CN101967193A

CN101967193A - 能与LOX-1结合的Hsp60片段、其衍生物及应用

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Publication number: CN101967193A
Application number: CN 201010127696
Authority: CN
Inventors: 顾建新; 谢建辉; 朱海燕; 恽小婧
Original assignee: SHANGHAI MEDICINE BIOTIC SCIENCE RESEARCH CENTRE Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI MEDICINE BIOTIC SCIENCE RESEARCH CENTRE Co Ltd; Shanghai Medical Life Science Research Center Co Ltd
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2030-03-19
Also published as: CN101967193B

Abstract

本发明提供了能与LOX-1结合的Hsp60片段、其衍生物及应用，所述衍生物包括融合蛋白、复合物和组合物等。具体而言，本发明涉及LOX-1作为一个Hsp60家族的共同受体，LOX-1通过识别Hsp60的C末端介导Hsp60的结合和内化的发现。Hsp60的C末端与抗原融合能够通过LOX-1提高抗原的免疫效果。本发明为进一步研究Hsp60的生物学功能，以及以Hsp60和Hsp60的C末端作为疫苗递送工具，以LOX-1作为受体靶向在抗肿瘤免疫和抗感染药物的研究与开发提供了理论依据。

Description

能与LOX-1结合的Hsp60片段、其衍生物及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和免疫学领域。更具体地说，LOX-1作为一个Hsp60家族的共同受体，可通过识别Hsp60的C末端介导Hsp60的结合和内化。而Hsp60的C末端与抗原融合能够通过与LOX-1的结合和随后的内化提高抗原的免疫效果。

发明背景

Sawamura等(Nature 386(6620)：73-7)于1997年使用氧化低密度脂蛋白(oxidizedlow-density lipoprotein，ox-LDL)作为诱饵筛选单一牛主动脉内皮cDNA文库，首次克隆到ox-LDL的受体，即Lox-1(凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1，Lectin-likeoxidized LDL receptor-1)。人的Lox-1含有273个氨基酸残基，含有四个潜在的糖基化位点，其相应的表达蛋白相对分子质量为42kDa。

研究表明，Lox-1是一种II型单次跨膜的糖蛋白，含有单个的C型凝集素样结构域；按结构来分类，它属于非经典的C型凝集素家族；然而，由于LOX-1能识别氧化低密度脂蛋白，从功能角度而言，它又被认为是一种清道夫受体(scavengerreceptor type E)。Lox-1的颈部含有一个半胱氨酸残基，在细胞表面以二聚化或多聚化形式发挥其生物。它在位于胞浆中的尾部有多个潜在的磷酸化位点，如Thr2，它们的磷酸化可能参与了Lox-1的所介导的细胞信号转导及其生物学功能。

尽管Lox-1胞内尾部缺失保守的信号基序，但它仍可以引发很多细胞效应，如配体内化、NF-κB激活、凋亡以及呼吸爆发、细胞因子的产生。在树突细胞中，在单核细胞中，ox-LDL能够激活MAPK(mitogen activated protein kinases)信号通路，从而增强其与血管内皮细胞的黏附功能，这种效应可以被Lox-1的反义脱氧寡核苷酸所抑制。

此外，血管内皮细胞表面的Lox-1能够作为血小板的黏附分子，当血管内皮损伤时，能够导致更易凝血和血小板的黏附。最近的研究表明，ox-LDL与其受体Lox-1结合以后，能够激活ROS酶源，从而引发自由基信号途径，导致了NF-κB的活化。其中，ROS是NF-κB特异性信号途径共同的下游信号信使，ROS生成是NF-κB激活这个链反应的早期事件，NF-κB的激活伴随着ROS的生成，同时伴有NO生成量的降低。

Lox-1可以结合、内化、降解ox-LDL，但并不能识别天然的LDL或乙酰化的LDL。并且Lox-1与ox-LDL结合是特异性的，此过程可有效地被多聚肌苷酸(polyinosinic acid)及卡拉胶(Carrageenan)所抑制，但并不被岩藻多糖或甲基化牛血清白蛋白所抑制。LOX-1是与ox-LDL上的蛋白部分相结合，并不能完全排除其与载脂蛋白B100的脂质部分结合的可能性。此外，LOX-1还能识别并内化衰老/凋亡细胞、红细胞和活化的血小板、革兰氏阳性/革兰氏阴性细菌等，在维持机体的自稳状态和抵御外来病原体过程中发挥着重要作用。

因此，筛选LOX-1的新的配体分子，为研究LOX-1在免疫系统中的功能以及进一步阐明它们的信号传导机制奠定基础，并为以LOX-1为药物靶点的药物开发提供理论基础。

Hsp60在进化上是高度保守的蛋白质之一，在体内广泛表达，参与细胞内蛋白质的折叠，阻止蛋白质的聚集，对于细胞的生存是必需的。在哺乳动物中，Hsp60定位在线粒体内，在外界环境的压力下，包括应激和病态条件等，Hsp60可以易位到胞浆、细胞膜，还可以分泌到细胞外；在外界损伤的情况下，细胞坏死也可以释放大量的Hsp60。在健康人体的血浆中，存在着低水平的Hsp60，随着年龄的升高，Hsp60水平逐渐下降。但在高血压，动脉粥样硬化，糖尿病以及内风湿性关节炎等疾病中，血浆水平的Hsp60明显升高。

近年来研究表明Hsp60在自身免疫性疾病及慢性感染等的发病中均发挥重要的调节作用。在应激状态下，包括感染等，Hsp60过表达或异位表达可以作为一种自身抗原被免疫系统识别，诱发机体的保护性免疫应答，促进机体的免疫学功能。另外，在细胞受到外界刺激导致细胞坏死也可以释放大量Hsp60到血浆中，以及Hsp60可以通过一些未知的分泌途径分泌到血浆中，这些可溶性的Hsp60能够调节固有免疫和获得性免疫，从而调节机体的免疫功能。这种血浆中的Hsp60在机体中发挥着一种调节免疫的作用，因此通常可把血浆中的Hsp60作为一种危险信号。

在固有免疫系统中，Hsp60能够激活促炎症细胞因子(包括TNF-α、IL-12等)产生，同时激活细胞表面共刺激分子(如CD80、CD86)的表达，促进抗原呈递细胞的成熟等。在获得性免疫系统中，Hsp60能够降低T细胞的趋化功能，增强T细胞的黏附。特别在T调节细胞中，Hsp60能够促进T调节细胞的增殖，提高IL-10、TGF-1β的分泌，从而调节炎症的发生发展。因此专家推测，Hsp60可能作为一种细胞因子，能够调节机体的免疫功能。

