CN101993477B

CN101993477B - 一种棘白菌素b的脱氧类似物的制备方法

Info

Publication number: CN101993477B
Application number: CN200910056561.2A
Authority: CN
Inventors: 胡海峰; 闵涛玲; 朱宝泉
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2009-08-18
Filing date: 2009-08-18
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2029-08-18
Also published as: CN101993477A

Abstract

本发明公开了一种棘白菌素B的脱氧类似物的制备方法。所述的方法包括步骤：(1)将棘白菌素B的发酵混合物和有机溶剂混合，得到溶液1；(2)将溶液1和酸水溶液混合，得到溶液2；和(3)将溶液2在30-50℃放置12-60小时，得到如式I所示的化合物的脱氧类似物；

式中，R是亚麻酰基，R₁＝OH，R₂＝OH，R₃＝OH；所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、或氯仿；所述的酸水溶液中的酸选自盐酸、乙酸、或柠檬酸，其中酸的浓度为1-3mol/L；所述的溶液2的pH 1-6。

Description

一种棘白菌素B的脱氧类似物的制备方法

技术领域

本发明涉及抗生素生产领域，尤其涉及一种棘白菌素B的脱氧类似物的制备方法。

背景技术

棘白菌素类(echinocandins，以下简称ECBs)是20世纪70年代发现的一类具有环状六肽核心和脂肪酸侧链结构天然环状脂肽类化合物。根据环六肽上不同的取代基和脂肪酸侧链分为不同的化合物。ECBs属于一类新型抗真菌化合物，作为葡聚糖合成酶抑制剂，非竞争性地抑制真菌细胞壁的β-(1，3)-D-葡聚糖的合成而发挥杀菌作用。在发酵过程中会产生很多类似组分(美国专利US4024245)。其中echinocandin B的脱氧类似物具有与echoncandin B类似或更高的抑菌活性，因此具有开发价值(美国专利US4024245、US5386010)，然而在发酵过程中脱氧类似物产量比echoncandin B的低20-200倍，后续分离提取困难，成本较高。

目前已经有关于使用ECBs转化成脱氧类似物的报道：中国专利CN1298410A公开了在中性条件下使用阮内镍氢解将带有R1羟基的各种纯品ECBs还原成其单脱氧类似物。上述方法中使用纯品原料进行转化，转化效率较低，成本较高。

1992年在《四面体通讯》[(Terahedron letts.)33，4529-4532]以及1994年4月4日提交的美国专利申请222157也涉及使用ECBs转化成脱氧类似物。上述方法通过使用三氟乙酸及NaCNBH₃或NaBH(OAc)₃将带有R1羟基或R2羟基的各种纯品ECBs还原成其单脱氧类似物。上述方法原料使用纯品进行转化，转化效率较低，成本较高。三氟乙酸具有一定毒性，对人体有害。

发酵得到的ECBs混合物中含有一定数量的相关副产品，组分复杂，物质之间存在相互干扰，转化难度较使用纯品转化高。在ECBs的纯化过程中，需要使用大量毒性较大的有机试剂，污染较大，成本较高。

