CN101974170B

CN101974170B - 一种蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN101974170B
Application number: CN 201010291789
Authority: CN
Inventors: 孟志云; 顾若兰; 吴卓娜; 朱晓霞; 窦桂芳; 孙文种; 甘慧; 王延琳
Original assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2010-09-26
Filing date: 2010-09-26
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-09-26
Also published as: CN101974170A

Abstract

本发明公开了一种蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵及其制备方法与应用。该壳聚糖止血海绵是将清洁干燥后的蝇蛆壳粉碎，用盐酸溶液除金属离子，用氢氧化钠溶液脱蛋白质，用过氧化氢溶液脱色，用氢氧化钠溶液梯度脱乙酰化，干燥后成粉剂；再溶解于稀乙酸溶液中，冷冻干燥，灭菌得到。本发明产品能有效激活局部血小板、吸附红细胞并促进局部凝血酶生成，粘合局部组织伤口而发挥迅速、稳定的止血活性，同时有选择性抗菌及促进细胞增殖作用，对控制中度创伤性出血及组织脏器弥漫面出血效果良好，不仅可适用于创伤性出血的外用急救，尤其适用于术中植入性止血，还具有预防创面伤口感染、促进创面愈合的功能。

Description

一种蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医用止血材料领域，涉及一种蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵及其制备方法，尤其是涉及一种能快速止血、止血机制多样、可用于术中植入性止血并可预防创面伤口感染、促进创面愈合的蝇蛆壳来源壳聚糖及其止血海绵和其制备方法。

背景技术

出血是引起各种创伤死亡的主要原因。快速止血是各种手术及创伤急救的重要环节。局部止血材料由于在对手术及突发性事故的急救治疗中有着简便、迅速等特点，是院前及术中急救止血的首选措施。对理想局部止血材料的研发一直是国内外关注的热点。

壳聚糖是一种自然界含量丰富的天然高分子线性多糖。早期大量研究已证明壳聚糖无毒性、无免疫原性，且具有良好的生物降解性、抗菌活性及促进创伤愈合等生物学优势。近年来研究发现壳聚糖还具备独特的止血活性。迄今为止，越来越多的研究开始关注这种生物学特性良好的新型止血材料。如美国HemCon Medical Technologies公司生产的HemCon止血绷带，已于2002年9月由美国FDA批准生产，用于中重度大出血救治。迄今美国FDA已批准数种壳聚糖类止血产品用于暂时性外用止血急救，国内目前类似产品较少。

现有研究表明，壳聚糖的各种生物学活性，包括止血活性与其提取制备工艺及原料来源密切相关。目前，壳聚糖的制备原料多采用天然收集的虾蟹壳经高浓度酸碱高温长时间提取制备，在原料的质量控制以及生产工艺的重现性方面存在较大隐患。此外，由于环境污染等造成的国内天然壳聚糖生产原料不足问题日益明显，开发新资源、降低生产成本也是目前的迫切任务。

发明内容

本发明提供了一种能快速止血、止血机制多样、可用于术中植入性止血并可预防创面伤口感染、促进创面愈合的壳聚糖止血海绵。

本发明所提供的壳聚糖止血海绵，是以蝇蛆壳为来源提取制备的。

所述蝇蛆壳的来源是广泛的，如一种人工繁殖的食草蝇的蝇蛆壳。

本发明的第二个目的是提供一种上述壳聚糖止血海绵的制备方法。

本发明所提供的制备方法，可包括以下步骤：

1)将清洁干燥后的蝇蛆壳粉碎，用盐酸溶液除金属离子，用氢氧化钠溶液脱蛋白质，用过氧化氢溶液脱色，用氢氧化钠溶液梯度脱乙酰化，干燥后成粉剂；

2)将步骤1)获得的壳聚糖粉剂溶解于稀乙酸溶液中，冷冻干燥，灭菌，得到蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵。

