CN101939334B - C型肝炎病毒抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明系关于与C型肝炎病毒E2蛋白结合之人源化抗体及其片段，及其使用方法。

Description

C型肝炎病毒抗体
相关申请的交叉参考
本申请案主张2007年12月17日申请之美国临时申请案61/006,066之优先权，该申请案系以全文引用的方式并入本文中。
发明领域
本发明系关于保持亲本鼠单克隆抗体之对HCV感染的广谱抑制作用的治疗性人源化抗体及其片段，及其使用方法。
背景技术
HCV为属于黄病毒家族之正链RNA病毒。其为非A非B病毒性肝炎之主要原因。HCV已感染约200,000,000人且目前之估算表明每年新感染多达3,000,000个体。约80％彼等感染者未能清除病毒；接着发生慢性感染，此通常导致严重慢性肝病、硬化及肝细胞癌。慢性感染的当前治疗效率低且急迫需要开发预防性及治疗性疫苗。
由于RNA依赖性RNA聚合酶之易出错特性及活体内高复制速率，因此HCV展示高度遗传可变性。HCV可分为6种独特遗传基因型且进一步细分为至少70种亚型，其核苷酸水平分别相异约30％及15％。疫苗研发之主要挑战将为识别在多数病毒基因型及亚型中保守之保护性表位。此问题因包膜蛋白(中和反应之天然标靶)为两种最可变蛋白质之事实而变得复杂。
包膜蛋白E1及E2负责细胞结合及进入。其为具有N末端胞外域及C末端疏水性膜锚着点的N连接之糖基化跨膜蛋白。活体外表达实验已展示E1及E2蛋白形成提议为病毒表面之功能错合物的非共价杂二聚体。由于缺乏有效培养系统，因此病毒进入之确切机制未知。尽管如此，仍有增长之证据表明进入经分离原代肝细胞及细胞系需要与细胞表面受体CD81及B类1型清道夫受体(SR-B1)之相互作用，尽管单独之此等受体不足以允许病毒进入。
当前证据表明细胞介导之免疫在急性感染中病毒复制之清除及控制中至关重要。然而，代用感染模型(诸如，动物感染及细胞及受体结合检定)已强调抗体在急性及慢性感染中之潜在作用。不令人吃惊地，中和抗体辨识线性及构形表位两者。多数表明广泛中和能力之抗体系针对E2内之构形表位。辨识保守构形表位之抗体的诱导与疫苗设计关系极大，但此可能证实难以实现，因为可变区看似为免疫显性的。一种此类免疫显性线性表位位于E2之第一高变区(HVR1)内。已提议使用保守HVR1模拟表位克服受限特异性之问题，但仍未知此方法是否将成功。
HVR1之直接下游区域含有多个表位。一个包括残基412-423且由单克隆抗体AP33定义之表位抑制CD81与一系列表达形式之E2(包括可溶性E2、E1E2及病毒样颗粒)之间的相互作用。参见Owsianka A.等人，J Gen Virol82：1877-83(2001)。
WO 2006/100449教示命名为AP33之单克隆抗体可结合且中和HCV之6种已知基因型1-6中之每一者。因此，推断AP33靶向之表位与HCV之所有基因型1-6交叉反应，表明其为抗HCV配位体之标靶且为产生抗HCV抗体之免疫原。
AP33为小鼠抗体，且因此若治疗学上用于多次投与，则可能在人类患者体内产生人类抗小鼠抗原性反应(HAMA)。因此需要与AP33共享交叉反应性但在人类个体体内具有降低之抗原性的抗体。
发明内容
本发明系关于改良之治疗性人源化抗体，其保留对HCV感染之广泛范围的抑制作用。已展示技术上未解决AP33之人源化，且人源化AP33之产生已导致以下研究。
在AP33单克隆抗体之人源化期间，本发明者遭遇与人源化可变轻链域之不良表达水平有关的问题。不存在小鼠轻链的人类直系同源物。L1环不可与人类κ链匹配且此人类κ链通常为人源化过程之关键组份。尽管已对可变轻链域作出若干修饰(诸如移除潜在剪接位点突变及交换前导序列)，但此等修饰均不会将表达水平有效恢复至高于背景，尽管先前已报导该等修饰有效改良表达水平。令人惊奇地，本发明者最终识别出可变轻链域(在本文中命名为RK2b)，其不仅表达良好且具有良好轻链接合活性。
本发明者亦已发现人源化可变重链域之最佳活性需要位置47处之W的保留。此令人惊奇，因为在小鼠(嵌合)抗体中，位置47处之氨基酸为W(人类残基)或Y(小鼠残基)看似不重要。在人源化可变重链域中，位置47处之氨基酸对于最佳活性而言应为W。正相反，所有其它重要框架残基(亦即，微调残基(vernier residue)及规范残基(canonical residue))对于最佳活性而言需要突变为小鼠供体残基。
本发明者此外惊奇地发现本文所述之人源化抗体在抑制HCV感染时至少与AP33一样有效。一般而言，当抗体人源化时，由于以人类框架置换形成围绕CDR之环境的鼠框架，因此预期活性会降低。然而，在本发明中，置换鼠框架已导致活性增加。有利地，本发明之抗体不仅具有与人源化有关之优势(例如，使其在人类个体体内具有较低免疫原性)，而且亦保留广泛范围之针对HCV种的中和交叉反应性。
因此在第一方面中，提供人源化AP33抗体之可变轻链域，其包含或由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20中之任一者所述的氨基酸序列组成。在一些实施例中，人源化AP33抗体之可变轻链域与C型肝炎病毒E2蛋白结合。
在第二方面中，提供人源化AP33抗体之可变重链域，其包含或由SEQID No.3中所述之氨基酸组成。SEQ ID No.3表示移植到人类框架上之鼠CDR。有利地，人类框架藉由在其位置30、48、67、71、78及94中之一或多者处回复突变来修饰，从而匹配小鼠染色体组中之等效位置。
合适地，氨基酸突变为取代，例如S30T、I48M、V67I、V71R、F78Y及R94L。在上文中，其次表示小鼠残基且首先表示人类残基；因此，在人源化程序中，残基30在初始AP33框架中为T，在所采用之人类框架中为S，且在回复突变、人源化抗体框架中为T。
在一些实施例中，可变重链域包含或由SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18中之任一者所述之氨基酸序列组成。在一些实施例中，人源化AP33抗体之可变重链域与C型肝炎病毒E2蛋白结合。
在第三方面中，提供包含本发明第一方面所述之可变轻链域的人源化抗体或人源化抗体片段。在一些实施例中，包含可变轻链域之人源化抗体或人源化抗体片段与C型肝炎病毒E2蛋白结合。在一些实施例中，人源化抗体片段为抗原结合片段。
在第四方面中，提供包含本发明第二方面之可变重链域的人源化抗体或人源化抗体片段。在一些实施例中，包含可变重链域之人源化抗体或人源化抗体片段与C型肝炎病毒E2蛋白结合。在一些实施例中，人源化抗体片段为抗原结合片段。
