CN101988928A - 用于Hum j 3检测的夹心ELISA试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于Hum j3检测的夹心ELISA试剂盒，其通过天然葎草花粉纯化主要致敏蛋白Hum j3的制备、小鼠杂交瘤单抗的制备和筛选、夹心ELISA方法两种单抗的选择、夹心ELISA方法试验条件的确定、夹心ELISA方法敏感性、特异性、线性范围、稳定性等方法学指标的确定等步骤建立夹心ELISA法。本发明试剂盒包括该方法的运用包括：捕捉抗体和检测抗体，所述捕捉抗体包被于酶标板中，所述检测抗体为酶标记抗体，所述捕捉抗体和检测抗体分别特异性地针对Hum j3的不同抗原决定簇。本发明在临床实践、变应原制药工业生产、质控与新药研发、气候与环境中Hum j3含量监测与预报中有重要的运用价值。

Description

用于Hum j3检测的夹心ELISA试剂盒

技术领域

本发明涉及一种以小鼠杂交瘤单抗和天然葎草花粉纯化主要致敏蛋白Hum j3为基础的检测Hum j3含量的夹心ELISA试剂盒，其在临床实践、变应原制药工业生产、质控与新药研发、气候与环境中Hum j3含量监测与预报中有重要的实际运用价值。

背景技术

蔷薇亚纲大麻科一年生缠绕草本植物葎草(Humμlus japonicus或Humμlus scandens)，原产我国，广泛分布于远东地区，我国除新疆、青海以外的各省区均有分布，东亚各国(朝鲜、日本、俄罗斯、越南)以及欧洲、美国西海岸地区亦有分布。上世纪八十年代由北京协和医院牵头的第一次全国性气传致敏花粉调查中，在79个花粉收集点中有53个点可收集到葎草花粉，仅次于蒿属花粉，其分布范围基本上覆盖全国，播散高峰为八、九月。北京协和医院首次发现葎草花粉是我国夏秋季节仅次于蒿属花粉的重要致敏原，是导致临床上出现变应性鼻炎、过敏性结膜炎、花粉性皮炎、季节性哮喘等花粉症症状的重要病因，很大程度上影响了患者的生活质量。

现阶段对于花粉症的诊断和治疗，依赖于特异性变应原疫苗(Specific Allergenic Vaccines)。变应原疫苗是指包括变应原提取物以及其它成分的生物制剂，可有效用于人类过敏性疾病的诊断、预防和治疗。变应原特异的免疫治疗(Allergen-Specific Immunotherapy，SIT)通过调节抗原提呈细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞的免疫应答以及调节介导变态反应效应细胞的功能和数量，从而减轻患者症状。WHO发布指导文件指出，SIT是唯一能影响过敏性疾病自然病程、有效阻止变应性鼻炎进展为哮喘的治疗方法。

尽管SIT是目前成熟的针对花粉症病因治疗的方法，由于现阶段用于变应性疾病免疫治疗的变应原浸液大部分直接从天然生物组织中提取，源材料采集时间和地点、培养基种类、提取缓冲液、提取方式、保存剂、保存温度等诸多影响因素的存在使得变应原浸液的蛋白组分、比例和含量、生物效价在不同厂商、同一厂商不同批号之间有很大变异。各卫生组织、药品管理部门、以及各大医学协会都有指导文件明确推荐应该选用安全性和有效性确定的、获得许可证的、合格的变应原产品，而且优先选用标准化的变应原产品，使变应原特异的免疫治疗在医疗实践中能达到WHO关于医疗保健的质量定义，即“高度的专业诊断标准”、“有效的利用资源”、“患者承担风险最低”、“患者高度满意”、“以及患者治疗的连续性”。