在上述蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵的制备方法中，所述步骤1)中盐酸溶液的浓度优选为0.5-10mol/L，氢氧化钠溶液的重量浓度优选为1-20％，过氧化氢溶液的重量浓度优选为1-20％，氢氧化钠溶液重量浓度梯度优选为30-60％；其中，脱乙酰化次数为2-6次，反应时间为4-18小时，温度40-90℃。

所述步骤2)中优选为按重量体积比浓度0.5-20％将壳聚糖粉剂溶解于0.5-10％的稀乙酸溶液中。

此外，步骤2)中将壳聚糖粉剂溶解于稀乙酸溶液后，可倒入模具中自流平并预冷，再将模具冷冻干燥，使模具中物质呈微多孔状结构的海绵体，孔腔隙直径优选为0.5-20μm。

将海绵体取出即为蝇蛆壳来源壳聚糖海绵；再经密封包装、灭菌得到蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵成品。

本发明的另一目的是提供以上所述蝇蛆壳来源壳聚糖海绵的新用途。该蝇蛆壳来源壳聚糖海绵可以在制备创伤性出血的外用急救止血材料和/或术中植入性止血材料中的应用；还可以在制备兼具止血、防创面伤口感染和促进创面愈合的功能材料中的应用。

本发明提供了一种蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵、其制备方法及应用。该蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵的止血机制和特点如下：

1)该止血海绵呈微多孔状结构，孔腔隙直径0.5-20μm，利于血细胞的吸附和聚集，是其物理机械性止血基础；

2)该止血海绵与抗凝全血共孵育两分钟即可大量吸附局部红细胞并引起红细胞形态学的显著变化，呈明显多角状或有伪足形成；

3)该止血海绵与富含血小板血浆共孵育两分钟即可引起局部血小板的明显激活；

4)该止血海绵可在不依赖红细胞及血小板存在的前提下明显促进局部凝血酶生成。

本发明蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵的生物学活性如下：

1)该止血海绵可抑制大肠杆菌及多种金黄色葡萄球菌的生长；

2)该止血海绵可促进成纤维细胞及原代肝细胞的增殖；

3)该止血海绵在体内可吸收降解，具备良好的血液、细胞以及组织相容性。

实验证明，该壳聚糖止血海绵能有效激活局部血小板、吸附红细胞并促进局部凝血酶生成，有效粘合局部组织伤口而发挥迅速、稳定的止血活性，同时有选择性抗菌及促进细胞增殖作用。本发明对控制中度创伤性出血及组织脏器弥漫面出血效果良好，不仅可适用于创伤性出血的外用急救，尤其适用于术中植入性止血。此外，它还具有预防创面伤口感染、促进创面愈合的功能。本发明壳聚糖止血海绵的提取原料可来源于人工繁殖食草蝇的蝇蛆壳，来源广泛，成本低，适合大面积推广和应用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为不同浓度CS浸提液对L929细胞的体外细胞毒性实验结果

图2为1.0％、0.5％和0.25％组CS、GS和OC体外原代肝细胞孵育结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所述百分比浓度如无特别说明均为质量百分比浓度。

本发明蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵的制备方法，可包括以下步骤：

1)将清洁干燥后的人工养殖蝇蛆壳粉碎(过100目筛网)，用0.5-10mol/L盐酸溶液除金属离子，用1-20％氢氧化钠溶液脱蛋白质，用1-20％过氧化氢溶液脱色，用30-60％氢氧化钠溶液梯度浸泡脱乙酰化(脱乙酰化次数为2-6次，反应时间为4-18小时，制备温度40-90℃)，干燥后成粉剂。

2)将上述壳聚糖粉剂按重量体积比浓度0.5-20％溶解于0.5-10％稀乙酸溶液，倒入模具中自流平并-20℃预冷。

3)将步骤2)中模具放入冷冻干燥机中冷冻干燥(-50℃，48-72h)，使模具内物质呈微多孔状结构的海绵体，孔腔隙直径0.5-20μm。

4)取出模具内的海绵体，即为蝇蛆壳来源壳聚糖海绵。再经密封包装，灭菌，得到蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵成品。