在第五方面中，提供包含轻链及重链之人源化抗体或人源化抗体片段，其中轻链可变区及重链可变区系如上文之第一及第二方面中所定义。在一些实施例中，包含轻链可变区及重链可变区之人源化抗体或人源化抗体片段与C型肝炎病毒E2蛋白结合。在一些实施例中，其人源化抗体片段系选自由Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、scFv、Fv及双功能抗体组成之群。在一些实施例中，人源化抗体片段为抗原结合片段。
在第六方面中，提供编码可变轻链域之核酸序列。
合适地，编码可变轻链域之核酸序列包含或由SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40中之任一者所述的序列组成。
在第七方面中，提供编码可变重链域之核酸序列。
合适地，可变重链域包含或由SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38中之任一者所述之序列组成。
在第八方面中，提供编码本文所述之人源化抗体或人源化抗体片段之核酸或氨基序列。
在第九方面中，提供与本文所述之核酸序列互补的核酸序列。
在第十方面中，提供能与本文所述之核苷酸序列杂交的核酸序列。
在第十一方面中，提供包含本文所述之核酸序列的构建体或载体。在一些实施例中，载体进一步包含与编码可变重链区及/或可变轻链区之核酸操作性连接之表达控制序列。合适地，该载体为表达载体。在一些实施例中，提供含有第十一方面之构建体或载体的重组细胞。在一些实施例中，细胞为真核细胞。在一些实施例中，真核细胞为CHO细胞。
在第十二方面中，提供编码本文所述之可变重链的氨基序列。
在第十三方面中，提供编码本文所述之人源化抗体或人源化抗体片段之氨基序列。
在第十四方面中，提供包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20中之任一者所述序列的氨基酸序列。
在第十五方面中，提供制备人源化抗体之方法，其包含以下步骤：(a)提供由以下任一者转化之宿主细胞：(i)编码前述方面之可变轻链域之第一表达载体及编码前述方面之可变重链域之第二表达载体；或(ii)编码前述方面之可变轻链域及前述方面之可变重链域两者的单个表达载体；(b)在各链得以表达之条件下培养该宿主细胞；及(c)视情况分离藉由装配所表达之链形成的人源化抗体。
在一些实施例中，提供制造人源化抗体，或其抗原结合片段之方法，该方法包含生长含有第八方面之核酸的重组细胞使得细胞表达所编码之可变重链区及/或可变轻链区；及回收所表达之人源化抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，该方法进一步包含分离及/或纯化所回收之人源化抗体或其抗原结合片段。
在第十六方面中，提供由此方法获得或可由此方法获得之人源化抗体。
在第十七方面中，提供医药组合物，其包含医药学上可接受之载剂或稀释剂，及作为活性成份的本文所述之人源化抗体或人源化抗体片段。
在第十八方面中，提供用于治疗及/或预防C型肝炎病毒感染之方法，其包含使用本文所述之人源化抗体或人源化抗体片段或医药组合物。在一些实施例中，C型肝炎病毒感染为急性C型肝炎病毒感染。在一些实施例中，C型肝炎病毒感染为慢性C型肝炎病毒感染。在一些实施例中，C型肝炎病毒感染之治疗包含降低病毒负荷及/或病毒滴度。在一些实施例中，该方法进一步包含投与第二治疗剂。
合适地，用于治疗及/或预防C型肝炎病毒感染之方法包含向有需要之个体投与有效量之人源化抗体或其人源化抗体或医药组合物。
在第十九方面中，提供人源化抗体或其片段或医药组合物用于治疗及/或预防个体之C型肝炎病毒感染。在一些实施例中，C型肝炎病毒感染为急性C型肝炎病毒感染。在一些实施例中，C型肝炎病毒感染为慢性C型肝炎病毒感染。在一些实施例中，C型肝炎病毒感染之治疗中之用途包含降低病毒负荷及/或病毒滴度。
在第二十方面中，提供人源化抗体或其片段或医药组合物之用途，其系用于制造用以治疗及/或预防个体之C型肝炎病毒感染的组合物。在一些实施例中，C型肝炎病毒感染为急性C型肝炎病毒感染。在一些实施例中，C型肝炎病毒感染为慢性C型肝炎病毒感染。在一些实施例中，C型肝炎病毒感染之治疗包含降低病毒负荷及/或病毒滴度。在一些实施例中，该用途进一步包含投与第二治疗剂。
在第二十一方面中，提供用于识别改良或增强人源化抗体或其片段针对C型肝炎病毒之中和活性功效之药剂的检定方法，该方法包含以下步骤：(a)提供人源化抗体或其片段；(b)使该人源化抗体或其片段与待测试之药剂接触；及(c)判定该药剂是否改良或增强人源化抗体或其片段中和C型肝炎病毒传染性之功效。
在一些实施例中，本文提供用于识别改良或增强人源化抗体或其抗原结合片段针对C型肝炎病毒之中和活性功效之药剂的检定方法，该方法包含以下步骤：(a)使该人源化抗体或其抗原结合片段与待测试之药剂接触；及(b)判定该药剂是否改良或增强人源化抗体或其抗原结合片段中和C型肝炎病毒传染性之功效。在一些实施例中，将该改良或增强人源化抗体或其抗原结合片段中和C型肝炎病毒传染性之药剂与合适对照比较。在一些实施例中，合适对照为不存在药剂之状况下的人源化抗体或其片段。
在第二十二方面中，提供由此方法获得或可由此方法获得之药剂。
在第二十三方面中，亦提供用于判定样本中C型肝炎病毒之存在的方法，其包含使用本文所述之人源化抗体或人源化抗体片段。
合适地，该方法包含以下步骤：使来自个体之样本与人源化抗体或人源化抗体片段接触。在一些实施例中，该方法进一步包含与合适对照比较。在一些实施例中，合适对照为不辨识HCV之抗体。在一些实施例中，合适对照为已知含有HCV之样本。
附图说明
图1展示人源化及嵌合抗体与AP33模拟表位H6之结合。为了比较嵌合抗体与人源化重链及轻链之相对结合，将COS7细胞以一系列嵌合及人源化重链及轻链构建体转染且将上清液用于比较与模拟表位H6之结合。模拟表位肽H6与嵌合(Vh/Vl)及人源化抗体RHb-h/RK2bc及RHA/RK2bc或人源化与嵌合抗体RHA/Vl、RHb-h/Vl或Vh/RK2bc之混合物的结合系藉由ELISA量测。
图2展示AP33RHI与肽H6之结合。为了测定重链界面残基Q39是否造成与肽H6的次最佳结合，藉由ELISA量测人源化重链RHI(Q39K)之结合。将COS7细胞以一系列嵌合及RHI重链及RK2b轻链构建体转染，且将上清液用于比较与模拟表位H6之结合。模拟表位肽H6与嵌合(Vh/Vl)及人源化抗体RHb-h、RHI/RK2bc及人源化与嵌合抗体RHI/Vl或RHb-h/Vl之混合物的结合系藉由ELISA量测。
