可凝结的血小板生长因子浓厚液及其制备方法
技术领域
本发明是关于血小板衍生物的领域,更特别是关于从血小板得出的生长因子浓厚液的领域。本发明亦关于制备这类生长因子浓厚液的方法,以及可凝结的血小板生长因子浓厚液在治疗性及/或美容性应用上的用途。
背景技术
指挥组织伤口疗愈及组织再生的机制及路径已有非常详细的研究,特别显示出创伤后的细胞及分子活动(event)结果大多会由体内不同组织共同承受。因此,一般性的机制包括了早期及晚期发炎反应期、细胞的增生及移动、血管新生、颗粒化组织形成及最后基质形成及再塑(remodelling)。
有趣的是,这些反应过程(cascade)会在受伤后立刻由血凝块(clot)的形成所启动,其中前述血凝块的特征是有相互交联的纤维蛋白(fbrin)及多种蛋白,如透明粘连蛋白(vitronectin)、纤维粘连蛋白(fibronectin)及凝血酶敏感蛋白(thrombospondin),而这个血凝块会预防再度流血,并作为入侵细胞的基质,同时提供一道抵抗病原体入侵的障壁。此外,这个初始血凝块可用来储存在疗愈后期所需的细胞衍生物。
特定言之,当我们假定组织修复的所有时期都是由许多因子、细胞激素及蛋白居中调控的,而它们是透过和横跨细胞膜上的受器(receptor)功能域(domain)直接物理性交互作用来调整细胞功能。之后,二次元(secondary)的信息转换子(transducer)则控制细胞内的多方面的生物反应(subcellular biology)。虽然目前与组织再生有关的机制和成分所扮演的角色只有一部份被诠释出来,但大多数的潜在优点则已被证实,特别是在血小板衍生物的优点,尤其是血小板衍生的生长因子(platelet-derived growth factor)方面的优 点。
众所皆知,血小板衍生的生长因子会展现出趋化性及细胞分裂的性质,且显现出其与软组织及硬组织的疗愈与再生(如趋化性、细胞增生、血管新生、细胞外基质沉淀及重塑)及增强细胞增生有直接的相关。进一步来说,血小板衍生物和一些密切相关的生物功能也有间接的关联,例如由旁观细胞(bystander cell)如纤维母细胞、巨噬细胞、上皮细胞或淋巴细胞等刺激趋化因子(chemokine)及细胞激素的产生。
因此,富含血小板的制剂、以及血小板凝胶、粘胶及其释出物在单独使用或与移植生物材料合并使用的情形都在增加,它们在多种临床性或治疗性应用上作为血小板衍生物或血小板生长因子的来源。
现已发现,这类包含血小板或血小板源的制剂特别有利于处理大型骨胳损伤、复杂头颅成形术(complex cranioplasties)及慢性伤口(例如口腔及颚面手术、骨科手术、牙周病科手术及整形手术),且在处理慢性溃疡、牙科的骨胳及软组织再生及口腔植体时亦特别有利;以及处理肌肉骨胳病症时亦是。
而且,在间叶干细胞的活体(ex vivo)扩增及分化方面、以及加速软骨细胞、内皮细胞及纤维母细胞增生方面,血小板释出物也受到特别的关注,因此它在软骨再生及伤口疗愈方面逐渐增加的治疗优点也逐渐受到注意和支持。
局部血小板源制剂(如凝胶、粘胶及释出物)的制备通常是使血小板浓厚液与能够引发血小板颗粒内容物释出的活化剂混合,以模拟血小板的生理活化情形。活化步骤一般是通过直接加入外源性凝血酶、或透过氯化钙(CaCl2)的使用来进行,这会抵消在收集血液或血小板期间加入抗凝血剂的效应,而引发血液凝集连锁反应(coagulation cascade),并释出内源性凝血酶。内源性及外源性凝血酶也会诱发纤维蛋白原(fibrinogen)的聚合作用,并形成以纤维蛋白为主的生物材料(血凝块),从而导致血小板内蕴含的多种掺合物 (multifaceted blend)如多种血小板生长因子的释出。
近来已开发出新的研究方法,从现有表现系统中生产重组血小板生长因子,如Regranex(人类PDGF-bb)(Janssen Cilag Internat.)。然而,可用的重组生长因子在数量上仍然相当地少,一部份是因为这些生长因子在分离、鉴定、选殖及表现上的难度。进一步来说,由于我们可以观察到多种生长因子合并的协同效果,因此,相较于单一重组因子的使用,血小板源制剂仍提供了一种补充性的优点。
包含血小板或血小板源的既有制剂的主要缺点之一是这类制剂缺乏合适的标准化及定义,这会让具有多种治疗效果的富含血小板的产物特征产生变动。用血小板浓度来预估血小板衍生物中生长因子的量的这项简单假设确实是不明确的,因为用以收集及/或活化血小板的方法的技术会影响生长因子的含量及所得的临床效果。所得产物的异质性(heterogeneity)可能取决于下列不同参数的差异:如血小板浓度、起始材料中的白血球、起始材料的种类、存放时间、储存条件、以及活化的方式。因此,这些变因显然会引起产物间的重大差异,之后并产生生物性质及临床效度(如疗愈力)上的区隔。
举例来说,将包含完整血小板的溶液/胶直接送到伤口的时候,血小板的活化与纤维蛋白血凝块的快速形成有关,同样的,也和血小板的不完全溶解有关。是以,相当量的完整血小板仍然被包于纤维蛋白血凝块内部,所以很难去测定真正的生长因子释出量。
进一步来说,当血小板凝胶及/或生长因子制剂是通过凝血酶活化同时使血小板激发而得到的,故当血小板衍生物产生时,纤维蛋白原已完全耗尽,不再是可凝结的状态,因此,需在送到伤口位置之前与外源性的天然或合成产物混合。
进一步来说,多数的治疗性局部血小板衍生物是由自体来源进行制备。也就是说,自体血小板浓厚液由患者在手术前几小时或几天所捐的血液进行制备,而用于重点照护(point-of-care)。因此它们大多用于需要固定体积的 血小板凝胶的计划性手术,以及用于健康可捐血的患者身上。此外,在手术部位制造自体制剂是有其缺点的,因为它们常常是在控制不良的条件下进行,故缺乏应有的标准化来确保生长因子释出及其临床效度。
是以,吾人对允许提前制备血小板衍生物方法有强烈的需求,特别是在标准化条件下提前制备血小板生长因子浓厚液的情形,如此可配制出一种量身定做的制剂,而用于各种特殊的生理病理状况。
进一步来说,既有的血小板源产物的另一项重要缺点来自于必然会有完整血液细胞或重要血液细胞碎片的存在,从而在血小板源产物是来自异体来源时引发针对捐赠者抗原的免疫反应。针对同种异体抗原的免疫反应可能会引起严重的后果,如同输血反应观察到的现象,并包括患者的自体免疫及溶血并发症。
进一步来说,既有的血小板源产物的另一项重大缺点是使用生物产物必然会有的相关感染风险。尽管在具有高度发展的管理环境及血液收集服务的国家中,以现代技术来测试单一捐赠者的人类同种异体血小板浓厚液的安全性确实很高,尽管标准血库方法(如血小板分离术(apheresis)或由全血得出的血小板制剂)保证无菌制备条件的可能,但是,使用血小板衍生物时仍有可能发生病毒及细菌传染。因此,血小板衍生物及血小板生长因子的病毒无害性(innocuity)是极为重要的,以确保局部使用的同种异体血小板制剂有理想的病毒安全界线。
最后,老年人口及慢性疾病的增加成了一项重要且逐渐滋长的健康问题,这在不久的将来必须要面对的。虽然目前已有多种治疗性处理,包括例如手术、抗生素投予、营养补给或组织移植,但对于组织伤口疗愈及组织再生来说,高效且经济的成分的需求仍在逐渐增长。
在密集研究后,发明人惊奇地发现,这些目的可以用后文所述的可凝结的血小板生长因子浓厚液及其制备方法来达成。
本发明的方法可以简单、快速且有效的制备血小板衍生物,且更特别的 是,可从个人血小板浓厚液或来自多数人的血小板浓厚液(pool)得到可凝结的血小板生长因子浓厚液。更特定言之,与所属领域的其他方法相较之下,本发明的方法会明显增加所有生长因子的回收,至少是比较重要的血小板生长因子的回收,且更特别的是生长因子PDGF、TGF-β及EGF的回收。
进一步来说,本发明的方法可溶解脂质膜,所以会将脂质套膜病毒及其他病原体(如细菌及寄生虫,如原虫)去活化,并可移除在起始血小板浓厚液中存在的血浆及血小板脂质。
是以,本发明的方法使之可能提供一种病毒去活化的可凝结的血小板生长因子浓厚液,其可被有效地标准化,而用于治疗性处理或细胞治疗。
临床上在静脉内使用血小板来矫治数量性或功能性血小板数量低下症(thrombocytopenia)时,由于血小板的保存期限是5或7天(部分是因为细菌污染的风险),所以每年通常都会废弃大量保存时间大于5或7天的血小板单位。在允许使用过期血小板储存液来制备血小板源生长因子浓厚液的情况下,本发明的方法最后揭示了一种极具有经济目标的愿景。
发明内容
本发明的一目的是一种可凝结的血小板生长因子浓厚液,其用于治疗性及/或美容性用途。
在一较佳实施态样中,前述可凝结的血小板生长因子浓厚液包含生长因子PDGF、TGF-β、IGF、EGF、CTGF、bFGF及VEGF。
在另一较佳实施态样中,前述可凝结的血小板生长因子浓厚液不会诱发血液细胞相关的输血反应。
在另一较佳实施态样中,前述可凝结的血小板生长因子浓厚液包含至少一种选自由纤维粘连蛋白、透明粘连蛋白、凝血酶敏感蛋白、凡威勒伯氏因子(von Willebrand factor)与第II、V、VII、VIII、IX、X及XI凝血因子所组成的组群的蛋白。
本发明的另一目的是一种制备本发明的可凝结的血小板生长因子浓厚液的方法,其包含下列步骤:使血小板浓厚液与溶剂及/或清洁剂接触;使前述血小板浓厚液与前述溶剂及/或清洁剂于维持在从约6.0至约9.0范围内的pH值及在从2℃至50℃范围内的温度下共同培养至少5分钟至6小时的时间,较佳为在从25℃至45℃范围内的温度进行;以及通过油萃取及/或层析方式来移除前述溶剂及/或清洁剂。
在一较佳实施态样中,用于本发明的方法的溶剂是选自由二-或三烷基磷酸酯类、具有不同烷基链的二或三烷基磷酸酯类所组成的组群;且较佳为三正丁基磷酸酯(TnBP)。
在一较佳实施态样中,用于本发明的方法的清洁剂是选自由脂肪酸的聚氧乙烯衍生物、山梨糖醇酐的偏酯类(partial esters)、非离子性清洁剂、去氧胆酸钠及磺基甜菜碱类(sulfobetaines)所组成的组群;且又更佳为选自由Triton X-45、Triton X-100、Tween 80及Tween 20所组成的组群。
在一较佳实施态样中,用于本发明的方法的前述溶剂及/或前述清洁剂的个别最终浓度范围为从0.2至5体积%,较佳为从0.2至2体积%,其是以前述起始血小板浓厚液的体积为基础计算。在本发明的方法的较佳实施态样中,前述起始血小板浓厚液是与单用的2%TnBP接触、或与1%TnBP及1%TritonX-45接触,其是以前述血小板浓厚液的体积为基础计算。
再者,在本发明的较佳实施态样中,油萃取是以医药等级油来进行,且前述油的用量为从2至20重量%、或从5至15重量%、或从5至10重量%,其是以前述血小板浓厚液与前述溶剂及/或清洁剂的混合物的重量为基础计算。
在另一较佳实施态样中,层析方式是使用如包含C18二氧化硅装填材料、或SDR(溶剂-清洁剂移除,Solvent-Detergent removal)hyperD来移除前述溶剂及/或清洁剂。
在一较佳实施态样中,本发明的方法进一步包含一步骤,使用10至75-nm 孔径的滤膜或类似的病毒移除膜对所得可凝结的血小板生长因子浓厚液进行纳米过滤。
在另一较佳实施态样中,本发明的方法进一步包含一设计用来浓缩生长因子及可凝结的纤维蛋白原的超滤(ultrafiltration)步骤,将之浓缩到适用于治疗性应用或细胞治疗的程度,其是使用截取值(cut value)为5000 Daltons或以下的超滤膜。
在一较佳实施态样中,本发明的方法包含一制备起始血小板浓厚液的初步步骤,前述起始血小板浓厚液是通过血小板分离术或血沉棕黄层(buffy-coat)分离法从全血加以制备,且为新鲜或过期且以液态储存、或过期且冷冻储存的状态。
本发明的另一目的是一种形成血凝块的方法,其是将本发明或通过本发明的方法所得的血小板生长因子浓厚液与凝血酶(thrombin)混合。较佳为,在前述形成血凝块的方法中所使用的凝血酶是得自人类。在一特别实施态样中,是将0.1至1体积的活性范围为从20IU/ml至1000IU/ml的凝血酶与1体积的本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液混合。
在另一较佳实施态样中,是使用如疏水型的层析方式来移除前述溶剂及/或清洁剂,其包含如C18二氧化硅装填材料、或SDR(溶剂-清洁剂移除)hyper D;亦可使用SD及/或DEAE型层析(阴离子/阳离子层析)来移除前述溶剂及/或清洁剂。
本发明的另一目的是一种医药产物或人工鹰架,其包含本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液。