实施例1、蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵的制备

用本发明的方法制备蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵，具体方法包括以下步骤：

1)将清洁干燥后的人工养殖蝇蛆壳粉碎，用0.5mol/L盐酸溶液除金属离子，用1％氢氧化钠溶液脱蛋白质，用1％过氧化氢溶液脱色，分别用30％、60％氢氧化钠溶液2次梯度脱乙酰化，单次反应时间18小时，制备温度90℃，干燥后成粉剂。

2)将上述壳聚糖粉剂按重量体积比浓度0.5％溶解于0.5％稀乙酸溶液中，倒入模具中自流平并-20℃预冷。

3)将模具放入冷冻干燥机中冷冻干燥(-50℃，72h)，使模具内物质呈微多孔状结构的海绵体，孔腔隙直径0.5-20μm。

4)取出模具内的海绵体，即为蝇蛆壳来源壳聚糖海绵。再经密封包装、灭菌得到蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵成品。

实施例2、蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵的制备

1)将清洁干燥后的人工养殖蝇蛆壳粉碎，用5mol/L盐酸溶液除金属离子，用10％氢氧化钠溶液脱蛋白质，用10％过氧化氢溶液脱色，分别用30％、40％、50％、60％氢氧化钠溶液4次梯度脱乙酰化，单次反应时间10小时，制备温度60℃，干燥后成粉剂。

2)将上述壳聚糖粉剂按重量体积比浓度10％溶解于5％稀乙酸溶液中，倒入模具中自流平并预冷。

3)将模具放入冷冻干燥机中冷冻干燥(-50℃，48h)，使模具内物质呈微多孔状结构的海绵体，孔腔隙直径0.5-20μm。

4)将海绵体密封包装，灭菌，得到蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵。

实施例3、蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵的制备

1)将清洁干燥后的人工养殖蝇蛆壳粉碎，用10mol/L盐酸溶液除金属离子，用20％氢氧化钠溶液脱蛋白质，用20％过氧化氢溶液脱色，分别用35％、40％、45％、50％、55％、60％氢氧化钠溶液6次梯度脱乙酰化，单次反应时间4小时，制备温度40℃，干燥后成粉剂。

2)将上述壳聚糖粉剂按重量体积比浓度20％溶解于10％稀乙酸溶液，倒入模具中自流平并预冷。

3)将模具放入冷冻干燥机中冷冻干燥(-50℃，60h)，使模具内物质呈微多孔状结构的海绵体，孔腔隙直径0.5-20μm。

抗菌实验

采用抑菌圈法测定：待测菌株(E coli.25922、SA.10442、SA.25923、SA.4744)常规复苏培养，取菌液适量分别接种于各琼脂培养基表面后，均匀分布打孔，孔内分别加入质量体积浓度为0.01％或0.03％的壳聚糖止血海绵-生理盐水浸提溶液(浸提条件为37℃，24h)，置于37℃培养箱内培养12-24小时。阴性对照为生理盐水及1％乙酸溶液，培养结束后取出，测量各孔周围抑菌圈半径值。

实验结果如表1所示，表明本发明的蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵对大肠杆菌及多种金黄色葡萄球菌有抑制作用。