因此，本领域迫切需要提供一种低成本、低毒性、操作简便的ECBs向其脱氧类似物转化的方法。

发明内容

本发明旨在提供一种如式I所示的化合物的脱氧类似物的制备方法。

在本发明中，提供了一种如式I所示的化合物的脱氧类似物的制备方法，所述的方法包括步骤：

(1)将棘白菌素B的发酵混合物和有机溶剂混合，得到溶液1；

(2)将溶液1和酸水溶液混合，得到溶液2；和

(3)将溶液2在30-50℃放置12-60小时，得到如式I所示的化合物的脱氧类似物；

式中，R是亚麻酰基(linoleoyl)，R₁＝OH，R₂＝OH，R₃＝OH；

所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、或氯仿；

所述的酸水溶液中的酸选自盐酸、乙酸、或柠檬酸，其中酸的浓度为1-3mol/L；

所述的溶液2的pH 1-6。

在另一优选例中，步骤(1)在室温下进行。

在另一优选例中，以溶液1的总体积计，其中棘白菌素B的发酵混合物的浓度为5-20w/v％。

在另一优选例中，以棘白菌素B的发酵混合物的总重量计，其中棘白菌素B的含量为1-80w/w％。

在另一优选例中，所述的有机溶剂选自甲醇或乙醇。

在另一优选例中，溶液2的pH 3-6。

在另一优选例中，所述的酸水溶液中的酸的浓度为1-2mol/L。

在另一优选例中，以溶液1的总体积计，其中棘白菌素B的发酵混合物的浓度为8-12w/v％。

在另一优选例中，以棘白菌素B的发酵混合物的总重量计，其中棘白菌素B的含量为5-60w/w％。

据此，本发明提供了一种低成本、低毒性、操作简便的ECBs向其脱氧类似物转化的方法。

附图说明

图1显示了棘白菌素B发酵混合物的HPLC图谱。

图2显示了实施例4中棘白菌素发酵混合物经1mol/LHCl处理后的HPLC图谱。

本发明附图中，B为棘白菌素B；D为组分D；X为组分X；Y为组分Y。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现可以直接用制备棘白菌素B(echoncandin B)的发酵混合物作为起始物实现其脱氧类似物的转化，而不需要使用棘白菌素B纯品，也就是从发酵液或从部分纯化的过程物流中得到含有式I所示的棘白菌素B的混合物转化为棘白菌素B的脱氧类似物。

具体的方法是将制备棘白菌素B的发酵产物(混合物)在有机溶剂中用酸水溶液调节pH 1-6，便能得到棘白菌素B的脱氧类似物。

进一步地，发明人发现，当使用的酸不同，调节的pH值不同，可以影响棘白菌素B的转化方向，即可得到其不同的脱氧类似物。发明人相信，对于其它棘白菌素类肽类物质都可采用这样的方法得到它们的脱氧类似物。

定义

如本文所用，“棘白菌素B”是如式I所示的化合物：

式中，R是亚麻酰基(linoleoyl)，R₁＝OH，R₂＝OH，R₃＝OH。

如本文所用，“棘白菌素B的发酵混合物”是指通过本领域描述的公知的发酵技术得到棘白菌素B的发酵产物，以混合物的总重量计，其中棘白菌素B的含量为1-80w/w％，优选5-60w/w％。所述的发酵技术可以是本领域熟知的，例如但不限于美国专利US4024245、US4288549，等公开的方法；所述的发酵产物可以是不经过任何纯化步骤的发酵液，也可以是将发酵液经过一定步骤纯化，如通过正相色谱法(使用氧化铝或硅胶作为固定相和诸如石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、甲醇或其混合物这样的洗脱剂)的分级分离除去了部分色素物质的棘白菌素B的混合物。

如本文所用，“脱氧类似物”是指R₁、R₂、或/和R₃为氢的通式I化合物。

本发明提供的一种棘白菌素B的脱氧类似物的制备方法由单一步骤组成，所述步骤是在没有预先对棘白菌素B发酵混合物进行纯化或部分纯化去除部分色素物质的条件下选择性地将含有带有R₁、R₂、和R₃羟基的棘白菌素B混合物转化成其脱氧类似物。

所述制备方法通过在诸如甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿这样的溶剂中用盐酸、乙酸、柠檬酸等调节pH至1-6，可以实现将棘白菌素B转化为其脱氧类似物。优选的情况是，所述的还原反应通过在温度40-50度的乙醇中用盐酸或柠檬酸，调节pH至3-4来进行。一般为获得组分Y优选盐酸，为获得组分X优选柠檬酸。

本发明中，组分D(分子量1012)的结构为：

R为亚麻酰基(linoleoyl)

组分X(分子量1044)的结构为：

R为亚麻酰基(linoleoyl)

组分Y(分子量1028)的结构为：

R为亚麻酰基(linoleoyl)

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、本发明直接使用发酵混合物进行转化，在没有预先对ECBs进行纯化或部分纯化的基础上直接使用ECBs的混合物进行转化，减少了原料的纯化步骤，降低了转化成本。

2、本发明去除有毒物质三氟乙酸及NaCNBH₃、NaBH(OAc)₃的添加，通过一步处理获得脱氧类似物，简化了操作步骤，减少了污染，降低了成本，提高了转化效率。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