变应原标准化一个方面关注变应原浸液总体生物效价，另一方面则是关注单一变应原的含量，尤其是主要致敏蛋白的含量。近年来随着大量变应原蛋白被鉴定和纯化，以主要致敏蛋白含量测定作为变应原产品质量控制的方法逐步在实际中运用，ELISA作为一种简单、适用、易于标准化的方法用于检测主要致敏蛋白方面已有大量文献发表。以单抗分别作为捕获抗体和检测抗体的双位点夹心ELISA法其灵敏度达到ng水平，该方法比放射免疫扩散法(RID)和竞争ELISA法检测限低100到1000倍。利用该法定量欧洲橄榄主要致敏原Olee1，其敏感度为1ng/ml，测试范围为1 to 25ng/ml.。

由于葎草花粉由于地理分布广、流行病学意义重大而倍受国内外研究者重视。在国内李东栋等对武汉地区葎草花粉变应原蛋白质组分的进行了双向电泳分析，孙秀珍等对葎草花粉变应原致敏组分进行了研究；刘昀等构建葎草和初步鉴定了花粉cDNA表达文库，陶爱林等创建了葎草及豚草过敏原的嵌合基因，并对其抗原性作出评价等等。但一直以来，对于葎草主要变应原一直没有足够的认识。直至最近，率先由北京协和医院变态反应科尹佳等纯化、克隆、鉴定一个葎草花粉致敏蛋白，其过敏患者血清sIgE结合率约为74％，确定为葎草主要致敏蛋白，拟定名为Hum j3。该蛋白对应的cDNA全序列在GenBank accession number中的序列接受号为：FJ967117，而其蛋白全序列在UniProt Knowledgebase中的序列接受号为：P86278。

然而到目前为止，还没有建立一种能够简便高效检测Hum j3的方法。

发明内容

本发明的目的提供一种用于检测葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3试剂盒，已达到简便高效检测Hum j3的目的。

本发明试剂盒是以小鼠杂交瘤单抗和天然葎草花粉纯化主要致敏蛋白Hum j3为基础建立的，具体地说包括如下步骤：

1)通过纯化主要致敏蛋白Hum j3免疫BALB/c小鼠，制备多株小鼠杂交瘤单抗；

2)通过十字交叉法筛选小鼠杂交瘤的单抗，寻找最优的构建夹心ELISA方法的两种单抗的配置：首先经过单抗与特异葎草花粉主要致敏蛋白过敏的人血清IgE的竞争ELISA法分析，确定与人血清IgE的存在最大竞争抑制率的一种候选单抗；其次通过与Hum j3结合的单抗之间的相互竞争抑制ELISA的分析，确定构建夹心ELISA方法的另一种单抗；

3)优化夹心ELISA方法检测葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3的条件，包括：包被单抗浓度、葎草变应原浸液和纯化葎草花粉主要致敏蛋白的浓度稀释范围，酶标单抗的稀释浓度；

4)确定夹心ELISA方法检测葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3的各种方法学指标，包括：敏感性、特异性、线性范围、显色稳定性。

通过上述方法，本发明获得了多组用于夹心法检测的单克隆抗体，并建立了相应的试剂盒。

本发明检测葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3的夹心ELISA检测试剂盒，包括捕捉抗体和检测抗体，所述捕捉抗体包被于酶标板中，所述检测抗体为酶标记抗体，所述捕捉抗体和检测抗体分别特异性地针对Hum j3的不同抗原决定簇。优选，所述捕捉抗体是由杂交瘤细胞Hum j3-#87-mAb(已于2009年7月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为小鼠杂交瘤细胞，保藏号为：CGMCC No.3208)分泌获得；所述检测抗体是由杂交瘤细胞Humj3-#66-mAb(已于2009年7月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为小鼠杂交瘤细胞，保藏号为：CGMCC No.3209)分泌获得。

本发明试剂盒还可包括以下试剂中的一种或多种：1)洗涤液；2)底物显色液；3)反应终止液；4)Hum j3标准品。

上述检测抗体的标记酶可以是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶或β-半乳糖苷酶。

同时，在使用具体的标记酶时，底物显色液、终止液应当相适应。例如使用辣根过氧化物酶作为标记酶时，显色剂可由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；碱性磷酸酶作为标记酶时，显色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。

