CN102004138B

CN102004138B - 一种快速分析烟草花冠中花青素苷的方法

Info

Publication number: CN102004138B
Application number: CN2010102781708A
Authority: CN
Inventors: 戴思兰; 孙翊; 李慧; 王亮生
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2010-09-10
Filing date: 2010-09-10
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2030-09-10
Also published as: CN102004138A

Abstract

本发明公开了快速分析烟草中花青素苷的方法，该方法包括对烟草花冠提取液进行高效液相色谱法分离和采用质谱法鉴定花青素苷分子结构。该方法可以在短时间内分析大量烟草花冠中花青素苷样品，分析速度迅速，分析结果准确，降低了分析成本，为不采用高新分析仪器，如超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)，进行花青素苷合成相关基因在烟草中的异源表达研究提供了一种有效、快捷、实用的分析方法。

Description

一种快速分析烟草花冠中花青素苷的方法

技术领域

本发明涉及一种对天然物质进行定性定量快速分析的方法，特别涉及一种花青素苷的快速分析方法。

背景技术

花青素苷(anthocyanins)是植物花色形成的重要物质基础，因此对花青素苷成分和含量的分析是花色研究的重要内容之一。目前，花色相关的异源基因在植物中的表达研究常常以烟草(Nicotiana tabacum)作为受体材料，对于烟草中花青素苷成分分析方法已开展了一些研究，主要有如下4种方法：(1)薄层层析技术(thin layer chromatography，TLC)、(2)高效液相色谱-光电二极管阵列检测技术(high-performance liquid chromatography with a photodiodearray detector，HPLC-PAD/DAD)、(3)高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用分析技术(HPLC-electrospray ionization-mass spectrometry，HPLC-ESI-MS)和(4)超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)。

早期应用较多的TLC技术依赖于同已知花青素苷元标准样品迁移率的对比来确定其种类，能对花青素苷元的种类进行初步的定性研究，但结构鉴定的准确性较差，也不能进行精确的定量分析。HPLC-PAD/DAD技术是依据与已知花青素苷元标准品进行洗脱速度的对比，从而推测色素的结构，可以进行定量研究，但并不能直接确定花青素苷的种类。最近几年开始采用的HPLC-ESI-MS技术可以直接对花青素苷进行定性和定量分析，根据二级或多级质谱的结果不仅可以推定其花青素苷元的类型，还可以推测其糖苷化、酰基化和甲氧基化等情况，至今已经在许多物种中得到了较好的应用。例如荷花、牡丹和菊花等。

花色作为植物重要的生物学性状和观赏性状，一直倍受研究者的关注。近年来，利用分子生物学手段，研究者通过对花青素苷生物合成途径进行调控，创造出许多具有新异花色的花卉新品种，如矮牵牛(Petunia hybrida)、香石竹(Dianthus caryophyllus)、月季(Rosa spp.)等。花色分子育种技术的有效开展依赖于花色相关基因功能的解析。由于烟草的遗传转化体系相对成熟，因而其已经成为研究外源基因在植物体内异源表达的重要受体物种之一，花青素苷合成相关基因在烟草中异源表达可以为花青素合成调控机理的研究提供重要参考资料。

Asaph Aharoni等人研究表明矢车菊素-3-O-芸香糖苷(cyanidin-3-O-rutinoside，Cy3R)是烟草花瓣中积累的主要花青素苷，其含量占花青素苷总量的90％以上(The strawberry FaMYB1 transcription factorsuppresses anthocyanin and flavonol accumulation in transgenic tobacco；The PlantJournal，2001，28(3)，319-332)。矢车菊素-3-O-芸香糖苷的分子结构如下：

许多研究者使用的烟草花冠中花青素苷的分析方法需要将花冠中提取的花青素苷水解转化成花青素苷元(anthocyanidins)后再进行分析，如TLC和HPLC-PAD/DAD方法。这类方法最大的局限在于只能鉴定到花青素苷元的类型，不能对花青素苷的种类进行结构鉴定。并且破坏了花青素苷天然存在的形式，无法全面有效地研究花青素苷的结构和功能。同时，水解法需要从专业的化学试剂公司购得标准品进行洗脱速度的比较才能推断花青素苷元的结构。TLC法和水解法准确性不高，操作复杂且所需分析成本也较高。