本发明的另一目的是本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液的用途,其用于形成血凝块、或用于骨胳再生或伤口疗愈、或用于活体外研究(in vitro)或活体研究(ex vivo)的细胞培养。
附图说明
图1:研究设计:将捐输的分离术血小板(N=8)分成两个子集池。子集池1直接以1%TnBP-1%Triton X-45处理1小时,没有先用CaCl2活化。子集池2则先用23mM CaCl2及玻璃球粒加以活化,形成血小板凝胶。经过1小时培养后,移除血凝块,并将释出物以1%TnBP-1%Triton X-45处理1小时。经S/D两者(溶剂-清洁剂)处理的溶液经过油萃取(3次),将溶剂及清洁剂移除。测定起始血小板、活化后、S/D处理-油萃取后的生长因子含量。
图2:(A)PDGF-AB、(B)TGF-β1、(C)EGF及(D)IGF在起始血小板浓厚液中(起始)、在直接S/D处理(1%TnBP-1%Triton X-45)后(S/D)、在起始血小板浓厚液经CaCl2活化后(活化)、以及在经CaCl2活化的血小板释出物经S/D处理(1%TnBP-1%Triton X-45)后(活化+S/D)的含量(ng/ml)。S/D处理如材料及方法所述来进行,并包括3次油萃取来移除S/D用剂。
图3:(A)PDGF-AB、(B)TGF-β1及(C)EGF在起始血小板浓厚液中(起始)、在起始血小板浓厚液经CaCl2活化后(Act)接着进行牛凝血酶活化(Act-T)及S/D处理(1%TnBP-1%Triton X-45)(Act T-S/D)时的含量(ng/ml)。S/D处理如材料及方法所述来进行,并包括3次油萃取来移除S/D用剂。
图4:起始血小板浓厚液(第1行)、经本发明的溶剂-清洁剂方法处理的相同血小板浓厚液(第2行)及CaCl2活化后的相同血小板浓厚液(第3行)的间的蛋白组成物比较。样本是在4%-12%凝胶上以SDS-PAGE分离,之后蛋白以考马斯蓝染色。第M行相当于蛋白标记(大小以千道尔顿(kiloDalton)计,标示在凝胶左侧)。
图5:过期冷冻血小板分别接受S/D处理(1%TnBP-1%Triton X-45)(S/D-PC)、或接受CaCl2活化(Act-PC)、或选择性在CaCl2活化接着进行S/D处理(Act-PC+S/D)所得的浓厚液中,PDGF-AB(图5a)及EGF(图5b)的组成物比较。
图6:过期冷冻血小板分别接受S/D处理(1%TnBP-1%Triton X-45) (S/D-PC)或接受CaCl2活化(Act-PC)所得的浓厚液中,IGF-1(图6a)及TGF-β1(图6b)的组成物比较。
图7:在各种层析凝胶(CM、SP及DEAE)上进行吸附测试后,上清液内的残余PDGF-AB含量(以ng/mL表示)。各凝胶所呈现的结果由左至右分别对应每1ml凝胶对3mL、6mL、9mL或10mL SD-PC的比率。
图8:在各种层析凝胶(CM、SP及DEAE)上的VEGF吸附值%。
图9:在各种层析凝胶(CM、SP及DEAE)上的TGF-β吸附值%。
图10:在各种层析凝胶(CM、SP及DEAE)上的EGF吸附值%。
图11:本发明的方法的一特定具体实施例的图示,该方法包括一次油萃取及之后在SP-Sepharose上进行的第一分离/纯化步骤。从SP-Sepharose得出的PDGF洗提物包含PDGF及VEGF两种生长因子。从SP-Sepharose得出的前缘部分(breakthrough fraction)在DEAE-Sepharose上进一步分离/纯化,而得以制备出含有TGF-β及EGF两种生长因子的TGF-β洗提物。
图12:在起始PC、经溶剂-清洁剂处理的PC、经溶剂-清洁剂处理在一次油萃取及离心后的PC(SD-PC)、在载入DEAE Sepharose FF后的前缘部分(breakthrough fraction)(DEAE-BKT)、以及从DEAE Sepharose FF回收的洗提物(DEAE-E1M)中的EGF含量(以ng/mL表示)。
图13:经溶剂-清洁剂处理在一次油萃取及离心后的PC(SD-PC)、在载入DEAE Sepharose FF后的前缘部分(breakthrough fraction)(DEAE-BKT)、以及从DEAE Sepharose FF回收的洗提物(DEAE-E1M)中的EGF总含量(以ng表示)。
图14:经溶剂-清洁剂处理在一次油萃取及离心后的PC(SD-PC)、在载入DEAE Sepharose FF后的前缘部分(breakthrough fraction)(DEAE-BKT)、以及从DEAE Sepharose FF回收的洗提物(DEAE-E1M)中的VEGF总含量(以ng表示)。
图15:经溶剂-清洁剂处理在一次油萃取及离心后的PC(SD-PC)、在 载入DEAE Sepharose FF后的前缘部分(breakthrough fraction)(DEAE-BKT)、以及从DEAE Sepharose FF回收的洗提物(DEAE-E1M)中的PDGF-AB总含量(以ng表示)。
图16:MTT测试结果。培养在(A)补充有10%(v/v)FBS的D-MEM(10%FBS)、不含FBS的D-MEM(w/o FBS)、补充有10%(v/v)经活化的PC释出物的D-MEM(Act PC)、以及补充有10%(v/v)经C18层析后的HPGF混合物(10%C18)或经tC18层析后的HPGF混合物(10%tC18)或经SDR层析后的HPGF混合物(10%SDR)的D-MEM;以及培养在(B)补充有10%(v/v)FBS的D-MEM、或补充有3、5、7.5、10、15或20%(v/v)经C18层析后的HPGF的D-MEM中的HEK293A纤维母细胞。(C)培养在补充有10%FBS的D-MEM、不含FBS的D-MEM(w/o FBS)、或补充有0.1、0.5、1、2、3、5、7、10、15或20%(v/v)经C18层析后的HPGF的D-MEM中的SIRC纤维母细胞。细胞存活率在5天后使用MTS细胞增生法,制造商的指示进行测定。
具体实施方式
本发明的一目的是一种可凝结的血小板生长因子浓厚液,其用于治疗性及/或美容性用途。
在本发明中所使用的“可凝结”一词指本发明或通过本发明的方法所得的血小板生长因子浓厚液包含纤维蛋白原(fibrinogen)及第XIII凝血因子,故当有治疗性应用需求时,其可与合适的活化剂(如凝血酶)混合而生成血凝块。
在一特别实施态样中,本发明的可凝结的血小板生长因子浓厚液中的纤维蛋白原浓度较佳为高于1g/L浓厚液,更佳为高于1.5g/L浓厚液,又更佳为高于2.5g/L浓厚液;且其第XIII因子浓度较佳为高于0.5IU/ml浓厚液,更佳为高于0.75IU/ml浓厚液,又更佳为高于1.0IU/ml浓厚液。
在本文中所使用的“美容性用途”的说法指一种会与人体的多种体表部 分接触的处理方式,特别是与皮肤、头发、指甲、嘴唇、外生殖器官、或与牙齿及口腔粘膜接触,而使之清洁芳香、并有保护及改变的作用,或使之维持在良好的状态。
在本发明中所使用的“治疗性用途”的说法指一种治疗性或预防性处理方式来处理人类及/或动物的病症,其透过医药、免疫或代谢效用来回复、修正或改变其生理功能。
本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液特别适用于处理人类及/或动物的病症、及/或用于与其身体的体表部分接触,这是因为它已被清除溶剂及清洁剂两者,且具有病毒安全性。
“清除溶剂及/或清洁剂”的说法指可凝结的血小板生长因子浓厚液中的溶剂及/或清洁剂量极低,且较佳为其量无法检测。确实,所属领域具有通常知识者已知溶剂及/或清洁剂浓度升高与长期毒性是有直接连结的,且特别是与神经性病症的发生有直接连结(如揭示于:J.P.R.Pelletier,S.Transue,E.L.Snyder.Pathogen inactivation techniques.Best Practice & Research Clinical Haematology Vol.19,No.1,pp.205-242,2006)。
故本发明中“清除溶剂”的说法指该溶剂的量小于100ppm,较佳为小于50ppm,更佳为小于20ppm,又更佳为小于10ppm、小于5ppm,且再更佳为小于1ppm。
进一步来说,本发明中“清除清洁剂”的说法指清洁剂的量小于500ppm,较佳为小于250ppm,更佳为小于100ppm,又更佳为小于50ppm,且再更佳为小于10ppm。
“病毒安全性”的说法指可凝结的血小板生长因子浓厚液实质上不带有感染性病毒,特别是不带有含脂质的病毒,举例来说,如人类免疫不全病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、西尼罗病毒(WNV)、TT病毒、登革热病毒、巨细胞病毒(CMV)、Epstein Barr病毒(EBV)、人类疱疹病毒-8(HHV-8)、猿猴泡沫病毒、严重急性呼吸道症候群病毒(SARS 冠状病毒)以及其他脂质套膜肝炎病毒、巨细胞病毒、乳酸脱氢酶病毒、疱疹群病毒(Herpes group virus)、棒状病毒(rhabdovirus)、白血病病毒(leukovirus)、黏液病毒、α病毒、虫媒病毒(arbovirus)、副粘液病毒、沙状病毒(arenavirus)及冠状病毒。“实质上不带有”是指可凝结的血小板生长因子浓厚液的病毒去活化程度至少大于4log10,这是强力病毒减毒步骤所定出的标准(由欧洲医药产物评量机构(European Agency for the Evaluation of Medicinal Products,EMEA)的专利医药产物委员会(Committee for proprietary medicinal products,CPMP)在病毒批核研究基准(Note for guidance on virus validation studies)定出,参考文献CPMP/BWP/268/95),且更佳为大于5log10或更进一步大于6log10,因此,它不大可能会在输血给患者时造成脂质套膜病毒的血源性感染。
本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液进一步包含下列功能性生长因子:血小板源生长因子(PDGF),其为A及B链的异二聚体及/或A-A及/或B-B链的同二聚体(PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB);转形生长因子(TGF-β)超级家族,其特别包含TGF-β1及/或TGF-β2及/或骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP);胰岛素样生长因子(IGF);表皮生长因子(EGF);结缔组织生长因子(CTGF);基层纤维母细胞生长因子(bFGF)及血管内皮生长因子(VEGF)。
在一特别实施态样中,本发明的可凝结的血小板生长因子浓厚液中的PDGF浓度高于90ng/ml浓厚液,较佳为高于100ng/ml浓厚液,更佳为高于120ng/ml浓厚液,又更佳为高于150ng/ml浓厚液,再更佳为高于180ng/ml浓厚液,且又再更佳为高于250ng/ml浓厚液。
在一特别实施态样中,本发明的可凝结的血小板生长因子浓厚液中的TGF-β1浓度高于100ng/ml浓厚液,较佳为高于140ng/ml浓厚液,更佳为高于160ng/ml浓厚液,又更佳为高于180ng/ml浓厚液,再更佳为高于250ng/ml浓厚液。
在一特别实施态样中,本发明的可凝结的血小板生长因子浓厚液中的IGF浓度至少与起始血小板浓厚液中者类似,且较佳为高于65ng/ml浓厚液,更佳为高于75ng/ml浓厚液,又更佳为高于80ng/ml浓厚液,再更佳为高于100ng/ml浓厚液。
在一特别实施态样中,本发明的可凝结的血小板生长因子浓厚液中的EGF浓度高于0.5ng/ml浓厚液,较佳为高于1ng/ml浓厚液,更佳为高于1.5ng/ml浓厚液,又更佳为高于2ng/ml浓厚液,且再更佳为高于2.5ng/ml浓厚液。
在一特别实施态样中,本发明的可凝结的血小板生长因子浓厚液中的VEGF浓度在经过SD处理及油萃取后为高于0.5ng/ml浓厚液,较佳为高于0.75ng/ml浓厚液,更佳为高于1ng/ml浓厚液,又更佳为高于1.5ng/ml浓厚液。
在一特别实施态样中,本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液适用于需要低脂质含量的病症。