图3A-B展示嵌合及人源化抗体与E2肽之结合。为了比较嵌合抗体与人源化抗体RHb-h/Vl之相对结合，将COS7细胞以一系列嵌合及人源化抗体构建体转染。使抗体上清液经受ELISA且用于比较与表5中所述之肽的结合。
图4展示RK2变体与H6肽之结合。人源化轻链RK2起作用所必需之最少突变数系藉由比较RHb-g与轻链RK2、RK2b及RK2c之结合来测定。测试中包括嵌合抗体Vh/Vl作为与先前实验之比较例。将COS7细胞以一系列嵌合及人源化抗体构建体转染。抗体上清液与E2肽(表5)之结合系藉由ELISA量测。
图5A-I展示E2肽与人源化重链VC变体之结合。人源化重链RHb-h起作用所必需之最少突变数系藉由比较RHb-h与回复突变重链RH-B、RH-C、RH-D、RH-E、RH-F、RH-G及RH-H之结合来测定。测试中包括嵌合抗体Vh/Vl作为与先前实验之比较例且将人源化轻链RK2bc用于与所有人源化重链配对。将COS7细胞以一系列嵌合及人源化抗体构建体转染。抗体上清液与E2肽(表5)之结合系藉由ELISA量测。
图6A-E展示使用标准化数据的与E2肽结合之人源化抗体VC突变体的比较。藉由将各数据组标准化为H6结合之百分比且将各基因型群聚在一起对来自图5之资料进一步分析。
图7A-E展示人源化AP33抗体抑制HCVpp感染。由源自不同基因型之HCVpp的嵌合AP33或人源化抗体的中和。在37℃下将HCVpp以不同浓度之经纯化嵌合AP33或人源化抗体预培育1h，随后感染Huh-7细胞。抗体之中和活性表示为感染滴度之抑制百分比。
图8A-B展示源自基因型5之HCVpp之嵌合AP33或人源化抗体的中和。在37℃下将HCVpp以不同浓度之经纯化嵌合AP33或人源化抗体预培育1h，随后感染Huh-7细胞。抗体之中和活性表示为感染滴度之抑制百分比。展示来自两个单独实验之结果。
图9展示AP33之分子模型，其展示AP33之CDR的俯视图。透明Connolly表面以褐色展示亲脂性区域。微调及规范残基以锥形棒描绘。该视图系自上方向下注视CDR。环H1、H2、L3及L1有助于形成亲脂性的谷形结构。
图10展示AP33的分子模型，其展示AP33之CDR的仰视图。透明Connolly表面以褐色展示亲脂性区域。微调及规范残基以锥形棒描绘。
图11A-E展示AP33突变体Y47F及Y47W与E2肽之结合。AP33之嵌合重链之突变残基Y47的影响。使用表5中所示之E2肽的结合来比较野生型重链AP33与突变体Y47F及Y47W。将COS7细胞以一系列嵌合及突变抗体构建体转染。抗体上清液与E2肽之结合系藉由ELISA量测。藉由将各数据组标准化为H6结合之百分比且将各基因型群聚在一起来处理数据。
图12展示藉由AP33突变体Y47F及Y47W抑制HCVpp感染。由源自1a基因型之HCVpp的嵌合AP33或人源化抗体的中和。在37℃下将HCVpp以不同浓度之经纯化嵌合AP33或人源化抗体预培育1h，随后感染Huh-7细胞。抗体之中和活性表示为感染滴度之抑制百分比。
图13(先前61/006,066中之表7)展示AP33H及L链中微调、规范及界面残基与供体序列之比较。″Vern/CDR″指示微调残基(v)及CDR(-＝＝＝-)。浅灰色亮区表示CDR。带白色文字之黑色亮区表示VCI残基。带粗体字的深灰色亮区区分AP33及S67826、X61125、AB064133、AB064072及AY68527中的VCI残基差异。
图14(先前61/006,066中之表8)展示AP33VH与所选人类VH基因中VCI残基的比较。将20个具有最佳VCI计分及匹配CDR1及2尺寸之人类VH序列与AP33VH比较。″.″表示与AP33VH中一致的残基。使用白字之黑色亮区表示潜在供体框架不同之位点。VCI/FW计分表示与AP33VH一致的VCI或FW残基数。浅灰色亮区、使用黑体字之深灰色亮区及使用黑体字之非亮区分别表示非保守、保守及可接受之规范替代残基。
图15(先前61/006,066中之表9)展示AP33VH与所选人类VH蛋白序列之比较。此为如图14之20个人类VH序列的比较。灰色亮区表示Pro残基。使用黑体字之深灰色亮区表示Cys残基。
图16(先前61/006,066中之表10)展示4个最佳人类VH序列的ClustalW比对。使用白字之黑色亮区表示CDR，且灰色亮区及使用黑体字之深灰色亮区展示CDR外供体候选物之间的差异。
图17A-B(先前61/006,066中之表11)展示VH4-59前导子及S67826 FW1的AP33RHA前导子选择及SignalP结果[14]。
图18A-B(先前61/006,066中之表12)展示AP33RHA蛋白及DNA序列产生。图18A展示AP33RHA蛋白序列移植物，且图18B展示AP33RHA DNA序列移植物。使用黑体字之深灰色亮区表示CDR。
图19(先前61/006,066中之表14)展示AP33RHA之DNA及蛋白质序列。浅灰色框符展示移除隐蔽剪接位点的核苷酸变化。
图20(先前61/006,066中之表15)展示AP33 VK与种系人类VK基因、仅AP33VK之V基因区段及人类种系基因的比较。AP33VK与人类种系V基因之比较展示此CDR1长度不由任何人类VK基因表示。人类种系κ基因均不具有相同尺寸之CDR1环。CDR1环系以黑色亮区及白字表示。亮区及/或黑体残基强调具有短CDR1环之V基因的保守脯氨酸与具有较长环之彼等之间的差异。
图21(先前61/006,066中之表16)展示具有相同CDR1尺寸之人类VK的VCI计分。数据库中发现的仅6个具有匹配规范环长度之″人类″VK序列为噬菌体或人源化抗体。″.″表示与AP33VK中一致的残基。VCI/FW计分表示与AP33VK一致的VCI或FW残基数。AP33K中使用白字之黑色亮区表示非保守残基。
图22(先前61/006,066中之表17)展示具有高VCI计分之人类VK(包括不同CDR1长度)。将具有最佳VCI计分及匹配CDR2尺寸之20个人类VK序列与AP33VK比较。″.″表示与AP33VK中一致的残基。VCI/FW计分表示与AP33VK一致的VCI或FW残基数。AP-33K中使用白字之黑色亮区表示潜在供体框架中不同之位点。
图23A-B。图23A(先前61/006,066中之表18A)展示具有非匹配CDR1尺寸的AP33VK及人类VK序列。Cys、Pro及CDR分别由使用黑体字之深灰色亮区、使用白字之黑色亮区及浅灰色亮区表示。图23B(先前61/006,066中之表18B)展示具有非匹配CDR1尺寸的AP33VK及人类序列之ClustalW比对。残基与AP33之一致性由点及灰色亮区CDR及其长度差异表示。使用白字之黑色亮区表示VCI残基中之差异，使用黑体字之灰色为X61125或AY685279中之非保守变化。X61125之FW4 KLEIN极异常且可能为定序人工产物且可为KLEIK。AP33中之KLEIK为常见基元。
