CN101988068A

CN101988068A - 一个耐旱基因SpUSP的克隆及其在抗逆方面的应用

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Publication number: CN101988068A
Application number: CN 201010235244
Authority: CN
Inventors: 叶志彪; 理查德; 李汉霞; 王涛涛; 张俊红; 张余洋; 卢永恩
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2010-07-21
Filing date: 2010-07-21
Publication date: 2011-03-23
Anticipated expiration: 2030-07-21
Also published as: CN101988068B

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其属于番茄转基因技术领域。克隆得到一种与植物抗旱相关的基因SpUSP，该基因的核苷酸如序列表SEQ ID NO：1所示，它的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。生物学功能验证和遗传转化表明，该基因可在番茄抗逆育种和遗传改良中应用，为番茄类植物提供了一种新的基因资源。

Description

一个耐旱基因SpUSP的克隆及其在抗逆方面的应用

技术领域

本专利属于植物基因工程领域。具体涉及植物抗逆生物技术领域中，一个新鉴定的植物USP基因，该USP基因在提高植物抗旱、抗寒、耐盐和抗氧化逆境等方面有显著的作用。

背景技术

干旱的最直接危害是造成农作物减产，使农业歉收，严重时形成大饥荒。在严重干旱时，人们饮水发生困难，生命受到威胁。中国每年都有不同程度的旱灾发生。常年农作物受旱面积约3亿至4亿亩，每年损失粮食近158亿公斤，占各种自然灾害损失总量的60％。通过引流及节水灌溉等措施，可以暂缓干旱对农作物的威胁，但不能彻底改变植物对干旱的抗性。应对干旱，需要转换新思路，变被动抗旱为主动抗旱，由单一抗旱转向全面抗旱。通过基因工程的途径为我们提供了一条主动的抗旱途径(Carlos et al.2005)。

植物的生长发育和对逆境的适应涉及到复杂的基因表达调控网络，尤其是对于干旱、低温和高盐等胁迫的抗逆反应是多基因参与的协同防御反应。在长期的进化过程中植物形成了逆境应答的基因表达模式来适应不同的环境胁迫(Bray，1997；Shinozaki andYamaguchi-Shinozaki，1997)。

转录因子调控的基因表达是植物逆境应答反应的关键环节。目前发现的与植物逆境反应相关的转录因子主要分为如下几类：bZIP家族转录因子，WRKY家族转录因子，AP2/EREBP家族转录因子，MYB家族转录因子，NAC家族转录因子。这些转录因子有些受ABA诱导，如bZIP可被干旱、高盐等逆境因子和ABA激活表达，与ABA响应元件ABRE(ABA responsiveelement)结合后，也可促进下游基因表达(Choi et al.，2000)。MYB受干旱、高盐、低温等多种逆境和ABA诱导表达，与下游调控因子结合位点为TAACTG，MYB必须与靶位点结合后，受调控基因才响应逆境表达(Abe et al.，1997)。逆境胁迫下，另有部分基因表达与ABA含量变化无关，表明逆境响应基因中存在不依赖ABA的调控方式，如脱水响应元件(DRE/CRT)和锌指蛋白同源结构域基因(ZFHDR)等。

本发明的SpUSP基因是以抗旱的番茄IL系(渗入系)为材料，通过基因芯片差异杂交技术，筛选到一些与抗旱相关的候选基因，对部分候选基因进行转基因验证后，发现了一个能显著增强植株抗旱性的新基因，在GenBank检索与其同源性最高的仅为58％，其保守域为存在一类似USP(Universal stress protein)的转录因子，该基因克隆自潘那利番茄(Solanumpennelli)，因此我们将其命名为SpUSP。USP转录因子在细菌中有少量功能的研究，在植物关于有功能的USP转录因子的报道非常少，在番茄中还未见相关报道。SpUSP包含一个USP保守结构域，它是一个小的细胞质细菌蛋白，当细胞处在外界压力的条件下时，它的表达会增强，从而增强细胞的存活能力，提供了一种对外界压力的普遍抗性。USP结构域可能和Na⁺//H⁺反向转运体结构域，Cl^-电压通道，氨基酸透酶，蛋白质激酶等发生作用(Kristian et al.2003)。在大肠杆菌中有6个编码USP的蛋白家族，其中4个形成一类蛋白，其作用为保护细胞，减少DNA损伤。