本发明所使用的“需要低脂质含量的病症”的说法是指本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液是已除去脂质(depleted in lipids),亦即,在本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液中,胆固醇、三酸甘油酯、HDL及LDL的量明显低于其于起始血小板浓厚液中的量、或低于其在血小板活化领域中已知的生长因子浓厚液中的量。本发明的可凝结的血小板源生长因子浓厚液中的脂质量极低(特别是胆固醇、三酸甘油酯及LDL量极低)会使该浓厚液适用于特定的治疗性用途,举例来说,如用于心血管并发症风险高的患者、或用于高心脏风险的病症的患者,这是因为,对已接受治疗的患者提供极低量的脂质会大大减少由动脉及静脉系统中脂肪斑(plaque)形成所引起的血管阻塞的风险。
更佳者,在本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液中,胆固醇的量是低于100mg/dl可凝结的血小板生长因子浓厚液,较 佳为低于50mg/dl可凝结的血小板生长因子浓厚液,且更佳为低于35mg/dl可凝结的血小板生长因子浓厚液。
更佳者,在本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液中,三酸甘油酯的量是低于100mg/dl可凝结的血小板生长因子浓厚液,较佳为低于50mg/dl可凝结的血小板生长因子浓厚液,且更佳为低于30mg/dl可凝结的血小板生长因子浓厚液。
更佳者,在本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液中,HDL的量是低于30mg/dl可凝结的血小板生长因子浓厚液,较佳为低于15mg/dl可凝结的血小板生长因子浓厚液,且更佳为低于10mg/dl可凝结的血小板生长因子浓厚液。
更佳者,在本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液中,LDL的量是低于80mg/dl可凝结的血小板生长因子浓厚液,较佳为低于50mg/dl可凝结的血小板生长因子浓厚液,更佳为低于20mg/dl可凝结的血小板生长因子浓厚液,且又更佳为低于5mg/dl可凝结的血小板生长因子浓厚液。
进一步来说,本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液中的脂质量非常低及/或无法检测,故有较佳的稳定性,当大规模纯化血小板生长因子时,会使该方法的进行较为容易。这在进行阴离子及/或阳离子层析分离的时候特别有用。
在一特别实施态样中,本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液不会引起血液细胞相关的输血反应。“血液细胞相关的输血反应”是指这种可凝结的生长因子浓厚液不带有完整的活细胞(例如红血球、血小板及白血球),故可避免在患者身上引起一定范围的已知输血反应,包括免疫(如异体免疫(Alloimmunization))及溶血性并发症(如参见Stroncek et Rebulla,“Platelet transfusions”,The Lancet,August 4,2007;vol.370:427-438)。确实,免疫能力正常的受赠者通常会对捐赠者的血液细胞抗原表 现出免疫反应,而引起多种取决于相关血液细胞及特异抗原的临床结果。最普遍的相关抗原系选自下列种类:(1)第一型HLA,是血小板及白血球共有者;(2)第二型HLA,在某些白血球有表现者;(3)颗粒性白血球特异抗原;(4)血小板特异抗原(举例来说,如人类血小板抗原HPA);以及(5)红血球特异抗原。
更特定言之,在本发明的制备方法中,活的血液细胞(红血球、白血球及血小板)会被溶剂-清洁剂摧毁/溶胞,从而减少(且更佳为预防)患者暴露于外来抗原及完整血液细胞的风险。故本发明的方法可从由患者得到的血小板(用来治疗患者本身)、或从同种异体的血小板来制备可凝结的血小板生长因子浓厚液。
在一特别实施态样中,本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液进一步包含至少一种选自由纤维粘连蛋白、透明粘连蛋白、凝血酶敏感蛋白及/或第II(凝血酶原(prothrombin))、V、VII、VIII、IX、X、XI凝血因子及凡威勒伯氏因子所组成的组群的蛋白。
在一特别实施态样中,本发明的可凝结的血小板生长因子浓厚液中纤维粘连蛋白的浓度较佳为高于0.2g/L浓厚液,且更佳为约0.3g/L浓厚液。
在一特别实施态样中,本发明的可凝结的血小板源生长因子浓厚液中第II、IX、X、VII及/或XI凝血因子的个别浓度较佳为高于0.5IU/ml浓厚液,且更佳为约1IU/ml浓厚液。
在一特别实施态样中,本发明的可凝结的血小板生长因子浓厚液中第VIII凝血因子及/或凡威勒伯氏因子的个别浓度较佳为高于0.5IU/ml浓厚液,更佳为高于0.9IU/ml浓厚液,且又更佳为约1IU/ml浓厚液。
在另一实施态样中,通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液进一步包含免疫球蛋白,如IgG、IgM及/或IgA。
在一特别实施态样中,本发明的可凝结的血小板生长因子浓厚液中免疫球蛋白IgG的浓度较佳为高于5g/L浓厚液,且更佳为约10g/L浓厚液。
在另一实施态样中,本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板 生长因子浓厚液进一步包含至少一种选自由下列各项所组成的组群的生长因子:CCN家族成员、结缔组织活化蛋白-3(CTAP-3)、PF4、血小板源血管新生因子(PDAF)、内皮细胞生长抑制剂、早期怀孕因子(early pregnancy factor,EPF)、表皮生长抑制剂(EGI)、角质细胞生长因子(KGF)、血管生成素样蛋白-6(ANGPTL6)、IGFBP-3、雌激素受器相关蛋白、纤维母细胞源内皮细胞生长因子(f-ECGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织胺释出因子、人类胶原蛋白酶抑制剂、血小板抗菌蛋白-1(PMP-1)、经凝血酶诱发的血小板抗菌蛋白-1(t-PMP)、凝血肽-1(thrombocidin-1,TC1)及凝血肽-2(thrombocidin-2,TC2)。
在另一实施态样中,本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液进一步包含至少一种选自由下列各项所组成的组群的蛋白:血清素、组织蛋白酶(cathepsin)、白蛋白、血小板碱性蛋白-PBP(CXCL7)、嗜中性球活化蛋白-2及-4(NAP-2、-4)、体抑素(somatostatin,SST)、RANTES、CTAP-3、胎盘蛋白14(PP14)、SCUBE1、膜联蛋白11(annexin 11)、热休克蛋白27(HSP27)、及热休克蛋白60(HSP60)。
在一特别实施态样中,本发明的可凝结的血小板生长因子浓厚液中的白蛋白浓度较佳为高于30g/L浓厚液。
在另一实施态样中,本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液进一步包含至少一种选自由下列各项所组成的组群的酶:胶原蛋白酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、肝素酶、金属蛋白酶MMP-1、-2、-9、-13、自泌性ERK(ext.Cell reg.kinase)、自泌性及旁泌性蛋白C(PC)、以及微量的酶如醛缩酶(aldolase)、羧基胜肽酶、酸性磷酸酶、芳基硫酸酯酶(arylsulphatase)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-甘油磷酸酶(β-glycerolphosphatase)、α/β-葡萄糖苷酶、α/β-岩藻糖苷酶(α/β-fucosidase)、α-甘露糖苷酶(α-mannosidase)及α-阿拉伯糖苷酶(α-arabinosidase)。
在另一实施态样中,本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液进一步包含组织胺、ADAMTS-13、α1-α2抗胰蛋白酶、α2-抗胞浆素(α2-antiplasmin)、α2-巨球蛋白、C1-INH、诱发性BMP-2、-6、-7(TGF-β超级家族)、ECM再塑因子(ECM remodelling factor,已诱发的MMP、TNF-α、弹性蛋白酶......)、自泌性及旁泌性溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)、HMGB1(两性调节蛋白(amphiregulin))、ATP、ADP、GPT、GDP、Ca2+、Mg2+及/或Zn2+。
本发明的另一目的是一种医药产物,其包含本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液。
“医药产物”是指血小板凝胶(platelet gel)、血小板粘胶(platelet glue)、富含生长因子的纤维蛋白粘胶及/或密封剂(sealant)、人工鹰架。
本发明的另一目的是本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子在培养基中的用途,其中前述培养基适用于纤维母细胞、软骨细胞、成骨细胞、角质细胞、干细胞及/或移植细胞的活体外或活体研究的培养。本发明的另一目的是一种适用于纤维母细胞、软骨细胞、成骨细胞、角质细胞、干细胞及/或移植细胞的活体外或活体研究的培养的培养基,且其包含本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子。
本发明的另一目的是一种制备本发明的可凝结的血小板生长因子浓厚液的方法,其包含下列步骤:使起始血小板浓厚液与溶剂及/或清洁剂接触;使前述起始血小板浓厚液与前述溶剂及/或清洁剂于维持在从约6.0至约9.0范围内的pH值及在从2℃至50℃范围内的温度下共同培养至少5分钟至6小时的时间,更佳为在从25℃至45℃范围内的温度进行;以及通过油萃取及/或层析方式来移除前述溶剂及/或清洁剂。
在一较佳实施态样中,进行培养的时间范围为从2至4小时,其是于生理pH值下进行,如在从pH 7.0至pH 7.5范围内的pH值(当起始血小板为新鲜的血小板时)、或在从pH 6.8至8.2范围内的pH值(当起始血小板为过期 及/或冷冻血小板时)进行。有利的是,培养温度为约31℃。
在本发明的方法中所使用的合适溶剂为二-或三烷基磷酸酯类,如三-(n-丁基)磷酸酯、三-(t-丁基)磷酸酯、三-(n-己基)磷酸酯、三-(2-乙基己基)磷酸酯、三-(n-癸基)磷酸酯、二-(n-丁基)磷酸酯、二-(t-丁基)磷酸酯、二-(n-己基)磷酸酯、二-(2-乙基己基)磷酸酯、二-(n-癸基)磷酸酯及具有不同烷基链的二烷基磷酸酯类。可使用具有不同烷基链的二或三烷基磷酸酯类,例如二-(n-丁基)磷酸乙酯。特佳为三烷基磷酸酯为三-(n-丁基)磷酸酯(TnBP)。
在本发明的方法中所使用的合适清洁剂包括脂肪酸的聚氧乙烯衍生物、山梨糖醇酐的偏酯类(例如品名为“Tween 80”(也称为“聚山梨醇酯80(polysorbate 80)”)、“Tween 20”的市售产品)及非离子性清洁剂(如以下列品名贩售的氧乙基化的烷基酚:“Triton X-100”或“Triton X-45”)。进一步考虑的清洁剂是去氧胆酸钠及磺基甜菜碱类,如N-十二基-N,N-二甲基-2-铵-1-乙烷磺酸盐(N-dodecyl-N,N-dimethyl-2-ammonio-1-ethane sulphonate)。特佳清洁剂为“Triton X-45”、“Triton X-100”、“Tween 80”及“Tween 20”。
在本发明的特别实施态样中,起始血小板浓厚液是与溶剂及清洁剂共同培养,较佳为与TnBP及Triton X-45共同培养。
有利的是,前述溶剂或前述清洁剂的最终浓度、或前述溶剂及前述清洁剂的个别最终浓度包含在从0.2至5体积%的范围内,较佳为包含在从0.2至2体积%的范围内,其是以前述血小板浓厚液的体积为基础计算。在一较佳实施态样中,前述起始血小板浓厚液与2%TnBP共同培养。在另一较佳实施态样中,前述起始血小板浓厚液与1%TnBP及1%Triton X-45共同培养。