图24(先前61/006,066中之表19)展示具有较长CDR1的AP33 VK及非-VK4人类VK序列之VCI。将具有最佳VCI计分、匹配CDR2尺寸及较长CDR1之20个人类VK非VK4序列与AP33VK比较。VCI/FW计分表示与AP33VK一致的VCI或FW残基数。
图25(先前61/006,066中之表20)展示具有较长CDR1的AP33 VK及人类VK非-VK4序列。Cys、Pro及CDR分别由使用黑体字之深灰色亮区、使用白字之黑色亮区及浅灰色亮区表示。
图26(先前61/006,066中之表21)展示具有较大CDR1的AP33 VK及非VK4人类序列之ClustalW比对。与AP33VK一致之残基由点表示。前7个序列中，保守变化为中等灰色且非保守变化为深灰色。CDR为浅灰色。
图27(先前61/006,066中之表22)展示使用人类框架X61125及AY685279的AP33RKA设计。预测之具有VKIV-B3前导子及X61125-ATGGACATGAGGGTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCAGCTCTGGCTCTCcGGcGCCAGATGT的信号蛋白酶裂解结果[20]。
图28(先前61/006,066中之表23)展示预测之具有VKI-012/02前导子及AY685279-ATGGACATGAGGGTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCAGCTCTGGCTCTCcGGcGCCAGATGT的信号蛋白酶裂解[21]结果。
图29(先前61/006,066中之表24)展示预测之具有VKII-A17前导子及AB064133 FW1的信号蛋白酶裂解结果[22]。
图30A及B(先前61/006,066中之表25)展示AP33RKA序列的产生。图30A展示AP33RKA蛋白序列移植物。图30B展示具有VKIV B3前导子的AP33RKADNA序列移植物。CDR用亮区表示。
图31A-B(先前61/006,066中之表26)展示AP33RK2序列的产生。图31A展示AP33RK2蛋白序列移植物。图31B展示AP33RK2 DNA序列产生。CDR用亮区表示。
图32A-B(先前61/006,066中之表27)展示AP33RK3序列的产生。图32A展示AP33RK3蛋白序列移植物。图32B展示AP33RK3 DNA序列产生。CDR用亮区表示。
图33(先前61/006,066中之表28)展示AP33RK4DNA序列产生。CDR用亮区表示。
图34A-D(先前61/006,066中之表29)展示具有前导子之AP33RKA、AP33RK2、AP33RK3及AP33RK4DNA序列。CDR用亮区表示。
图35(先前61/006,066中之表30)展示具有前导子之AP33RKA之DNA及蛋白质序列。浅灰色框符代表移除隐蔽剪接位点或非所要BamHI位点之改变核苷酸。
图36(先前61/006,066中之表31)展示具有前导子之AP33RK2之DNA及蛋白质序列。浅灰色框符代表移除隐蔽剪接位点或非所要BamHI位点之改变核苷酸。
图37(先前61/006,066中之表32)展示AP33RHA构建体之DNA及蛋白质序列。NB AP33RLB使两个VCI回复突变。未由此产生剪接位点。
图38(先前61/006,066中之表33)展示AP33RK4构建体之DNA及蛋白质序列。
图39A-C。图39A展示如感染百分比量测的Con1 HCVpp之AP33及RH-C/RK2b中和。图39B展示如感染百分比量测的J6 HCVpp之AP33及RH-C/RK2b中和。图39C展示使用Con1及J6HCVpp之AP33与RH-C/RK2b之EC50(μg/ml)。
图40A-C。图40A展示如感染百分比量测的Con1 HCVcc之AP33及RH-C/RK2b中和。图40B展示如感染百分比量测的J6 HCVcc之AP33及RH-C/RK2b中和。图40C展示使用Con1及J6HCVcc之AP33与RH-C/RK2b之EC50(μg/ml)。
图41A-B。图41A展示在RH-C/RK2b及10％正常人类血清(NHS)或来自慢性HCV感染患者之血清(CHCHS-1及CHCHC-2)存在下使用Con1 HCVpp的中和检定之结果。图41B展示藉由使用来自GT1b(Con1)E1E2转染之293T细胞之裂解物的ELISA检定如吸光率(A450)所量测之NHS、CHCHS-1、CHCHS-2及RH-C/RK2b与Con1 HCV E1E2反应性抗体的结合水平。
图42A-G展示表8之人源化抗体可变链的氨基酸及核苷酸序列。
实施方式
I.抗体
抗体为天然存在之具有可变结构之免疫球蛋白分子，该等可变结构均基于免疫球蛋白折迭。举例而言，IgG抗体(诸如，AP33)具有经二硫化物键结形成功能抗体之两个″重″链及两个″轻″链。各重链及轻链本身包含″恒定″(C)及″可变″(V)区。V区决定抗体之抗原结合特异性，而C区在与免疫效应子的非抗原特异性相互作用中提供结构支持及功能。抗体或抗体之抗原结合片段的抗原结合特异性为抗体或其片段与特定抗原特异性结合之能力。
抗体之抗原结合特异性由V区的结构特征决定。可变性并非均匀分布在可变区之110个氨基酸跨度上。换言之，V区由具有15-30个氨基酸之称为框架区(FR)之相对不变伸展组成，该等氨基酸由各自9-12个氨基酸长的极可变之较短区域(称为″高变区″)隔开。天然重链及轻链之可变区各自包含由三个高变区连接之四个FR(主要采用β折叠构型)，该等高变区形成环连接且在一些状况下形成β折叠结构的部分。各链中之高变区由FR紧密地固持在一起，且与来自另一链之高变区一起有助于形成抗体之抗原结合位点(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。恒定区并不直接与抗体与抗原之结合有关，但展现各种效应功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