Hsp60激活自身免疫系统作为它的新功能，具有非常广泛的功能重要性，然而对它发挥功能的机制目前尚不清楚。Hsp60的细胞因子效应可能是通过TLR-2/4受体发挥其功能的，进而激活NF-κB的转录活性，促进抗原递呈细胞的成熟以及细胞因子的产生。然而，越来越多的证据表明，在抗原递逞细胞表面，存在Hsp60的吞噬受体，并且该受体发挥了重要的生物学功能，但是目前还没有被鉴定。

为了更进一步的对Hsp60的免疫调节功能的研究，鉴定免疫学细胞上的Hsp60受体显得非常必要。Hsp60受体的鉴定，将为阐明Hsp60在自身免疫性疾病中的生物学功能以及以Hsp60作为免疫佐剂或自身免疫性疾病治疗药物的研究提供必要的理论基础。

综上所述，本领域迫切需要对LOX-1的新的配体分子进行筛选和对Hsp60的受体进行鉴定，从而为药物靶点的开发提供基础。

发明内容

本发明的目的之一就是揭示LOX-1与Hsp60之间的关系，通过本发明证实了：LOX-1是Hsp60家族的共同受体，其通过识别Hsp60的C末端介导Hsp60的结合和内化。本发明的另一目的是提供LOX-1结合结构域(即Hsp60的C末端)在提高Hsp60C末端与抗原的融合蛋白的免疫效果中的用途。

在本发明的第一方面中，提供了一种融合蛋白，其包含：(A)含热休克蛋白Hsp60的C末端序列的肽段；(B)活性肽段；和(C)任选的位于(A)和(B)之间的连接肽。

在一个优选例中，所述(C)是长度为0-50个氨基酸，优选2-30个氨基酸，更优选4-20个氨基酸的连接肽。

在一个优选实施方式中，该融合蛋白中的部分(A)是选自下组的肽段：

(i)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；

(ii)全长Hsp60；

(iii)在(i)或(ii)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且能结合LOX-1并被LOX-1介导内化的由(i)或(ii)衍生的氨基酸序列；或

(iv)与(i)～(iii)中任一项所述多肽同源、且能结合LOX-1并被LOX-1介导内化的氨基酸序列。

在一个优选例中，(A)包含一个或多个含热休克蛋白Hsp60的C末端序列的肽段，优选所述多个含热休克蛋白Hsp60的C末端序列的肽段为相同肽段的重复序列。

在本发明的另一个实施方式中，所述(A)是由选自下组的核苷酸序列编码的：

(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5序列或Hsp60的全长序列；

(b)与(a)中序列同源的序列；或

(c)在严格条件下与(a)或(b)限定的序列杂交、且能结合LOX-1并被LOX-1介导内化的活性分子。

在另一个实施方式中，所述(B)是具有选自下组的一种或多种活性的肽段：抗原递呈、抗肿瘤、免疫调节、抗感染、促进细胞成熟、和促进细胞因子分泌。

在一个优选例中，所述肽段选自：所述(B)选自：肿瘤抗原(优选Mucin I或NY-ESO-1)、微生物抗原(优选HBsAg、HPV抗原E6、或HPV抗原E7)，优选肿瘤抗原Mucin I或它们的活性片段。

在本发明的第二方面中，提供了一种分离的核酸分子，其编码本发明的融合蛋白。在本发明的另一个方面还涉及含有所述核苷酸序列的载体以及宿主细胞。

在本发明的第三方面中，提供了一种复合物，所述复合物包含与热休克蛋白Hsp60的C末端结合的LOX-1。在一个优选例中，所述复合物包含：(I)含热休克蛋白Hsp60的C末端序列的多肽或蛋白质；和(II)与热休克蛋白Hsp60的C末端结合的LOX-1。

在一个优选例中，所述(I)是选自下组的多肽或蛋白质：

(i)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示的多肽；

(ii)全长Hsp60；

在一个优选例中，所述LOX-1通过具有SEQ ID NO：15所示序列的结合结构域或其同源序列(例如具有90％以上(如90、95、98或99％)同源性的同源序列)与热休克蛋白Hsp60的C末端结合。

在另一个优选例中，所示LOX-1的结合结构域由SEQ ID NO：14的核苷酸序列或其同源序列(例如具有90％以上(如90、95、98或99％)同源性的同源序列)编码。

在一个优选例中，所述热休克蛋白Hsp60是哺乳动物来源的Hsp60或微生物来源的Hsp60，优选所述Hsp60是：人的Hsp60、细菌的GroEL或牛结核杆菌的Hsp65。

在本发明的一个实施方式中，所述LOX-1通过LOX-1的结合结构域与所述热休克蛋白Hsp60的C末端结合。

在一个优选例中，所述LOX-1是全长LOX-1或LOX-1胞外段(如aa140-273)。

在本发明的另一个实施方式中，所述热休克蛋白Hsp60和/或LOX-1还连接或融合有其它活性蛋白或多肽。

在一个优选例中，所述其它活性蛋白或多肽具有抗原递呈、抗肿瘤、免疫调节、抗感染、促进细胞成熟、和/或促进细胞因子分泌的活性。

在另一优选例中，所述其它活性蛋白或多肽选自：肿瘤抗原Mucin I或来自于微生物或病毒的抗原，优选肿瘤抗原Mucin I。

在本发明的第四方面中，提供了一种组合物，所述组合物包含：

(A)有效量的选自下组中的一种或多种：本发明的融合蛋白、编码本发明融合蛋白的分离的核酸分子或含有该核酸分子的载体或宿主细胞、本发明的复合物、Hsp60的C末端多肽或其编码序列、全长Hsp60或其编码序列；和

(B)药学上、免疫学上或保健品学上可接受的载体。

在本发明的第五方面中，提供了本发明的融合蛋白、编码本发明融合蛋白的分离的核酸分子或含有该核酸分子的载体或宿主细胞、本发明的复合物、Hsp60的C末端多肽或其编码序列、全长Hsp60或其编码序列的用途，其用于制备调节免疫、抗感染、抗肿瘤、促进细胞成熟和/或促进细胞因子分泌的组合物。

在一个优选例中，所述组合物为保健品、药物或疫苗。

在本发明的第六方面中，提供了LOX-1多肽、LOX-1的结合结构域或它们的编码序列的用途，其用于结合热休克蛋白Hsp60的C末端。

在一个优选例中，所述结合介导了热休克蛋白Hsp60的内化，从而提高了热休克蛋白Hsp60的抗原递呈、抗肿瘤、免疫调节、抗感染、促进细胞成熟、和/或促进细胞因子分泌的活性。

