CN101991744A - 一种治疗奶牛子宫内膜炎的中药灌注剂 - Google Patents

Abstract

本发明目的是提供一种制备防治奶牛子宫内膜炎的中药灌注剂，以筛选有效的抗病毒中药。本发明的技术方案是：将十三中中药组方，然后提取、浓缩、过滤、离心、助溶、附加剂处理、调节pH值、混合、灭菌、灌封得到成品，应用于防治奶牛子宫内膜炎。本发明提取的中药稳定性好，抗菌效果明显增强，获得了良好的应用效果。

Description

一种治疗奶牛子宫内膜炎的中药灌注剂

技术领域

本发明涉及中兽药制剂领域，具体涉及一种中药灌注剂的制备。

背景技术

奶牛子宫内膜炎是奶牛养殖业中的常发病，传统的治疗方法是抗生素疗法，但经常出现药物残留、耐药菌株等现象，导致食品安全问题。研究表明中草药对治疗子宫内膜炎有着残留低、刺激性小，效果好的优点。

目前，使用的中兽药剂型有散剂、汤剂、子宫灌注剂等。散剂一般采用拌料和饮水方式服药，药物经过消化道酶的作用，很多药物很难达到应有的药效，还有适口性问题会导致动物饮食下降。汤剂主要采用灌服，除了和散剂一样的缺点外，灌服给动物造成的应激也是汤剂使用受限的一个方面。子宫灌注剂直接针对病灶用药，药前对受试牛进行直肠适度按摩，促使子宫收缩，排出子宫内容物，待子宫无内容物排出后再灌注药物。本发明的灌注剂是纯中草药提取溶液，用于取代抗生素治疗奶牛乳房炎，不会在牛奶中残留，用药期间无停药期，无需弃奶。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明通过筛选有效的抗病毒中药组方，制备了一种用于治疗奶牛子宫内膜炎中药灌注剂。

本发明中的一种中药灌注剂，原料配方为：

益母草48-52份，川芎18-22份，香附子23-27份，黄芩28-32份，赤芍43-47份，鸡血藤23-27份，连翘28-32份，苦参38-42份，白芷28-32份，元胡28-32份，苍术33-37份，艾叶18-22份，功劳木18-22份；

以上份上均为重量份；

按照以上比例将上述十三种中草药组方，其中益母草、川芎、香附子、黄芩、赤芍、鸡血藤和连翘用水提法提取；苦参、白芷、元胡、苍术、艾叶和功劳木用醇提法提取，浓缩，过滤，离心，分离上清液，混合上述两种溶液；加入辅料，最后加注射用水调节总量至400ml-450ml，灭菌灌封。

其中优选原料配方为：

益母草50份，川芎20份，香附子25份，黄芩30份，赤芍45份，鸡血藤25份，连翘30份，苦参40份，白芷30份，元胡30份，苍术35份，艾叶20份，功劳木20份；以上份数均为重量份。

对本发明而言，灌注剂中药的组方和稳定性是重要的，实验测得中药灌注剂的PH在5.4～6.8之间，表现稳定；密度都高于1.10，表现稳定；芍药苷含量未见明显变化，表现正常；根据美国FDA推荐的标准，该灌注剂的有效期2年。

中药中芍药苷的浓度是本发明的一个关键，芍药苷的浓度应该要大于0.0150mg/ml。此种成分在此药方中是有效的抗菌成分，经过多次样品实验，芍药苷的浓度可以作为该药的质量标准和有效性的依据，后面有实施案例说明。可作为该中药灌注剂的定量检测。

本发明中所述一种中药灌注剂在治疗奶牛子宫内膜炎上的应用。

按照本方法13种中药提取物进行了抗菌筛选，赤芍、白芍、连翘、黄芩水煎剂的综合抑菌效果好，对五种细菌都有较强的抑菌作用。苦参、艾叶、元胡、苍术和功劳木的醇提液相比水煎剂，抗菌谱和抑菌活性都得到扩大和增强。按照原料配比组方后获得了良好的应用效果。

附图说明

图1是中药灌注剂中芍药苷含量的标准曲线。

具体实施方式

实施例1

中草药对奶牛子宫内膜炎病原菌的体外抑菌试验

1材料与方法

1.1药物

艾叶、败酱草、旱莲草、益母草、功劳木、鸡血藤、元胡、白鲜皮、赤参、白参、蛇床子、白术、连翘、白芷、川芎、苦参、虎杖、兔丝子、香附子、薏苡仁、石南藤、苍术、地肤子、淫羊霍、大血藤、黄芩均购自湖南药材公司。