在一些实施例中，高变区为负责抗原结合之抗体氨基酸残基。高变区可包含来自″互补决定区″或″CDR″之氨基酸残基(例如，VL中约残基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)，及VH中约残基31-35B(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版。Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)))及/或来自″高变环″之彼等残基(例如VL中之残基26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)及VH中之26-32(H1)、52A-55(H2)及96-101(H3)(Chothia及Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。
各V区通常包含三个互补决定区(″CDR″，其各自含有″高变环″)及四个框架区。抗体结合位点(以实质亲和力与特定所要抗原结合所需之最小结构单元)因此通常将包括三个CDR，及至少三个，优选四个散布于其间从而以适当构型固持及呈现CDR之框架区。典型四链抗体(诸如，AP33)具有VH及VL域合作界定之抗原结合位点。某些抗体(诸如，骆驼及鲨鱼抗体)缺乏轻链且依赖于仅由重链形成之结合位点。可制备经单个结构域基因工程设计之免疫球蛋白，其中结合位点于不存在VH与VL之间的合作之状况下系仅由重链或轻链形成。
在本说明书及申请专利范围全文中，除非另外说明，否则免疫球蛋白重链之恒定区中的残基编号为如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版。Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1991)中之EU指数，该文献之内容以引用的方式明确并入本文中。″如Kabat中之EU指数″系指人类IgG1 EU抗体之残基编号。除非明确说明连续或其它编号系统，否则V区中之残基系根据Kabat编号进行编号。
本文所述之抗体或抗体片段可经分离或纯化至任何程度。如本文所用，″分离″意谓抗体或抗体片段已自其天然环境移除。在一些实施例中，其天然环境之污染组份为将干扰抗体之诊断或治疗用途之材料，且可包括酶、激素及其它蛋白或非蛋白溶质。在一些实施例中，抗体(1)如藉由Lowry方法所测定，经纯化为大于95重量％之抗体，且最优选大于99重量％；(2)纯化至足以藉由使用旋杯式序列测定仪获得至少15个残基之N末端或内部氨基酸序列的程度；或(3)使用考马斯蓝(Coomassie blue)或优选银染剂在还原条件或非还原条件下纯化至SDS-PAGE之均质性。由于抗体天然环境之至少一种组份将不存在，因此经分离抗体包括原位处于重组细胞内之抗体。然而，通常经分离抗体将藉由至少一个纯化步骤制备。
″纯化″意谓抗体或抗体片段纯度已增加，使得抗体或抗体片段以比其天然环境中所存在及/或在实验室条件下初始合成及/或扩增时更纯之形式存在。纯度为相对术语且并非必需意谓绝对纯度。
抗体″效应功能″系指由抗体之Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)引起之彼等生物活性，且其随抗体同型而变化。抗体效应功能之实例包括：C1q结合及补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导之细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；及B细胞活化。
″抗体依赖性细胞介导之细胞毒性″或″ADCC″系指一种细胞毒性形式，其中与存在于某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性白血球及巨噬细胞)上之Fc受体(FcR)结合的分泌Ig使此等细胞毒性效应细胞能够与携带抗原之标靶细胞特异性结合且随后以细胞毒性杀伤标靶细胞。抗体″配备″细胞毒性细胞且完全为此杀伤所需。介导ADCC之原代细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血细胞上之表达概述于Ravetch及Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)之第464页上的表3中。为评定所关注之分子的ADCC活性，可进行活体外ADCC检定，诸如美国专利第5,500,362号或第5,821,337号或Presta美国专利第6,737,056号中所述之彼检定。适用于该等检定之效应细胞包括外周血液单核细胞(PBMC)及天然杀伤(NK)细胞。或者，或此外，所关注分子之ADCC活性(例如)可在动物模型(诸如Clynes等人PNAS(USA)95：652-656(1998)中所揭示之彼动物模型)中活体内评定。
″人类效应细胞″系表达一或多个FcR且执行效应功能之白血球。该等细胞优选至少表达FcγRIII且执行ADCC效应功能。介导ADCC之人类白血球之实例包括外周血液单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞及嗜中性白血球，其中PBMC及NK细胞优选。效应细胞可自天然来源(例如血液)分离。
″Fc受体″或″FcR″描述与抗体之Fc区结合的受体。优选FcR为天然序列人类FcR。此外，优选之FcR为结合IgG抗体之FcR(γ受体)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子类之受体，包括此等受体之等位基因变体及其它剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(″活化受体″)及FcγRIIB(″抑制受体″)，其具有主要在其细胞质域中不同之类似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其细胞质域中含有免疫受体酪氨酸基活化基元(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质域中含有免疫受体酪氨酸基抑制基元(ITIM)(参见评论Daeron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR评论于Ravetch及Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中。本文之术语″FcR″涵盖包括彼等待将来识别之其它FcR。该术语亦包括新生儿受体FcRn，其负责将母本IgG传递至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))且调节免疫球蛋白之稳定。
