CN101995455B - 血细胞分析试剂、制备方法及稳定mcv的方法 - Google Patents

血细胞分析试剂、制备方法及稳定mcv的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于稳定红细胞平均体积(MCV)的血细胞分析试剂，所述试剂含有碳酸盐。本发明还公开了所述试剂的制备方法以及稳定MCV的方法。本发明的试剂能够在血细胞分析中抑制红细胞MCV的下降，从而保证MCV测定重复性。

Description

血细胞分析试剂、制备方法及稳定MCV的方法
技术领域
本发明涉及一种血细胞分析的试剂，特别是涉及一种能够稳定红细胞平均体积(MCV)测定重复性的血细胞分析试剂、其制备方法以及稳定MCV的方法。
背景技术
血细胞分析是医学诊断中的重要手段，主要包括红细胞参数、白细胞参数、血小板参数中各种指标的测定。在血细胞分析的各个指标中，红细胞平均体积(Mean Corpuscular Volume，简称MCV)是很重要的一项，其反映了红细胞的平均大小情况，进而反映红细胞的病理变化，在贫血鉴别诊断中具有很高的临床意义。MCV单位是fl(飞升)或10-15L，MCV有两种计算方法：一种是直接测定法，通过单个细胞脉冲高度来计算；另一种是换算法，先通过脉冲高度的叠加，并根据红细胞的数目，得到红细胞比容，MCV通过红细胞比容除以红细胞总数，即HCT/RBC得到。无论采用上述何种方法，MCV都代表红细胞大小情况，对复检的病人来说其血样进行重复测定时MCV必须保持稳定，否则会导致临床诊断结果出现差异。
实际上同一血样进行重复测定，尤其是采用手动进样模式时，需要将盛装血样的容器如真空采血管开盖测定，并重复混匀-开盖测定-混匀的步骤，这时血样就会与空气充分接触，出现红细胞MCV逐次降低的现象，这就是血样处理中的“通风效应”。随着重复测定次数的增加，测定的红细胞MCV会逐次降低，使得数次重复测定后MCV相对于初始MCV的降低程度可达到2-5％。而初始MCV才是诊断所需的真实值。
美国专利US4506018公开了一种稀释液，在其中加入一种非离子表面活性剂以抵消防腐剂对红细胞的影响，目的是通过非离子表面活性剂对MCV的逆向作用来抑制稀释液中防腐剂对MCV的影响，然而该专利并没有公开能够抑制同一血样重复测定时MCV逐渐下降的试剂或方法。
美国专利6225124和申请号为00106392.8的中国专利公开了一种用于血样中MCV分析的稀释液，该试剂加入了非离子表面活性剂并将渗透压调节到合适范围，目的是确保采集后经过72小时后的血样MCV测定值与血样采集后立即测定所得的MCV值在诊断可接受的范围内一致。然而该专利目的是消除血样的“储存效应”，红细胞在储存过程中膨胀所造成的MCV增大的现象，与本专利的解决目的不同，并没有公开能够抑制同一血样重复测定时MCV逐渐下降的试剂或方法。
美国专利US6468732公开了一种稀释液，在其中加入碳酸氢盐和表面活性剂，用以抑制细胞的收缩和长时间放置时的细胞膨胀。但该试剂含有的碳酸氢盐如碳酸氢钠的水溶液放置稍久，或振摇，或加热，碱性即增强(中国药典2005年版(二部)827页)，当其作为产品使用时，运输和搬运过程中难免摇振，会造成试剂pH升高，影响MCV测定结果的准确性；另外由于碳酸氢盐溶液不稳定，该专利采用一种复合材质并特殊设计的容器对该试剂进行盛装，而不能用普通材质如低密度聚乙烯(LDPE)的塑料容器来盛装，会明显增加稀释液产品的生产成本。
美国专利US4971917公开了一种对网织红细胞进行染色的试剂，试剂中含有NaHCO3和染色网织红细胞的染料，试剂的pH≥8.0。该专利中加入NaHCO3的目的是为了抑制染料对成熟红细胞的非特异性染色，没有公开能够抑制同一血样重复测定时MCV逐渐下降的试剂或方法。而且采用该专利试剂测定MCV时，由于其pH偏高，会改变红细胞形态，影响MCV测定结果的准确性。