前述溶剂及/或清洁剂可通过以医药等级油进行油萃取及/或其他方法(如管柱层析)而从生物性流体中萃出,如此则浓厚液中的溶剂及/或清洁剂已被除去。
前述医药等级油可以是天然油(例如从植物或动物萃取出来的油)或结构类似的合成化合物。合适的天然油包括蓖麻油(castor oil,或称ricinus oil)、 大豆油、葵花油、棉籽油。较佳的合成化合物为合成性三酸甘油酯。合适的合成性三酸甘油酯范例包括三油精(triolein)、三硬脂精(tristearin)、三棕榈精(tripalmitin)、三肉豆蔻精(trimyristin)、及其合并物。
医药等级油的量为可萃取至少80%脂溶性制程化学物质(process chemical)的量,所用油量为从2至20重量%,其是以血小板浓厚液的溶胞产物的重量为基础计算;较佳为从5至15重量%,且更佳为从5至10重量%。油萃取可以进行一次,较佳为两次,且更佳为三次,其特别取决于油的浓度。
前述溶剂及/或清洁剂也可通过管柱层析而从血小板浓厚液的溶胞产物中移除。管柱层析也可在油萃取后进行,或直接在溶剂及/或清洁剂处理后进行。
可用的合适层析管柱包含反相(疏水性交互反应)基质、或蛋白吸附基质如离子交换(阴离子及阳离子)基质及亲和力(如免疫-亲和力或固定化肝素)基质、或尺寸排除(size-exclusion)基质。较佳的反相基质为C18二氧化硅装填材料、SDR(溶剂-清洁剂移除)hyper D(Pall corporation)、聚苯乙烯吸收剂(Variant)及Amberlyte(Rohm)。即便C18是一般用于工业规模层析的较佳选择,亦将tC18二氧化硅装填材料列入考虑。这些吸附物质在前述溶剂及清洁剂于前缘部分(breakthrough fraction)流洗出来的时候用来与前述生长因子作结合。阴离子交换基质取决于所要纯化的生长因子,较佳为阴离子交换凝胶,如DEAE-Sephadex A-50、DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose、DEAE-Toyopearl 650M、DEAE-Hyper D。较佳的阳离子交换基质(取决于所要纯化的生长因子)为阳离子交换凝胶,如SP-Sepharose及CM-Sepharose(两者均有FF等级可用),其中又以SP为更佳。这些吸附物质在前述溶剂及清洁剂于前缘部分中洗提出来的时候用来与生长因子作结合。
在一较佳实施态样中,阴离子及/或阳离子层析在油萃取之后进行。依照所选择的层析方式,这类溶剂及/或清洁剂移除步骤也可加强生长因子的分离。在这方面来说,阴离子层析(如DEAE)会与TGF-β1及EGF有较佳的结合,而阳离子层析(如SP)则会与PDGF(AB、AA及BB)及VEGF有较佳的 结合。因此,成功地使用阴离子及阳离子层析能够制备出富含特定生长因子(GF(s))的洗提管分(fraction)。这样的具体实施态样揭露于图11。
在一较佳实施态样中,当阴离子及/或阳离子层析系在油萃取之后及/或在疏水性层析后进行,则洗提条件依发明所属领域具有通常知识者的一般常识来决定。洗提较佳是以包含由0.15M至2M NaCl的盐溶液来进行。用于洗提的盐溶液也可包含NaCl与一碱金属或碱土金属盐(如磷酸盐或柠檬酸盐)的混合物,其范围为由0.15M至2M。
进一步言之,当进行阴离子层析时,要选择高于目标生长因子的等电点的pH值。相对的,当进行阳离子层析时,要选择低于目标生长因子的等电点的pH值。较佳是选择能在与目标生长因子的稳定性及生理功能相容的pH值下进行层析分离/纯化的层析条件,例如实质中性的pH值,如此可避免生长因子变性(denaturation)。
或者,当阴离子及/或阳离子层析是在油萃取之后及/或在疏水性层析之后进行时,则洗提条件依发明所属领域具有通常知识者的一般常识来设定。也可用一与将生长因子结合到树脂上的缓冲液的pH值不同的缓冲液来进行洗提,其取决于生长因子的pHi值。在维持生长因子的稳定性及生理功能的条件下,洗提用溶液的pH值范围为从4至10,较佳为从5至9。
在一较佳实施态样中,油萃取及/或层析后的溶剂量为小于100ppm,较佳为小于50ppm,更佳为小于20ppm,又更佳为小于10ppm,小于5ppm,且再更佳为小于1ppm。
在一较佳实施态样中,油萃取及/或层析后的清洁剂量为小于500ppm,较佳为小于250ppm,更佳为小于100ppm,又更佳为小于50ppm,且再更佳为小于10ppm。
在通过油萃取及/或层析来移除溶剂及/或清洁剂后,可进一步加入一步骤,来使非套膜病毒(如小病毒B19、或者也可能是A型肝炎病毒(HAV))去活化或将之移除,例如纳米过滤,且更特别是使用75-nm、35-nm、20-nm、 15-nm或10-nm孔径的滤膜来进行纳米过滤。
在另一较佳实施态样中,在油萃取及/或层析后进行离心步骤,以移除细胞碎片。有利的是,前述离心步骤是于800至20000×g进行10至30分钟,且较佳为于10000×g进行15分钟。
在另一较佳实施态样中,在油萃取及/或层析后进行过滤清除步骤,以移除细胞碎片。有利的是,前述过滤步骤系以从1μm至0.2μm渐次变化的过滤器来进行,这也会移除细菌。
在一特别实施态样中,在本发明的方法中用作起始材料的血小板浓厚液为单一或混合(pooled)的标准血小板浓厚液,例如制备作输血用途的血小板浓厚液。血小板浓厚液亦可得自全血的血沉棕黄层分离法。一单位得自血沉棕黄层的血小板浓厚液一般为30至50ml。得自血沉棕黄层的血小板可用作起始材料,其是单一单位或多个单一单位的混合,如在形成一治疗性单位时,其为4至6个单一单位的混合(如Guide to the preparation,use and quality assurance of blood components-13th edition(2007),edited by the Council of Europe的揭示)。
血小板浓厚液可通过血液分离术(指透过全血捐输的血小板制备法)、细胞分离术(cytapheresis)或血小板分离术(plateletpheresis)标准程序(如参见Guide to the preparation,use and quality assurance of blood components,13th edition(2007),edited by the Council of Europe)得出,且可通过使用MCS+(Haemonetics)、Trima Accell或COBE Spectra(Gambro)或Amicus(Baxter)而得出。与透过血沉棕黄层分离法程序所得者相较之下,血小板分离术一般会从每个捐赠者身上得到较大的体积(相当于300ml血小板浓厚液)。
在一较佳实施态样中,本发明的方法包含一制备起始血小板浓厚液的初步步骤。有利的是,制备起始血小板浓厚液的方法包括但不限于:标准血库程序(如血小板分离术或透过全血捐输的血小板制备法)及重点照护程序(如那些使用血球保存剂/分离器或桌上装置者)。
在本发明的方法中用作起始材料的血小板浓厚液可以是新鲜(即收集后少于5或7天)、过期(即收集后多于5或7天)、或过期且冷冻于-20℃或以下数周的时间。
在一特别实施态样中,在本发明的方法中用作起始材料的血小板浓厚液可进一步包含白血球及/或红血球。故该起始血小板浓厚液可能包含数种已分化且未活化的白血球,如淋巴细胞、嗜中性的颗粒性白血球及单核球。更特定言之,嗜中性球及单核球富含内有骨髓过氧化酶(myeloperoxidase)的颗粒,这种酶会催化氯化物的氧化作用,而生成次氯酸(hypochlorous acid)及其他反应性氧衍生物,其中前述反应性氧衍生物作为杀菌氧化剂,对微生物及霉菌具有毒性。
因此,当起始血小板浓厚液包含数种已分化且未活化的白血球时,通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液进一步包含得自白血球的抗微生物成分。
在一较佳实施态样中,用作起始材料的血小板浓厚液中的白血球会被消灭,更佳为通过白血球去除作用(leukoreduction)来进行,以避免白血球中的蛋白酶及酸水解酶发生促发炎反应。白血球去除作用也可降低普利子蛋白(prion)污染的风险。
健康人的正常血小板计数一般为每mm3血液中包含150000至400000个血小板,亦即150至400×109个血小板/L。这个“正常”血小板计数在约95%健康人身上是如此,而剩下的5%可能会有统计上不正常的血小板计数(非常低或非常高)。
当以血小板分离术收集血小板时,在一袋250ml当中的血小板计数一般高于每ml有1.2×109个血小板,其血小板计数相当于每袋(单位)有多于约3×1011个血小板。
在一较佳实施态样中,在起始血小板浓厚液中的血小板数目要比血液中通常可见的数目高出3至10倍。
本发明的另一目的是一种形成血凝块的方法,其由下列步骤所组成:将本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液与凝血酶混合,或与另一种血液凝集连锁反应的活化剂混合,如已活化的FVII、或者牛或人类的凝血活酶(thromboplastin)。
在以本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液形成血凝块之前,可在本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液中加入抗纤维蛋白溶解剂,来抑制或减缓纤维蛋白溶解系统中的天然蛋白水解酶(如胞浆素(plasmin))分解纤维蛋白血凝块。
在一特别实施态样中,前述抗纤维蛋白溶解剂为抑胰肽(aprotinin),但浓度>10mg/ml的传明酸(tranexamic acid)或ε-胺基己酸(epsilon aminocaproic acid)也可以用作抑胰肽的替代化合物。在液体形式中,所提供的抑胰肽浓度通常为3000KIU或以下。在可凝结的血小板生长因子浓厚液及凝血酶成分混合后,抑胰肽的最终浓度一般是起始溶液的一半。
本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液可进一步与人工鹰架(例如以胶原蛋白、几丁聚醣(chitosan)、陶瓷所制造者)混合,或与得自血浆的纤维蛋白粘胶或纤维蛋白密封剂混合。
在与凝血酶混合之前,亦可在本发明的可凝结的血小板生长因子浓厚液中加入额外的化合物。这类额外成分特别包含但不限于:化疗剂、抗生素及/或激素。
将本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液与凝血酶混合在一起会重现血液凝集连锁反应的最后步骤,且使纤维蛋白原逐渐聚合,而形成血凝块或不溶性纤维蛋白。
在本发明中所使用的“凝血酶”一词是关于可得自任一来源的凝血酶,且较佳是指牛凝血酶;若用于人类的治疗性应用,更佳为人类凝血酶。经CaCl2活化的人类血浆或蝮蛇类凝血酶(batroxobin,另一种纤维蛋白原凝血蛋白酶,是从蛇bothrops atrox moogendi得出的蛇毒)、已活化的FVII、或者人类或牛 的凝血活酶也可用作凝血酶的替代化合物。
在一较佳实施态样中,将0.1至1体积的凝血酶加到1体积的本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液中。
在一较佳实施态样中,凝血酶浓度范围是从20IU/ml至1000IU/ml。更佳者,凝血酶的最终浓度为约500IU/ml,以确保连续且快速的纤维蛋白原聚合作用会先得出可溶的纤维蛋白,之后再得出稳定的(不溶性)纤维蛋白;或者当在特殊手术情形中想要减缓聚合作用时,其最终浓度会较低,大约为4至25IU/ml。
在另一较佳实施态样中,是在表面活化物(如金属或玻璃珠)存在的情况下使用10-50mM CaCl2,而通过富含纤维蛋白原的生长因子浓厚液的自动活化而得出凝血酶。
两种成分(亦即本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液和凝血酶)都可通过双针筒系统而先后施用或同时施用在要修复的位置上,其可使用或不使用内视镜递送装置来协助,且使用喷洒方式或易吸收的海棉来进行(参见Radosevich et al.,“Fibrin sealant:Scientific Rationale,Production Methods,Properties,and Curreny Clinical use”,Vox Sanguinis,1997,72:133-143以及Marx G,“Evolution of fibrin glue applicators”,Transfus Med Rev,2003;17(4):287-98所述的应用方法,以上合并于本文作为参考文献)。