HPLC-ESI-MS分析方法比上述方法准确性高，成本低，操作简单。例如，2008年Nakatsuka等建立的烟草花冠钟花青素苷的HPLC-ESI-MS分析方法具体如下：首先采用1％盐酸-甲醇(v/v)的提取液提取烟草花冠中花青素苷，接着，提取液采用高效液相色谱法(HPLC法)进行分离，然后采用紫外吸收法进行含量测定，其中HPLC法分离过程中色谱柱为反相柱Asahipack ODA-50 4E(柱长×内径，250×4.6mm；Showa Denko，Tokyo，Japan)，柱温40℃，流速0.6mL·min^-1；HPLC洗脱条件为流动相A：含有0.1％(v/v)三氟乙酸的乙腈，流动相B为保密技术参数；梯度洗脱程序：0min，10％A；30min，60％A；32min，60％A；紫外吸收检测过程中检测波长为500nm。HPLC分析时花青素苷的洗脱分析时间为32min，花青素苷之一矢车菊素-3-O-芸香糖苷(Cy3R)的保留时间约为14min，分离度高，分离度均大于1.5，其分离效果如图1所示。

Nakatsuka等2008年建立的采用HPLC-ESI-MS技术分析烟草花冠中花青素苷成分的方法，虽然该方法的分析效果较好，但是由于其烟草花冠提取液的提取方法、HPLC分离花青素苷过程中采用的色谱柱、洗脱液成分及其配比和洗脱液的洗脱程序的不同，HPLC分析时间为32min，矢车菊素-3-O-芸香糖苷(Cy3R)的保留时间约为14min，使得完成一次花青素苷的分析操作时间长，导致分析效率低，分析成本提高，分析方法的实用性降低。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的技术问题提供一种烟草花冠中花青素苷的快速分析方法，该方法可以在短时间内分析大量烟草花冠中花青素苷样品，分析速度迅速，分析结果准确，降低了分析成本，为不采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)等高新分析仪器，研究花青素苷合成相关基因在烟草中的异源表达的研究提供了一种实用的分析方法。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种烟草花冠中花青素苷快速分析方法，包括对烟草花提取液进行高效液相色谱分离和采用质谱法鉴定花青素苷分子结构。

其中，所述的花青素苷为矢车菊素-3-O-芸香糖苷或锦葵素-3，5-O-葡萄糖苷，优选为矢车菊素-3-O-芸香糖苷。

其中，高效液相色谱法分离过程中的色谱条件是：采用十八烷基键合硅胶作为填充剂；洗脱流动相为甲酸、水、乙腈和甲醇的混合溶液或三氟乙酸、甲酸、水、乙腈和甲醇的混合溶液；洗脱流动相采用梯度洗脱分离烟草花冠提取液。

特别是，高效液相色谱法分离过程中柱温为25-35℃；流动相的洗脱流速为0.8-1mL/min；检测波长为520-530nm。

尤其是，所述的柱温优选为35℃；流动相的洗脱流速为0.8mL/min；检测波长为525nm。

特别是，洗脱流动相为由体积之比为1-2∶8-9的甲酸和水的混合液组成的A液和由体积之比为80-85∶15-20的乙腈-甲醇的混合液组成的B液组成。

尤其是，所述A液中甲酸与水的体积之比为1∶9；所述B液中乙腈-甲醇的体积之比为85∶15。

其中，高效液相色谱法分离过程中流动相的洗脱梯度依次为：

0min，90％A液与10％B液，即流动相中A液与B液的体积之比为9∶1；

10min，80％A液与20％B液，即流动相中A液与B液的体积之比为8∶2；

12min，50％A液与50％B液，即流动相中A液与B液的体积之比为5∶5；

15min，90％A液与10％B液，即流动相中A液与B液的体积之比为9∶1。

也就是说，HPLC洗脱过程中流动相的洗脱梯度依次为：

0-10min，即从进样开始计时到流动相洗脱10min，流动相中B液的体积百分比含量从10％梯度升高至20％，流动相中A液的体积百分比含量从90％梯度降低至80％；

10-12min，即从流动相洗脱10min到洗脱12min，流动相中B液的体积百分比含量从20％梯度升高至50％，流动相中A液的体积百分比含量从80％梯度降低至50％；

12-15min，即从流动相洗脱12min到洗脱15min，流动相中B液与的体积百分比含量从50％梯度降低至10％，流动相中A液的体积百分比含量从50％梯度升高至90％。

