CN102002524B - 一种dab2ip基因的实时荧光pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种DAB2IP基因的实时荧光PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物：5′-TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3′，下游引物：5′-ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3′，荧光探针：5′-FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3′，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。本发明的有益效果主要体现在：采用本发明方法，DAB2IP基因的检测灵敏度高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对DAB2IP基因快速、准确、特异检测和分析，也可加入标准品进行定量检测，同时还可以加入管家基因(如β-actin基因等)进行相对定量检测。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种DAB2IP基因的实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法。
(二)背景技术
自适应及自我加速生长是恶性肿瘤发生发展的必经之路，作为重要的表达网络调节者，DAB2IP归属于RAS-GTP酶激活蛋白家族，具有抑制肿瘤细胞增殖的活性，能通过多种复杂的通路抑制肿瘤生长及转移。DAB2IP可减弱H-RAS，R-RAS和TC21等癌基因的表达，并与TNF-a介导的肿瘤细胞凋亡相关。作为EZH2的靶基因，DAB2IP可能参与EZH2参与的肿瘤表观遗传学沉默调节。此外，DAB2IP可介导PI3K-Akt通路失活，该通路是重要的肿瘤细胞信号传导途径，调节肿瘤的增殖，存活和转移。最新研究发现，DAB2IP还可通过NF-κB途径阻断肿瘤转移，并在关键的上皮-间质转化(EMT)过程中具有潜在的调节能力。因此，DAB2IP的表达高低与肿瘤生长，转移以及侵袭等多种重要特性密切相关，精确检测DAB2IP可明晰这一独特的抑癌基因在人体的表达，指导个体化抗肿瘤研究，治疗及预后判断。
目前DAB2IP研究方兴未艾，常规测定DAB2IP表达的方法仍然以免疫组化及半定量PCR为主，前者较难在外周血中测定，后者只能起到定性的作用。实时荧光定量PCR技术具有快速、准确、可定量等优点，能真实反映待测定样本的DAB2IP表达高低，从而协助临床甄别可能的抑癌活性，同时为肿瘤基础研究提供重要支持。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种检测DAB2IP基因的荧光检测试剂盒及其检测方法，以实现对DAB2IP基因快速、准确、特异检测。
本发明采用的技术方案是：
一种DAB2IP基因的实时荧光PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下：
上游引物：5′-TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3′
下游引物：5′-ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3′
荧光探针：5′-FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3′
其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
本发明关键在于特异性引物和荧光探针序列的设计，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择，该试剂盒可用作DAB2IP基因的定性检测，也可加入标准品进行定量检测，同时还可以加入管家基因(如β-actin基因等)进行相对定量检测。
为达到精确定量测定的效果，所述试剂盒还包括可DAB2IP基因标准品，所述标准品序列如下：TGCGAAGTGGATCCCAGCAAGTGCTCGGCCGCTGACCTCCCAGAGCACCAGGGCAACCTCAGATGT GCTGCGAGCTGGCCTTCTGCAAGATCATCAACTCCTACTGTGT。
以标准品的梯度浓度的DNA溶液进行荧光PCR检测，根据拷贝浓度的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照标准曲线即可获得样品DNA的拷贝浓度。
一种DAB2IP基因的荧光定量PCR检测方法，所述方法如下：
(1)提取待测样本DNA；也可提取样本RNA后，进行逆转录获得其cDNA作为待测样本DNA；上述DNA或RNA提取方法或逆转录方法可按本领域常规方法进行；
本发明中样本RNA提取可采用RNAi Plus(大连宝生物，D19108A)提取总RNA，按照下述体系进行逆转录：
2×RT buffer 10.0μL
dNTP(各10mM) 1μL
Oligo dT(10uM) 1μL
RNAinhibitor 0.5μL
RTase 1μL
总RNA 1μg
水补足至20μL。
逆转录条件：30℃，10分钟；42℃，30分钟；95℃，5分钟。
(2)取特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，分别加入阴性对照品或待测样品逆转录产物cDNA配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；
所述特异性引物和荧光探针序列如下：
上游引物：5′-TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3′
下游引物：5′-ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3′
荧光探针：