因此,本发明的另一目的是本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液在治疗性应用上的用途、以及形成血凝块的用途、或在活体外或活体研究的细胞培养用途。当其用于活体外或活体研究的细胞培养时,本发明或通过本发明的方法所得的可凝结的血小板生长因子浓厚液会以从1%至30%范围的量出现在培养基中,更佳为从2%至20%,且又更佳为从3%至10%,其是以培养基的体积为基础计算。
前述浓厚液/凝血酶混合物的主要治疗性应用包含但不限于:牙科手术、植入、骨科及口腔手术、整型手术、软组织及硬组织的疗愈及重建、心血管、 胸腔、或胃肠道手术、神经手术、一般手术/创伤外科、眼科、耳鼻喉科、泌尿科、以及在抗凝血患者或凝血不良的患者身上进行的手术。
本发明的上述及其他目的、特征及优点将因以下叙述、参考文献及附图而变得更加显明。
实施例
I.材料及方法
I.1-分离术血小板(apheresis platelet)的收集
起始血小板浓厚液(PC)是征得志愿捐赠者同意后使用MCS+多成分系统(Haemonetics,Braintree,USA)收集而来。全血透过静脉导管取得,使用间歇性流动(intermittent flow)及抗凝血剂(1ml抗凝血柠檬酸右旋葡萄糖溶液配方-每10ml血液)。富含血小板的血浆(PRP)会自动通过离心而与其他血液成分分离,并收集在一个无菌、单次使用的抛弃式袋子里,而红血球及血浆会再回到捐赠者体内。重复此一循环,直到得到预定体积的PRP(约300ml)为止。起始血小板浓厚液如下所述,在收集后24小时内进行处理。
I.2-血液细胞计数
血小板、白血球(WBC)及红血球计数使用细胞计数器(ABC Vet Automatic Blood Counter,ABX Diagnostics,France)来进行测定。
I.3-起始血小板浓厚液的处理
a-研究设计
起始血小板浓厚液根据图1的研究设计来处理。简言之,将相同捐赠者起始血小板浓厚液(300ml)轻轻混合,并分成两个等体积的子集池(150ml)。子集池1直接接受S/D处理,没有先活化。子集池2在23mM CaCl2及玻璃球粒(beads)存在时,于会使血小板凝胶形成的条件下活化,如下所述;用吸量(pipetting)的方式小心地回收所得的释出物(平均体积相当于120ml, 因为有30ml损失在血小板凝胶中),之后接受S/D处理,接着进行油萃取。从起始血小板浓厚液所得的样本中,有经S/D处理后的未活化的血小板子集池1,血小板活化后的子集池2,以及经S/D处理后的经活化子集池2。
b-血小板活化:
在玻璃球粒存在的情况下,在血小板浓厚液(子集池2)中加入1M CaCl2(Sigma,批号056k0688)来进行活化,其最终浓度为23mM。将混合物轻轻地旋转混合,直到血凝块形成为止,这一般会在5至8分钟内形成。使混合物再活化60分钟的时间,在这些实验条件下,这个时间会使最理想的血小板源生长因子释出。将上清液倒出,与玻璃球粒/已形成的纤维蛋白血凝块分离。所回收的上清液平均体积为起始血小板浓厚液的约80%。该上清液会进一步做S/D处理。
c-S/D处理:
为了方便起见,未活化的子集池1及已活化的子集池2的S/D处理如EP1 685 852所述,在袋中进行。简言之,将TnBP(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)及TritonX-45(Sigma,Missouri,USA.)的50%/50%混合物加入各个子集池中15分钟,并持续混合,以使其最终浓度(v/v)为1%TnBP及1%Triton X-45。在完全加入后,将S/D-血小板子集池的混合物猛烈震荡1分钟。之后将处理袋完全地浸入水浴,将S/D血小板混合物加温至25±0.5℃,之后在持续温和的搅动下处理1小时。S/D处理完成时,在S/D-血小板子集池中加入大豆油(Sigma,Missouri,USA),使之最终浓度为10%(v/v)。将上述袋子猛烈震荡1分钟,之后置入旋转震荡器处理15分钟。以倒出的方式将血小板子集池(下层)从油(上层)移除(20分钟),并通过重力移入第二袋,再重复进行三次油萃取。此一油萃取程序可使TnBP及Triton X-45分别降到小于10及100ppm。
I.4-离心与溶胞剂种类的影响
为了研究血小板含量及S/D试剂种类对血小板源生长因子释出的影响,进行了一项实验:将血小板浓厚液(300ml)次分为两个150ml的子集池。
其中一个子集池进行高速(10000×g)离心,使血小板成为一团块(pellet),并使上清液接受1%TnBP-1%Triton X-45的处理。另一个未离心的子集池再分为两个75ml的子集池,其中一个接受1%TnBP-1%Triton X-45处理,另一个接受2%TnBP处理。S/D处理(培养及油萃取)如前述来进行。
I.5-牛凝血酶活化实验
为了排除CaCl2活化不会使血小板完全活化的假设,如前述将两种血小板浓厚液(14ml)在0.23M CaCl2及玻璃球粒存在的情况下进行活化。
于室温温和旋转混合60分钟后,回收10ml的血小板浓厚液释出物,并加入0.5ml的1000国际单位(IU)/ml的牛凝血酶(Thrombin-JMI,52604-7102-1,Jones Pharma,Saint-Louis,MO),使其最终浓度为约48IU/ml。将混合物于室温温和地旋转混合60分钟。之后进行1%TnBP-1%Triton X-45处理及油萃取。在平行实验中,亦将两种血小板浓厚液样本(10ml)以0.5ml的相同牛凝血酶直接活化,在数秒内凝胶形成,接着轻轻旋转混合60分钟。在实验方法的多个步骤中采取样本,于10000×g离心并于-80℃冷冻,直到进行血小板源生长因子分析为止。
I.6-生长因子测定
在程序的各个步骤中取出1-ml样本。将之于10000×g离心15分钟( 22R,Beckman Coulter,Fullerton,CA),使血小板及/或细胞碎片成为一团块,并得出无细胞的上清液进行血小板源生长因子测量。另外,也以800×g的离心力进行15分钟的平行实验。之后上清液立即于-80℃冷冻。
样本于37℃解冻,并在1小时内以敏感且具专一性的市售免疫测定法进 行分析。标准品及样本进行二重复测定,并计算平均值。结果乘以样本所用的稀释系数。
a-PDGF-AB
使用Quantikine ELISA kit(#.DHD00B,R&D SYSTEMs,Minneapolis,MN)来测定PDGF-AB。样本以Calibrator稀释剂(RD6-11)稀释100倍。将孔盘培养2小时、清洗、并和与酶共轭结合的PDGF-AB抗体于室温再共同培养3小时。使用清洗缓冲液(Wash Buffer)来清洗盘孔,之后于室温加入受质溶液(Substrate Solution)20-30分钟。盘孔避光保护。在各盘孔中加入停止溶液(Stop Solution),并使用微滴定盘读取仪来测定450nm的吸光值。最小可检测的剂量为1.7pg/ml。
b-TGF-β1
使用Quantikine ELISA kit(DB100B,R&D SYSTEMs)来测定TGF-β1。样本以Calibrator稀释剂(RD5-26)稀释100倍。在涂覆有TGF-β-受器II的96孔微滴定盘中制备体积为100-μl的TGF-β1标准品(890207)稀释序列。在TGF-β1分析之前,进行酸活化及中和反应,以将潜性TGF-β1活化到免疫活性形成状态。为达此目的,将0.5ml样本与0.1ml的1N HCl混合,于室温培养10分钟,加入0.1ml的1.2N NaOH/0.5M HEPES(N-[2-羟基乙基]哌-NO-[2-乙烷磺酸])(Sigma,H-7523)加以中和,再行离心。之后测定上清液部分的总TGF-β1含量。将各等分(50μl)以二重复的方式加到微滴定盘中,之后盖上盖子,于室温培养2小时。之后清洗盘孔,加入与酶共轭结合的TGF-β1多株抗体,并于室温持续培养1.5小时。如前述完成测量。TGF-β1的检测限值为4.61pg/ml。
c-EGF
使用Quantikine ELISA kit(#.DEG00,R&D SYSTEMs,Minneapolis,MN) 来测定EGF。样本以Calibrator稀释剂(RD6N)稀释20倍。将200μl的标准品、对照品或样本加入盘孔中。将孔盘于室温培养2小时。各盘孔经过抽吸,并填入清洗缓冲液来加以清洗。在各盘孔中加入EGF共轭结合物,并于室温培养2小时。使用清洗缓冲液清洗盘孔,并在各盘孔中加入受质溶液(200μl)。混合物于室温避光培养20分钟。在各盘孔中加入停止溶液(50μl)。各盘孔的光学密度是使用微孔盘读取仪(VersaMaxTM microplate reader,Molecular Devices,USA)在30分钟内于450nm进行测定。最小可检测的剂量为0.7pg/ml。
d-IGF-1
使用Quantikine ELISA kit(DG100,得自R&D SYSTEMs)来定量IGF-1。样本以Calibrator稀释剂(RD5-22)稀释100倍。如制造商所说,其最小可检测的剂量范围为从0.007至0.056ng/ml,且平均MDD为0.026ng/ml。在各盘孔中加入150μl的测定稀释剂(RD1-53),接着是50μl的标准品(890775)。以粘胶条覆盖孔盘,并于2-8℃培养2小时。将盘孔清洗3次,之后和与酶共轭结合的IGF-1于2-8℃共同培养1小时。如前述完成测量。
I.7-统计分析
所有系列实验的数据是以平均值、标准差、以及最小值及最大值来呈现。并以双尾配对学生检定(two-tailed paired Student test)来进行统计上的比较。p值小于0.05用来估算血小板制备程序的不同步骤中平均PGF浓度的明显差异(the significance of the differences)。其值表示为不明显(NS,<0.05)、<0.01或<0.001。当其值接近0.05时,会显示确实的p值。
I.8-PC、S/D-PC及Act-PC比较的样本的制备及分离
分别对应于起始血小板浓厚液(PC)、经溶剂/清洁剂(1%TnBP及1% Triton X-45)处理的起始血小板浓厚液(S/D-PC)、以及经CaCl2活化的起始血小板浓厚液(Act-PC)的样本用SDS-PAGE加以分离,以比较其蛋白含量。
将20μg的各样本与5μl NuPAGE LDS样本缓冲液(4×)(Invitrogen)、2μl NuPAGE还原剂(10×)(Invitrogen)及去离子水混合,所得最终体积为20μl(已活化的血小板浓厚液的样本为21μl)。之后将所得混合物于70℃加热10分钟,并使用4-12%聚丙烯酰胺梯度凝胶(NuPAGE Bis-Tris,Invitrogen)来进行SDS-PAGE。
蛋白分离是在恒定电压200V之下进行35分钟,其中预定电流为150mA/凝胶。所得凝胶以考马斯蓝R-250(coomassie blue R-250)加以染色。
蛋白标记Mark 12的未染色标准品(Invitrogen)用以测定样本中的蛋白的分子量。Mark 12标记装入带有MES的NuPAGE novex 4-12%Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上,并在分离后以考马斯蓝R-250加以染色。对应结果揭示于图4。
经溶剂/清洁剂方法处理的起始血小板浓厚液的蛋白图谱(profile)显示它与未处理的起始血小板浓厚液并没有很大的差异,而经活化的血小板浓厚液的蛋白图谱则有明显的差异,在40至70kDa区域中的条带(band)消失了,这些条带对应到纤维蛋白原的α、β及γ次单元,分别是63.5、56及47kDa。
I.9-生长因子活性测定
为了测定血小板S/D处理(1%TnBP-1%Triton X-45)所得的生长因子是否能保持活性,使用人类成骨细胞样MG-63细胞株来进行活体外细胞培养研究。MG-63细胞接受从S/D-PC或从Act-PC所得的生长因子浓厚液处理,其细胞反应是以细胞形态学及存活率来加以评估。