发明内容

本发明的目的在于提供一个新鉴定植物耐旱基因即SPUSP基因，通过在植物中超量表达该SPUSP基因，能提高植物的抗旱和耐盐等特性，可以增强作物在逆境下(干旱、低温、盐碱等)的适应性，使植物在逆境环境中能正常生长和发育。经基因改良后的植物，特别适用于在田间和设施环境下栽培和种植，从而有利于增强作物生产力、稳定处理和品质、降低农业生产风险和成本。

本发明是这样实现的：

本发明利用芯片差异筛选技术，从植物中克隆得到一个新的USP基因，它的核苷酸序列与目前已经鉴定的基因序列相似程度很低，最高仅为58％，属于一个新的基因。其cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示，序列全长为572bp，其ORF序列从92-526bp。该基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码145氨基酸，将该基因在植物中超量表达，可以提高植物的抗旱、抗寒和耐盐等逆境适应性。

本发明所述的植物包括单子叶植物、双子叶植物。

本发明克隆的基因被命名为SpUSP，包括该基因的DNA序列、cDNA序列，与该序列具有90％以上同源性的序列及编码相同功能蛋白质的DNA序列，均属于本发明的保护范围。

本发明所述基因包括完整的或部分的(20个及以上)核苷酸和(6个及以上)氨基酸系列。

本发明可以通过农杆菌介导的遗传转化方法或其他转基因方法把SpUSP基因转入植物中，通过筛选鉴定并纯化，获得纯合的转基因植株或株系均属于本发明的保护范围。

本发明通过在植物体内超量表达该基因可以提高植物的抗旱性，抗寒性，耐盐性和抗氧化胁迫，其在抗逆方面的应用均属于本发明的保护范围。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的SpUSP基因的cDNA序列。

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的SpUSP基因编码的氨基酸序列。

图1：是SpUSP基因正义(超量)表达载体构建过程。

图2：是图1中PMD18-T载体的示意图。

图3：是图1中PMV载体示意图。

图4：SpUSP基因在番茄不同组织和器官中特异性表达分析。图中1：幼叶，2：中等叶，3：老叶，4：幼茎，5：花，6：果实，7：根。

图5：不同逆境下番茄SpUSP基因的表达分析。图中1：CK，2：3μMABA处理2h，3：3μMABA处理12h，4：4℃冷处理8小时，5：40℃热处理7小时，6：10mM H2O2处理，7：200mMNaCl处理6h，8：200mMNaCl处理12h，9：2mM SA处理。

图6：干旱处理对SpUSP转基因番茄植株的影响。图6A是干旱处理下的植株；图6B是正常浇水下生长的植株。

图7：SpUSP转基因番茄植株和对照叶片失水情况。

图8：SpUSP转基因番茄植株在控制浇水条件下植株鲜重与干重的差异。图8A是鲜重，图8B是干重。

图9：SpUSP转基因番茄植株在限制浇水条件下叶绿素含量差异。

图10：SpUSP转基因番茄植株经PEG处理后脯氨酸含量差异。

图11：低温处理后转基因株系和对照的生长情况。图中：图左为对照中蔬6号，图右为存活的为转基因株系E44，死亡的为E69株系。

图12：NaCl和甘露醇处理后番茄SpUSP转基因种子的发芽情况。图中：A，B，C为对照未处理的番茄种子发芽情况；D，E，F为NaCl和甘露醇处理后番茄种子的发芽情况；A，D是转基因株系E69；B，E是转基因株系E44；C，F是对照中蔬6号。

图13：盐处理对番茄SpUSP转基因叶片叶绿素含量的影响。

图14：百草枯处理后番茄SpUSP转基因种子的发芽抗性情况。上排清水对照，下排添加0.2M百草枯。

图15：百草枯处理后，番茄SpUSP转基因植株生长的差异。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出更详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