特别是，流动相中所述A液中甲酸与水的体积之比为1∶9；所述B液中乙腈-甲醇的体积之比为85∶15时，流动相的洗脱梯度依次为：

20min，70％A液与30％B液，即流动相中A液与B液的体积之比为7∶3；

25min，90％A液与10％B液，即流动相中A液与B液的体积之比为9∶1。

也就是说，HPLC洗脱过程中流动相的洗脱梯度依次为：

0-20min，即从进样开始计时到流动相洗脱20min，流动相中B液的体积百分比含量从10％梯度升高至30％；流动相中A液的体积百分比含量从90％梯度降低至70％；

20-25min，即从流动相洗脱20min到洗脱25min，流动相中B液的体积百分比含量从30％梯度降低至10％，流动相中A液的体积百分比含量从70％梯度升高至90％。

其中，洗脱流动相为由体积之比为0.1∶9-10∶89.9-90.9的三氟乙酸、甲酸、水的混合液组成的A液和由体积之比为80-85∶15-20的乙腈-甲醇的混合液组成的B液组成。

特别是，所述A液中三氟乙酸、甲酸、水的体积之比为0.1∶10∶89.9；所述B液中乙腈-甲醇的体积之比为85∶15。

也就是说，HPLC洗脱过程中流动相的洗脱梯度依次为：

特别是，流动相中所述A液中三氟乙酸、甲酸、水的体积之比为0.1∶10∶89.9；所述B液中乙腈-甲醇的体积之比为85∶15时，流动相的洗脱梯度为：

其中，所述的烟草花冠提取液按照如下步骤制备而成：

1)采集烟草的盛开期的新鲜花冠，收集花冠着色部分样品；

2)将着色的花冠样品用液氮冷冻，研磨成粉末后加入到提取液中，避光，进行花青素苷的提取，其中，每1克花冠样品提取过程中加入的提取液的体积为3-6mL；提取时间为20-72h；

3)吸取上层清液，得到花青素苷提取液。

特别是，步骤2)中所述花青素苷提取过程中，提取时间为24h。

特别是，步骤2)中所述花青素苷提取过程中，提取温度为4℃。

尤其是，所述花青素苷提取过程中，每隔8h振摇1次提取混合物。

特别是，步骤2)中所述的提取液为浓盐酸与甲醇混合液，浓盐酸与甲醇的体积之比为1∶99-999，优选为1∶999，其中浓盐酸的质量百分比浓度为36.5-37％。

其中，所述鉴定花青素苷分子结构的质谱法选择电喷雾离子化质谱法。

本发明的烟草花冠中花青素苷快速分析方法具有以下优点：

1、本发明方法分析速度快，完成烟草花冠中花青素苷的HPLC法分析的分析操作时间短，完成一次分析操作时间为15-25min(即连续2次HPLC法分析烟草花冠中花青素苷的时间间隔为15-25min，也即是从一次将烟草花冠中花青素苷样品送入高效液相色谱仪进行HPLC分离开始计时到下一次将烟草花冠中花青素苷样品送入高效液相色谱仪进行HPLC分离的时间间隔为15-25min)，其中，花青素苷矢车菊素-3-O-芸香糖苷(Cy3R)的保留时间小于8min，最短出峰时间为6.21min，而Nakatsuka等的HPLC-ESI-MS法的花青素苷分析时间为32min，其中矢车菊素-3-O-芸香糖苷(Cy3R)的洗脱保留时间约为14min，相对于Nakatsuka等的方法，本方法的分析时间大大缩短，分析速度加快，分析效率提高。

2、本发明方法进行HPLC层析洗脱之前不需要进行预先的水解反应，因此不破坏烟草花冠中花青素苷的分子结构，操作便捷，结果全面、准确、有效。

3、本发明方法烟草花冠中花青素苷经过HPLC层析分离之后，再结合质谱图谱分析花青素苷的分子结构，可以准确地鉴定花青素苷的种类，为花青素苷合成相关基因在烟草中的异源表达研究提供生化产物的直接证据。