在本发明的其它方面中，提供了LOX-1与热休克蛋白Hsp60聚合物，所述聚合物包含：分离的哺乳动物LOX-1结合的结构域的多肽，其中所述分离的哺乳动物LOX-1结合的结构域由与SEQ ID No：2或与SEQ ID No：4或与SEQ ID No：6所示的LOX-1结合的结构域中任一种具有70％以上相同性(例如75％、80％、85％、90％95％、98％、99％或100％)的氨基酸序列组成；或，

包含LOX-1结合的结构域的多肽，其中所述的LOX-1结合的结构域由与SEQID No：2或与SEQ ID No：4或与SEQ ID No：6所示的LOX-1结合的结构域中任一种具有70％以上相同性(例如75％、80％、85％、90％95％、98％、99％或100％)的氨基酸序列组成，条件是所述多肽不是全长的Hsp60家族的多肽；或，

包含SEQ ID No：2或SEQ ID No：4或SEQ ID No：6所示的LOX-1结合的结构域的多肽中的任一个。

在一个实施方式中，所述LOX-1结合的结构域的多肽做了保守性氨基酸置换。

在另一个实施方式中，其中分离的哺乳动物LOX-1结合的结构域由SEQ ID No：2或SEQ ID No：4或SEQ ID No：6中任一种所示的氨基酸序列组成。

在另一个实施方式中，所述分离的哺乳动物LOX-1结合的结构域介导抗原递呈、细胞的成熟和细胞因子的分泌、调节免疫、抗感染和抗肿瘤功能。

在本发明的其它方面中，还提供了一种分离的核酸分子，它包含下列的核苷酸的一种：

编码分离的哺乳动物LOX-1结合的结构域的核苷酸序列，其中所述分离的哺乳动物LOX-1结合的结构域与SEQ ID No：1(来源于人)或与SEQ ID No：3(来源于大肠杆菌K1)或与SEQ ID No：5(来源于牛结核杆菌H37Rv)所示的LOX-1结合的结构域其中任何一个具有70％以上的氨基酸序列相同性；或，

编码分离的哺乳动物LOX-1结合的结构域的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列在45℃6×SSC中、然后在50-65℃下用0.2SSC和0.1％SDS洗涤一遍或多遍后与编码LOX-1结合的结构域的SEQ ID No：1或SEQ ID No：3或SEQ ID No：5所示的核苷酸序列的任何一个互补序列杂交；或，

如SEQ ID No：1或SEQ ID No：3或SEQ ID No：5中所示的编码分离的哺乳动物LOX-1结合的结构域的核苷酸序列的任何一种。

在一个实施方式中，所述分离的哺乳动物LOX-1结合的结构域由SEQ ID No：1或SEQ ID No：3或SEQ ID No：5中其中任何一种所示的核酸序列组成。

在另一个实施方式中，所述分离的LOX-1结合的结构域介导抗原递呈，细胞的成熟和细胞因子的分泌，调节免疫，抗感染和抗肿瘤等中的应用。

在另一个实施方式中，所述核酸分子编码融合蛋白。

在本发明的另一方面中，还提供了一种融合蛋白，该蛋白包括由分离的LOX-1结合的结构域组成的第一多肽和其它的第二多肽。

在一个实施方式中，该融合蛋白的第一多肽由分离的LOX-1结合的结构域的一个或一个以上的重复氨基酸序列组成。

本发明还进一步提供了一种载体，它包含本发明的核酸分子。在一个实施方式中，该载体包含一个或多个重复的本发明的核酸分子。

在另一方面，本发明提供了一种介导抗原递呈，细胞的成熟和细胞因子的分泌，调节免疫和抗肿瘤功能的方法，该方法包括调节Hsp60多肽或其LOX-1结合的结构域的活性，或者包括调节Hsp60或其LOX-1结合的结构域的表达。

在另一方面，本发明提供了一种鉴定化合物的方法，该化合物调节LOX-1结合的结构域的介导抗原提成，细胞的成熟和细胞因子的分泌，调节免疫和抗肿瘤功能，该方法包括：

使含LOX-1结合的结构域的无细胞混和物与测试化合物接触；

测定测试化合物调节LOX-1结合的结构域的能力，从而鉴定出能调节LOX-1结合的结构域的介导抗原递呈，细胞的成熟和细胞因子的分泌，调节免疫和抗肿瘤功能。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了LOX-1和Hsp60-C在酵母中的相互作用。

图2显示了LOX-1和Hsp60细胞流式分析的结果。

图3显示了LOX-1和Hsp60-C细胞流式分析的结果。

图4显示了LOX-1结合和内化Hsp60和Hsp60-C免疫荧光的结果。

图5显示了LOX-1作为Hsp60家族共同受体，能够结合GroEL和Hsp65(微生物来源的Hsp60家族成员)的结果。

图6显示了Hsp60-C与抗原融合能够通过LOX-1提高抗原的免疫效果。

图7显示了含有LOX-1胞外段的pGADT7质粒的结构示意图。

具体实施方式

本发明中，发明人通过酵母双杂交，免疫荧光分析以及细胞流式等实验证明了LOX-1是Hsp60家族的共同识别受体，能够通过识别Hsp60的C末端介导Hsp60的结合和内化。并且发明人通过进一步的试验证实了：Hsp60的C末端与抗原融合能够通过LOX-1提高抗原的免疫效果。

具体而言，本发明人做出了如下独创性的发现：

1.证明了LOX-1通过识别Hsp60的C末段介导Hsp60的结合和内化

通过酵母双杂交筛选，发明人发现Hsp60的C末段(Hsp60-C，aa436-573)，而不是Hsp60的N末端(Hsp60-N，aa27-152)或Hsp60的AM结构域(Hsp60-AM，aa153-435)，能够与LOX-1胞外段(aa140-273)相互作用，从而对酵母报告基因的表达有很强的激活作用。通过细胞流式技术和免疫荧光分析，发明人进一步证明了LOX-1通过识别Hsp60的C末段介导Hsp60的结合和内化。

2.证明了LOX-1是Hsp60家族一个共同受体

通过细胞流式分析和免疫荧光分析，发明人发现，LOX-1除了能够识别哺乳动物的Hsp60外，还能识别微生物来源的Hsp60家族成员，包括但不限于细菌的GroEL和牛结核杆菌的Hsp65。由此证明了，LOX-1能够作为Hsp60家族的一个共同受体。

3.证明了Hsp60的C末段与LOX-1的结合可提高肿瘤抗原的抗肿瘤作用

通过把Hsp60的C末端与肿瘤抗原Mucin I融合(Hsp60-C/Mucin I)，进行免疫小鼠，我们发现，使用Hsp60-C/Mucin I比单独使用Mucin I蛋白具有更好的抗肿瘤能力。使用LOX-1的胞外端多肽阻断Hsp60-C与LOX-1的结合，明显抑制Hsp60-C/Mucin I的抗肿瘤效果，与单独Mucin I蛋白的抗肿瘤效果没有明显差异，表明Hsp60的C末段能够通过LOX-1提高肿瘤抗原的抗肿瘤作用。

