在外加磁场作用下对复合物进行分离，收集超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-目标酸性蛋白质复合物，并用盐离子强度小于0.50mol/L的与步骤1中所调pH值相同的酸性溶液对该复合物进行清洗。
4、超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-目标酸性蛋白质复合物的解离：以每毫升混合蛋白质溶液磁分离所得超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-目标酸性蛋白质复合物中加入1.0mL解离液的比例，在超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-目标酸性蛋白质复合物中加入9.0＜pH＜12的碱性溶液作为解离液，于15～25℃室温下，充分振荡解离0.50～2.0小时，将目标酸性蛋白质从超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-目标酸性蛋白质复合物中洗脱下来。
5、超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒的回收：在外加磁场的作用下，将超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒从解离液中分离回收，所得溶液即纯化的目标酸性蛋白质溶液。
如果混合蛋白质溶液中的目标酸性蛋白质太多，可以在上清溶液中进行多次纳米颗粒吸附磁分离，最终可以实现目标酸性蛋白质的完全分离。
实施例1：牛血清白蛋白(酸性蛋白质，pI 4.6)和细胞色素C(碱性蛋白质，pI 10.6)的混合溶液中细胞色素C的提取：
1、细胞色素C和牛血清白蛋白混合溶液pH值的调节：室温下，用1/15mol/L的磷酸氢二钠的溶液，调节混合蛋白质溶液的pH值为8.0。
2、超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-细胞色素C复合物的形成：在5.0mL混合蛋白质溶液中，加入15mg超顺磁性纯硅壳纳米颗粒，于15～25℃室温下，充分混匀并培育0.50小时，形成超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-细胞色素C的复合物。
3、超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-细胞色素C复合物的分离收集：利用超顺磁性纯硅壳纳米颗粒的超顺磁性，在外加磁场作用下，对超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-细胞色素C复合物进行分离，收集超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-细胞色素C复合物。用5.0mL pH8.0的1/15mol/L的磷酸盐溶液对该复合物进行磁分离清洗，清洗三次。
4、超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-细胞色素C复合物的解离：在超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-细胞色素C复合物中，加入5.0mL pH3.0的磷酸二氢钾-盐酸溶液(经0.1mol/L盐酸调节1/15mol/L磷酸二氢钾溶液的pH值到3.0)作为解离液，于15～25℃室温下，充分振荡解离0.50小时，将细胞色素C从超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-细胞色素C复合物中解离下来。
5、超顺磁性纯硅壳纳米颗粒的回收：在外加磁场的作用下，将超顺磁性纯硅壳纳米颗粒从解离液中分离回收，所得溶液即纯化的细胞色素C溶液。
对分离过程中所得的各种蛋白质溶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，如图2所示：第一、二泳道分别表示牛血清白蛋白和细胞色素C的标准样品，与此对比可知，原始牛血清白蛋白和细胞色素C的混合溶液(第3泳道)中的细胞色素C被完全分离出来(第4泳道)，并成功地实现了被吸附细胞色素C的解离，得到纯化的细胞色素C溶液(第5泳道)。
实施例2：牛血清白蛋白(酸性蛋白质，pI 4.6)、免疫球蛋白G(碱性蛋白质，pI 8.0)和细胞色素C(碱性蛋白质，pI 10.6)的混合溶液中细胞色素C的提取：
1、牛血清白蛋白、免疫球蛋白G和细胞色素C混合溶液pH值的调节：室温下，用1/15mol/L的磷酸氢二钠的溶液，调节混合蛋白质溶液的pH值为8.0。
2、超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-细胞色素C复合物的形成：在1.0mL混合蛋白质溶液中，加入3.0mg超顺磁性纯硅壳纳米颗粒，于15～25℃室温下充分混匀并培育0.50小时，形成超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-细胞色素C的复合物。
3、超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-细胞色素C复合物的分离收集：利用超顺磁性纯硅壳纳米颗粒的超顺磁性，在外加磁场作用下，对超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-细胞色素C复合物进行分离，收集超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-细胞色素C复合物。用1.0mL pH8.0的1/15mol/L的磷酸盐溶液对该复合物进行磁分离清洗，清洗三次。
4、超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-细胞色素C复合物的解离：在超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-细胞色素C复合物中，加入1.0mL pH3.0的磷酸二氢钾-盐酸溶液(经0.1mol/L盐酸调节1/15mol/L磷酸二氢钾溶液的pH值到3.0)作为解离液，于15～25℃室温下，充分振荡解离0.50小时，将细胞色素C从超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-细胞色素C复合物中解离下来。
5、超顺磁性纯硅壳纳米颗粒的回收：在外加磁场的作用下，将超顺磁性纯硅壳纳米颗粒从解离液中分离回收，所得溶液即纯化的细胞色素C溶液。