本发明还提供检测Hum j3的方法，具体地可利用上述试剂盒进行如下操作：

1)向包被捕获抗体的酶标板微孔中分别加入Hum j3标准品和待检测的样品；

2)洗涤液洗板，加入检测抗体；

3)加入底物显色液显色，加入反应终止液终止反应，OD492读数；

4)以Hum j3标准品的剂量-效应曲线为标准曲线，计算样品Humj3含量。

利用本发明试剂盒在检测葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3含量，具体可以应用于：a)在临床实践中用于确定皮试诊断和免疫治疗时变应原浸液产品中主要致敏蛋白Hum j3的含量以及安全有效的剂量范围；b)在大气生物学花粉预报、环境监测方面监测环境中微量的Hum j3含量；c)在新药研发中运用衡量和监测重组Hum j3蛋白的表达质量以及产量。

本发明利用纯化的天然葎草主要致敏蛋白，免疫BALB/c小鼠，得到了杂交瘤单抗，通过对单抗的筛选，首次构建了以夹心ELISA方法测定葎草主要致敏蛋白Hum j3的方法及相应试剂盒，具有很好的敏感性、特异性、线性检测范围、显色稳定性。

本发明在首次利用构建的夹心ELISA方法测定了不同类型葎草浸液产品中Hum j3含量，为中国葎草过敏患者的临床诊断和治疗中所需使用的变应原浸液产品的剂量提供了科学有效的检测方法。

本发明在首次利用构建的夹心ELISA方法测定了不同类型葎草浸液产品中Hum j3含量随时间的衰减情况，为葎草变应原浸液产品的有效期的确定提供了科学有效的检测方法。

本发明的检测方法和试剂盒在变应原制药工业生产、质控与新药研发、气候与环境中Hum j3含量监测与预报等领域均有重要的实际运用价值。

附图说明

图1.部分单抗与葎草花粉浸液的Western Blotting结果，M表示分子量Marker；1表示葎草花粉变应原浸液电泳图谱；2-9表示筛选获得的8株单抗分别与葎草变应原浸液western blotting结果，单抗顺序依次为#8，#50，#59，#66，#67，#68，#87，#92；10表示一株与葎草无关的阴性小鼠单抗对照。

图2.十字交叉法筛选夹心ELISA方法所需要的两种单抗，标识灰度深浅与终止时显色OD值对应，显色值深的表示两个单抗之间对识别的抗原表位没有竞争抑制作用，其搭配有可能构建夹心ELISA方法。图示表明#87和#92两种单抗与其它6种单抗之间搭配可能构建夹心ELISA方法。

图3.竞争ELISA方法筛选与Hum j3-specific的sIgE识别相同表位的鼠IgG单抗。

图4.ELISA抑制试验显示#8，#50，#59，#66，#67，#92六种单抗对#87单抗在识别Hum j3时的抑制效应。

图5.#87-Hum j3-#66*夹心ELISA配置的相关方法学指标。

图6.#87-Hum j3-#66*夹心ELISA法标准曲线终止显色后随时间读数的稳定性。

图7.夹心ELISA方法在稳定性试验中监测葎草主要致敏蛋白含量变化方面的运用。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如抗体技术实验指南，Ed Harlow，David Lane等著，沈关心，龚菲力等译，科学出版社，2000年，第一版)，以及相关制造厂商所建议的要求。

实施例1夹心ELISA方法的建立

1.葎草天然纯化主要致敏蛋白Hum j3的获得

通过分子凝胶层析、离子交换层析、亲和层析获得天然葎草花粉纯化主要致敏蛋白Hum j3。

2.针对Hum j3的小鼠杂交瘤单抗的获得

获得天然纯化葎草主要致敏蛋白Hum j3后，参照“杂交瘤技术与单克隆抗体制备”(巴德年主编，《当代免疫学技术与运用》，第十一章，P351-364)完成小鼠杂交瘤单抗的制备与初筛。具体方法参见专利申请CN 101392022。