Hsp60、其C末端序列、及它们的编码序列

如本发明中所用，术语“Hsp60”是指本领域中已知的一类热休克蛋白，其在进化上高度保守，且可在体内广泛表达，并介导细胞生存必需的多种反应。该术语不仅包括动物来源的Hsp60(例如人的全长Hsp60基因及蛋白序列分别如SEQ ID NO：9和10所示)，还包括诸如微生物等其它生物来源的Hsp60家族成员(如牛结核杆菌的Hsp65)。

在本发明中，发明人证明了Hsp60可被LOX-1所识别，与LOX-1的结合结构域识别，从而完成Hsp60的内化并在胞内实现或增强Hsp60的各种功能、实现或增强与Hsp60相连或融合的其它活性多肽或蛋白质的功能。

经本发明人研究发现，Hsp60主要通过其C末端与LOX-1结合。所述C末端序列为例如：人Hsp60的第436-573位氨基酸、大肠杆菌的第411-548位氨基酸或牛结核杆菌的第409-540位氨基酸。本发明中Hsp60蛋白或多肽优选由哺乳动物(优选人)、细菌(如结核杆菌)等Hsp60基因或其同源基因或家族基因编码。

在本发明中，术语“Hsp60的C末端”、“结合LOX-1的(多肽/Hsp60)序列”、“Hsp60的活性片段”和“(Hsp60上的结合)LOX-1的结合结构域”可互换使用，均表示实现位于Hsp60或其同源序列中的与LOX-1结合和内化所需的氨基酸序列或由其衍生的序列。

应理解本发明中所述的Hsp60，还包括它们的变异形式(包括保守性变异多肽)、或其同源蛋白或多肽、或其活性片段。本发明的蛋白质或多肽或其结合结构域可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的LOX-1蛋白质或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有与LOX-1结合的活性。本领域技术人员可根据本领域常识和/或常规试验很容易地确定这些变异方式，而不会影响蛋白或多肽的活性。

在本发明中，“保守性变异多肽”指与Hsp60蛋白或多肽或其结合结构域(例如SEQ ID NO：2(源自人Hsp60)、SEQ ID NO：4(源自大肠杆菌K1的GroEL)或SEQ ID NO：6(源自牛结核杆菌H37Rv的Hsp65))的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据下表进行氨基酸替换而产生：

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile

Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

在本发明中还提供了上述活性片段或多肽的编码序列(或基因)。例如，术语“Hsp60基因”、“Hsp60编码序列”或“编码Hsp60的序列”可互换使用，均是指一种编码本发明所述的Hsp60蛋白或多肽的序列，其与人Hsp60基因序列可高度同源或为在严格条件下与所述基因序列杂交的分子或为与上述分子高度同源的家族基因分子。

在本发明的一个实施方式中，优选使用编码Hsp60上的LOX-1结合结构域的序列，例如：(a)SEQ ID NO：1(源自人Hsp60)、SEQ ID NO：3(源自大肠杆菌K1的GroEL)或SEQ ID NO：5(源自牛结核杆菌H37Rv的Hsp65)的序列；(b)与(a)中序列同源的序列；或(c)在严格条件下与(a)或(b)限定的序列杂交、且能结合LOX-1并介导Hsp60内化的活性分子。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。

本发明的Hsp60基因或具有Hsp60活性片段的编码核苷酸序列(例如Hsp60上与LOX-1结合的结合结构域)通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

应理解，本发明的Hsp60基因可获自哺乳动物(优选人)、细菌(如结核杆菌)，且与这些Hsp60基因之间高度同源(如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。

LOX-1、LOX-1的结合结构域和它们的编码序列

在本发明中，术语“LOX-1蛋白或多肽”、“LOX-1基因编码的蛋白质或多肽”或“凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1”可互换使用，均是指由本发明的LOX-1基因编码的蛋白质或多肽、它们的保守性变异多肽、或其同源蛋白或多肽。LOX-1蛋白在本领域中是已知的一个蛋白家族，例如人LOX-1是含有273个氨基酸残基的蛋白质(其编码序列及氨基酸序列如SEQ ID NOs：7和8所示)。在本发明中可使用LOX-1蛋白或多肽，也可使用其活性片段，即LOX-1结合结构域。

本发明人发现全长LOX-1可以结合Hsp60并介导Hsp60内化，并且本发明人还证明了LOX-1蛋白或多肽通过其上的结合结构域与Hsp60结合并介导Hsp60的内化。所述LOX-1上的结合结构域的序列可选自：(i)SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且能结合Hsp60的C末端并介导其内化的由(i)衍生的氨基酸序列；或(iii)与(a)和(b)中所述多肽同源、且具有结合Hsp60的C末端并介导Hsp60内化的活性的氨基酸序列。

本发明的蛋白质或多肽或其结合结构域可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

应理解本发明中所述的LOX-1蛋白或多肽，还包括它们的变异形式(包括保守性变异多肽)、或其同源蛋白或多肽、或其活性片段。关于蛋白质或多肽变异形式或保守性变异多肽的描述可参见上文。

如本文所用，术语“LOX-1基因”、“LOX-1编码序列”或“编码LOX-1的序列”可互换使用，均是指一种编码本发明所述的LOX-1蛋白或多肽的序列，其与人LOX-1基因序列可高度同源或为在严格条件下与所述基因序列杂交的分子或为与上述分子高度同源的家族基因分子。

应理解，本发明中LOX-1蛋白或多肽由哺乳动物(优选人)LOX-1基因或其同源基因或家族基因编码。与这些LOX-1基因之间高度同源(如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。

融合蛋白、复合物和组合物

基于LOX-1可与Hsp60的C末端结合并介导Hsp60的内化的发现，本发明中还提供了一种融合蛋白，其包含：(A)含Hsp60的C末端序列的肽段；(B)其它活性肽段(即非Hsp60的C末端序列肽段、且具有生理学、免疫学或药学上活性的肽段)；(C)任选的，位于(A)和(B)之间的连接肽。

本技术领域人员可根据需要选取其它活性肽段，方便地用各种已知方法制得本发明的融合蛋白。这些方法例如但不限于：重组DNA法，人工合成，等[参见Murray KM，Dahl SLAnn；Pharmacother 1997Nov；31(11)：1335-8]。在得知了本发明的融合蛋白的氨基酸序列后，本领域人员可以方便地根据所述的氨基酸序列获得编码本发明的融合蛋白的基因序列，这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。

本发明还提供了一种表达载体，包含编码本发明的融合蛋白的序列以及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