将105至106个细胞在35-mm Petri培养盘中,使用90%Minimum essential medium Eagle(MEM)进行培养,其中前述培养基带有2mM-麸酰胺酸、Eagle’sBSS(Balanced Salt Solution)、调整至1.5g/L的碳酸氢钠、0.1mM的非必须 胺基酸、1.0mM的丙酮酸钠、10%的加热去活化的胎牛血清,并选择性带有5%S/D-PC或Act-PC生长因子浓厚液。于37℃在包含5%CO2及95%空气的潮湿大气中培养后,以磷酸缓冲盐溶液(PBS,Gibco,UK)清洗细胞,之后用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25%胰蛋白酶)于37℃作用5分钟,使细胞脱落,之后离心并悬浮,以进行进一步的细胞测试。
使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)测定法来检测活/死细胞(存活率测定法)。另亦进行电子显微镜观察来研究细胞形态。
使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓(MTS)测定法来监测细胞增生。简言之,在各样本中加入500μl的MTS(Celliter 96Promega Corp.,USA)。于37℃培养60分钟后,使用微孔盘读取仪来测量490nm的吸光值。
I.10-病毒去活化测定
用于起始血小板浓厚液溶胞作用的溶剂及/或清洁剂处理的病毒效力研究是以规模较低的实验来进行,其根据国际基准如EMEA及WHO的建议来进行。分别将50ml的起始血小板浓厚液搀入相关病毒(HIV,人类免疫不全病毒)及三种模型病毒的储存悬浮液:牛病毒性腹泻病毒(BVDV),其是C型肝炎病毒的模型;假性狂犬病病毒(PRV),在没有其他方便活体外模型病毒时,有时用作HBV的模型;以及水泡性口炎病毒(VSV)。将这些病毒的高效价储存悬浮液引入起始血小板浓厚液,并加入1%TnBP及1%tritonX-45的混合物。病毒感染力是在溶剂-清洁剂处理之前及处理期间不同的时间点进行估算,以测定病毒去活化的动力学。进行活体外细胞培养来测定感染力,数据是以TCID50/ml的值来表示。所得数据显示,S/D处理会在处理后5分钟内使4种病毒完全去活化(在第一时间点进行估算),未发现有残余病毒感染力。所得减缩系数(reduction factor)在HIV为>5.6log10,在BVDV为>6.6log10,在PRV为>6.4log10,而在VSV为>7.0log10。故溶剂及/或清洁 剂的溶胞处理会确保可能存在于起始血小板浓厚液溶胞产物中的脂质套膜病毒当中强壮的病毒去活化。
I.11-过期冷冻血小板的生长因子组成物
将过期(收集后超过5天)血小板浓厚液移入-20℃冷冻库储存一个月。之后将它们在35℃水浴中解冻,并进行前述与新鲜血小板相同的实验。测量多个制备物中的生长因子含量,对应结果揭示于图5及图6。
I.12-血凝块形成测定
从经S/D处理的起始血小板浓厚液得出的生长因子浓厚液通过油萃取来移除溶剂及清洁剂之后进行回收。将5ml所得生长因子浓厚液引入一5-ml针筒中。将5ml的500IU/ml的牛凝血酶引入另一5-ml针筒中。将两个针筒置于一个以单一喷嘴连接的双针筒供给器。让这两种成分从中通过。血小板凝胶会在5秒内形成。
II.结果
II.1-细胞计数
对从十名不同的捐赠者所得的十份血小板分离术浓厚液进行研究。得自血小板分离术的血小板浓厚液结果平均为1064±235.2×106个血小板/ml(范围:782-1358×106个血小板/ml),平均WBC计数为0.1125±0.025×106个/ml(范围:0.0-1.5),且平均RBC含量为0.0212±0.025×106个/ml。
II.2-生长因子含量
PDGF-AB、TGF-β1、EGF及IGF-1在多种血小板制备中的平均浓度±标准差(SD)、最小值及最大值、以及p值示于表1。从各系列实验所得的个别数据点可见于图2。
表1:在起始血小板中(A)、在1%TnBP-1%Triton X-45处理后(B)、以及在CaCl2活化后(C)接着对释出物进行1%TnBP-1%Triton X-45处理(D)的生长因子平均浓度(ng/ml)。NS:无明显差异。
在起始血小板浓厚液中的平均PDGF-AB含量为13.8±14.3ng/ml(N=10)。在以TnBP-Triton X-45进行直接S/D处理后,其含量会明显增加(p<0.001)至184.4±80.2ng/ml,相当于比起始血小板浓厚液增加大约13倍。当起始血小板浓厚液首先被CaCl2活化时,其含量也会明显增加(84.6±35.5,p<0.001),但增加量较少(约增加6倍),而且它在后续S/D处理期间保持实质上未改变的状态(88.3±45.9,NS)。在未活化的经S/D处理的血小 板中,PGDF-AB含量明显高于其在已活化、以及已活化/经S/D处理的血小板中的含量(p<0.001)。
在TGF-β1方面也有类似的数据。在起始血小板浓厚液中的平均TGF-β1含量为16.6±14.3ng/ml(N=10)。直接S/D处理后,TGF-β1含量会比起始PC增加近12倍,为192.2±37.4ng/ml(p<0.001)。当起始血小板浓厚液首先被CaCl2活化时,含量会增加约4倍(63.8±14.1ng/ml)(p<0.001)并在后续S/D处理期间保持在没有明显不同的状态(68.6±27.2ng/ml)。又,在经S/D处理的血小板中,TGF-β1平均含量明显高于其在已活化、以及已活化再经S/D处理的血小板中的值(p<0.001)。
在起始血小板浓厚液中,无法检测到EGF(<0.7pg/ml),但在S/D处理后会变成可检测到,且平均EGF含量(2.2±1.6ng/ml,N=6)明显高于(p<0.05)CaCl2活化后所得的值(0.9±0.6ng/ml)(p<0.05),或者明显高于在CaCl2活化后接着进行S/D处理所得的值(1.4±1.0ng/ml)。
在起始血小板浓厚液中,IGF-1平均含量为83.4±32.8ng/ml(N=8)。相对于其他血小板源生长因子来说,它在S/D处理后似乎没有明显的增加(88.4±33.5,p=0.025)。在CaCl2活化后的血小板制备中,它的平均含量甚至还稍高(p<0.001)(117.2±34.9ng/ml),且在后续S/D处理之后保持稳定(112.4±39.7ng/ml)。
在150ml血小板浓厚液中,直接S/D处理后(153ml)所回收的PDGF-AB、TGF-β1、EGF及IGF-1总量分别为28213、29406、336及13525ng;而在CaCl2活化后则分别为10152、7156、108及14064ng;血小板凝胶形成(120ml)所引起的20%平均体积损失亦计算在内。这确认了S/D处理在释出PDGF-AB、TGF-β1及EGF方面的效度会比CaCl2活化来得高。
表2比较了血小板源生长因子在起始新鲜血小板浓厚液中(A)、在离心后(离心成一团块并移除血小板)接着对上清液进行TnBP-Triton X-45处理时(B)、及以1%TnBP-1%Triton X-45对起始血小板浓厚液进行S/D处理后(C) 或以2%TnBP对之进行S/D处理后(D)的含量。PDGF-AB、TGF-β1、EGF及IGF-1在未处理的血小板浓厚液(A)中的含量与先前数据一致(表1)。当无血小板的上清液(B)接受TnBP-Triton X-45处理时(B),PDGF-AB、TGF-β1或EGF的含量保持低量或无法检测(3.9;1.1;p<0.001),其中IGF-1的含量高,但与其在起始血小板浓厚液中的量类似(75.4对72.2ng/ml)。故,PDGF-AB、TGF-β1及EGF在S/D处理期间的释出取决于血小板的存在。在经1%TnBP-1%Triton X-45或2%TnBP处理的血小板溶胞产物中,血小板源生长因子的含量增加是类似的。进一步来说,血小板浓厚液接受1%triton X-45或1%triton X-100处理后,后续清洁剂处理会在没有油萃取情况下通过tC18吸附作用(SP1T45tC18及SP1T100tC18)移除;这显示,单以2%TnBP或以1%TnBP及1%Triton X-45处理后所观察到的生长因子PDGF-AB、TGF-β1、IGF及EGF释出情形是在一范围内,故而指出血小板溶胞的程度实质上是与使用此一溶剂及清洁剂合并物或单用溶剂或清洁剂的情况是相同的。
最后,数据(未显示)指出,样本于10000×g或800×g下离心不会影响在此测定中所测量到的血小板源生长因子的量。
表2:多种生长因子在起始血小板浓厚液中(A)、经离心的无血小板上清液在TnBP-Triton X-45处理后(B)、在TnBP-Triton X-45处理后(C)或在2%TnBP处理后(D)的起始血小板浓厚液中的浓度(ng/ml)。
进一步来说,纤维蛋白原、纤维粘连蛋白、白蛋白、免疫球蛋白IgG及第II、VII、VIII、IX、X、XI、XIII凝血因子以及凡威勒伯氏因子的浓度是在 经S/D处理的起始血小板浓厚液及经CaCl2活化的血小板浓厚液所得的生长因子浓厚液当中进行测量。这些结果揭示于表3。
蛋白 |
S/D-PC |
Act-PC |
纤维蛋白原(g/L) |
2.6 |
0.2 |
纤维粘连蛋白(g/L) |
0.33 |
0.12 |
第VIII因子(IU/ml) |
0.92 |
<0.1 |
第II因子(IU/ml) |
1.2 |
<0.1 |
第IX因子(IU/ml) |
1.02 |
<0.1 |
第X因子(IU/ml) |
1.15 |
<0.1 |
第VII因子(IU/ml) |
1.08 |
<0.1 |
第XIII因子(IU/ml) |
0.87 |
<0.1 |
第XI因子(IU/ml) |
1.35 |
<0.1 |
凡威勒伯氏因子(IU/ml) |
0.95 |
<0.1 |
白蛋白(g/L) |
33.8 |
32.5 |
IgG(g/L) |
11.5 |
11.2 |
表3:在得自以本发明的1%TnBP-1%TritonX-45处理的起始血小板浓厚液(S/D-PC)、或得自以CaCl2活化的起始血小板浓厚液(Act-PC)的生长因子浓厚液中的多种蛋白浓度比较。
故显示经活化的血小板浓厚液会几乎完全除去纤维蛋白原及凝血因子。
II.3-牛凝血酶活化实验
CaCl2/玻璃球粒处理只会部分活化血小板,这可能可以解释其释出物中的PDGF-AB、TGF-β1及EGF含量要比S/D溶胞产物中来得低;为了破除上述假设,故测定这些血小板源生长因子在血小板浓厚液的释出物中的含量(图3),其中前述血小板浓厚液的释出物首先被CaCl2活化,之后接受牛凝血酶 (Act-T)及凝血酶的进一步处理,并接受进一步S/D处理(Act-T-S/D)。图3显示:PDGFAB(A)、TGF-β1(B)及EGF(C)在起始血小板浓厚液中(起始)、在经CaCl2活化后(Act)接着进行牛凝血酶活化(Act-T)及S/D处理(Act-T-SD)时的含量。可以看到,与CaCl2活化相较之下,再加上牛凝血酶活化不会增加PDGF-AB(A)、TGF-β1(B)及EGF(C)的释出。
这是首度显示,对血小板进行S/D处理时,血小板生长因子的释出(特别是PDGF-AB、TGF-β1及EGF的释出)会比用钙及/或凝血酶来活化血小板时要高得多。S/D处理理应会诱发富含脂质的血小板膜溶解,而使血小板源生长因子从细胞内α颗粒中释出。事实是,当先进行凝血酶活化时,那些血小板源生长因子的释出可能会比较低,这可能是因为,凝集的血小板及部分释出的血小板源生长因子会被抓在纤维蛋白网络(称为血小板凝胶)中,该网络由起始血小板浓厚液中的纤维蛋白原被凝血酶诱发产生聚合作用而形成的。确实,CaCl2只导致部分活化、以及内源性凝血酶引起的血凝块形成不完全的可能性,可以被在已活化的血小板释出物中进一步加入约48NIH单位的牛凝血酶/ml后,仍不会导致血小板源生长因子释出量继续增加的事实来加以排除。血小板的完全活化亦可用纤维蛋白原及凝血因子浓度极低(或无法检测)的情形来加以确认,如上表3所示。
同样地(未显示),我们发现,当使用牛凝血酶活化血小板浓厚液时,在释出液中的血小板生长因子的含量是类似的。我们也发现,IGF-1含量在S/D处理后保持为实质未改变,而在钙/凝血酶活化后只有轻微地增加。这项结果可能反映出绝大多数的IGF是以自由循环形式早已存在于血浆中,只有极小比例存在于血小板中的事实。