5′-FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3′
其中FAM为荧光报告基团，TAMARA为荧光淬灭基团；
(3)选择荧光检测模式FAM荧光对应波长，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。
所述阴性对照品可按本领域常规方法选择，通常选择不含有该靶基因的非人源性细胞。在对多个样品进行检测时，可根据样品DNA测得的Ct值大小，粗略判断不同样品之间DAB2IP基因表达量的差异(通常是Ct值越大，其DAB2IP基因表达量越低)。
进一步，所述方法同时以梯度浓度的前述标准品的DNA溶液在与样品DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为横坐标、标准品Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品DNA的拷贝浓度。
所述PCR反应条件可按参照本领域常规荧光定量PCR方法，具体的，本发明中PCR反应条件如下：95℃变性2分钟，95℃15秒、60℃45秒，进行40个循环扩增。
PCR反应液通常按如下组成配制(终浓度)：1×PCR buffer、0.3～0.5μM的引物、0.1～0.3μM的荧光探针、1～5U的DNA聚合酶、0.2～0.4mM的dNTPs，通常取2μL的模板，反应总体积通常为20～50μL。
本发明建立了利用TaqMan荧光定量PCR技术检测DAB2IP基因的方法，并经检测肿瘤病人临床样本，表明该方法切实可行。由于本方法采用了PCR扩增技术，使得DAB2IP基因检测的灵敏度大大提高，而且由于荧光探针的应用，使得其特异性亦大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率，使得我们可以在极少的样本中获得准确、详实的样本信息。
本发明采用了目前较先进的特异性荧光探针杂交定量PCR检测技术，在保持高灵敏度的前提下尽量减少假阳性干扰。在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR模板的定量不论是直接PCR还是竞争性PCR，基本上都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测起始模板的量，但这些方法实际上都属于半定量水平，因为即使PCR条件已最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给结果分析带来影响，从而影响定量这一目的。对于一些使用管家基因进行半定量分析的方法，由于引物间扩增效率不一致，导致管家基因和目的基因的PCR扩增产物比例不能真实的反应目的基因表达量的变化。随着实时荧光定量PCR技术的出现，人们可以真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性大大提高。
本发明的有益效果主要体现在：采用本发明方法，DAB2IP基因的检测灵敏度高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对DAB2IP基因快速、准确、特异检测和分析，也可加入标准品进行定量检测，同时还可以加入管家基因(如β-actin基因等)进行相对定量检测。
(四)附图说明
图1为实时荧光定量PCR标准品检测：DAB2IP基因实时荧光定量PCR标准品检测结果，从左至右分别为105、104、103、102、101copies/μL标准品；
图2为实时荧光定量PCR标准曲线：标准曲线为Y＝-4.022×1gX+35.12；Y：对应的CT值；X：DAB2IP基因的拷贝数。
图3为5例阳性临床样本荧光定量PCR检测结果，CT值为16.18，16.59，27.02，31.93，32.15，对应拷贝数为5.26×106copies/μL，4.24×106copies/μL，1.1×103copies/μL，0.1copies/μL和0.05copies/μL。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：特异性引物、荧光探针
1、材料：
RNA提取试剂，逆转录试剂，PCR反应试剂均购自大连宝生物工程有限公司；Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司，MX3000P型定量PCR仪为美国Agilent-Stratagene公司产品。
2、引物及探针设计与合成：
以DAB2IP基因序列(注册号为NM 032552.2)为模板，使用PrimerExpressTM(V2.0，美国ABI公司)软件分析TaqMan引物和探针位点，从中选择最佳组合。
检测用PCR引物和探针序列如下：
上游引物：5′-TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3′
下游引物：5′-ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3′
荧光探针：5′-FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3′
其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
均由大连宝生物工程有限公司合成。
实施例2：荧光定量PCR法检测DAB2IP基因
1、临床样本检测：
5例临床肿瘤组织标本，采用RNA提取试剂RNAi Plus(大连宝生物，D19108A)提取总RNA，分别取1.0ug进行逆转录反应，2×RT buffer，10.0μL；dNTP(10mM)，1μL；Oligo dT(10uM)，1μL；RNA inhibitor，0.5μL；RTase，1μL；总RNA 1μg，水补足至20μL。逆转录条件：30℃，10分钟；42℃，30分钟；95℃，5分钟后取1ul cDNA做模板，用检测用上下游引物在Agilent-Stratagene MX3000P定量PCR仪上进行PCR扩增。
PCR反应液组成如下：
2×PCR buffer 10.0μL
检测用上游引物(10μM) 1μL
检测用下游引物(10μM) 1μL
检测用荧光探针(10μM) 0.5μL