本发明还提供了表达本发明融合蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的融合蛋白的编码序列。所述的宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CHO，COS细胞，293细胞，RSF细胞等。作为本发明的优选方式，所述的细胞是CHO-K1细胞，其可良好地表达本发明的融合蛋白，可获得结合活性良好，稳定性良好的融合蛋白。

本发明还提供一种用重组DNA制备本发明融合蛋白的方法，其步骤包括：1)提供编码融合蛋白的核酸序列；2)将1)的核酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；4)在适合表达的条件下培养转化宿主细胞；以及5)收集上清液，并纯化融合蛋白产物。

将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。

可采用本领域中熟知的各种方法对上述制备获得的融合蛋白进行纯化，使其具有基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。

本发明中还提供了一种由Hsp60与LOX-1结合后可形成复合物，其可介导Hsp60的内化和功能的行使。因此，本发明的复合物可用于制备调节免疫、抗感染、抗肿瘤、促进细胞成熟、或促进细胞因子分泌的组合物。所述热休克蛋白Hsp60和/或LOX-1还可连接或融合有其它活性蛋白或多肽，优选所述其它活性蛋白或多肽具有抗原递呈、抗肿瘤、免疫调节、抗感染、促进细胞成熟、和/或促进细胞因子分泌的活性。

本发明中还提供了一种组合物，所述组合物包含：(A)有效量的本发明的复合物、LOX-1多肽、LOX-1多肽结合的结构域或它们的编码序列；和(B)药学上、免疫学上或保健品学上可接受的载体。

如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。如本文所用，术语“药学上(免疫学上或保健品学上)可接受的载体”是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质，它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。

在组合物中可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质、佐剂等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

本发明的组合物中有效成分(即本发明的融合蛋白、复合物、LOX-1多肽结合的结构域或它们的编码序列)占组合物总重量的0.001-99.9wt％；优选为组合物总重量的1-95wt％，较优选为5-90wt％，更优选10-80wt％。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。

本发明的组合物，可以为固态(如颗粒、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液、注射液)或其它合适的形式。应理解，所用活性物质的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师或营养师可以判断的范围内。

本发明的组合物可以通过常规途径施用，其中包括(但并不限于)：口服、肌注、皮下注射等。优选口服施用。组合物形式应与施用方式相匹配。本领域技术人员可根据需要确定本发明活性物质的服用量。通常对于人类，本发明组合物的施用量按活性物质重量计，为每次约0.1-200微克活性物质/kg体重，较佳地约1-100微克活性物质/kg体重，更优选2-50微克/kg体重。

本发明的组合物还可含有其它活性物质或与其它活性物质联合使用，且一般具有优于单独给予本发明活性物质的效果。

本发明的优点

本发明的优点主要在于：

(1)发现了LOX-1是Hsp60家族的共同受体，其可识别并介导Hsp60的内化，有助于Hsp60或其含有其它活性片段的融合蛋白在胞内发挥其功能；

(2)证明了Hsp60的C末端与抗原融合能够通过LOX-1提高抗原的免疫效果，从而为以Hsp60和Hsp60的C末端作为疫苗递送工具，以LOX-1作为受体靶向在抗肿瘤免疫和抗感染药物的研究与开发提供了依据。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件【如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)】中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.LOX-1与Hsp60的C末端在酵母中的相互作用

通过常规分子克隆的方法，将Hsp60的N末端(Hsp60-N，aa27-152)、顶部区和中间区(Hsp60-AM，aa153-435)和C末端(Hsp60-C，aa436-573)分别构建到pGBKT7载体(Clontech)中获得人Hsp60的三个缺失突变体Hsp60-N、Hsp60-AM和Hsp60-C，经测序表明序列正确。

按照Clontech公司的酵母双杂交操作手册，用上述三种质粒分别与含有LOX-1的结合结构域(即SEQ ID NO：14所示核苷酸序列)的pGADT7质粒共转化酵母细胞(质粒结构参见图7)。通过营养筛选和颜色筛选(挑取酵母克隆划α-gal和缺少组氨酸、亮氨酸、腺嘌呤和色氨酸的营养缺陷板，并按照常规方法检测其半乳糖苷酶活性)，结果如图1所示。图中：阳性对照为p53与T抗原相互作用，阴性对照为Lam与T抗原相互作用。

结果显示：Hsp60-C能够强烈激活报告基因LacZ的表达，半乳糖苷酶活性很高。该结果表明：在酵母细胞中，Hsp60-C能够与LOX-1的结合结构域相互作用，激活报告基因的表达，暗示是LOX-1可通过Hsp60C末端氨基酸436-573肽段的介导来识别Hsp60，而不是Hsp60的N末端或AM结构域的介导实现识别与结合。

实施例2.重组蛋白的纯化

将人Hsp60的全长cDNA以及三个缺失突变体的cDNA通过常规分子生物学技术分别连接到PET22b载体(购自Novagen)，转化DH5α(购自invitrogen)，通过氨苄青霉素筛选到的阳性克隆，经质粒纯化和测序，证明挑选的克隆序列正确。

用如上构建的四个质粒分别转化BL21大肠杆菌，挑克隆接种到LB培养液中，于37℃培养。培养至菌液达到OD0.6-0.8时，用浓度为0.1mM的IPTG进行表达诱导。诱导表达5小时后收集并裂解细胞。按照镍柱纯化操作手册(Sigma)，通过镍柱珠子纯化目的蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot的鉴定证明纯化的产物即为所需的目的蛋白Hsp60、Hsp60-N、Hsp60-AM以及Hsp60-C。

实施例3.Hsp60与LOX-1在细胞表面的结合

按照pierce公司的操作手册，对实施例2原核表达的Hsp60进行Alexa 488荧光标记。分装荧光标记产物，并将其储存在-80℃。

将LOX-1稳定转染的CHO-K1细胞(使用lipofectamine 2000(invitrogen)常规转染CHO-K1细胞，使用800μg/ml的G418(invitrogen)筛选LOX-1稳定转染的CHO-K1细胞克隆)与6μg/ml的上述荧光标记蛋白(细胞密度为1×10⁶个/ml，100μl)在4℃分别孵育45分钟，用PBS洗涤细胞三遍后，在室温下进行流式细胞(BD公司，BD FACSCalibur)常规检测。

在研究受体配体的竞争抑制分析中，使上述LOX-1稳定转染的CHO-K1细胞细胞预先与未标记的Hsp60或LOX-1抗体23C11孵育30分钟，然后加入荧光标记的Hsp60。流式细胞分析的结果如图2所示(横坐标为Alexa488-Hsp60，纵坐标为细胞数)。