1本发明的SpUSP基因的克隆与分析

本发明中的基因是根据番茄耐旱基因芯片杂交结果，对大量候选基因进行转基因功能验证的基础上，发现番茄SpUSP基因能显著增强植株对逆境的抵抗能力。

基因芯片杂交结果表明，SpUSP基因在耐旱与干旱敏感的材料中表达量存在明显差异，根据基因芯片注释的基因信息(Http://solgenomics.net/tomato/)，设计扩增SpUSP基因的引物，正向引物为5’-CACGCGGCAAGAGAGAATACATGGA-3’，反向引物为5’-ATAATGTAATGAATGTGTTGGGCGA-3’，通过PCR的方法，从野生番茄种潘那利(S.pennellii)引自美国番茄遗传资源中心(TGRC)中扩增出全长SpUSP基因cDNA序列。扩增方法是先提取番茄RNA，然后利用反转录试剂盒(购自TOYOBO公司，日本)，按照试剂盒说明书反转录合成SpUSP基因的cDNA，利用上述设计SpUSP基因的引物，通过PCR扩增得到SpUSP全长基因，经1％琼脂糖凝胶检测，用回收试剂盒(购自北京普博欣公司，具体程序见说明书)回收目的片段，克隆至pMD18-T载体(购自TAKARA公司)，取5μL连接产物热击法(参照J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002版)转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有氨苄青霉素/异丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-D-半乳糖甘(Amp/IPTG/X-gal)的LB固体平板上，37℃培养过夜，挑选蓝斑1个和白斑若干，于含Amp 50mg/L的液体LB培养基中，37℃200r/min振荡培养过夜，用小量法提取质粒(试剂盒购自北京普博欣公司，具体程序见说明书)。质粒用限制性内切酶(XhoI和BamHI)酶切，对经检测正确的阳性重组克隆进行序列测定，测序工作由上海英骏生物技术有限公司完成。

利用GENESCAN对该基因序列分析，结果表明，该基因序列全长为572bp，编码145个氨基酸(见序列表SEQ ID NO.1所示)。该基因含有2个内含子，具有USP基因的保守结构域。利用BLAST软件(程序)在NCBI，MicroTom和TIGR数据库上进行搜索，发现本发明克隆的基因序列与目前公布的基因序列的同源性均很低，最高的仅为58％，属于一个新的与植物耐旱性状相关的候选基因，申请人将其命名为SpUSP。

2载体构建

在扩增SpUSP基因的引物两侧分别加上Sal I和Kpn I酶切位点，随后以潘那利cDNA为模板，进行PCR扩增，将扩增的产物克隆到PMD18-T载体，具体步骤见本发明的SpUSP基因的克隆与分析部分。随后，以Sal I和KpnI双酶切带有目的基因全长片段的PMD18-T载体，同时以Xho I和KpnI双酶切pMV载体，1.0％琼脂糖胶检测，回收目的基因片段及pMV的载体大片段，将回收的目的基因片段与pMV的载体大片段以1∶1的比例混合，加入T₄DNA连接酶2U，1×反应缓冲液，无菌水补充体积至20μL。22℃连接1h，取5μL连接产物转化大肠杆菌DH5α，Km抗性平板筛选阳性克隆，酶切检测。pMV载体和PMD18-T载体的示意图及其构建流程见图1，图2和图3。

对获得的重组克隆利用电转化仪在1800V的电压下转化农杆菌C58，用含利福平(Rif)100mg/L，卡那霉素(Km)50mg/L的LB固体平板筛选，挑选阳性克隆，28℃、150r/min振荡培养过夜，收集20μL菌液，ddH₂O重悬，95℃变性10min，10000r/min离心1min，取2μL上清液作为模板，以上述SpUSP基因的引物进行重组质粒的PCR阳性检测，确认为阳性的保存后用于进一步的遗传转化。

3遗传转化

将中蔬6号番茄种子(购自中国农科院蔬菜花卉研究所)经次氯酸钠消毒15min，播种于1/2MS培养基上(pH＝5.8)，于25±2℃，黑暗条件下培养直至种子发芽，转入光照强度为1800lx，16h光/8h暗的光周期条件下进行培养。切取7-8d苗龄无菌苗子叶预培养2d(培养基为MS，pH＝5.8)。MS₀重悬至OD₆₀₀≈0.5的农杆菌液浸染3-5min，用灭菌滤纸吸干多余菌液，重新置回预培养基上，黑暗条件下共培养2d，转入到筛选培养基1.0ZR+头孢霉素(Cef)400mg/L+卡拉霉素(Km)100mg/L)上进行抗性筛选，每两周继代一次，抗性芽出现后将外植体转入0.2ZR+Cef(头孢霉素)200mg/L+Km(卡拉霉素)100mg/L的培养基中。于20～30d后切下抗性芽，转移至生根培养基(编号为RM)中诱导生根，根系发达的植株移栽花钵。上述培养基的具体配方见表1所示。