对分离过程中所得的各种蛋白质溶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，如图3所示：第一、二、三泳道分别表示免疫球蛋白G、细胞色素C和牛血清白蛋白的标准样品，与此对比可知，原始免疫球蛋白G、牛血清白蛋白和细胞色素C的混合溶液(第4泳道)中的细胞色素C被完全分离出来(第5泳道)，并成功地实现了被吸附的细胞色素C的解离，得到纯化的细胞色素C溶液(第6泳道)。
实施例3：牛血清白蛋白(酸性蛋白质，pI 4.6)和细胞色素C(碱性蛋白质，pI 10.6)的混合溶液中牛血清白蛋白的提取：
1、细胞色素C和牛血清白蛋白混合溶液pH值的调节：室温下，用1/15mol/L的磷酸二氢钾溶液，调节混合蛋白质溶液的pH值为5.0。
2、超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-牛血清白蛋白复合物的形成：在3.0mL混合蛋白质溶液中，加入9.0mg超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒，于15～25℃室温下，充分混匀并培育0.50小时，形成超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-牛血清白蛋白复合物。
3、超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-牛血清白蛋白复合物的分离收集：利用超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒的超顺磁性，在外加磁场作用下进行分离，收集超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-牛血清白蛋白复合物。用3.0mL pH5.0的1/15mol/L的磷酸盐溶液对该复合物进行磁分离清洗，清洗三次。
4、超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-牛血清白蛋白复合物的解离：在超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-牛血清白蛋白复合物中加入3.0mL pH9.0的1/15mol/L的磷酸盐溶液作为解离液，于15～25℃室温下，充分振荡解离0.50小时，将牛血清白蛋白从超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-牛血清白蛋白复合物中解离下来。
5、超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒的回收：在外加磁场的作用下，将超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒从解离液中分离回收，所得溶液即纯化的牛血清白蛋白溶液。
对分离过程中所得的各种蛋白质溶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，如图4所示：第一、二泳道分别表示细胞色素C和牛血清白蛋白的标准样品，与此对比可知，原始牛血清白蛋白和细胞色素C混合溶液(第3泳道)中的牛血清白蛋白被部分提取出来(第4泳道)，并实现了被吸附牛血清白蛋白的解离，得到纯化的牛血清白蛋白溶液(第5泳道)。
实施例4：牛血清白蛋白(酸性蛋白质，pI 4.6)、免疫球蛋白G(碱性蛋白质，pI 8.0)和细胞色素C(碱性蛋白质，pI 10.6)的混合溶液中牛血清白蛋白(酸性蛋白质，pI 4.6)的提取：
1、牛血清白蛋白、细胞色素C和免疫球蛋白G混合溶液pH值的调节：室温下，用1/15mol/L的磷酸二氢钾溶液，调节混合蛋白质溶液的pH值为5.0。
2、超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-牛血清白蛋白复合物的形成：在6.0mL混合蛋白溶液中，加入18mg超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒，于15～25℃室温下，充分混匀并培育0.50小时，形成超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-牛血清白蛋白复合物。
3、超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-牛血清白蛋白复合物的分离收集：利用超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒的超顺磁性，在外加磁场作用下进行分离，收集超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-牛血清白蛋白复合物。用6.0mL pH5.0的1/15mol/L的磷酸盐溶液对该复合物进行磁分离清洗，清洗三次。
4、超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-牛血清白蛋白复合物的解离：在超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-牛血清白蛋白复合物中加入6.0mL pH9.0的1/15mol/L的磷酸盐溶液作为解离液，于15～25℃室温下，充分振荡解离0.50小时，将牛血清白蛋白从超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-牛血清白蛋白复合物中解离下来。
5、超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒的回收：在外加磁场的作用下，将超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒从解离液中分离回收，所得溶液即纯化的牛血清白蛋白溶液。
对分离过程中所得的各种蛋白质溶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，结果如图5所示，第一、二、三泳道分别表示细胞色素C、牛血清白蛋白和免疫球蛋白G的标准样品，与此对比可知，原始免疫球蛋白G、牛血清白蛋白和细胞色素C的混合溶液(第4泳道)中的牛血清白蛋白被部分提取出来(第5泳道)，并成功地实现了被吸附牛血清白蛋白的解离，得到纯化的牛血清白蛋白溶液(第6泳道)。
Claims (2)