表1壳聚糖海绵CS抑制细菌生长的抑菌圈半径值

-：无抑菌圈产生；

+/-：接种圈周围菌株生长可疑减弱，但未形成明显抑菌圈促进细胞增殖实验

受试细胞株分别采用成纤维L929细胞株和新鲜分离的大鼠原代肝细胞。采用MTT法评价壳聚糖海绵(CS)对以上两种细胞的增殖影响。壳聚糖止血海绵用DMEM培养基浸提(37℃、5％CO₂细胞培养箱、24h)，取上层浸提液进行实验。其中，在对L929细胞的增殖影响实验中，阴性细胞组为空白培养基(含10％胎牛血清及100U/mL青-链霉素的DMEM完全培养基)培养，阳性细胞组采用含0.5％苯酚溶液的培养基培养；受试壳聚糖海绵浸提比例为1.25cm²/mL浸提液，即为100％组；50％组采用空白DMEM培养基对100％组稀释1倍得到。壳聚糖对大鼠原代肝细胞的增殖影响考察实验中，对照止血材料分别为氧化纤维素止血纱布(OC)和明胶海绵(GS)，止血材料的浸提比例采用重量体积比，依次为1.0、0.5、0.25％。

实验结果如图1(不同浓度CS浸提液对L929细胞的体外细胞毒性)和图2(1.0％、0.5％和0.25％组CS、GS和OC体外原代肝细胞孵育结果(n＝6))所示，表明本发明的蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵具有较明显的促进细胞增殖作用，体外可显著促进成纤维细胞及大鼠原代肝细胞的增殖。

止血动物实验

1、大鼠股静脉出血模型实验

大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠10mg/100g麻醉，仰卧位固定于鼠板，75％酒精消毒腹股沟区，无菌操作纵向切开腹股沟区皮肤，暴露皮下组织肌肉，血管钳钝性暴露并游离中上段股静脉，剪刀剪断股静脉制造失血模型。分别取壳聚糖海绵(CS)和对照止血材料明胶海绵(GS)适量直接应用于血管断端出血部位，手法按压止血，计时，1分钟后轻轻松开并观察出血情况，如再无活动性出血则定义为止血，记录按压次数；如仍出血，则重复手法按压1分钟，直至血止，记录按压次数。统计方法采用成组设计t检验。

实验结果如表2所示，表明本发明的蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵对大鼠股静脉损伤的上血效率均优于对照止血材料明胶海绵及氧化纤维素止血纱布。

表2CS和GS在大鼠股静脉出血模型中的止血效果比较(n＝6)

*：P＜0.01vs.GS

2、大鼠股动脉出血模型实验

大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠10mg/100g麻醉，仰卧位固定于鼠板，75％酒精消毒腹股沟区，无菌操作纵向切开腹股沟区皮肤，暴露皮下组织肌肉，血管钳钝性分离并暴露中上段股动脉，剪刀剪断股动脉制造失血模型。分别取CS和对照止血材料氧化纤维素止血纱布(OC)适量直接应用于血管断端出血部位，手法按压止血，计时，1分钟后轻轻松开并观察出血情况，如再无活动性出血则定义为止血，记录按压次数；如仍出血，则重复手法按压1分钟，直至血止，记录所需按压次数。统计方法采用成组设计t检验。

实验结果如表3所示，表明本发明的蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵对大鼠股动脉损伤的止血效率均优于对照止血材料明胶海绵及氧化纤维素止血纱布。

表3CS和OC在大鼠股动脉出血模型中的止血效果比较(n＝6)

*：P＜0.01vs.OC

3、兔股动脉出血模型实验

新西兰大耳白兔耳缘静脉注射2％戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定，75％酒精消毒腹股沟皮肤，备皮。无菌操作纵向切开腹股沟区皮肤，暴露皮下组织肌肉，血管钳钝性暴露并游离中上段股动脉，剪刀部分剪断股动脉制造出血模型。分别取CS和对照止血材料OC适量直接应用于股动脉断端出血部位，手法按压止血，计时，3分钟后轻轻松开并观察出血情况，如再无活动性出血则定义为止血，记录按压次数；如仍出血，则重复手法按压3分钟，直至血止，记录按压次数。

实验结果如表4所示，表明本发明的蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵对家兔股动脉损伤出血模型上的止血效率均优于对照止血材料明胶海绵及氧化纤维素止血纱布。

表4CS和OC在家兔股动脉出血模型中的止血效果比较(n＝4)