发明内容
为了解决血细胞分析过程中血样与空气接触导致的红细胞MCV逐渐降低的技术问题。
本发明第一方面提供了一种用于稳定红细胞平均体积(MCV)的血细胞分析试剂。
本发明第二方面提供了一种稳定红细胞平均体积的方法。
本发明的第三方面提供了一种用于稳定红细胞平均体积的血细胞分析试剂的制备方法。
根据本发明的第一方面，本发明公开了一种用于稳定红细胞平均体积(MCV)的血细胞分析试剂，其特征在于：所述试剂为等渗溶液，所述试剂含有碳酸盐。
所述碳酸盐为碱金属碳酸盐，优选碳酸钠或碳酸钾中至少一种。
所述碳酸盐在所述试剂中的含量为0.9～100mM，优选为2～10mM。
所述血液分析试剂的pH为6到8，优选为7.0到7.8。
根据本发明的第二方面，本发明还公开了一种稳定红细胞平均体积的方法，所述方法包括使用上述血细胞分析试剂与血样混合。
根据本发明的第三方面，本发明再公开了一种用于稳定红细胞平均体积的血细胞分析试剂的制备方法，所述方法包括将和渗透压调节剂和碳酸盐溶解于溶剂中，所述溶剂为水。
由于采用以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：能够在血细胞分析中抑制重复测定时由于血样与空气充分接触而导致的红细胞MCV的逐渐下降的现象，从而能够稳定MCV测定重复性。
具体实施方式
本发明所公开的试剂中加入碳酸盐的作用是稳定红细胞MCV，以抑制由于接触空气而导致的红细胞MCV逐渐下降，稳定MCV测定重复性。
在使用血液分析仪对血液样本进行分析时，待分析血样都盛放在封闭容器，如真空采血管中保存。当采用手动模式测定时，先将采血管上下颠倒混匀，然后打开采血管盖并用仪器进行测定，此时血液样本上方就会存在一段空气，当对该血样重复测定时，须再次混匀开盖，此时管内空气与血样充分接触。红细胞具有携带人体新陈代谢后所产生的CO2由各个组织器官运送到肺的功能，因此血液尤其是静脉血的红细胞中存在很多大量溶解性CO2，主要以碳酸氢根离子形式存在，其浓度远远高于空气中CO2浓度。当血样与空气充分接触时，由于血液和空气中CO2含量的差异很大，这种差异会导致红细胞释放CO2并通过血浆释放到空气中。这一CO2释放过程会导致红细胞内碳酸氢根离子浓度降低，使红细胞内渗透压降低。此时红细胞将胞内水分转移到胞外以维持其生理渗透压，这样的最终结果是红细胞发生收缩，体积变小，MCV降低。随着重复测定次数的增加，CO2释放量增大，红细胞MCV会逐渐降低，而最终的MCV降低程度可达到2-5％。
通过实验发现，当稀释液中含有一定量碳酸盐时，能很好的抑制重复测定时红细胞MCV逐次下降的现象，使MCV稳定，重复测定结果真实可信。其原因如下：
当稀释液中含有碳酸盐时，溶液中存在一个电离平衡：
当溶液稀释血液时，溶液中碳酸盐电离出的碳酸氢根会进入红细胞，弥补这些红细胞由于和空气充分接触而导致的胞内碳酸氢根浓度的下降，使红细胞内的渗透压恢复首次测定时的大小，因此重复测定时红细胞MCV很稳定，不会呈现逐次下降的现象。
本发明公开的试剂中包含有渗透压调节剂，以将试剂渗透压调节与红细胞生理渗透压相近的等渗状态，例如200-350mOsm/kg的范围内，优选渗透压范围为280-300mOsm/kg，在此范围内能保持血细胞呈天然状态，使测定的细胞体积大小真实准确。最常用的渗透压调节剂是氯化钠，其他常见的无机盐和有机酸盐也可以使用，只要能调节试剂的渗透压到合适范围即可。
本发明公开的试剂的制备方法可以是，将渗透压调节剂溶解在水中，搅拌溶解配好等渗溶液，然后将碳酸盐加入等渗溶液中，搅拌溶解，定容。当然也可以将渗透压调节剂和碳酸盐一起加入水中搅拌溶解，定容。