以下实施例中ECBs混合物是按美国专利US4024245公开的发酵方法获得。

HPLC检测方法：

HPLC采用的色谱仪是Waters510型高效液相色谱仪，色谱柱是C18柱，检测器是Waters 996Photodiode Array Detector，流动相是甲醇∶水∶乙腈(7∶2∶1)，流速是1.0ml/min，进样量是20μl，柱温是室温。

以下实施例中，ECB及各组分百分含量计算公式为：相应组分百分含量＝(HPLC测定的相应组分峰面积÷总峰面积)×100％。

ECB的转化率计算公式为：ECB的转化率＝1-(ECB转化后的百分含量÷ECB转化前的百分含量)×100％。

实施例1

在室温下将ECBs混合物(1g，echinocandin B含量在5％)溶解于乙醇(10ml)，用盐酸(3mol/L)调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(0.15％)、组分X(1.7％)、组分Y(3％)、组分D(1.2％)。组分echoncandin B的转化率为97％，主要转化为组分Y、X、D。

实施例2：

在室温下将ECBs混合物(1g，echinocandin B含量在5％)溶解于乙醇(10ml)，用盐酸(3mol/L)调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置12h。HPLC检测获得echoncandin B(1.5％)、组分X(3.7％)。组分echoncandin B的转化率为70％，主要转化为组分X。

实施例3：

在室温下将ECBs混合物(1g，echinocandin B含量在5％)溶解于乙醇(10ml)，用盐酸(3mol/L)调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置36h。HPLC检测获得echoncandin B(0.5％)、组分X(4％)、组分Y(1.5％)。组分echoncandinB的转化率为90％，主要转化为组分X、Y。

实施例4

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在30％)溶解于乙醇(10ml)，用1mol/L盐酸调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(1％)、组分X(12％)、组分Y(20％)、组分D(10％)。组分echoncandin B的转化率为96.7％，主要转化为组分Y、X、D。

实施例5

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在60％)溶解于乙醇(10ml)，用1mol/L盐酸调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(2％)、组分X(20％)、组分Y(40％)、组分D(18％)。组分echoncandin B的转化率为96.7％。主要转化产物为组分Y、X、D。

实施例6

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在80％)溶解于乙醇(10ml)，用1mol/L盐酸调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(3.2％)、组分X(23％)、组分Y(46％)、组分D(22％)。组分echoncandin B的转化率为96％。主要转化产物为组分Y、X、D。

实施例7

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在1％)溶解于乙醇(10ml)，用1mol/L盐酸调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(0.01％)、组分X(0.4％)、组分Y(0.6％)、组分D(0.1％)。组分echoncandin B的转化率为90％。主要转化产物为组分Y、X、D。

实施例8

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在5％)溶解于乙醇(10ml)，用1mol/L盐酸调节pH至3-4，放置于温度30度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(2％)、组分X(3.6％)。组分echoncandin B的转化率为60％。主要转化产物为组分X。

实施例9

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在5％)溶解于乙醇(10ml)，用1mol/L盐酸调节pH至3-4，放置于温度50度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(0.16％)、组分X(1.7％)、组分Y(3％)、组分D(1.1％)。组分echoncandin B的转化率为96.8％。主要转化产物为组分X、Y、D。

实施例10

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在5％)溶解于乙醇(20ml)，用1mol/L盐酸调节pH至3-4，放置于温度50度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(0.15％)、组分X(1.7％)、组分Y(3％)、组分D(1.1％)。组分echoncandin B的转化率为97％。主要转化产物为组分X、Y、D。

实施例11

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在5％)溶解于乙醇(5ml)，用1mol/L盐酸调节pH至3-4，放置于温度50度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(0.25％)、组分X(1.7％)、组分Y(3％)、组分D(1％)。组分echoncandin B的转化率为95％。主要转化产物为组分X、Y、D。

实施例12

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在30％)溶解于乙醇(10ml)，用1mol/L乙酸调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(10％)、组分X(24％)。组分echoncandin B的转化率为66.7％。主要转化为组分X。

实施例13

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在5％)溶解于乙醇(10ml)，用柠檬酸(1mol/L)调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(0.1％)、组分X(7％)。组分echoncandin B的转化率为98％，主要转化为组分X。