WO 00/42072(Presta)描述具有经改良或经减弱之FcR结合力的抗体变体。彼专利公开案之内容以引用方式特定并入本文中。亦参见Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
在一实施例中，对于与FcRn之结合亲和力而言，抗体之EC50或视Kd(在pH 6.0下)≤100nM，更优选≤10nM。在一实施例中，对于增加之与FcγRIII(F158；亦即，低亲和力同型)的结合亲和力而言，EC50或视Kd≤10nM，且对于FcγRIII(VI 58；高亲和力)而言，EC50或视Kd≤3nM。量测与FcRn结合之方法已知(参见例如Ghetie 1997，Hinton 2004)且在下文中描述。可(例如)在表达人类FcRn之转基因小鼠或经转染人类细胞系中或已投与Fc变体多肽之灵长类动物体内检定与人类FcRn之活体内结合及人类FcRn高亲和力结合多肽之血清半衰期。在某些实施例中，本文所述之人源化抗体进一步包含IgG Fc中之氨基酸改变且展示增加之针对人类FcRn的结合亲和力，该结合亲和力优于具有野生型IgG Fc之抗体至少60倍、至少70倍，至少80倍，更优选至少100倍，优选至少125倍，甚至更优选至少150倍至约170倍。
″补体依赖性细胞毒性″或″CDC″系指在存在补体状况下标靶细胞之溶解。典型补体路径之活化系由补体系统之第一组份(C1q)与其同源抗原结合之抗体(适当子类)结合而起始。可进行CDC检定来评定补体活化，例如，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods，202：163(1996)所述。
具有改变之Fc区氨基酸序列及增加或降低之C1q结合能力之多肽变体描述于美国专利第6,194,551号及WO 99/51642中。彼等专利公开案之内容系以引用的方式特定并入本文中。亦参见Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
如本文所用，本文提及″约″值或参数包括(且描述)针对彼值或参数本身的变化。举例而言，关于″约X″之描述包括″X″之描述。
如本文及随附申请专利范围中所用，除非上下文明确另外规定，否则单数形式″一″、″或″及″该″包括复数对象。应理解本文所述之本发明之方面及变化包括″由方面及变化组成″及/或″基本上由方面及变化组成″。
人源化抗体
本发明提供基于AP33之人源化抗HCV抗体。一般而言，抗体将包含至少三个可辨识之CDR或高变环，及至少三个，优选四个可辨识框架区，且将保持与HCV E2蛋白结合之能力。抗体亦包含轻链恒定区及/或重链恒定区，优选包含两者。
术语″人源化抗体″系指包括至少一个人源化抗体链(亦即，至少一个人源化轻链或重链-诸如至少一个人源化可变轻链或可变重链)之抗体。
术语″人源化抗体链″(亦即，″人源化免疫球蛋白轻链″或″人源化免疫球蛋白重链″)系指具有可变区(包括(实质上)来自接受者人类抗体之可变框架区及实质上来自非人类供体抗体(例如，小鼠抗体)之互补决定区(CDR)(例如，至少一个CDR，优选两个CDR，更优选三个CDR))且视情况进一步包括人类起源之恒定区(例如，在轻链状况下至少一个恒定区或其部分，且在重链状况下优选三个恒定区)的抗体链(亦即，分别轻链或重链)。此外，接受者框架之一或多个残基可突变以匹配供体框架中存在之残基，从而增加结合亲和力。
术语″人源化可变区″(例如，″人源化轻链可变区″或″人源化重链可变区″)系指包括实质上来自人类抗体之可变框架区及实质上来自非人类抗体之互补决定区(CDR)的可变区。
非人类供体抗体为命名为AP33之单克隆抗体或由其产生。分泌AP33单克隆抗体之杂交瘤为在布达佩斯条约(Budapest Treaty)下保存于欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Culture)之个体(ECACC，CAMRPorton Down，Salisbury，Wiltshire.SP49JG；寄存日期2006年1月27日；寄存编号05122101)。
人源化抗体比鼠抗体或嵌合抗体免疫原性低。嵌合抗体为包括与人类恒定区连接之整个非人类抗体可变区的抗体。因此，在嵌合抗体中，可变区系来自非人类供体且恒定区为人类的。嵌合抗体及其制备方法描述于(例如)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6841-6855(1984)中。尽管嵌合抗体可能比小鼠单克隆抗体免疫原性低，但嵌合抗体之投与已与抗体之非人类部分的人类免疫反应(HAMA)相关。嵌合抗体亦可藉由将来自具有适当抗原结合特异性之小鼠抗体分子的基因与来自具有适当生物活性(诸如，活化人类补体且介导ADCC之能力)之人类抗体分子的基因剪接在一起来产生。一实例为以不同同型之Fc区置换Fc区。
人源化抗体包括CDR移植抗体，其为包括与人类″接受者″抗体之框架区连接的来自非人类″供体″抗体之CDR的抗体。一般而言，CDR移植抗体包括比嵌合抗体多的人类抗体序列，因为其包括来自人类接受者抗体而非来自非人类供体之可变区(框架)序列。因此，例如，本发明之CDR移植人源化抗体可包含一重链，该重链包含来自人类抗体框架区(例如，人类抗体之FR-1、FR-2或FR-3)之邻接氨基酸序列(例如，约5个或5个以上，10个或10个以上，或甚至15个或15个以上邻接氨基酸残基)或视情况整个人类抗体框架区的多数或全部。CDR移植抗体及其制备方法描述于Nature，321：522-525(1986)中。可用于制造人源化抗体之方法亦描述于(例如)US 5,721,367及6,180,377中。
在一些实施例中，人源化抗体为人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者高变区残基经具有所要特异性、亲和力及能力之非人类物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、家兔或非人类灵长类动物)高变区残基置换。在一些实施例中，人类免疫球蛋白之Fv框架区(FR)残基系经相应非人类残基置换。此外，人源化抗体可包含不出现于接受者抗体或供体抗体中之残基。进行此等修饰以进一步改进抗体效能(诸如，结合亲和力)。在一些实施例中，人源化抗体将包含实质上所有至少一个、及通常两个可变区，其中所有或实质上所有高变环对应于非人类免疫球蛋白之彼等高变环且所有或实质上所有FR区为人类免疫球蛋白序列之彼等FR区，尽管FR区可包括一或多个改良结合亲和力之氨基酸取代。在一些实施例中，FR中之此等氨基酸取代数在H链中不超过6，且在L链中不超过3。在一些实施例中，人源化抗体亦将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人类免疫球蛋白恒定区。更多细节参见Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332：323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