我们的数据显示,与其他方法如凝血酶活化、冷冻-解冻周期及/或冷冻干燥相较之下,以S/D处理来进行血小板溶胞作用是使血小板生长因子从血小板细胞内颗粒释出到渗出液中最有效的手段。稍早的研究业已发现,人类全血血清中的平均PDGF量为17.5ng/ml,即每106个血小板含0.06ng的量。这 个量相当于我们的研究当中的分离术血小板浓厚液60ng/ml,而我们发现,经S/D处理的血小板浓厚液中的PDGF量平均约三倍以上。我们的数据进一步显示,要使PDGF-AB、TGF-β1及EGF从血小板释出量增加,可通过使用1%TnBP-1%Triton X-45合并物、2%TnBP、或1%triton X-45或Triton X-100的S/D处理来进行,且以油萃取处理来移除S/D,不会降低血小板溶胞产物中4种血小板生长因子的含量。
II.4-生长因子浓厚液中的脂质含量的比较
起始血小板浓厚液经S/D处理或CaCl2活化后,血小板生长因子浓厚液中的脂质含量结果系经测量,并与起始血小板浓厚液中的含量进行比较,如表4所示。
表4:从相同起始血小板浓厚液制备的生长因子浓厚液的脂质含量比较,其使用0.5%Triton X-100(Trit-PC);或在本发明的S/D处理后,接着进行一次油萃取(S/D-PC 1);或在本发明的S/D处理后,接着进行三次油萃取(S/D-PC 3);或者在血小板的CaCl2活化后进行。
脂质含量通过Hitachi临床技术仪器来进行测试。各受试样本是以pH值为7.2且包含886×103个血小板/μl、0.1×103个白血球(WBC)/μl及0.08×106个红血球(RBC)/μl的相同起始血小板浓厚液来制备。
如表4所示,与经Triton处理的血小板或与已活化的血小板相较之下,在通过S/D处理再接着进行油萃取所制备的S/D-PC生长因子浓厚液中,LDL(低密度脂蛋白)、HDL(高密度脂蛋白)、三酸甘油酯及胆固醇量明显较低。进一步来说,经S/D处理溶胞的血小板以油萃取来萃取一次或三次不会观察到明显的差异。
本发明的生长因子浓厚液中胆固醇、三酸甘油酯及LDL被除去,将引起临床及治疗目的方面很大的关注,因为目前已知三酸甘油酯、以及LDL-胆固醇合并物在动脉粥状硬化及透过动脉及静脉系统中脂肪斑形成所引起的心血管疾病的发展中所扮演的角色,这些问题会引起心脏病发作、中风及周边血管疾病。
对可进一步在除去脂质的浓厚液进行的阴离子及/或阳离子层析分离技术来说,脂质的去除也是重要目标。
II.5-生长因子活性
显微镜观察显示细胞在形状、大小及数目上的变化:当细胞与经S/D处理或CaCl2活化的起始血小板浓厚液所得的血小板源生长因子浓厚液共同培养时,会特别观察到许多纺锤状细胞。进一步来说,细胞计数显示,与Act-PC或未与生长因子浓厚液共同培养的细胞相较之下,当细胞与SD-PC生长因子浓厚液共同培养时,MG-63成骨细胞的数目会以时间及剂量依存性的方式有明显的增加。MTT分析结果也显示,与经Act-PC处理的细胞相较之下,SD-PC生长因子浓厚液的存在会增加培养细胞的细胞活性。S/D-PC或Act-PC生长因子浓厚液都不会对MG-63成骨细胞表现出细胞毒性。
故本研究的结果显示,从经S/D处理的血小板或经活化的血小板两者得到的生长因子,用所选的萃取方法后仍保持活性。然而,我们的实验显示,当细胞与从S/D处理得到的生长因子浓厚液共同培养时,细胞反应会明显增加。本发明的方法所得的浓厚液在MG-63细胞上的效果有所改善,这可能是因为生长因子含量增加的关系,特别是PDGF、TGF-β1及EGF(这些因子在 伤口疗愈及组织再生方面的重要性为已知),及/或可能是因为其他原本在经活化的血小板浓厚液中不存在或表现量低的生物活性物质的量增加的关系。
亦使用人类胚胎肾纤维母细胞(HEK293A,Invitrogen Corporation,Carlsbadm California,USA)及Statens Seruminstitute兔角膜纤维母细胞(SIRC)(ATCC CCL-60,生物资源保存及研究中心,台湾新竹)来评估已病毒去活化的HPGF混合物刺激细胞生长的能力。这些细胞株在一含有5%CO2的受到控制的大气环境中维持于37℃。细胞在平底96孔盘(Greiner bio-one,Tokyo,Japan)中以每盘孔2×103个细胞的密度培养在添加了10%FBS、0.1mM非必须胺基酸及1mM丙酮酸钠的D-MEM培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)。使细胞贴附18小时,之后使之在无血清培养基中进行饥饿培养(starved)6小时。以无血清培养基清洗两次后,将细胞在添加了10%FBS(Gibco,Invitrogen)、经活化的血小板释出物(activated platelet releasate)、或HPGF(经SD处理、油萃取及疏水性层析而从PC制备得出)的D-MEM培养基中培养高达5天。亦使用多个浓度的HPGF管分(HPGF fraction)进行细胞培养,以检测任何可能的细胞毒性特征,并估算出能在缺乏FBS的情况下促进细胞生长的最适剂量。可用得自Promega Corporation(Madison,Wisconsin,USA)的MTS四唑鎓化合物(MTS tetrazolium compound)并依据制造商的指示来测定细胞的生长。
由HEK293A细胞所得的MTS测定结果显示于图16。当细胞培养在添加了10%(v/v)FBS的D-MEM培养基中,其存活率良好。而在缺乏FBS的情况下,没有细胞生长(B)。而当细胞培养在添加了10%(v/v)经活化的PC及分别在tC18、C18或SDR处理后的HPGF混合物的D-MEM培养基中时,其存活率亦良好,显示出刺激细胞生长和无毒两种特质。图16显示,当HPGF的浓度从3%增加到20%,则MTS会有剂量依存性模式的改善。即使是在20%的浓度,HPGF混合物也未表现出细胞毒性。以SIRC细胞得出的MTS数据是在图16。HPGF能刺激SIRC增生。有趣的是,所测试的所有HPGF浓度(高 达20%)都会刺激细胞生长,但与由10%FBS所得结果相较之下,当使用0.1%至0.5%HPGF时,会得到最适增生度。
HPGF会支持细胞生长,并维持细胞存活。在D-MEM培养基中的10%(v/v)HPGF会刺激人类HEK293A纤维母细胞株增生。细胞生长与使用10%经活化的PC释出物或10%FBS所观察到的情况类似。这显示(a)在病毒去活化及S/D移除的过程中,HPGF的生理活性没有受到改变,而最终的制备物未表现出细胞毒性。在从3%至20%(v/v)的HPGF浓度中,其浓度越高,MTS值也会增加。HPGF亦以与FBS相当的方式来支持兔SIRC细胞株的生长,有趣的是,第5天最有效的HPGF浓度低至0.3%至0.5%。正常细胞生长和形态证明HPGF不会引发毒性。进一步言之,这项测试确认:与FBS相较之下,使生长培养基富含血小板溶胞产物(platelet lysates)会支持细胞生长,并维持细胞存活,使人类MSC细胞在活体外扩增,增强它们的形成骨细胞(osteogenic)、软骨细胞(chondrogenic)及脂肪细胞adipogenic)的分化潜力,减少长到全满(confluence)的时间,并增加细胞集落形成单位纤维母细胞(colony-forming unit-fibroblast)的大小。
这些结果也确认了本发明的生长因子浓厚液或通过本发明的方法所得到的生长因子浓厚液在治疗性处理及改良细胞培养基的制备方面的重大潜力。确实,本发明的生长因子浓厚液能够在不造成毒性的情况下维持血小板释出物的细胞生长刺激活性。因此,其于细胞治疗及再生医学上可被视为用以取代FBS及经活化的血小板释出物的候选物。
II.6-除去纤维蛋白原的GF浓厚液的制备
a.GF混合物的制备
起始血小板浓厚液(PC)(约300mL)在收集后于24小时内处理。首先使用1%三正丁基磷酸酯(TnBP;Merck KGaA,Darmstadt,Germany)及1%Triton X-45(Sigma,Missouri,USA)的组合物(总量=6mL)进行袋内溶剂/ 清洁剂(S/D)处理。将S/D-PC混合物猛烈震荡1分钟,确保完全混合。之后将之浸入持续温和搅动的31℃水浴至少1小时。在S/D处理完成后,以30mL(相当于10%v/v)大豆油(Sigma,Missouri,USA)对S/D-PC混合物进行一次萃取。在油加入后,将上述袋子猛烈震荡1分钟,之后置入旋转震荡器处理20分钟。在30分钟内,将前述混合物以倒出的方式将油相从PC相分离出来,PC(下层,约280mL)通过重力进行回收。完成油萃取后,将SD-PC在室温(20-25℃)下于10,500rpm(10,400×g)离心15分钟。
将30mL未稀释的上清液以疏水性交互作用层析(hydrophobic interaction chromatography,HIC)管柱处理,其使用购自Waters Corporation(Guyancourt,France)的十八基(C18;批号WAT020594;干燥粉末;孔度 颗粒大小55-105μm)装填材料。将层析材料装填到管柱内,以5倍体积的1M氯化钠和20%乙醇清洗,之后以5倍体积的20mM柠檬酸盐缓冲液(pH 7.4)平衡(equilibrated)。之后以每mL HIC吸附剂对7mL的比例注入SD-PC,线性流速为22.6cm/hr。在于280nm吸收值开始增加的时候回收C18流出物(C18-GF),直到吸收值回到基线水平为止。在所用的实验设定中,前缘部分(breakthrough fraction)的体积为60-80mL,与所注入的SD-PC体积相较,稀释倍数相当于2-3倍。
另外在研究的过程中,使用与前文所述相同的实验条件评估了其他两种HIC吸附剂:tC18吸附剂(批号WAT036810;干燥粉末;孔度 颗粒大小36.1-54.2μm;Waters Corporation)和SDR HyperD吸附剂(批号20033-0223;颗粒大小40-100μm;Pall-BioSepra,Cergy Saint Christophe,France)。得到了相似的结果。
b.通过凝血酶活化来移除纤维蛋白原
通过加入(a)0.3mL的1M CaCl2(最终浓度23mM)及玻璃珠(以产生内源性人类凝血酶)或(b)1000IU牛凝血酶而使其最终浓度为约50IU/mL的方式来使10mL经C18层析后所得的生长因子混合物活化,而移除纤维蛋白原(及其他凝血因子)。使该混合物温和旋转混合(60rpm),直到纤维蛋白凝块形成。之后将上清液回收、分管并进行评估。
c.纤维蛋白原的测量
表5
管分 |
纤维蛋白原(mg/mL)
|
经C18层析后的生长因子混合物 |
0.9 |
CaCl2活化后 |
无法检测 |
加入50IU/mL凝血酶后 |
无法检测 |
这些数据显示,在以CaCl2或外源性凝血酶活化后,纤维蛋白原会被完全移除。
d.生长因子的测量
表6
这些数据显示,在移除纤维蛋白原后的上清液中仍有生长因子存在。
因此,经病毒去活化后的生长因子混合物在(通过前述方法)去除纤维蛋白原后,可用作细胞培养用的补充物,特别是用于干细胞培养。
II.7-病毒去活化
此外,有许多证据显示此处所使用的S/D处理会有效地将血源性套膜病毒去活化,特别是HIV、HBV及HCV。
如上材料及方法所示,1%TnBP-1%Triton X-45合并物于31℃处理,会确保HIV、BVDV及PRV减缩系数在处理后5分钟内为>5.6、>6.6、及>6.4log10,此外也会快速地将≥7.0log10的VSV及辛德毕斯模型病毒(Sindbis model virus)去活化。非套膜病毒(如HAV及小病毒B19)无法通过S/D处理而去活化,但它们只对少数免疫功能改变的患者具有致病性。不做混合(pooling)会大大降低单一捐赠者的同种异体血小板源生长因子制剂污染在统计上的风险,但进一步纳米过滤也可用来降低非套膜病毒污染的风险。显然,此处所描述的血小板源生长因子制剂将必须在优良制造标准(GMP)的条件下生产,如血液机构的标准(参见Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products.www.WHO.int.Geneva,2003:1-72)。这类血小板制剂的S/D处理可在局部应用上提供一定程度的实用优点。第一,同种异体捐输的病毒安全性会有所改善,而使这类产物拥有较广的临床潜力。第二,通过S/D处理来释出效价较高的血小板源生长因子可能可以改善使用血小板释出物在程序上的成本效益问题。第三,在不允许使用重组血小板源生长因子的情况下,病毒去活化方法可以让同种异体血小板源生长因子在应用上更加方便;或者,在允许使用重组血小板源生长因子的情况下(如用以处理某些下肢糖尿病溃疡时),当它与天然血小板源生长因子合并使用时,可得出有利的协同效用。最后,经病毒去活化的血小板源生长因子在充分定性后亦可并入以纤维蛋白为主的人工鹰架来作为局部应用,以加速疗愈,作为胎牛血清的替代物,或在细胞工程研究、或间叶干细胞活体扩增(expansion)及其分化为骨细胞或软骨细胞的过程中用作重组血小板源生长因子。