1.2培养基

普通肉汤培养基、普通琼脂平皿培养基、鲜血琼脂平皿培养基

1.3菌种

从湖南省某奶牛场分离的五种病原菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、普通变形杆菌和克雷伯氏杆菌。

1.4试验方法

1.4.1菌液的制备

将从患有子宫内膜炎的奶牛分泌物中分离到的五种病原菌，接种于普通营养肉汤培养基，在37℃的恒温箱中培养18～24h，用麦氏比浊法，经肉汤稀释，使其在625nm处吸光度为0.8。

1.4.2药液的制备

1.4.2.1水提法

取上述26种药物各10g，用5倍水浸泡，而后保持微沸1h，5层纱布过滤得滤液；滤渣再加水以盖住中药为准，后保持微沸1h，5层纱布过滤得滤液，如此操作重复两次，将三次滤液合并，减压浓缩药液至1g/ml(1ml药液相当于1g生药材)，后静置12h，滤纸过滤。药液流通空气灭菌30min，4℃冰箱保存备用。

1.4.2.2醇提法

每种药物的主要成分是不一致的，醇提法主要适合含有生物碱的一些物质，上述26种药物中有8种适合醇提法。

固用醇提法提取艾叶、白芷、苦参、元胡、苍术、地肤子、连翘和功劳木等8中药物各10g，用5倍75％乙醇浸泡3天，后用5层纱布过滤得滤液，滤渣也用5倍量的75％的乙醇浸泡3天，过滤得滤液，滤渣按此步骤再操作一次，合并三次滤液，减压回收乙醇，浓缩至1g/ml，4℃冰箱保存备用。

1.4.3纸片的制备

用直径5.5mm的打孔器在新华一号定性滤纸上打孔，得滤纸，将30片滤纸装于一青霉素小瓶中，在121℃条件下高压蒸汽灭菌20min，后往每一小瓶中加药液1ml，使其充分浸透5min，在超净工作台上无菌条件下吹干，保存于4℃冰箱中备用。

1.4.4体外抑菌试验

运用药敏纸片抑菌法

2结果

2.1水提26味中药抑菌结果

采用药敏纸片法测定26种单味中药，对奶牛临床型的五种病原菌的抑菌效果。不同的细菌用各自合适的培养基培养，置37℃恒温箱中培养24h，量取5张纸片的抑菌圈直径，取其均值得结果如下表：

表126种水提中药对五种病原菌的抑菌圈直径(单位：mm)

Table 1The Restrainning Diameters of Water Extracts From 26 Kinds of Chinese HerbalMedicine to 5 Pathogenic Bacterias

注：直径小于8mm为低敏；8-15mm为中敏；15mm以上为高敏；-表示无抑菌圈

由表1可知，中药赤参、白参和黄芩对五种病原菌都呈现较强的抑制作用，除白参对链球菌表现低敏外，其余都显示出较强的抑菌作用。益母草、石南藤对五种病原菌皆无抑制作用。中草药对大肠杆菌的抑制效果依次为：赤参CS、白参表现为高度敏感；旱莲草、白芷、黄芩、艾叶、败酱草、淫羊藿、连翘、白鲜皮、大血藤属于中度敏感。中草药对金黄色葡萄球菌的抑制效果依次为：白术、赤参、白参、虎杖、元胡表现为高度敏感；艾叶、功劳木、蛇床子、连翘、川芎、KS、大血藤、黄芩属于中度敏感。中草药对化脓链球菌的抑制效果依次为：功劳木、赤参、连翘、白芷、川芎、苦参、苍术、黄芩表现为中度敏感。中草药对普通变形杆菌的抑制效果依次为：赤参为高度敏感；艾叶、败酱草、旱莲草、白参、连翘、白芷、虎杖、苍术、黄芩属于中度敏感。中草药对克雷伯氏杆菌的抑制效果依次为：败酱草、白鲜皮、赤参、白参、连翘、大血藤表现为中度敏感。

2.2醇提8味中药抑菌结果

同上采用药敏纸片法测定8种醇提中药对上述五种病原菌的抑菌活性，得结果如下表：

表28种醇提中药对五种病原菌的抑菌圈直径(单位：mm)