表1番茄遗传转化培养基配方

注：以上培养基中除MS₀外均含有琼脂7.4g/L，补充蒸馏水至1L，调培养基的pH至5.8。按照常规方法灭菌。

5SPUSP基因的表达分析

RT-PCR分析表明，在干旱敏感的栽培番茄M82品种(引自美国番茄遗传资源中心)和抗旱的耐旱番茄种潘那利(S. pennellii)(引自美国番茄遗传资源中心)的幼嫩叶片和中等大小的叶片以及果实中，SpUSP基因都有很高的表达，在根中的表达都很低(图4)。对正常浇水的植株，不抗旱的植株检测不到SpUSP基因的表达，在两个抗旱系(IL9-1和IL2-5)表达也很低。当在干旱胁迫下SpUSP基因的转录水平明显增加，表明其与抗旱关系密切。进一步检测了SpUSP基因在其他一些非生物逆境处理后的表达情况，例如脱落酸(ABA)，氯化钠(NaCl)，水杨酸(SA)，双氧水(H₂O₂)，40℃高温和4℃低温等，结果表明：3μM ABA处理2小时后，SpUSP转录开始增加，到12小时增加到最大(见图5)。200mM的NaCl处理6小时后，SpUSP表达也增加了。2mM的SA，10mM的H₂O₂，40℃高温不影响SpUSP基因的表达。4℃低温没有影响SpUSP基因在S.pennellii中的表达，但是在M82中表达量增加了。

6、SpUSP基因功能鉴定

6.1转基因植株的抗旱性鉴定

为了验证SpUSP基因在番茄抗旱方面的功能，申请人将转基因植株和对照植株同时种在一个营养钵内，对转SpUSP基因的植株和对照植株(非转基因植株)在21天不浇水的情况下，发现转基因植株仅表现为中度缺水症状，对照植株则表现为严重缺水(见图6a)，同时发现转基因植株比对照植株生长更高大，恢复浇水后转基因植株能很快恢复生长，并能正常开花结果，而对照植株大部分死亡了。没有进行干旱处理的转基因植株和对照植株长势比较一致(图6b)。同时以转基因株系E44，E54和E69及非转基因中蔬6号野生型(WT)为材料，将生长到4周大小的番茄植株，去根后检测了在离体情况下，植株的失水程度，通过在空气中自然干燥5小时，与中蔬6号相比，发现3个转基因株系的水份丧失的更慢，其中E54失水最慢(图7)。

此外，申请人还比较了转基因株系E44，E54和E69和非转基因中蔬6号(WT)的干鲜量、叶绿素含量及光合效率等指标(测定方法参见李合生，2000)。实验对转基因株系和对照植株，设置了正常浇水(浇水量为100mL)和限制浇水21天(浇水量25mL)。限制浇水21天的条件下，非转基因植株(对照)的生物量减少超过50％，而转基因植株仅减少2-23％(图8A、图8B)。在限制浇水21天后，对照叶绿素含量显著减少，而转基因植株叶绿素含量减少不明显(见图9)。限制浇水21天后，对照光合效率减少了80％；而转基因株系光合效率仅减少了25％。在正常浇水条件下，转基因植株和对照植株没有明显的变化，两者表现出相近的光合效率。

脯氨酸是一个渗透调节剂，在干旱条件下其产量会明显增高，来保护植株减少伤害，可以保护蛋白和质膜不受影响。本试验选取上述3个转SpUSP基因的番茄植株，用聚乙二醇(PEG)处理24h后，测定了脯氨酸含量(方法参见李合生，2000)，发现转SpUSP基因株系E44比对照中蔬6号植株的脯氨酸含量提高了近5倍，转SpUSP基因株系E54提高了近4倍，转SpUSP基因株系E69与对照相差不大(图10)。