通过筛选获得多株单抗细胞株，其中较好的8株单抗性质的鉴定结果如表1所示。8株单抗与葎草变应原浸液的Western Blotting的验证结果见附图1。

表1针对葎草主要致敏蛋白Hum j3的单抗鉴定结果

其中western blotting试验条件和操作如下：葎草花粉变应原浸液上样量10μg/泳道，电转印条件：恒流2.0mA/cm2×90min。将转印好、切成条状的PVDF膜浸入3％BSA/PBST中封闭，37℃×3hr。然后以PBST洗涤5min×3次洗涤；随后分别加入1∶4000稀释后的小鼠杂交瘤单抗、阴性小鼠单抗抗体，总体积500μl/strip，室温摇振1小时后，洗涤同前；然后加HRP酶标的羊抗鼠二抗1∶6000稀释，500μl/strip，室温下摇振1hr后，洗涤同前；最后室温避光显色5min，出现清晰条带后，蒸馏水漂洗终止反应。

3.用于夹心ELISA方法的两种单抗的筛选

(1)十字交叉法筛选小鼠杂交瘤单抗，筛选能够组成夹心ELISA的配对抗体

十字交叉法筛选小鼠杂交瘤单抗，其中条件和操作程序为：包被八种抗体的浓度是0.3μg/孔，4℃包被12h。1％BSA-PBST封闭液室温封闭1.5h。加入Hum j3的量为50μg/孔，37℃反应1h。酶标检测单抗的稀释度是1∶4000，37℃反应1h。每次以洗涤液PBS/0.05％Tween-20洗涤液洗板5次。最后以OPD-H₂O₂显色系统显色5min，以100μl 2mol/L H₂SO₄硫酸终止，于酶标板仪492nm波长显色。结果显示#87与#92号单抗有相同的抗原识别表位，其中任何之一都能与其它六种单抗配对构建夹心ELISA法；还显示#66与#68可能也具有相同的抗原识别表位；而#87和#92以及#66与#68两对抗体之间则有不同的抗原识别表位，能两两搭配构建夹心ELISA方法检测Hum j3。十字交叉法筛选小鼠杂交瘤单抗的结果见附图2。

(2)ELISA抑制试验显示小鼠IgG单抗对葎草过敏患者血清池sIgE与Hum j3结合的抑制效应，筛选单抗株A，使其具备与sIgE抗体有最大相似性的Hum j3识别位点。

单抗对葎草过敏患者血清池sIgE与Hum j3的结合的抑制ELISA分析，其条件和操作程序为：用100μl 1μg/ml纯化的Hum j3于4℃包被12h。1％BSA-PBST封闭液室温封闭1.5h。加入50μl 0.1mg/ml单抗与50μl 1∶4稀释的血清池(20位证实为葎草过敏患者的血清)混合，37℃温育3h。加入鼠抗人IgE酶标单抗，使用稀释度：1∶2000，37℃温育2h。OPD-H₂O₂显色系统显色20min后以100μl 2mol/LH₂SO₄硫酸终止，于酶标仪492nm波长读数。结果显示，#66与#68的单抗对Hum j3-specific-sIgE的有最大抑制率，分别为74％，69％，提示这两种单抗可能与Hum j3-specific-sIgE识别相同或大部分重叠的主要致敏蛋白表位，而相反#87与#92单抗则识别Hum j3的非主要致敏蛋白表位，相同条件下抑制率只有4.7％，2.23％，从另一个侧面证实，#87和#92以及#66与#68两对抗体之间由于识别不同的Hum j3表位，从而能两两搭配构建夹心ELISA方法检测Humj3。因此保证了能检测到Hum j3。单抗与葎草过敏患者血清ELISA抑制的结果见附图3。最后选定#66号单抗作为单抗株A。

(3)ELISA抑制试验显示候选的小鼠IgG单抗B对已选定的小鼠IgG单抗A与Hum j3结合的抑制效应，筛选单抗株B，使其具备与已选定的单抗A不相同的Hum j3识别位点。