4、本发明方法使用常规的仪器设备，分离条件温和，分离试剂价格低廉、易得，分析操作步骤简单易行，花青素苷的分离效果好，分离度≥1.5，结果稳定可靠，适宜广泛推广。

5、本发明分析方法简单、易行、降低了花青素苷的分析成本，提高了分析效率。

6、本发明方法对烟草花冠中的花青素苷提取充分，花青素苷的提取效率高，花青素苷的产率高。

附图说明

图1是Nakatsuka等建立的烟草花冠钟花青素苷的HPLC-ESI-MS分析方法中提取液的高效液相色谱洗脱分离图谱；

图2是实施例1烟草花青素苷提取液的高效液相色谱洗脱分离图谱；

图3是实施例1烟草花青素苷提取液的的质谱分析图谱；

图4是实施例2烟草花青素苷提取液的高效液相色谱洗脱分离图谱；

图5是实施例3烟草花青素苷提取液的高效液相色谱洗脱分离图谱；

图6是实施例4烟草花青素苷提取液的高效液相色谱洗脱分离图谱；

图7是实施例5烟草花青素苷提取液的高效液相色谱洗脱分离图谱；

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例以烟草(Nicotiana tabacum L.‘NC89’)盛开期花的花冠为材料，盛开期的花的花冠筒先端已完全开张，约为90°、花下部完全呈白色，花的长度约为45～55mm，取盛开期花的花冠着色部分，提取其中的花青素苷。

烟草花瓣中积累的主要花青素苷是矢车菊素-3-O-芸香糖苷(cyanidin3-O-rutinoside，Cy3R)，Cy3R的含量大于90％，因此本发明实施例中以矢车菊素-3-O-芸香糖苷的分析方法进行说明。

实施例1

1、提取花青素苷

1)采集烟草的盛开期的新鲜花冠，收集花冠着色部分样品；

2)将着色的花冠样品用液氮冷冻，研磨成粉末，在避光条件下向花冠粉末加入到提取液，使花冠粉末浸没在提取液中，进行花青素苷的提取，提取温度保持为4℃，提取时间为24h，其中，提取液由浓盐酸和甲醇组成，其中浓盐酸的质量百分比浓度为36.5％，浓盐酸与甲醇的体积之比为1∶999(即配制1L的提取液，则由1mL质量百分比浓度为36.5％的浓盐酸与999mL甲醇混合组成)；每1g花冠粉末加入提取液4mL，提取过程中每隔8h振摇1次提取混合物；

3)吸取上层清液，得到烟草花青素苷提取液，置于低于-40℃冰箱保存备用。

2、HPLC法分离花青素苷

将烟草花青素苷提取液采用0.22μm微孔滤膜进行过滤，滤液送入高效液相色谱系统(美国戴安公司，Dionex，Sunnyvale，CA)中进行HPLC洗脱分离，烟草花青素苷HPLC洗脱分析操作时间为15min，即完成一次烟草花青素苷分离的时间是15min，也即是两次连续分离烟草花青素苷的时间间隔为15min，其中花青素苷即矢车菊素-3-O-芸香糖苷(Cy3R)的保留时间为6.21min，分离度≥1.5，HPLC洗脱分离图谱如图2。

高效液相色谱系统装备有PDA-100二极管阵列检测器(PDA-100photodiode array detector)，P680A LPG-4型二元梯度泵，UltiMate公司生产的3000型自动进样器(UltiMate 3000autosampler)，TCC-100色谱柱控温箱，以及色谱工作站(变色龙数据处理软件，Chameleon 6.60版)。

HPLC分离花青素苷的色谱条件：

色谱柱为日本Tosoh公司生产的反相C₁₈柱，其采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂(柱型号，ODS-80Ts QA；柱长×内径，150×4.6mm，固定相粒度5μm；生产厂商Tosoh，Tokyo，Japan)，