由于CDR环境之干扰，因此CDR移植抗体可能丢失结合亲和力。为了对此进行部分校正，CDR移植可补充有经设计以恢复抗原结合活性之框架区突变。例如参见EP 0239400。
人源化抗体可为″镶边抗体(veneered antibody)″，其为经设计置换某些经溶剂暴露之氨基酸残基从而降低其免疫原性或增强其功能之人源化抗体。镶边可包含识别非人类框架区中经溶剂暴露之残基且以来自人类框架区之相应表面残基置换其中至少一者。镶边可藉由任何合适基因工程设计技术完成。
人源化抗体可为异种抗体。异种抗体为连接在一起的两种或两种以上抗体或抗体结合片段(Fab)，各抗体或片段具有不同特异性。
抗体、人源化抗体、人类基因工程设计之抗体的细节及其制备方法可见于Antibody Engineering，Springer，New York，NY，2001中。抗体人源化之其它细节概述于(例如)Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)、US 5,530,101、US 5,585,089、US 5,693,761、US 5,693,762、WO90/07861及US 5,225,539中。
在一实施例中，提供人源化AP33抗体之可变轻链域，其包含SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20中之任一者所述的氨基酸序列。
在另一实施例中，提供人源化AP33抗体之可变重链域，其包含SEQ IDNo.3之位置30、48、67、71、78及94处的氨基酸突变。
氨基酸突变可藉由取代一或多个氨基酸残基获得。在某些状况下，可容忍缺失或插入。可使用诸如定点突变之标准技术进行突变。
合适地，氨基酸突变为取代。
在另一实施例中，可变重链域因此包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18中之任一者所述之氨基酸序列。
亦提供包含可变轻链域之人源化抗体或人源化抗体片段。
亦提供包含可变重链域之人源化抗体或人源化抗体片段。
亦提供包含轻链及重链之人源化抗体或人源化抗体片段，其中轻链可变区及重链可变区系如本文所定义。
在一些实施例中，人源化抗体或其片段包含选自由SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18组成之群的可变重链域及选自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20组成之群的可变轻链域。
在一些实施例中，可变重链域系选自由SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18组成之群且可变轻链域为SEQ IDNO：6。在一些实施例中，可变重链域系选自由SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18组成之群且可变轻链域为SEQ IDNO：7。在一些实施例中，可变重链域系选自由SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18组成之群且可变轻链域为SEQ IDNO：19。在一些实施例中，可变重链域为SEQ ID NO：13且可变轻链域为SEQID NO：19。在一些实施例中，可变重链域系选自由SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18组成之群且可变轻链域为SEQ ID NO：20。
在一些实施例中，本文所述之人源化抗体或其片段与HCV结合。在一些实施例中，人源化抗体或其片段能与HCV E2蛋白、可溶性HCV E2蛋白或HCV E1蛋白与HCV E2蛋白之杂二聚体结合。在一些实施例中，人源化抗体或其片段与HCV E2蛋白结合。在一些实施例中，HCV E2蛋白系来自选自由基因型1(例如，基因型1a及基因型1b)、基因型2(例如，基因型2a、基因型2b、基因型2c)、基因型3(例如，基因型3a)、基因型4、基因型5及基因型6组成之群的HCV基因型中之一或多者。在一些实施例中，人源化抗体或其片段抑制HCV E2蛋白与CD81的相互作用。在一些实施例中，人源化抗体或其片段防止及/或抑制HCV进入细胞。在一些实施例中，细胞为肝脏细胞，例如肝细胞。
在一些实施例中，人源化抗体或其片段与可溶性HCV E2蛋白以介于1-100nM之间的结合亲和力结合。在一些实施例中，结合亲和力系介于约1-10nM、10-50nM或50-100nM中之任一者。在一些实施例中，结合亲和力为约5nM或约50nM。在一些实施例中，人源化抗体或其片段与HCVE1/HCV E2杂二聚体以介于1-100nM之间的结合亲和力结合。在一些实施例中，结合亲和力系介于约1-10nM、10-50nM或50-100nM中之任一者。在一些实施例中，结合亲和力为约5nM或约50nM。在一些实施例中，抗体之结合亲和力可(例如)藉由Munson等人，Anal.Biochem.，107：220(1980)中所述之斯卡查德分析(Scatchard analysis)测定。
在一些实施例中，本文所述之人源化抗体或其片段抑制HCV感染。在一些实施例中，本文所述之人源化抗体或其片段抑制HCV伪颗粒(HCVpp)感染。合适地，本文所述之人源化抗体能抑制HCV伪颗粒感染，其中如HCVpp中和检定判断之该人源化抗体存在下之感染滴度的IC50为：基因型1(1a H7720)至少为约0.032；基因型1(1A20.8)至少为约1.6；基因型1(1B5.23)至少为约0.9；基因型2(2B1.1)至少为约3；基因型3a(F4/2-35)至少为约0.41；基因型4(4.21.16)至少为约0.41；基因型6(6.5.8)至少为约0.41；且基因型5(5.15.11)至少为约0.053。在一些实施例中，如本文所述之人源化抗体或其片段能抑制HCV伪颗粒感染，其中如HCVpp中和检定判断该人源化抗体存在下之感染滴度之IC50对于基因型1(1a H7720)而言为小于约0.41、小于约0.137或约0.32中之任一者、基因型1(1A20.8)为约1.6、基因型1(1B5.23)为约0.9、基因型2(2B1.1)为约3、基因型2(2a JFH1)为约0.64、基因型2(2A2.4)为约0.51、基因型3(3a F4/2-35)为小于约0.41、基因型4(4.21.16)为小于约0.41、基因型5(5.15.11)为约0.053，或基因型6(6.5.8)为小于约0.41。