候选的小鼠IgG单抗B对已选定的小鼠IgG单抗A与Hum j3结合的抑制ELISA分析，其条件和操作程序为：用100μl 1μg/ml纯化的Hum j3于4℃包被12h。1％BSA-PBST封闭液室温封闭1.5h。加入1∶5000稀释的HRP-酶标#87单抗50μl，同时分别加入50μl抑制物单抗与HRP-酶标#87单抗竞争结合Hum j3，该竞争单抗分别为依次为#8，#50，#59，#66，#67，#68，#87，#92，初始浓度均为0.1mg/ml，3×倍比稀释，连续10个稀释度。反应条件为室温反应1h。然后以OPD-H₂O₂显色系统显色，20min后以100μl 2mol/L H₂SO₄硫酸终止，于酶标仪492nm波长读数。结果见附图4。结果表明，除#92号单抗对#87单抗有较强的抑制效应外，其余的抑制效应均较弱。再次证明，#87、#92号单抗之间识别相互重叠的Hum j3表位，而#87号单抗与其它五种单抗之间基本是识别Hum j3不同的分子表位。最后选定#87号单抗作为单抗株B。

因此，最后确定的夹心ELISA配置方式为#87号单抗作为捕获抗体，纯化天然Hum j3作为标准品，HRP酶标的#66单抗作为检测抗体。

4.优化夹心ELISA方法检测葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3的条件

所述的一种以小鼠杂交瘤单抗和天然葎草花粉纯化主要致敏蛋白Hum j3为基础的检测Hum j3含量的夹心ELISA方法。其中具体的条件和操作程序为：

(1)以100μl#87-mAb(0.5μg/孔)4℃包被酶标板12h过夜；

(2)1×PBST洗液洗涤液洗板5次，1％BSA-PBST封闭液1.5h；

(3)1×PBST洗液洗涤液洗板5次，加入连续11个2×梯度稀释的初始浓度为0.05μg/ml的天然纯化葎草主要致敏蛋白Hum j3标准品和待检测的样品，每个样品均做复孔；

(4)1×PBST洗液洗涤液洗板5次，加入1∶6000稀释的辣根过氧化物酶标记的检测抗体#66；

(5)加入OPD-H₂O₂显色液缓冲液，5min后终止显色，OD492读数。

(6)以葎草主要致敏蛋白Hum j3标准品的剂量-效应曲线为标准曲线，计算样品Hum j3含量。

5.确定夹心ELISA方法检测葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3的各种方法学指标：敏感性、特异性、线性范围、显色稳定性。

所述的一种以小鼠杂交瘤单抗和天然葎草花粉纯化主要致敏蛋白Hum j3为基础的检测Hum j3含量的夹心ELISA方法。其中该方法技术指标数据得出的条件和操作程序为：

特异性：试验条件：Hum j3初始浓度0.05μg/ml，葎草花粉变应原浸液初始浓度0.3μg/ml，二者以2×倍比连续稀释11个梯度；大籽蒿、灰藜、苍耳、向日葵、白蜡、大麻、地蚨、玉米、豚草、刺苋等10种常见的花粉变应原浸液初始浓度33μg/ml，均分别以3×倍比连续稀释11个梯度。试验条件同上述步骤4。结果显示，该夹心ELISA方法在检测范围内，不与葎草变应原浸液中其它蛋白有交叉反应，其检测纯化天然Hum j3和葎草变应原浸液中Hum j3的剂量-效应关系是平行的；也不与大籽蒿、灰藜、苍耳、向日葵、白蜡、大麻、地蚨、玉米、豚草、刺苋等10种常见的花粉变应原浸液有交叉反应，特异性好。但值得注意的是，在高于最高检测限50倍时，灰藜变应原与会发生非特异性吸附，推测灰藜花粉浸液中含有与Hum j3存在交叉反应的变应原，当检测样本中含有灰藜花粉浸液污染，且其浓度大于1μg/ml时，该ELISA方法会导致假阳性的误判。如附图所示5。

敏感性：试验条件同前。结果显示，该方法最低检测限能达到52pg/ml，最高检测限26.6ng/ml。如附图所示5。

线性范围：试验条件同前。结果显示，当浓度在0.1ng/ml-6.64ng/ml范围时(第4到第10稀释度)，拟合的线性方程是y＝1.385x+5.7877，R²＝0.9903。有很好的线性关系。如附图所示5。