4、大鼠肝损伤出血模型植入性应用

实验所有操作步骤均在无菌条件下进行：

大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠10mg/100g麻醉，仰卧固定于鼠板，备皮，消毒。无菌打开腹腔暴露肝脏组织，在肝左叶建立8×8×5mm³大小肝组织缺损，自由出血10秒(无菌纱布收集积血，天平称量并计算沾血前后纱布重量差，表征自由出血量，作为各组模型出血程度比较的参数指标)后，立即将CS、GS或OC(均为12×12×5mm³)置于缺损出血肝组织表面，以一块干净纱布覆盖其上手法按压止血1分钟，松开后取下纱布观察，10分钟内无再次活动性出血则记为急性期止血成功；如继续出血，则换一块新材料(相同种类、相同大小)重复上述手法按压程序，直至止血成功，记录手法按压次数。依次间断缝合关腹。

急性期止血效果的观察指标为所需手法按压次数。慢性期止血效果的观察指标为术后4小时存活率。统计方法采用成组设计t检验。实验结果如表5所示。

表5CS、GS和OC大鼠肝损伤出血模型植入止血效果比较(n＝10)

该实验表明本发明的蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵对大鼠肝损伤出血模型上的止血效率均优于对照止血材料明胶海绵及氧化纤维素止血纱布，并且不仅适用于血管创伤性出血的外用急救，还可适用于术中植入性止血。

Claims

1.一种蝇蛆壳来源壳聚糖海绵的制备方法，包括以下步骤：

1)将清洁干燥后的蝇蛆壳粉碎，用浓度为0.5-10mol/L的盐酸溶液除金属离子，用重量浓度为1-20％氢氧化钠溶液脱蛋白质，用重量浓度梯度为30-60％的氢氧化钠溶液梯度脱乙酰化2-6次，脱乙酰化反应时间为4-18小时，温度40-90℃，最后干燥后成粉剂；

2)将步骤1)获得的壳聚糖粉剂溶解于稀乙酸溶液中，经冷冻干燥得到蝇蛆壳来源壳聚糖海绵。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)用氢氧化钠溶液脱蛋白质后，用过氧化氢溶液脱色。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中按重量体积比浓度0.5-20％将壳聚糖粉剂溶解于0.5-10％的稀乙酸溶液中。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中将壳聚糖粉剂溶解于稀乙酸溶液后，倒入模具中自流平并预冷，再将模具冷冻干燥，使模具内物质呈微多孔状结构的海绵体，孔腔隙直径为0.5-20μm。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将清洁干燥后的人工养殖蝇蛆壳粉碎，分别用0.5-10mol/L盐酸溶液除金属离子，用1-20％氢氧化钠溶液脱蛋白质，用1-20％过氧化氢溶液脱色，用重量浓度梯度为30-60％的氢氧化钠溶液梯度脱乙酰化；其中，脱乙酰化次数为2-6次，反应时间为4-18小时，制备温度40-90℃，干燥后成粉剂；

2)将上述壳聚糖粉剂按重量体积比浓度0.5-20％溶解于0.5-10％稀乙酸溶液，倒入模具中自流平并于-20℃预冷；

3)将步骤2)中模具放入冷冻干燥机中在-50℃下冷冻干燥48～72h，至其中物质呈微多孔状结构的海绵体，孔腔隙直径0.5-20μm；

4)将海绵体取出即为蝇蛆壳来源壳聚糖海绵；再经密封包装、灭菌得到蝇蛆壳来源壳聚糖止血海绵成品。

6.权利要求1至5任一所述方法制备得到的蝇蛆壳来源壳聚糖海绵在制备创伤性出血的外用急救止血材料和/或术中植入性止血材料中的应用。

7.权利要求1至5任一所述方法制备得到的蝇蛆壳来源壳聚糖海绵在制备兼具止血、防创面伤口感染和促进创面愈合的功能材料中的应用。