本发明的试剂，可适用于各种血细胞分析过程，特别可作为血样稀释液来使用。
本发明的试剂中所包含的碳酸盐，其中碳酸盐优选为碱金属碳酸盐，进一步优选自碳酸钠或碳酸钾中至少一种。碳酸盐的含量为0.9-100mM，优选含量为2-10mM。加入碳酸盐的作用是稳定红细胞MCV，以抑制重复测定时红细胞MCV的逐次下降。碳酸盐的含量偏高会明显提高试剂的pH值，不利于将试剂pH维持在6到8的范围内，因此其的含量以达到稳定红细胞MCV目的的最小量为宜。
在本发明具体的实施方式中，本发明的试剂为血样稀释液，除上述碳酸盐外，优选进一步包含有缓冲剂，以将试剂的pH维持在6到8左右，优选7.0-7.8，在此范围内，血细胞能保持正常形态，避免因溶液pH过高或者过低而导致其作为稀释液时造成血细胞大小形态上的改变。对于缓冲剂的选择，常见的缓冲系统如磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris)缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)等都可以用于本发明。
以下通过具体的实施例对本发明做进一步详细的描述。本发明的实施例中试剂A、C、E、G、I为未添加本发明所提供的保证MCV测定重复性的试剂，而试剂B、D、F、H、J为添加了本发明所提供的保证MCV测定重复性的无水碳酸钠。在表2、4、6、8、10中，可以看到未添加本发明所提供的保证MCV测定重复性的试剂，测定时产生了显著的红细胞MCV逐次下降的现象，重复测定10次后MCV的CV达到了0.8％～1.0％，而添加了无水碳酸钠后能有效地抑制重复测定时红细胞MCV逐次下降，重复测定10次后MCV的CV仅为0.1～0.4％左右。
实施例一
按表1称取相应组分，加蒸馏水溶解，调节pH值，定容，配制试剂A和试剂B，采用0.22μm的滤膜过滤。
用EDTA-2K抗凝剂处理新鲜抗凝血样，取2份新鲜抗凝血样各4ml，每支血平均分成两份，装入同样规格的真空采血管中，分别采用试剂A和试剂B作为阻抗通道稀释液在迈瑞公司的全自动五分类血液分析仪BC-5500上采用手动进样模式测定，操作手法完全一致，每支血重复测定10次，对比MCV测试结果。
表1
从表2的MCV重复测定结果来看，试剂A的MCV测定结果是随着重复测定次数的增加，其MCV呈明显下降，重复测定10次后MCV的CV为0.8％左右；而试剂B中由于含有一定量碳酸盐，能抑制重复测定时红细胞MCV逐次下降，重复测定10次后MCV的CV仅为0.2％左右。
表2
实施例二
按与实施例1相同的方法，根据表3配制试剂C和试剂D，采用0.22μm的滤膜过滤。
用EDTA-2K抗凝剂处理新鲜抗凝血样，取2份新鲜抗凝血样各4ml，每支血平均分成两份，装入同样规格的真空采血管中，分别采用试剂C和试剂D作为阻抗通道稀释液在迈瑞公司的全自动五分类血液分析仪BC-5500上采用手动进样模式测定，操作手法完全一致，每支血重复测定10次，对比MCV测试结果。
表3
从表4的MCV重复测定结果来看，试剂C的MCV测定结果是随着重复测定次数的增加，其MCV呈明显下降，重复测定10次后MCV的CV为1％左右；而试剂D中由于含有一定量碳酸盐，能抑制重复测定时红细胞MCV逐次下降，重复测定10次后MCV的CV仅为0.1％左右。
表4
实施例三
按与实施例1相同的方法，根据表5配制试剂E和试剂F，采用0.22μm的滤膜过滤。
用EDTA-2K抗凝剂处理新鲜抗凝血样，取2份新鲜抗凝血样各4ml，每支血平均分成两份，装入同样规格的真空采血管中，分别采用试剂E和试剂F作为阻抗通道稀释液在迈瑞公司的全自动五分类血液分析仪BC-5500上采用手动进样模式测定，操作手法完全一致，每支血重复测定10次，对比MCV测试结果。