结果表明：Hsp60能够结合到LOX-1稳定转染CHO-K1细胞表面，并且未标记Hsp60或LOX-1抗体23C11能够竞争性抑制荧光标记的Hsp60结合到LOX-1表达的细胞表面。这种特性表明，Hsp60与LOX-1的结合是一种受体与配体的关系。

实施例4

按照pierce公司的操作手册，对实施例2原核表达纯化后的人Hsp60的三个缺失突变体蛋白：Hsp60-N、Hsp60-AM以及Hsp60-C进行荧光标记，荧光标记物为Alexa488。

使用LOX-1稳定转染CHO-K1细胞进行流式细胞分析(同实施例3)。LOX-1稳定转染CHO-K1与6μg/ml的蛋白在4度分别进行孵育45分钟，用PBS洗涤细胞三遍后，进行流式细胞检测。

如图3A所示，荧光标记的Hsp60-C，而不是Hsp60-N或Hsp60-AM能够结合到LOX-1稳定转染CHO-K1细胞表面。该结果表明：LOX-1通过识别Hsp60的C末端介导Hsp60的内化。横坐标为细胞结合的Alexa 488荧光，纵坐标为细胞数。

进一步通过以流式细胞分析为基础的抑制实验：LOX-1稳定转染CHO-K1细胞分别预先与60μg/ml未荧光标记的Hsp60、Hsp60-N、Hsp60-AM或Hsp60-C在4℃孵育30min，然后加入6μg/ml Alexa 488标记Hsp60，在4℃继续孵育45min；用冷的PBS洗涤3遍后，进行细胞流式分析。结果如图3B所示。

该结果表明：Hsp60-C，而不是Hsp60-N或Hsp60-AM能够抑制全长Hsp60结合到LOX-1稳定转染CHO-K1细胞表面，进一步表明LOX-1识别Hsp60是通过Hsp60的C末端所介导。

实施例5.共聚焦显微镜分析LOX-1与Hsp60和Hsp60-C的结合

将LOX-1稳定转染CHO-K1细胞与抗Myc抗体(购自Invitrogen)和荧光标记的Hsp60或Hsp60-C在4℃孵育45分钟，然后用冷的PBS洗3遍，接着使用红荧光罗丹明标记的二抗(购自Santa cruz公司)染色。若为吞噬分析则继续37℃孵育15分钟。最后使用4％的福尔马林固定10分钟，然后用PBS洗涤，封片，进行共聚焦(Carl Zeiss)分析。结果如图4所示。

免疫荧光实验中，绿色荧光标记的为Hsp60和Hsp60-C，红色荧光显示的为LOX-1。通过比较和合并可发现，绿色荧光标记与红色荧光标记的分布位置基本相同。

试验结果表明：LOX-1能够识别和结合Hsp60和Hsp60-C，并介导它们的吞噬。

实施例6.LOX-1识别微生物来源的Hsp60家族成员

按照实施例2的方法对细菌(大肠杆菌K1，E.coli.K1)GroEL和牛结核杆菌的Hsp65进行表达纯化，并使用Alexa 488绿荧光标记。将带有绿荧光标记的GroEL和Hsp65分别与LOX-1稳定转染CHO-K1细胞在4℃孵育45分钟，然后使用冷的PBS洗涤细胞3遍，按照实施例3的方法进行流式细胞分析。

图5A显示：荧光标记的Hsp65和GroEL能够结合细胞表面的LOX-1。该结果表明：LOX-1的CHO-K1细胞能够识别GroEL和Hsp65。进一步按照实施例5的方法通过共聚焦分析，结果如图5B所示，该结果表明，表达LOX-1的细胞能够结合荧光标记的GroEL和Hsp65，而不表达LOX-1的细胞则无法与荧光标记的GroEL和Hsp65结合。

进一步通过以流式细胞分析为基础的抑制实验：将LOX-1稳定转染CHO-K1细胞分别预先与60μg/ml荧光未标记的BSA、Hsp60、GroEL在4℃孵育30min，然后加入6μg/ml Alexa 488标记Hsp65，在4℃继续孵育45min，用冷的PBS洗涤3遍，进行细胞流式分析。该流式细胞分析的结果如图5C所示，该结果表明：GroEL和Hsp60能够抑制Hsp65结合到LOX-1表达的细胞表面，但是BSA不能抑制Hsp65结合到LOX-1表达的细胞表面，表明这些蛋白具有共同的受体LOX-1。

实施例7.Mucin I、L-ECD和Hsp60-C/Mucin I融合蛋白的原核表达

通过常规分子克隆技术将编码Mucin I部分胞外端多肽(SEQ ID NO：12)的核酸序列(SEQ ID NO：11)、编码LOX-1胞外段多肽(aa68-273，L-ECD)的核酸序列、编码Hsp60的C末端多肽(aa436-573，Hsp60-C)与Mucin I部分胞外端多肽融合多肽(SEQID NO：13)的核酸序列进一步按照编码读框克隆进入PET22b载体(Novagen)，分别产生PET22b-MucinI，PET22b-L-ECD，PET22b-Hsp60-C/MucinI三个表达质粒。通过氨苄青霉素筛选到的阳性克隆，经质粒纯化和测序，证明挑选的克隆序列正确(Mucin I部分胞外端多肽及其编码序列分别如SEQ ID NOs：12和11中所示)。

用如上构建的三个质粒和pGEX-4T-1载体(Amersham公司)分别转化BL21大肠杆菌，挑克隆接种到LB培养液中，于37℃培养。培养至菌液达到OD_0.6-0.8时，用浓度为0.1mM的IPTG进行表达诱导。诱导表达5小时后收集并裂解细胞。

按照镍柱纯化操作手册(Sigma)，通过镍柱珠子纯化目的蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot的鉴定证明纯化的产物即为所需的目的蛋白Mucin I、L-ECD以及Hsp60-C/MucinI融合蛋白。按照GST纯化操作手册(GE公司)，通过GST珠子纯化目的蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot的鉴定证明纯化的产物即为所需的目的蛋白GST。

实施例8.Hsp60-C提高肿瘤抗原的抗肿瘤活性

给BALB/c小鼠(每组6只，6～8周，雄性，购自中国科学院上海实验动物中心)皮下注射免疫2nmol实施例7表达的Mucin I蛋白或Hsp60-C/Mucin I融合蛋白，以注射PBS的小鼠作为对照(若为抑制LOX-1的识别，Hsp60-C/Mucin I融合蛋白分别与等摩尔的L-ECD或GST蛋白4度孵育1小时后再进行注射免疫)。免疫一周后，同剂量、同方法加强一次。加强一周后，小鼠接受1×10⁵个4T1细胞的皮下接种。在不同的时间点(0、10、20和30天)观察和测量在肿瘤大小(肿瘤体积计算公式为：体积＝0.5×长度×宽度×宽度，单位为立方毫米)。25天以后，处死小鼠，对肿瘤体积数据采用双尾T检验进行统计。结果如图6所示。