显色稳定性：试验条件同前，加入2mol/L H2SO4终止显色后，于0min，5min，10min，15min，20min，30min，35min，结果显示，有较好的读数稳定性，建议在5-30min内读数。如附图所示6。

实施例2夹心ELISA试剂盒的组建

基于上述实验，本例提供一种用于葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3检测的试剂盒，其组成如下：

1)包被单克隆抗体的酶标板；(#87单抗，包被量为0.5μg/孔)

2)辣根过氧化物酶标记抗体；(#66单抗)

3)洗涤液；(PBST)

4)底物显色液：

底物缓冲液(pH 5.0)：

A液：0.1mol/L柠檬酸(2.1g C₆H₈O₇·H₂O/100ml)，4℃保存；

B液：0.2mol/L磷酸氢二纳(7.163gNa₂HPO₄·12H₂O/100ml)，室温保存；

取A液24.3ml，B液25.7ml混合，再加蒸馏水50ml，共100ml。4℃保存。

OPD-H₂O₂显色液缓冲液：底物缓冲液10ml，OPD 4mg，30％H₂O₂15μl。避光配制。

5)反应终止液(2mol/L H₂SO₄)；

6)Hum j3标准品。

实施例3夹心ELISA方法在实际临床实践中的运用

以构建的夹心ELISA方法确定临床使用的葎草变应原浸液不同产品类型中Hum j3的含量，以确定临床有效剂量。

参照实施例1第4项的条件进行操作。标准曲线是由连续11个2×梯度稀释的初始浓度为0.05μg/ml的天然纯化葎草主要致敏蛋白Hum j3标准品剂量——效应曲线做出。待检测的样品是由新华联协和药业变应原公司提供的50％甘油的葎草变应原浸液点刺液，批号分别为#20061213、#20061214、#20061215、#20070117，以复孔检测，每个批号重复测定三次。其中总蛋白含量是以Bradford法测定的，以蛋白含量测定试剂盒完成(Protein Assay Dye Reagent Concentrate，Catlog：500-0006，美国Bio-rad Laboratories，Inc.公司)。操作见产品说明。结果如表2所示，其产品批间质量好，Hum j3含量与总蛋白含量变异均较小。

表2Humj3含量与总蛋白含量测定(3次重复测定，

)

实施例4建立的夹心ELISA方法在制药工业生产实践中的运用。

以构建的夹心ELISA方法测定葎草变应原浸液产品中主要致敏蛋白Hum j3随时间的衰减情况。

参照实施例1第4项的条件进行操作。其中三个连续批号的50％甘油的葎草变应原浸液点刺液，批号为#20061213、#20061214、#20061215。加速试验条件设定为：温度25℃±2℃、相对湿度60％±10％。选定产品在上述条件下放置6个月，试验期间零起点、第1个月、2个月、3个月和6个月末分别取样一次，按具体实施方式4所述检测葎草变应原浸液产品中主要致敏蛋白Hum j3含量。结果如图7所示，其半衰期时间是2个月。

实验说明：

1.实验材料

(1)20位葎草过敏患者血清池：特异性sIgE检测结果48.5KUA/L。其中该20位葎草过敏患者得临床综合诊断标准按尹佳等^[18]设定标准进行确诊：1)典型夏秋季花粉过敏病史：季节性鼻炎、眼结膜炎和或支气管哮喘，夏秋季节(7月～10月)发病，葎草花粉浸液皮内试验≥+，同时葎草花粉RAST sIgE≥I级(0.35kUa/l)；2)病史和症状典型，单纯葎草花粉浸液皮内试验≥++者；3)病史和症状典型，单纯葎草花粉RAST sIgE≥II级(0.70kUa/l)。

(2)天然纯化Hum j3标准品，为协和医院变态反应科制备，纯度98％。

(3)碳酸钠(Na₂CO₃)、碳酸氢钠(NaHCO₃)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、磷酸氢二纳(Na₂HPO₄·12H₂O)、柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)、硫酸(H₂SO₄)均为国产分析纯。