表5
从表6的MCV重复测定结果来看，试剂E的MCV测定结果是随着重复测定次数的增加，其MCV呈明显下降，重复测定10次后MCV的CV为1％左右；而试剂F中由于含有一定量碳酸盐，能抑制重复测定时红细胞MCV逐次下降，重复测定10次后MCV的CV为0.3％左右，由于碳酸盐浓度降低，对重复测定时红细胞MCV的下降的抑制作用降低，相对于实例一中的试剂B和实例二中的试剂D测定MCV重复性的CV％有所增高。
表6
实施例四
按与实施例1相同的方法，根据表7配制试剂G和试剂H，采用0.22μm的滤膜过滤。
用EDTA-2K抗凝剂处理新鲜抗凝血样，取2份新鲜抗凝血样各4ml，每支血平均分成两份，装入同样规格的真空采血管中，分别采用试剂G和试剂H作为阻抗通道稀释液在迈瑞公司的全自动五分类血液分析仪BC-5500上采用手动进样模式测定，操作手法完全一致，每支血重复测定10次，对比MCV测试结果。
表7
从表8的MCV重复测定结果来看，试剂G的MCV测定结果是随着重复测定次数的增加，其MCV呈明显下降，重复测定10次后MCV的CV为1％左右；而试剂H中由于含有一定量碳酸盐，能抑制重复测定时红细胞MCV逐次下降，重复测定10次后MCV的CV仅为0.4％左右。由于碳酸盐浓度降低，对重复测定时红细胞MCV的下降的抑制作用降低，相对于实例一中的试剂B和实例二中的试剂D测定MCV重复性的CV％有所增高。
表8
实施例五
按与实施例1相同的方法，根据表9配制试剂I和试剂J，采用0.22μm的滤膜过滤。
用EDTA-2K抗凝剂处理新鲜抗凝血样，取2份新鲜抗凝血样各4ml，每支血平均分成两份，装入同样规格的真空采血管中，分别采用试剂I和试剂J作为阻抗通道稀释液在迈瑞公司的全自动五分类血液分析仪BC-5500上采用手动进样模式测定，操作手法完全一致，每支血重复测定10次，对比MCV测试结果。
表9
从表10的MCV重复测定结果来看，试剂I的MCV测定结果是随着重复测定次数的增加，其MCV呈明显下降，重复测定10次后MCV的CV为1％左右；而试剂J中由于含有一定量碳酸盐，能抑制重复测定时红细胞MCV逐次下降，重复测定10次后MCV的CV仅为0.1％左右。
表10
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种用于稳定红细胞平均体积的血细胞分析试剂，其特征在于：所述试剂为等渗溶液，由渗透压调节剂、碳酸盐及缓冲剂组成，所述试剂的pH维持在6到8。
2.根据权利要求1所述的血细胞分析试剂，其特征在于：所述碳酸盐为碱金属碳酸盐。
3.根据权利要求2所述的血细胞分析试剂，其特征在于：所述碱金属碳酸盐选自碳酸钠或碳酸钾中至少一种。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的血细胞分析试剂，其特征在于：所述碳酸盐在所述试剂中的含量为0.9-100mM。
5.根据权利要求4所述的血细胞分析试剂，其特征在于：所述碳酸盐在所述试剂中的含量为2-10mM。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的血细胞分析试剂，其特征在于：所述试剂pH为7.0到7.8。
7.一种稳定红细胞平均体积的方法，所述方法包括使用权利要求1至6中任一项的所述试剂与血样混合。
8.权利要求1～6中任意一项所述的用于稳定红细胞平均体积的血细胞分析试剂的制备方法，所述方法包括将渗透压调节剂和碳酸盐溶解于溶剂中，所述溶剂为水。
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