结果显示：使用Hsp60-C/Mucin I免疫的小鼠具有明显低的肿瘤负荷，肿瘤体积明显变小。使用L-ECD孵育(购自Hycult公司)，能够明显抑制Hsp60-C/Mucin I所介导的肿瘤抑制效果，而对照GST则无此抑制效果。

该结果表明：Hsp60-C能够通过LOX-1提高/Mucin I的抗肿瘤效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海医学生命科学研究中心有限公司

<120>能与LOX-1结合的Hsp60片段、其衍生物及应用

<130>095288

<160>15

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>390

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(390)

<400>1

gct gtt gaa gaa ggc att gtt ttg gga ggg ggt tgt gcc ctc ctt cga 48

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1 5 10 15

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20 25 30

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115 120 125

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Gly Ala

130

<210>2

<211>130

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg

1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

Gly Ala

130

<210>3

<211>396

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(396)

<400>3

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1 5 10 15

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100 105 110

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115 120 125

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130

<210>4

<211>132

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>4

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1 5 10 15

Ala Ser Lys Leu Ala Asp Leu Arg Gly Gln Asn Glu Asp Gln Asn Val

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Ala Gly Gly Met

130

<210>5

<211>390

<212>DNA

<213>牛结核杆菌(Bacillus tuberculosis bovis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(390)

<400>5

gtc gag gag ggc atc gtc gcc ggt ggg ggt gtg acg ctg ttg caa gcg 48

Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr Leu Leu Gln Ala

1 5 10 15

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Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp Glu Ala Thr Gly

20 25 30

gcc aac atc gtg aag gtg gcg ctg gag gcc ccg ctg aag cag atc gcc 144

Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val Thr Arg Ser Ala

85 90 95

ctg cag aat gcg gcg tcc atc gcg ggg ctg ttc ctg acc acc gag gcc 336

Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu Thr Thr Glu Ala

100 105 110

gtc gtt gcc gac aag ccg gaa aag gag aag gct tcc gtt ccc ggt ggc 384

Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser Val Pro Gly Gly

115 120 125

ggc gac 390

Gly Asp

130

<210>6

<211>130

<212>PRT

<213>牛结核杆菌(Bacillus tuberculosis bovis)

<400>6

Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr Leu Leu Gln Ala

1 5 10 15

Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp Glu Ala Thr Gly

20 25 30

Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala

35 40 45

Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys Val Arg Asn

50 55 60

Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly Val Tyr Glu Asp

65 70 75 80

Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val Thr Arg Ser Ala

85 90 95

Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu Thr Thr Glu Ala

100 105 110

Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser Val Pro Gly Gly

115 120 125

Gly Asp

130

<210>7

<211>819

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(819)

<400>7

atg act ttt gat gac cta aag atc cag act gtg aag gac cag cct gat 48

Met Thr Phe Asp Asp Leu Lys Ile Gln Thr Val Lys Asp Gln Pro Asp

1 5 10 15

gag aag tca aat gga aaa aaa gct aaa ggt ctt cag ttt ctt tac tct 96

Glu Lys Ser Asn Gly Lys Lys Ala Lys Gly Leu Gln Phe Leu Tyr Ser

20 25 30

cca tgg tgg tgc ctg gct gct gcg act cta ggg gtc ctt tgc ctg gga 144

Pro Trp Trp Cys Leu Ala Ala Ala Thr Leu Gly Val Leu Cys Leu Gly

35 40 45

tta gta gtg acc att atg gtg ctg ggc atg caa tta tcc cag gtg tct 192

Leu Val Val Thr Ile Met Val Leu Gly Met Gln Leu Ser Gln Val Ser

50 55 60

gac ctc cta aca caa gag caa gca aac cta act cac cag aaa aag aaa 240

Asp Leu Leu Thr Gln Glu Gln Ala Asn Leu Thr His Gln Lys Lys Lys

65 70 75 80

ctg gag gga cag atc tca gcc cgg caa caa gca gaa gaa gct tca cag 288

Leu Glu Gly Gln Ile Ser Ala Arg Gln Gln Ala Glu Glu Ala Ser Gln

85 90 95

gag tca gaa aac gaa ctc aag gaa atg ata gaa acc ctt gct cgg aag 336

Glu Ser Glu Asn Glu Leu Lys Glu Met Ile Glu Thr Leu Ala Arg Lys

100 105 110

ctg aat gag aaa tcc aaa gag caa atg gaa ctt cac cac cag aat ctg 384

Leu Asn Glu Lys Ser Lys Glu Gln Met Glu Leu His His Gln Asn Leu

115 120 125

aat ctc caa gaa aca ctg aag aga gta gca aat tgt tca gct cct tgt 432

Asn Leu Gln Glu Thr Leu Lys Arg Val Ala Asn Cys Ser Ala Pro Cys

130 135 140

ccg caa gac tgg atc tgg cat gga gaa aac tgt tac cta ttt tcc tcg 480

Pro Gln Asp Trp Ile Trp His Gly Glu Asn Cys Tyr Leu Phe Ser Ser

145 150 155 160

ggc tca ttt aac tgg gaa aag agc caa gag aag tgc ttg tct ttg gat 528

Gly Ser Phe Asn Trp Glu Lys Ser Gln Glu Lys Cys Leu Ser Leu Asp

165 170 175

gcc aag ttg ctg aaa att aat agc aca gct gat ctg gac ttc atc cag 576

Ala Lys Leu Leu Lys Ile Asn Ser Thr Ala Asp Leu Asp Phe Ile Gln

180 185 190

caa gca att tcc tat tcc agt ttt cca ttc tgg atg ggg ctg tct cgg 624

Gln Ala Ile Ser Tyr Ser Ser Phe Pro Phe Trp Met Gly Leu Ser Arg

195 200 205

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Arg Asn Pro Ser Tyr Pro Trp Leu Trp Glu Asp Gly Ser Pro Leu Met

210 215 220

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225 230 235 240

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Gly Thr Cys Ala Tyr Ile Gln Arg Gly Ala Val Tyr Ala Glu Asn Cys

245 250 255

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Ile Leu Ala Ala Phe Ser Ile Cys Gln Lys Lys Ala Asn Leu Arg Ala

260 265 270

cag 819

Gln

<210>8

<211>273

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>8

Met Thr Phe Asp Asp Leu Lys Ile Gln Thr Val Lys Asp Gln Pro Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ser Asn Gly Lys Lys Ala Lys Gly Leu Gln Phe Leu Tyr Ser