(4)牛血清白蛋白(BSA)购自北京元亨圣马生物技术研究所。

(5)Tween-20购自美国Fluka。

(6)辣根过氧化物酶羊抗鼠IgG抗体：Santa Cruz Biotechnology

(7)邻苯二胺(OPD)为美国Amresco产品，北京江晨生物技术开发公司分装。

(8)30％过氧化氢(H₂O₂)：北京北化精细化学品有限公司。

(9)美国Bio-rad Laboratories，Inc.蛋白含量测定染色剂Protein Assay DyeReagent Concentrate(分类号：500-0006)。

(10)仪器设备：BIOFIL 96孔可拆聚苯乙烯酶标板(加拿大JET BiochemicalsInt’l.，Inc)；anthos 2010酶标仪(奥地利anthos labtec instrumentsGes.m.b.h)；Auslab澳斯雷勃酶标实验室管理系统2.2.0.0(北京奥斯邦医学数据有限公司)。

(11)其它化学试剂：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺：美国SIGMA；十二烷基硫酸钠：瑞典Pharmacia biotech AB；Tris(MW：121.14)：B.M.，北京市方润生物中心；盐酸：北京益利精细化学品有限公司；甘氨酸：B.M.，北京市方润生物中心；β-巯基乙醇：香港Farco chemical supplies；溴酚蓝：BioMark，北京市方润生物中心；丙三醇(甘油)：北京世纪红星化工有限责任公司；TEMED：美国Fluka，北京市方润生物中心；过硫酸胺：美国Amresco；琼脂：美国SIGMA，北京市方润生物中心；考马斯亮蓝R-250：美国SIGMA，北京市方润生物中心；甲醇：北京益利精细化学品有限公司；乙酸(冰醋酸)：北京化学试剂公司；无水乙醇：北京世纪红星化工有限责任公司；50％戊二醛：北京益利精细化学品有限公司；37％甲醛：北京化学试剂公司；硫代硫酸钠：北京世纪红星化工有限责任公司；硝酸银、无水碳酸钠：北京益利精细化学品有限公司；低分子量蛋白质分子量标准：分子量范围97～14.4kDa(表1.3)，美国Amersham。

2.溶液配制

(1)包被缓冲液(pH 9.6)：Na₂CO₃ 0.16g，NaHCO₃ 0.293g，蒸馏水溶解至100ml。4℃保存。

(2)洗涤液(PBS/0.05％Tween-20，pH 7.4)：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水加至1000ml。4℃保存。

(3)封闭液兼一抗、二抗稀释液(1％BSA/PBST)：现用现配。

(4)底物缓冲液(pH 5.0)：

(5)A液：0.1mol/L柠檬酸(2.1g C₆H₈O₇·H₂O/100ml)，4℃保存。

(6)B液：0.2mol/L磷酸氢二纳(7.163gNa₂HPO₄·12H₂O/100ml)，室温保存。

(7)取A液24.3ml，B液25.7ml混合，再加蒸馏水50ml，共100ml。4℃保存。

(8)显色液：底物缓冲液10ml，OPD 4mg，30％H₂O₂15μl。临用时避光配制。

(9)终止液(2mol/LH₂SO₄)：将98％浓硫酸(18.4mol/l)50ml逐滴加入蒸馏水400ml中，并不断搅拌溶解。

(10)SDS-PAGE相关试剂配制：

30％丙烯酰胺单体溶液(单体总百分浓度T＝30％，交联百分浓度C＝3％)：含29.1％(w/v)丙烯酰胺Acr和0.9％(w/v)甲叉双丙烯酰胺Bis。Acr 58.2g，Bis 1.8g，加160ml蒸馏水加热搅拌溶解，再加蒸馏水定容至200ml，过滤。棕色瓶，4℃保存。

浓缩胶缓冲液(1.0mol/l Tris-HCl，pH6.8)：6.06g Tris溶于40ml蒸馏水后，用浓盐酸调pH值至6.8，再定容至50ml。4℃保存。

分离胶缓冲液(1.5mol/l Tris-HCl，pH8.8)：45.43g Tris溶于200ml蒸馏水后，用浓盐酸调pH值至8.8，再定容至250ml。4℃保存。