在ODS-80Ts反相C₁₈柱之前连接C₁₈保护柱(C18guard cartridge；生产厂商上海安谱科学仪器有限公司，柱长×内径，30×4.6mm)。

柱温35℃、进样体积10μL、流速0.8mL·min^-1、检测波长为525nm；

HPLC洗脱流动相为A液与B液的混合溶液，其中：

A液：甲酸-水，甲酸与水的体积之比为1∶9；

B液：乙腈-甲醇，乙腈与甲醇的体积之比为85∶15

HPLC洗脱采用梯度洗脱，流动相的洗脱梯度依次为：

12min，50％A液与50％B液，即流动相中A液与B液的体积之比为1∶1；

15min，90％A液与10％B液，即流动相中A液与B液的体积之比为9∶1；

也即是，HPLC洗脱过程中流动相的洗脱梯度依次为：

3、质谱法鉴定花青素苷的分子结构

使用安捷伦公司1100HPLC-ESI-MSⁿ系统(Agilent-1100HPLC system)，验证花青素苷成分的结构。

将花青素苷提取液送入1100HPLC-ESI-MSⁿ系统，进行电喷雾质谱分析，根据质谱数据确定花青素苷的分子量和结构。

质谱分析条件：

电喷雾电离，正离子模式；干燥气(N₂)温度为350℃；气体流速为8L·min^-1；雾化压力35psi；HV电压4kV；八级杆射频幅度150Vpp；一级锥孔电压47.7V；二级锥孔电压6.0V(skim 1 voltage，47.7V；skim 2 votage，6.0V)；毛细管出口电压127.3V；保护盖出口电压(cap exit offset)79.6V；全扫描质量范围(m/z)，0-1200u。质谱分析图如图3，用LC/MSD Trap软件(5.2版)分析质谱结果。

本发明实施例采用电喷雾质谱(ESI-MS)法进行花青素苷分子结构的鉴定，其他质谱法(如FAB-MS、FD-MS、EI-MS等)均可以用于鉴定花青素苷分子结构。

质谱图分析：

m/z 595为花青素苷Cy3R的分子离子([M]⁺)；

m/z 286.9为花青素苷Cy3R的碎片离子([Y⁰⁺])，即矢车菊素苷元的离子；

m/z 448.9为花青素苷Cy3R的碎片离子([Y⁰+162]⁺)，即Cy3R脱去一个鼠李糖基后的碎片离子，也即矢车菊素苷元加上一个葡萄糖基后的碎片离子；

m/z 472.1为花青素苷Cy3R的碎片离子([Y⁰+Na+162]⁺)；

质谱图分析结果与矢车菊素-3-O-芸香糖苷(Cy3R)的相同。

实施例2

提取花青素苷步骤中，除了提取液中浓盐酸与甲醇的体积之比为1∶199(即配制1L的提取液，则由5mL质量百分比浓度为36.5％的浓盐酸与995mL甲醇混合组成)；每1g花冠粉末加入6mL提取液；提取时间为20h之外，其余与实施例1相同；

HPLC法分离花青素苷步骤中，除了流动相的洗脱梯度依次为：

也即是，HPLC洗脱过程中流动相的洗脱梯度顺序为：

0-20min，即从开始计时到流动相洗脱20min，流动相中B液的体积百分比含量从10％梯度升高至30％；流动相中A液的体积百分比含量从90％梯度降低至70％；

20-25min，即从流动相洗脱20min到洗脱25min，流动相中B液的体积百分比含量从30％梯度降低至10％，流动相中A液的体积百分比含量从70％梯度升高至90％；

柱温为25℃之外，其余与实施例1相同，HPLC洗脱分离，烟草花青素苷HPLC洗脱分析操作时间为25min，其中花青素苷矢车菊素-3-O-芸香糖苷(Cy3R)的保留时间为6.28min，分离度≥1.5，HPLC洗脱分离图谱如图4。

质谱法鉴定花青素苷的分子结构与实施例1相同，质谱分析图如图3所述，鉴定结果是花青素苷为矢车菊素-3-O-芸香糖苷(Cy3R)。

实施例3

提取花青素苷步骤中，除了提取液中浓盐酸与甲醇的体积之比为1∶99(即配制1L的提取液，则由10mL质量百分比浓度为36.5％的浓盐酸与990mL甲醇混合组成)；提取时间为72h之外，其余与实施例1相同；

HPLC法分离花青素苷步骤中，除了流动相中A液由体积之比为2∶8的甲酸与水组成，B液由体积之比为80∶20的乙腈与甲醇组成；

其余与实施例1相同，HPLC洗脱分离，烟草花青素苷HPLC洗脱分析操作时间为15min，收集分离得到的花青素苷，其中花青素苷的保留时间为6.33min，分离度≥1.5，HPLC洗脱分离图谱如图5。

实施例4

除了HPLC法分离花青素苷步骤，梯度洗脱分离花青素苷步骤中，洗脱流动相中A液由体积之比为0.1∶10∶89.9的三氟乙酸、甲酸与水组成，B液由体积之比为85∶15的乙腈与甲醇组成；