Table 2 The Restrainning Diameters of Alcohol Extracts From 8 Kinds of Chinese HerbalMe dicineto 5 Pathogenic Bacterias

注：直径小于8mm为低敏；8-15mm为中敏；15mm以上为高敏；-表示无抑菌圈

由表1、表2可知，部分中药经过乙醇提取后，其抑菌活性比水提煎剂增强，抗菌谱也有所扩大，如苦参对肠道杆菌也表现出抑制作用，抗菌谱明显扩大；对金黄色葡萄球菌的抑制作用明显增强。中药艾叶、元胡、苍术和功劳木的抗菌谱和抑菌活性都得到扩大和增强；白芷的抗菌能力进一步提高，但连翘和地肤子的部分抑菌活性有减弱的趋势。

实施例2

奶牛子宫内膜炎中药灌注剂的研制

1材料与方法

1.1材料

益母草、鸡血藤、黄芩、赤芍、苦参等十三味中草药，95％芍药苷、10％NaOH、10％HCl、丙二醇、吐温-80、苯钾酸钠、95％乙醇、75％乙醇、旋转蒸发仪、紫外-分光光度计、电热恒温培养箱、手提式电热压力蒸汽灭菌锅、超净工作台、电子分析天平、离心机等。

1.2方法

1.2.1中药灌注剂的制备

1.2.1.1组方

中兽医学认为，子宫内膜炎属湿热带下范畴，乃邪毒秽浊之邪客于胞宫，致使瘀血停滞胞宫内，瘀久化热而发病。本试验依据清热利湿、活血化瘀、收敛止带为治疗原则，结合上一章单味中药的体外药敏抑菌结果，特形成组方：益母草50g，川芎20克、香附子25g，黄芩30g、赤芍45g、鸡血藤25g、连翘30g、苦参40g、白芷30g、元胡30g、苍术35g、艾叶20g、功劳木20g等十三味中药组成。

1.2.1.2、提取

水煮法制备中药药液：提取益母草50份，川芎20份，香附子25份，黄芩30份，赤芍45份，鸡血藤25份，连翘30份，，混合装于10L的玻璃瓶中，加5～8倍的蒸馏水浸泡4h，后用一铝锅在电炉上加热，保持微沸1h，过滤得滤液，往药材中再加入蒸馏水，使其能没过药材，加热，保持微沸1h，用5层纱布过滤得滤液，重复上述操作一次，将三次滤液合并，静置，再用水醇法进行处理

醇提法制备中药药液：提取苦参40份，白芷30份，元胡30份，苍术35份，艾叶20份，功劳木20份，混合装于10L的玻璃瓶中，加75％的乙醇使其盖过中药，浸泡3天，过滤得滤液，按此操作重复两次，将三次滤液合并，静置，再用醇水法进行处理。

1.2.1.3制备

将上述药液分别进行旋转蒸发浓缩至1克/ml、5000r/m离心10分钟、分离上清液，混合上述两种溶液(每种提取液的浓度都是浓缩至1克/ml，就是最终药物是1ml液体含有1克生药，所有的原料药都要进入最后的药物)，加入吐温800.5克、防腐剂山梨酸钾0.25克，最后加注射用水调节总量至400-450ml。调节PH值至6.1、110℃灭菌30分钟、灌封得到成品。浓缩、过滤、离心、助溶、附加剂处理、调节PH值、混合、灭菌、灌封和贴标签。

1.2.2芍药苷含量的测定

主要成分的测定：采用紫外-分光光度计测定药液中芍药苷的含量。

对照品溶液的制备：精密称取干燥恒重芍药苷对照品5mg于25ml量瓶中，加甲醇完全溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.20mg/ml的标准储备液备用。

制备标准曲线：精密量取标准储备液0.0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml于5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成含芍药苷系列标准溶液。以甲醇为空白，在230nm波长处测定其吸光度，以浓度(x)为横坐标，吸收度(Y)为纵坐标绘图。

供试品溶液含量的测定：吸取供试品溶液，在230nm处测定吸收度，按当日标准曲线之回归方程计算。

1.2.3稳定性试验

1.2.3.1热稳定性试验将样品置于温度为40±1℃，相对湿度为75％的恒温培养箱中，连续放置3个月，每月检查一次，观察其稳定性，检查外观性状、PH值、相对密度以及芍药苷的含量。