10％SDS：室温保存。

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(pH8.3)：900ml蒸馏水中溶解Tris 15.1g，甘氨酸94.0g和10％SDS 50ml，溶解后蒸馏水定容至1000ml。临用时加4倍体积蒸馏水稀释成1×使用。室温保存。

2×SDS样品缓冲液：1.0mol/l Tris-HCl(PH 6.8)10ml，10％SDS 40ml，甘油20ml，溴酚蓝0.2g，蒸馏水20ml。室温保存。临用时取900μl原液加入巯基乙醇100μl混匀后4℃保存，1周内使用。

10％过硫酸胺AP：0.1g AP溶于1ml蒸馏水中。4℃保存，1周内使用。

(11)Western Blotting相关试剂：

丽春红S(Ponceau S)：BioMark，北京市方润生物中心

三氯乙酸：北京化学试剂公司

5-磺基水杨酸：同上

氨基黑10B(amido black 10B)：北京化学试剂三厂

二氨基联苯胺DAB·4HCl：美国SIGMA

氯化锂LiCl·H2O：北京化学试剂公司。

Claims (10)

1.一种检测葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3的夹心ELISA建立方法，其包括如下步骤：

1)通过纯化主要致敏蛋白Hum j3免疫BALB/c小鼠，制备多株小鼠杂交瘤单抗；

2)通过十字交叉法筛选小鼠杂交瘤的单抗，寻找最优的构建夹心ELISA方法的两种单抗的配置：首先经过单抗与特异葎草花粉主要致敏蛋白过敏的人血清IgE的竞争ELISA法分析，确定与人血清IgE的存在最大竞争抑制率的一种候选单抗；其次通过与Hum j3结合的单抗之间的相互竞争抑制ELISA的分析，确定构建夹心ELISA方法的另一种单抗；

3)优化夹心ELISA方法检测葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3的条件，包括：包被单抗浓度、葎草变应原浸液和纯化葎草花粉主要致敏蛋白的浓度稀释范围，酶标单抗的稀释浓度；

4)确定夹心ELISA方法检测葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3的各种方法学指标，包括：敏感性、特异性、线性范围、显色稳定性。

2.一种检测葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3的夹心ELISA检测试剂盒，包括捕捉抗体和检测抗体，所述捕捉抗体包被于酶标板中，所述检测抗体为酶标记抗体，所述捕捉抗体和检测抗体分别特异性地针对Hum j3的不同抗原决定簇。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述捕捉抗体是由杂交瘤细胞Hum j3-#87-mAb保藏号CGMCC No.3208分泌获得。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测抗体是由杂交瘤细胞Hum j3-#66-mAb保藏号CGMCC No.3209分泌获得。

5.如权利要求2～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，其还包括以下试剂中的一种或多种：

1)洗涤液；

2)底物显色液；

3)反应终止液；

4)Hum j3标准品。

6.如权利要求2～4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测抗体的标记酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶或β-半乳糖苷酶。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为PBST，底物显色液为OPD-H₂O₂显色液、终止液为2mol/L H₂SO₄，所述检测抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。

8.一种检测葎草花粉主要主要致敏蛋白Hum j3的方法，其利用权利要求2～7任一项所述试剂盒进行检测，包括如下步骤：

1)向包被捕获抗体的酶标板微孔中分别加入Hum j3标准品和待检测的样品；

2)洗涤液洗板，加入检测抗体；

3)加入底物显色液显色，加入反应终止液终止反应，OD492读数；

4)以Hum j3标准品的剂量-效应曲线为标准曲线，计算样品Humj3含量。

9.权利要求2～7任一项所述试剂盒在检测葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3含量中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于包括：a)在临床实践中用于确定皮试诊断和免疫治疗时变应原浸液产品中主要致敏蛋白Hum j3的含量以及安全有效的剂量范围；b)在大气生物学花粉预报、环境监测方面监测环境中微量的Hum j3含量；c)在新药研发中运用衡量和监测重组Hum j3蛋白的表达质量以及产量。

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