1.一种采用超顺磁性硅壳纳米颗粒静电吸附分离蛋白质的方法，其特征在于：采用两种带不同电荷的超顺磁性硅壳纳米颗粒，即以Fe3O4为内核，二氧化硅为外壳的带负电荷的超顺磁性纯硅壳纳米颗粒和以Fe3O4为内核，氨基化二氧化硅为外壳的带正电荷的超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒，带负电荷的超顺磁性纯硅壳纳米颗粒与带正电荷的碱性蛋白质通过静电吸附作用形成超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-碱性蛋白质复合物，在外加磁场的作用下实现超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-碱性蛋白质复合物的分离，再利用解离液将结合在超顺磁性纯硅壳纳米颗粒上的碱性蛋白质解离下来，实现对碱性蛋白质的分离；带正电荷的超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒与带负电荷的酸性蛋白质通过静电吸附作用形成超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-酸性蛋白质复合物，在外加磁场的作用下实现超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-酸性蛋白质复合物的分离，再利用解离液将结合在超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒上的酸性蛋白质解离下来，实现对酸性蛋白质的分离。
2.根据权利要求1所述的采用超顺磁性硅壳纳米颗粒静电吸附分离蛋白质的方法，其特征在于采用超顺磁性纯硅壳纳米颗粒静电吸附分离目标碱性蛋白质，其具体步骤为：
(1)、混合蛋白质溶液pH值的调节：室温下，调节混合蛋白质溶液的pH值大于7.0，而小于目标碱性蛋白质的等电点pH值；
(2)、超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-目标碱性蛋白质复合物的形成：以每毫升混合蛋白质溶液中加入3.0mg的超顺磁性纯硅壳纳米颗粒的比例，向混合蛋白质溶液中加入超顺磁性纯硅壳纳米颗粒，于15～25℃室温下，充分混匀并培育0.50～2.0小时，形成超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-目标碱性蛋白质复合物；
(3)、超顺磁性硅壳纳米颗粒-目标碱性蛋白质复合物的分离收集：利用超顺磁性纯硅壳纳米颗粒的超顺磁性，在外加磁场作用下对复合物进行分离，收集超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-目标碱性蛋白质复合物，并用盐离子强度小于0.50mol/L的与步骤(1)中所调节的pH值相同的碱性溶液对该复合物进行清洗；
(4)、超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-目标碱性蛋白质复合物中被吸附蛋白质的解离：以每毫升混合蛋白质溶液磁分离所得超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-目标碱性蛋白质复合物中加入1.0mL解离液的比例，向超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-目标碱性蛋白质复合物中加入2.5＜pH＜5.0的酸性溶液作为解离液，于15～25℃室温下，充分振荡解离0.50～2.0小时，将目标碱性蛋白质从超顺磁性纯硅壳纳米颗粒-目标碱性蛋白质复合物中洗脱下来；
(5)、超顺磁性纯硅壳纳米颗粒的回收：在外加磁场的作用下，将超顺磁性纯硅壳纳米颗粒从解离液中分离回收，所得溶液即纯化的目标碱性蛋白质溶液。
3、根据权利要求1所述的采用超顺磁性硅壳纳米颗粒静电吸附分离蛋白质的方法，其特征在于采用超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒静电吸附分离目标酸性蛋白质，其具体步骤为：
(1)、混合蛋白质溶液pH值的调节：室温下，调节混合蛋白质溶液的pH值小于7.0，而大于目标酸性蛋白质的等电点pH值；
(2)、超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-目标酸性蛋白质复合物的形成：以每毫升混合蛋白质溶液中加入3.0mg超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒的比例，向混合蛋白质溶液中加入超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒，于15～25℃室温下，充分混匀并培育0.50～2.0小时，形成超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-目标酸性蛋白质复合物；
(3)、超顺磁性硅壳纳米颗粒-目标酸性蛋白质复合物的分离收集：利用超顺磁性硅壳纳米颗粒的超顺磁性，在外加磁场作用下对复合物进行分离，收集超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-目标酸性蛋白质复合物，并用盐离子强度小于0.50mol/L的与步骤(1)中所调节的pH值相同的酸性溶液对该复合物进行清洗；
(4)、超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-目标酸性蛋白质复合物中被吸附蛋白质的解离：以每毫升混合蛋白质溶液磁分离所得超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-目标酸性蛋白质复合物中加入1.0mL解离液的比例，在超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-目标酸性蛋白质复合物中加入9.0＜pH＜12的碱性溶液作为解离液，于15～25℃室温下，充分振荡解离0.50～2.0小时，将目标酸性蛋白质从超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒-目标酸性蛋白质复合物中洗脱下来；
(5)、超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒的回收：在外加磁场的作用下，将超顺磁性氨基化硅壳纳米颗粒从解离液中分离回收，所得溶液即纯化的目标酸性蛋白质溶液。
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