1.2.3.2光稳定性试验将样品置于洁净透明的玻璃瓶中，密封，放在2000LX的日光灯下照射，连续15天，每隔5天就进行抽样，观察其稳定性，检查外观性状，PH值，相对密度以及芍药苷的含量。

1.2.4体外抑菌试验

运用体外药敏纸片法。将五种细菌复壮，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、克雷伯氏杆菌接种于LB肉汤培养基，37℃培养18小时；化脓链球菌接种于加有新鲜血清的LB肉汤培养基中，37℃培养24h；后将上述细菌培养于普通琼脂平皿培养基和THB平皿培养基，进行药敏抑菌试验。

2结果

2.1制得中药灌注剂成品

该中药灌注剂是一种呈棕褐色、清亮透明、PH值为6.1的液体制剂。

2.2芍药苷含量的测定

采用紫外-分光光度法测定中药灌注剂中主要成分芍药苷的含量，测得标准品芍药苷在230nm波长处的吸光度见表1，并绘制标准曲线如下：

表1标准样品芍药苷的吸收度测定值

根据上述测定结果，绘制标准曲线如图1所示，得线性回归方程为：Y＝0.6269X+9.9602浓度(X)为横坐标，吸收度(Y)为纵坐标，结果表明芍药苷在0.04mg/ml～0.2mg/ml的浓度范围内，吸收度与浓度呈现良好的线性关系。按照紫外-分光光度法测定中药灌注剂供试品溶液中的芍药苷的吸光度，并依据上述线性回归方程计算，得供试品溶液中芍药苷含量如下表：

表2供试品溶液芍药苷含量测定结果

由表2可以知道，该复方中药灌注剂中主要抗炎物质芍药苷的浓度为0.0158mg/ml，可作为该中药灌注剂的定量检测。

2.3稳定性试验

药物的稳定关系到用药的安全性和有效性，试验测定了该灌注剂在一定光和热的条件下的理化变化，得结果如下：

表3中药灌注剂的热稳定性试验结果

表4中药灌注剂的光稳定性试验结果

标准为：PH在5.4～6.8范围之间为稳定，密度＞1.10即为稳定

由表3和表4可以看出，经过光、热稳定性试验以后，该中药灌注剂的PH在5.4～6.8之间，表现稳定，密度都高于1.10，表现稳定，芍药苷含量未见明显变化，表现正常，根据美国FDA推荐的标准，该灌注剂的有效期2年。

2.4中药灌注剂体外抑菌试验结果

运用药敏纸片抑菌法，测得该中药灌注剂对上述五种病原菌的抑菌圈如下表：表5中药灌注剂对五种病原菌的抑菌圈直径(单位：mm)

从上表可知，中药灌注剂的体外抑菌效果较好。

Claims (5)

1.一种中药灌注剂，其特征在于，原料配方为：

益母草48-52份，川芎18-22份，香附子23-27份，黄芩28-32份，赤芍43-47份，鸡血藤23-27份，连翘28-32份，苦参38-42份，白芷28-32份，元胡28-32份，苍术33-37份，艾叶18-22份，功劳木18-22份；

以上份上均为重量份；

按照以上比例将上述十三种中草药组方，其中益母草、川芎、香附子、黄芩、赤芍、鸡血藤和连翘用水提法提取；苦参、白芷、元胡、苍术、艾叶和功劳木用醇提法提取，浓缩，过滤，离心，分离得到上清液，混合上述两种溶液；加入辅料，最后加注射用水调节总量至400ml，灭菌灌封。

2.根据权利要求1所述一种中药灌注剂，其特征在于，原料配方为：

益母草50份，川芎20份，香附子25份，黄芩30份，赤芍45份，鸡血藤25份，连翘30份，苦参40份，白芷30份，元胡30份，苍术35份，艾叶20份，功劳木20份；以上份数均为重量份。

3.根据权利要求1或2所述一种中药灌注剂，其特征在于所说的醇提中使用体积百分数为75％的乙醇。

4.根据权利要求1或2所述一种中药灌注剂，其特征在于，该中药灌注剂中的有效成分芍药苷的浓度大于0.0150mg/ml。

5.根据权利要求1或2所述一种中药灌注剂在制备治疗奶牛子宫内膜炎药物中的应用。

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