试验结果表明，转SpUSP基因的番茄在抗旱方面效果显著，是一个在番茄耐旱应用上很具潜力的功能基因。

6.2番茄SpUSP转基因植株对其他非生物逆境的抗性

本实施例还对SpUSP基因在其他非生物逆境的抗性进行了鉴定，这些鉴定项目包括抗寒性、耐盐性和抗氧化逆境鉴定等。具体方法如下：

6.2.1转SpUSP基因植株的抗寒性鉴定

选取抗逆性强的2个番茄转SpUSP基因株系E44和E69，对其抗寒性进行了鉴定，将对照番茄中蔬6号植株和转基因番茄植株同时播种，待种子发芽长到4叶一心时，将苗移至4℃下处理10天，在10℃下恢复生长2天，然后在25℃恢复生长一周后，统计它们的成活率。发现经过低温处理后的对照番茄植株和转基因番茄株系E69全部死亡，而转基因番茄株系E44大部分生长正常(见图11)，说明转基因番茄株系E44的抗寒性明显增强。

6.2.2转基因植株的耐盐性鉴定

将抗逆性较强的3个转基因株系(E44，E54和E69)和对照中蔬6号的种子播种在滤纸上，其中滤纸上添加浓度为200mM的NaCl和浓度为200mM的甘露醇。发芽4天后，每隔2天统计一次发芽率。发现在10天后，这3个转基因株系的发芽率均超过了85％，而对照植株的发芽率仅为58％(见表2)，对照植株幼苗生长缓慢，矮小，根系不发达(图12)。当植株长到4周大小时，浇施300mM食盐水(NaCl溶液)，连续浇施30天后，25株转基因番茄植株有24株达到成年，并且正常开花结果，而非转基因对照植株仅存活2株，并且生长明显受到抑制，没有能够正常开花结果。

表2NaCl溶液处理不同时间后SpUSP转基因番茄种子的发芽率差异

另一方面，对前期未进行NaCl溶液处理的植株，待开花后，进一步检测了转基因番茄植株的耐盐性，利用打孔器将转基因番茄植株和对照(非转基因)番茄的叶片进行取样，将取的圆形叶片放在含300mM NaCl溶液中浸泡，在处理72小时后进一步测定了叶绿素含量，结果表明，转基因番茄株系叶盘的叶绿素含量显著高于对照，非转基因番茄植株的叶盘颜色明显变淡，而转基因番茄株系的叶片仍然保持绿色，未经NaCl处理的转基因和对照的叶盘仍保持绿色，颜色深浅无明显差异(图13)。

6.2.3番茄SpUSP转基因植株对氧化胁迫的抗性

百草枯是一种商用除草剂，喷撒到植株上后，会产生活性氧(ROS)，对植物能产生氧化胁迫。

本发明从转SpUSP基因的番茄植株中，选择转基因株系E69和2个对照品种的非转基因番茄品种中蔬6号和M82种子，分别接种在含清水和除草剂百草枯的滤纸上，测定百草枯对转基因番茄种子发芽的影响。发现转SpUSP基因番茄植株和对照在清水中均能正常生长。但添加百草枯后，上述两个对照植株即中蔬6号和M82的生长受到抑制，叶片皱缩，而转SpUSP基因番茄株系生长正常(图14)。另外，待植株长大后，在离体的条件下，用打孔器将转SpUSP基因植株和对照第3、4片叶打成直径约8mm的叶盘，将15片叶盘浸泡在0.2M的百草枯溶液里，先暗处放置1h，再转入25℃的光照条件下处理，36h后观察叶片褪绿情况，发现非转基因植株明显退绿，植株的鲜重显著减少，尤其是中蔬6号，重量减少近50％。而转SpUSP基因植株变化不显著(图15)。说明本发明的转SpUSP基因株系对由百草枯造成的氧化胁迫有较好的抗性。

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Claims

1.一种克隆的植物抗旱基因，它的核苷酸如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.一种克隆的植物抗旱基因，它的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求1所述的基因在番茄抗逆境中的应用。

4.权利要求2所述的基因在番茄抗逆境中的应用。