HPLC洗脱采用梯度洗脱，流动相的洗脱梯度依次为：

25min，90％A液与10％B液，即流动相中A液与B液的体积之比为9∶1；

也即是，HPLC洗脱过程中流动相的洗脱梯度顺序为：

0-20min，即从进样开始计时到流动相洗脱20min，流动相中B液的体积百分比含量从10％梯度升高至30％，流动相中A液的体积百分比含量从90％梯度降低至70％；

其余与实施例1相同，HPLC洗脱分离，烟草花青素苷HPLC洗脱分析操作时间为25min，其中花青素苷即矢车菊素-3-O-芸香糖苷(Cy3R)的保留时间为7.78min，分离度≥1.5，HPLC洗脱分离图谱如图6。

实施例5

除了HPLC法分离花青素苷步骤，梯度洗脱分离花青素苷步骤中，洗脱流动相中A液由体积之比为0.1∶9∶90.9的三氟乙酸、甲酸与水组成，B液由体积之比为85∶15的乙腈与甲醇组成；

HPLC法分离花青素苷步骤中，除了流动相的洗脱梯度依次为：

也即是，HPLC洗脱过程中流动相的洗脱梯度顺序为：

其余与实施例1相同，HPLC洗脱分离，烟草花青素苷HPLC洗脱分析操作时间为25min，其中花青素苷即矢车菊素-3-O-芸香糖苷(Cy3R)的保留时间为7.79min，分离度≥1.5，HPLC洗脱分离图谱如图7。

Claims

1.一种快速分析烟草中花青素苷的方法，其特征是包括如下顺序进行的步骤：

1）制备对烟草花冠提取液

1A）采集烟草的盛开期的新鲜花冠，收集花冠着色部分样品；

1B）将着色的花冠样品用液氮冷冻，研磨成粉末后加入到提取液中，避光，进行花青素苷的提取，其中，每1克花冠样品提取过程中加入的提取液的量为3-6mL；提取时间为20-72h，其中，所述的提取液为浓盐酸与甲醇混合液，浓盐酸与甲醇的体积之比为1：99-999，其中浓盐酸的质量百分比浓度为36.5-37%；

1C）吸取上层清液，得到花青素苷提取液；

2）高效液相色谱法分离

其中，色谱条件是：

采用十八烷基键合硅胶作为填充剂；

洗脱流动相为甲酸、水、乙腈和甲醇的混合溶液；

洗脱流动相采用梯度洗脱分离烟草花冠提取液，流动相梯度洗脱时的柱温为25-35℃，洗脱流速为0.8-1mL/min；检测波长为520-530nm；

洗脱流动相为由体积之比为1:9-2:8的甲酸与水的混合液组成的A液和由体积之比为85:15-80:20的乙腈-甲醇的混合液组成的B液组成；

3）采用质谱法鉴定花青素苷分子结构。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述流动相的洗脱梯度依次为：

0min，90％A液与10％B液；

10min，80％A液与20％B液；

12min，50％A液与50％B液；

15min，90％A液与10％B液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述流动相的洗脱梯度依次为：

0min，90％A液与10％B液；

20min，70％A液与30％B液；

25min，90％A液与10％B液。

4.一种快速分析烟草中花青素苷的方法，其特征是包括如下顺序进行的步骤：

1）制备对烟草花冠提取液

1C）吸取上层清液，得到花青素苷提取液；

2）高效液相色谱法分离

其中，色谱条件是：

采用十八烷基键合硅胶作为填充剂；

洗脱流动相为三氟乙酸、甲酸、水、乙腈和甲醇的混合溶液；

洗脱流动相采用梯度洗脱分离烟草花冠提取液，流动相梯度洗脱时的柱温为25-35℃；洗脱流速为0.8-1mL/min；检测波长为520-530nm；

洗脱流动相为由体积之比为0.1：9-10：89.9-90.9的三氟乙酸、甲酸和水的混合液组成的A液和由体积之比为85:15-80:20的乙腈-甲醇的混合液组成的B液组成；

3）采用质谱法鉴定花青素苷分子结构。

5.如权利要求4所述的方法，其特征是所述流动相的洗脱梯度依次为：

0min，90％A液与10％B液；

20min；70％A液与30％B液；

25min，90％A液与10％B液。