DNA聚合酶(5U/μL) 0.2μL
dNTPs(各250mM) 1.60μL
(dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量比1∶1∶1∶1)
模板DNA(50ng/μL) 1μL
水补足至20μL。
PCR反应条件为：95℃预变性2分钟，95℃15秒、60℃45秒进行40个循环扩增。
构建以不含有标准品序列的质粒片段为阴性对照于相同条件下进行PCR检测，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。
同时在相同条件下以不同浓度标准品(TGCGAAGTGGATCCCAGCAAGTGCTCG GCCGCTGACCTCCCAGAGCACCAGGGCAACCTCAGATGTGCTGCGAGCTGGCCTTCTGCAAGATCATCAACTCCTACTGTGT。)进行检测，并绘制标准曲线。
待测样本的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测样本中DAB2IP基因的拷贝数。
以非人源性细胞为待测样品，按照上述方法进行检测，检测结果均为阴性，说明本发明方法特异性强。
2、样品检测结果
标准品检测结果参见图1，标准曲线参见图2。
5例患者样本检出含有DAB2IP基因的不同拷贝数，检测结果参见图3：5例临床样本荧光定量PCR检测结果，CT值为16.18，16.59，27.02，31.93，32.15，对应拷贝数为5.26×106copies/μL，4.24×106copies/μL，1.1×103copies/μL，0.1copies/μL和0.05copies/μL。
由以上检测结果可知：DAB2IP具有抑癌基因活性，表达降低可致相应癌基因活跃复制，诱发肿瘤的增殖，浸润及转移。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 一种DAB2IP基因的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
tgtgaagtgg acccaagcaa 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
acgcagtagg agttgatgat tttg 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
cccgagcacc agggcaacct c 21
<210> 4
<211> 109
<212> DNA
<213> Human astrovirus
<400> 4
tgcgaagtgg atcccagcaa gtgctcggcc gctgacctcc cagagcacca gggcaacctc 60
agatgtgctg cgagctggcc ttctgcaaga tcatcaactc ctactgtgt 109
Claims (5)
1.一种DAB2IP基因的实时荧光PCR检测试剂盒，包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下：
上游引物：5′-TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3′
下游引物：5′-ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3′
荧光探针：5′-FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3′
其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括DAB2IP基因标准品，所述标准品序列如下：TGCGAAGTGGATCCCAGCAAGTGCTCGGCCGCTGACCTCCCAGAGCACCAGGGCAACCTCAGATGTGCTGCGAGCTGGCCTTCTGCAAGATCATCAACTCCTACTGTGT。
3.一种非诊断目的的DAB2IP基因的荧光定量PCR检测方法，所述方法包括：
(1)提取待测样本DNA；
(2)取特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，分别加入阴性对照品或待测样品DNA配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；
所述特异性引物和荧光探针序列如下：
上游引物：5′-TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3′
下游引物：5′-ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3′
荧光探针：5′-FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3′
其中FAM为荧光报告基团，TAMARA为荧光淬灭基团；
(3)选择荧光检测模式FAM荧光对应波长，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同时以梯度浓度的标准品DNA溶液在与样品DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为横坐标、标准品Ct值为纵坐标绘制标准曲线，根据样品DNA测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品DNA的拷贝浓度；所述标准品序列如下：TGCGAAGTGGATCCCAGCAAGTGCTCGGCCGCTGACCTCCCAGAGCACCAGGGCAACCTCAGATGTGCTGCGAGCTGGCCTTCTGCAAGATCATCAACTCCTACTGTGT。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR反应条件如下：95℃变性2分钟，95℃15秒、60℃45秒，进行40个循环扩增。
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