实施例14

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在30％)溶解于乙醇(10ml)，用柠檬酸(1mol/L)调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(0.5％)、组分X(35％)。组分echoncandin B的转化率为98.3％，主要转化为组分X。

实施例15

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在30％)溶解于乙醇(10ml)，用柠檬酸(3mol/L)调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(0.5％)、组分X(35％)。组分echoncandin B的转化率为98.3％，主要转化为组分X。

实施例16

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在30％)溶解于乙醇(10ml)，用柠檬酸(3mol/L)调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置36h。HPLC检测获得echoncandin B(1％)、组分X(30％)。组分echoncandin B的转化率为96.7％，主要转化为组分X。

实施例17

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在30％)溶解于乙醇(10ml)，用柠檬酸(3mol/L)调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置60h。HPLC检测获得echoncandin B(0.5％)、组分X(35％)。组分echoncandin B的转化率为98.3％，主要转化为组分X。

实施例18

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在30％)溶解于乙醇(5ml)，用柠檬酸(3mol/L)调节pH至5-6，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(5％)、组分X(27％)、组分Y(3％)。组分echoncandinB的转化率为83.3％，主要转化为组分X、Y。

实施例19

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在30％)溶解于乙醇(20ml)，用柠檬酸(3mol/L)调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(0.5％)、组分X(35％)。组分echoncandin B的转化率为98.3％，主要转化为组分X。

实施例20

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在30％)溶解于乙酸乙酯(10ml)，用1mol/L盐酸调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(27％)、组分X(3％)。组分echoncandin B的转化率为10％，主要转化为组分X。

实施例21

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在30％)溶解于丙酮(10ml)，用1mol/L盐酸调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(15％)、组分X(13％)、组分Y(2％)。组分echoncandin B的转化率为50％，主要转化为组分Y、X。

实施例22

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在30％)溶解于乙酸乙酯(10ml)，用柠檬酸(3mol/L)调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(27％)、组分X(3％)。组分echoncandin B的转化率为10％，主要转化为组分X。

实施例23

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在30％)溶解于丙酮(10ml)，用柠檬酸(3mol/L)调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(15％)、组分X(15％)。组分echoncandin B的转化率为50％，主要转化为组分X。

实施例24

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在30％)溶解于甲醇(10ml)，用1mol/L盐酸调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测获得echoncandin B(1.2％)、组分X(12％)、组分Y(20％)、组分D(10％)。组分echoncandin B的转化率为96％，主要转化为组分Y、X、D。

实施例25

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在30％)溶解于正丁醇(10ml)，用柠檬酸(3mol/L)调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测组分echoncandin B未转化为组分X或Y。

实施例26

在室温下将ECBs混合物(1g，echoncandin B含量在30％)溶解于正丁醇(10ml)，用1mol/L盐酸调节pH至3-4，放置于温度40度的环境中，放置48h。HPLC检测组分echoncandin B未转化为组分X或Y。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

1.一种如式I所示的化合物的脱氧类似物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

（1）将棘白菌素B的发酵混合物和有机溶剂混合，得到溶液1；

（2）将溶液1和酸水溶液混合，得到溶液2；和

（3）将溶液2在30－50℃放置12－60小时，得到如式I所示的化合物的脱氧类似物；

式中，R是亚麻酰基，R₁=OH，R₂=OH，R₃=OH；

所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸乙酯、或丙酮；

所述的酸水溶液中的酸选自盐酸、乙酸、或柠檬酸，其中酸的浓度为1－3mol/L；

所述的溶液2的pH3－6；

如式I所示的化合物的脱氧类似物是结构式如X、Y和/或D的化合物：

式中，R是亚麻酰基。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）在室温下进行。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以溶液1的总体积计，其中棘白菌素B的发酵混合物的浓度为5－20w/v％。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以棘白菌素B的发酵混合物的总重量计，其中棘白菌素B的含量为1－80w/w％。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自甲醇或乙醇。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酸水溶液中的酸的浓度为1－2mol/L。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以溶液1的总体积计，其中棘白菌素B的发酵混合物的浓度为8－12w/v％。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以棘白菌素B的发酵混合物的总重量计，其中棘白菌素B的含量为5－60w/w％。