20 25 30

Pro Trp Trp Cys Leu Ala Ala Ala Thr Leu Gly Val Leu Cys Leu Gly

35 40 45

Leu Val Val Thr Ile Met Val Leu Gly Met Gln Leu Ser Gln Val Ser

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Glu Ser Glu Asn Glu Leu Lys Glu Met Ile Glu Thr Leu Ala Arg Lys

100 105 110

Leu Asn Glu Lys Ser Lys Glu Gln Met Glu Leu His His Gln Asn Leu

115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

Gly Ser Phe Asn Trp Glu Lys Ser Gln Glu Lys Cys Leu Ser Leu Asp

165 170 175

Ala Lys Leu Leu Lys Ile Asn Ser Thr Ala Asp Leu Asp Phe Ile Gln

180 185 190

Gln Ala Ile Ser Tyr Ser Ser Phe Pro Phe Trp Met Gly Leu Ser Arg

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Gly Thr Cys Ala Tyr Ile Gln Arg Gly Ala Val Tyr Ala Glu Asn Cys

245 250 255

Ile Leu Ala Ala Phe Ser Ile Cys Gln Lys Lys Ala Asn Leu Arg Ala

260 265 270

Gln

<210>9

<211>1722

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1722)

<400>9

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Met Leu Arg Leu Pro Thr Val Phe Arg Gln Met Arg Pro Val Ser Arg

1 5 10 15

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Val Leu Ala Pro His Leu Thr Arg Ala Tyr Ala Lys Asp Val Lys Phe

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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Leu Val Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala Gly Asp Gly

100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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Met Leu Ala Val Asp Ala Val Ile Ala Glu Leu Lys Lys Gln Ser Lys

145 150 155 160

cct gtg acc acc cct gaa gaa att gca cag gtt gct acg att tct gca 528

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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Asp Ala Tyr Val Leu Leu Ser Glu Lys Lys Ile Ser Ser Ile Gln Ser

245 250 255

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Ile Val Pro Ala Leu Glu Ile Ala Asn Ala His Arg Lys Pro Leu Val

260 265 270

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Ile Ile Ala Glu Asp Val Asp Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Leu

275 280 285

aat agg cta aag gtt ggt ctt cag gtt gtg gca gtc aag gct cca ggg 912

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

gtg gct gtg ctg aag gtt ggt ggg aca agt gat gtt gaa gtg aat gaa 1248

Val Ala Val Leu Lys Val Gly Gly Thr Ser Asp Val Glu Val Asn Glu

405 410 415

aag aaa gac aga gtt aca gat gcc ctt aat gct aca aga gct gct gtt 1296

Lys Lys Asp Arg Val Thr Asp Ala Leu Asn Ala Thr Arg Ala Ala Val

420 425 430

gaa gaa ggc att gtt ttg gga ggg ggt tgt gcc ctc ctt cga tgc att 1344

Glu Glu Gly Ile Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile

435 440 445

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450 455 460

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Ile Glu Ile Ile Lys Arg Thr Leu Lys Ile Pro Ala Met Thr Ile Ala

465 470 475 480

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485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

tta ttg gat gct gct ggt gtg gcc tct ctg tta act aca gca gaa gtt 1632

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530 535 540

gta gtc aca gaa att cct aaa gaa gag aag gac cct gga atg ggt gca 1680

Val Val Thr Glu Ile Pro Lys Glu Glu Lys Asp Pro Gly Met Gly Ala

545 550 555 560

atg ggt gga atg gga ggt ggt atg gga ggt ggc atg ttc taa 1722

Met Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Phe

565 570

<210>10

<211>573

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>10

Met Leu Arg Leu Pro Thr Val Phe Arg Gln Met Arg Pro Val Ser Arg

1 5 10 15

Val Leu Ala Pro His Leu Thr Arg Ala Tyr Ala Lys Asp Val Lys Phe

20 25 30

Gly Ala Asp Ala ArgAla Leu Met Leu Gln Gly Val Asp Leu Leu Ala

35 40 45

Asp Ala Val Ala Val Thr Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile

50 55 60

Glu Gln Ser Trp Gly Ser Pro Lys Val Thr Lys Asp Gly Val Thr Val

65 70 75 80

Ala Lys Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys

85 90 95

Leu Val Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala Gly Asp Gly

100 105 110

Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Arg Ser Ile Ala Lys Glu Gly Phe

115 120 125

Glu Lys Ile Ser Lys Gly Ala Asn Pro Val Glu Ile Arg Arg Gly Val

130 135 140

Met Leu Ala Val Asp Ala Val Ile Ala Glu Leu Lys Lys Gln Ser Lys

145 150 155 160

Pro Val Thr Thr Pro Glu Glu Ile Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala

165 170 175

Asn Gly Asp Lys Glu Ile Gly Asn Ile Ile Ser Asp Ala Met Lys Lys

180 185 190

Val Gly Arg Lys Gly Val Ile Thr Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu Asn

195 200 205

Claims

1.一种融合蛋白，其包含：

(A)含热休克蛋白Hsp60的C末端序列的肽段；

(B)其它活性肽段；

(C)任选的，位于(A)和(B)之间的连接肽。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述(A)是选自下组的肽段：

(i)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；

(ii)全长Hsp60；

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述(A)是由选自下组的核苷酸序列编码的：

(b)与(a)中序列同源的序列；或

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述(B)是具有选自下组的一种或多种活性的肽段：抗原递呈、抗肿瘤、免疫调节、抗感染、促进细胞成熟、和促进细胞因子分泌。

5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述(B)选自：肿瘤抗原(优选Mucin I或NY-ESO-1)、微生物抗原(优选HBsAg、HPV抗原E6、或HPV抗原E7)、或它们的活性片段。

6.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白。

7.一种复合物，其包含：

(I)含热休克蛋白Hsp60的C末端序列的多肽或蛋白质；和

(II)与热休克蛋白Hsp60的C末端结合的LOX-1。

在一个优选例中，所述(I)是选自下组的多肽或蛋白质：

(i)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示的多肽；

(ii)全长Hsp60；

8.如权利要求7所述的复合物，其特征在于，所述复合物还连接或融合有其它活性蛋白或多肽。

9.一种组合物，所述组合物包含：

(A)有效量的权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白、权利要求6所述的分离的核酸分子和/或权利要求7-8中任一项所述的复合物；和

(B)药学上、免疫学上或保健品学上可接受的载体。

10.权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白、权利要求6所述的分离的核酸、权利要求7-8中任一项所述的复合物、含Hsp60的C末端序列的多肽或其编码序列、或全长Hsp60或其编码序列的用途，其用于制备调节免疫、抗感染、抗肿瘤、促进细胞成熟和/或促进细胞因子分泌的组合物。