III.生长因子的分离:用来移除SD并分离生长因子管分的离子交换层析实验
1.用来对多种生长因子选出适当层析支持物并测定其结合力的预批次吸 附步骤(preliminary batch adsorption steps)
a.PDGF-AB的吸附测试
如前文所述得出SD-PC。进行一次油萃取,以减少TnBP及Triton X-45中的污染程度。使5mL的SP-Sepharose FF凝胶、CM-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF在管柱中进行清洗,以用20mM柠檬酸钠、0.05M NaCl缓冲液(pH 7.5)来平衡这些凝胶。当凝胶平衡(=流出物的pH及传导性与起始缓冲液相等),将管柱解开,并将凝胶回收到烧杯内。用稀释的NaOH将SD-PC的pH调整到7.5。将1g各凝胶倒入不同的管子里,并除去多余的缓冲液。之后在不同的凝胶中加入不同量的SD-PC。使这些管子缓缓转动30分钟,再让凝胶沉降约5-10分钟,尽可能除去上清液,并取一样本,来测量生长因子的含量。
起始的SD-PC含有280ng/ml的PDGF-AB。数据清楚地显示,以每1ml凝胶对从3至10ml SD-PC的不同比率使用阳离子交换凝胶SP-Sepharose FF及CM-Sepharose FF时,可得出PDGF-AB的最大吸附值。在使用SP-SepharoseFF时,所得的吸附值特别高,事实显示,使SP-Sepharose FF以每1g凝胶对10ml SD-PC的比率进行接触后,上清液中的PDGF-AB量低。相对地,使SD-PC在DEAE-Sepharose FF(约250ng/g)上进行吸附后,所得上清液中发现了大量的PDGF-AB。
数据显示于图7。
b.VEGF的吸附测试
如前文所述得出SD-PC。进行一次油萃取,以减少TnBP及Triton X-45中的污染程度。使5mL的SP-Sepharose FF凝胶、CM-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF在管柱中进行清洗,以用20mM柠檬酸钠、0.05M NaCl缓冲液(pH 7.5)来平衡这些凝胶。当凝胶平衡(=流出物的pH及传导性与起始缓冲液相等),将管柱解开,并将凝胶回收到烧杯内。用稀释的NaOH将SD-PC的pH调整到7.5。将1g各凝胶倒入不同的管子里,并除去多余的 缓冲液。之后在不同的凝胶中加入不同量的SD-PC。使这些管子缓缓转动30分钟,再让凝胶沉降约5-10分钟,尽可能除去上清液,并取一样本,来测量生长因子的含量。
图8显示了VEGF在不同树脂上的吸附值%,其是以SD-PC对凝胶的比率为基础计算。数据显示,当使用阴离子交换物DEAE-Sepharose FF,特别是其比率为每1g凝胶对10ml SD-PC时,VEGF的吸附值受到限制,因为没有VEGF会被吸附。相对地,SP-Sepharose FF及CM-Sepharose FF所吸附的VEGF(约60%)比例较高。
c.TGF-β1的吸附测试
如前文所述得出SD-PC。进行一次油萃取,以减少TnBP及Triton X-45中的污染程度。使5mL的SP-Sepharose FF凝胶、CM-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF在管柱中进行清洗,以用20mM柠檬酸钠、0.05M NaCl缓冲液(pH 7.5)来平衡这些凝胶。当凝胶平衡(=流出物的pH及传导性与起始缓冲液相等),将管柱解开,并将凝胶回收到烧杯内。用稀释的NaOH将SD-PC的pH调整到7.5。将1g各凝胶倒入不同的管子里,并除去多余的缓冲液。之后在不同的凝胶中加入不同量的SD-PC。使这些管子缓缓转动30分钟,再让凝胶沉降约5-10分钟,尽可能除去上清液,并取一样本,来测量生长因子的含量。
图9显示了TGF-β1在不同树脂上的吸附值%,其是以SD-PC对凝胶的比率为基础计算。数据显示,当使用阴离子交换物DEAE-Sepharose FF,特别是其比率为每1ml凝胶对3ml SD-PC时,TGF-β1的吸附值最高,因为有70%以上的TGF-β1会被吸附。相对地,SP-Sepharose FF及CM-Sepharose FF所吸附的TGF-β1比例较低(约20%或以下)。
d.EGF的吸附测试
如前文所述得出SD-PC。进行一次油萃取,以减少TnBP及Triton X-45中的污染程度。使5mL的SP-Sepharose FF凝胶、CM-Sepharose FF、DEAE- Sepharose FF在管柱中进行清洗,以用20mM柠檬酸钠、0.05M NaCl缓冲液(pH 7.5)来平衡这些凝胶。当凝胶平衡(=流出物的pH及传导性与起始缓冲液相等),将管柱解开,并将凝胶回收到烧杯内。用稀释的NaOH将SD-PC的pH调整到7.5。将1g各凝胶倒入不同的管子里,并除去多余的缓冲液。之后在不同的凝胶中加入不同量的SD-PC。使这些管子缓缓转动30分钟,再让凝胶沉降约5-10分钟,尽可能除去上清液,并取一样本,来测量生长因子的含量。
图10显示了EGF在不同树脂上的吸附值%,其是以SD-PC对凝胶的比率为基础计算。数据显示,当使用阴离子交换物DEAE-Sepharose FF,特别是其比率为每g凝胶3ml SD-PC时,EGF的吸附值最高,因为有70%以上的EGF会被吸附。相对地,SP-Sepharose FF所吸附的EGF比例较低(15至30%);而CM-Sepharose FF所吸附的EGF则更低(5至20%)。
e.结论
发现阳离子交换物SP-Sepharose FF及CM-Sepharose FF适用于PDGF-AB及VEGF的吸附,而DEAE-Sepharose FF则在吸附TGF-β1及EGF方面有令人满意的数据。
2.SP-Sepharose FF管柱层析实验
进行进一步的实验来确认在使用离子交换物时SD去除的情形如下:
a.SD-PC的制备
在这个实验中,使SD-PC进行一次油萃取。对100ml经1次油萃取的SP-PC所用的SP-Sepharose FF量为10ml(约10g),由批次吸附实验来测定。
b.管柱平衡
将SP-Sepharose FF填充入一管柱(GE Healthcare)。在管柱填充后,用20mM柠檬酸盐、0.05M NaCl缓冲液(pH 7.5)来平衡SP-Sepharose FF。使平衡缓冲液以线性流速50cm/hr流过管柱,直到流出物的pH及传导性与平衡缓冲液相等。记录流出物于280nm的吸收值。
c.SD-PC的注入及前缘部分(breakthrough fraction)的收集
用稀释的NaOH将SD-PC的pH调整到7.5,之后以线性流速50cm/hr将之注入管柱。之后在A280nm吸收值开始增加的时候收集流出物。
d.回到基线及生长因子的洗提
当所有的SD-PC注入,以平衡缓冲液清洗管柱,直到A280nm回到起始基线为止。
之后用20mM柠檬酸盐、1M NaCl缓冲液(pH 7.5)以线性流速50cm/hr来清洗SP-Sepharose FF。在A280nm开始增加的时候收集洗提物(eluate),直到A280nm回到基线水平为止。
e.管柱再生及储存
之后先后以两倍管柱体积的2M氯化钠及两倍管柱体积的0.5N NaOH来使管柱再生。
f.结果
表7显示了管柱洗提物的生长因子含量,而表8显示了在溶剂及清洁剂中的含量。
表7:生长因子含量(ng/ml)
|
PDGF-AB
|
VEGF |
PDGF-AA
|
PDGF-BB
|
SD-PC |
101.8±41.43
|
1.211±0.5113
|
9.342±1.477
|
35.25±12.34
|
SP-洗提物 |
238.3±87.09
|
1.18±0.7244
|
3.488±0.755
|
136.7±44.22
|
SP-流出物 |
2.278±1.055
|
0.3624±0.1414
|
1.140±0.5626
|
4.823±0.0
|
表7显示SP-洗提物富含PDGF-AB及PDGF-BB,并可分离出PDGF-AA及VEGF两者,同时在前缘部分(流出物)中发现了TnBP及Triton X-45(参见表8)。在1M PDGF-AB/VEGF洗提物,这些病毒去活化剂的污染是无法检测的。
表8:溶剂及清洁剂含量
|
TnBP ppm |
Triton X-45ppm
|
SD-PC |
850 |
1500 |
SP-洗提物 |
<2 |
<2 |
SP-流出物 |
600 |
1180 |
3.DEAE-Sepharose FF管柱层析实验
a.SD-PC的制备
起始血小板浓厚液(PC)(约300mL)在收集后于24小时内处理。首先使用1%三正丁基磷酸酯(TnBP;Merck KGaA,Darmstadt,Germany)及1%Triton X-45(Sigma,Missouri,USA)的组合物(总量=6mL)进行袋内溶剂/清洁剂(S/D)处理。将S/D-PC混合物猛烈震荡1分钟,确保完全混合。之后将之浸入持续温和搅动的31℃水浴至少1小时。在S/D处理完成后,以30mL(相当于10%v/v)大豆油(Sigma,Missouri,USA)对S/D-PC混合物进行一次萃取。在油加入后,将上述袋子猛烈震荡1分钟,之后置入旋转震荡器处理20分钟。在30分钟内,将前述混合物以倒出的方式将油相从PC相分离出来,PC(下层,约280mL)通过重力进行回收。完成油萃取后,将SD-PC在室温(20-25℃)下于10,500rpm(10,600×g)离心15分钟。
b.Hi-TrapTM DEAE-Sepharose FF
将20mL未稀释的上清液以阴离子交换层析处理,其使用预先充填准备好可使用的管柱。HiTrapTM DEAE-Sepharose FF的用量为5ml对20ml SD-PC样本。管柱以5倍体积的20mM柠檬酸盐、0.05M NaCl缓冲液(pH 7.5)加以平衡。以流速50cm/hr注入SD-PC(20mL)后,注入平衡缓冲液。在于280nm吸收值增加的时候回收前缘部分(breakthrough fraction)(DEAE-BKT),直到吸收值回到基线水平为止。前缘部分的体积为49.7mL。之后进一步用5倍体积的平衡液清洗管柱,将SD完全洗掉送入前缘部分,再用20mM柠檬酸盐、1M NaCl缓冲液(pH 7.5)以线性流速50cm/hr对管柱进行洗提。
在于280nm的吸收值增加的时候收集洗提物,直到吸收值回到基线水平为止(体积:10mL)。
图12及图13显示了制备过程中的EGF含量,其是以ng/ml和总ng来表示。在于280nm的吸收值增加的时候收集对应的洗提物,直到吸收值回到基线水平为止。所收集的体积为17.9mL。测量前缘部分及洗提物中的SD剂及生长因子(参见表9)。
表9:TnBP及Triton X-45的含量
|
TnBP,ppm |
Triton X-45,ppm |
一次油萃取后的SD-PC |
686 |
2245 |
DEAE-前缘 |
459 |
1580 |
DEAE洗提物 |
<2 |
<2 |
数据显示,在一次油萃取后,DEAE层析步骤会消除SD-PC中的S/D剂。S/D剂会被收集到前缘部分,而这些S/D剂在1M NaCl洗提物中的量是无法检测的。
c.生长因子VEGF及PDGF-AB的含量
分析前缘部分及洗提物中生长因子VEGF及PDGF-AB的含量。图14及图15显示了生长因子的含量,其是以总ng来表示。数据显示,PDGF-AB及VEGF不会结合在DEAE-Sepharose基质上,会出现在前缘部分(在本申请案的前后文中,凝胶与基质这两个专有名词的意义相同)。相对地,EGF会被吸附到凝胶上而从管柱上被洗提出来,不带有SD剂。
前述阴离子及/或阳离子层析方法可如前文例示,用经油萃取后的SD-PC来进行,但亦可直接用于未经油萃取的SD-PC。较佳是进行一次油萃取,因为这会减少TnBP及Triton X-45污染的程度,从而降低清洗管柱所需的缓冲液体积,使之更快回到基线水平。油萃取也可降低脂质含量,脂质容易使层析材料结块,而使分离技术的效率降低。但油萃是可以略过的。
因此,前述阴离子及/或阳离子层析方法可以在S/D处理后直接进行,但较佳为在油萃取后进行,或者在S/D处理后或油萃取后使用疏水性管柱的前缘部分来进行。