在一些实施例中，本文所述之人源化抗体能抑制HCVpp感染，其中如HCVpp中和检定判断之该人源化抗体存在下之感染滴度的EC50为：基因型1b至少为约0.511或基因型2a为至少约0.793。
合适地，如HCVpp中和检定判断在该人源化抗体存在下感染滴度之IC90为：基因型1(1a H77 20)至少为约0.6；基因型1(1A20.8)至少为约15；基因型1(1B5.23)至少为约8.3；基因型2(2B1.1)至少为约15；基因型3a(D4/2-35)至少为约2.15；基因型4(4.21.16)至少为约0.92；基因型6(6.5.8)至少为约1.8；且基因型5(5.15.11)至少为约0.82。在一些实施例中，如本文所述之人源化抗体或其片段能抑制HCV伪颗粒感染，其中如HCVpp中和检定判断该人源化抗体存在下之感染滴度之IC50对于基因型1(1a H7720)而言为小于约0.41、约2.4或约0.6中之任一者、基因型1(1A20.8)为约15、基因型1(1B5.23)为约8.3、基因型2(2B1.1)为大于约15、基因型2(2a JFH1)为约7、基因型2(2A2.4)为约0.51、基因型3(3a F4/2-35)为小于约0.41、基因型4(4.21.16)为小于约6、基因型5(5.15.11)为约0.82，或基因型6(6.5.8)为小于约1.8。
在一些实施例中，本文所述之人源化抗体或其片段抑制重组细胞培养物产生之HCV(HCVcc)感染。在一些实施例中，本文所述之人源化抗体能抑制HCVcc感染，其中如HCVpp中和检定判断之该人源化抗体存在下之感染滴度的EC50为：基因型1b至少为约0.72或基因型2a为至少约1.7。
在一些实施例中，人源化抗体或其片段展示上述特征中之一或多者。
抗体基因工程设计
用于基因工程设计抗体之若干技术为此项技术中已知。一般而言，抗体藉由将CDR自供体(非人类)抗体转移至接受者(人类)抗体框架呈现较少免疫原性；此程序称为CDR移植或人源化。此程序之缺点为，由于供体与接受体框架之间的差异，结合活性可能受损或丧失。此外，特定量之免疫原性可由CDR自身保持。已提出各种补充及替代技术来解决此等问题，包括镶边、表面重建、SDR转移及去免疫。
在一些实施例中，本文所述之人源化抗体具有一或多个自非人类来源引入其中之氨基酸残基。此等非人类氨基酸残基通常称为″引入″残基，其通常取自″引入″可变区。基本上可根据Winter及同事之方法(Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988))藉由以高变区序列取代人类抗体之相应序列来进行人源化。因此，该等″人源化″抗体为嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中实质上少于完整人类可变区之可变区经来自非人类物种之相应序列取代。实际上，人源化抗体通常为人类抗体，其中一些高变区残基及可能之一些FR残基经来自啮齿动物抗体中之类似位点之残基取代。
当抗体意欲用于人类治疗用途时，在制造人源化抗体时待使用之人类轻及重可变区之选择对于减少抗原性及HAMA反应(人类抗小鼠抗体)尤其重要。根据所谓″最佳匹配(best-fit)″法，针对已知人类可变区序列之完整库筛检啮齿动物抗体之可变区序列。接着，识别最接近啮齿动物序列之人类V结构域序列且接受其中之人类框架区(FR)用于人源化抗体(Sims等人，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一方法使用由轻链或重链之特定子群之所有人类抗体之一致序列产生的特定框架区。相同框架可用于若干不同之人源化抗体(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.，151：2623(1993))。
更重要的是，人源化之抗体对抗原具有持久之高结合亲和力且具有其它有利生物特性。为实现此目标，根据一优选方法，人源化抗体藉由使用亲本及人源化序列之三维模型分析亲本序列及各种设想之人源化产物的方法来制备。通常可获得三维免疫球蛋白模型且为彼等熟习此项技术者熟悉。可获得说明及展示所选候选免疫球蛋白序列之或然三维构形结构之计算机程序。对此等展示之检视使分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中之可能作用(亦即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合之能力的残基)成为可能。以此方式，FR残基可选自接受者及引入序列且将其加以组合以便获得所要抗体特征，诸如对靶标抗原增加之亲和力。一般而言，高变区残基直接且最实质上涉及影响抗原结合。
抗体人源化已描述于(例如)EP 460167、EP 682040、US 5530101、US5585089、US 5693761、US 5693762、US 5766886、US 5821337、US 5859205、US 5886152、US 5887293、US 5955358、US 6054297及US 6180370中。此等方法均涉及再设计抗体可变区以便负责赋予抗原结合特异性之氨基酸残基整合入人类抗体可变区之框架区中。
在一些状况下，非人类抗体之免疫原性部分由来自人类抗体之残基置换(例如，US 5712120)。或者，抗体可变区之表面上的残基可由来自人类抗体之残基置换以使非人类可变区″表面重建″(例如，US 5639641)。表面重建系由Padlan提出(1991，EP 0519596)且亦称为″镶边″。在此程序中，第一(供体等效物-CDR来源)抗体之溶剂可接近残基由来自第二(″接受者″)抗体之残基置换。通常，第二抗体为人类抗体。溶剂不可接近之残基、CDR、结构域间接触残基及直接侧接CDR之残基均保持为第一抗体中之状态。此策略意欲模拟第二抗体之表面，同时保持第一抗体之所有封装及界面相互作用，此可帮助保持完全抗原结合活性。此应减少B细胞表位数(且亦可减少一些T表位数)，产生较低免疫原性。
藉由检视抗体之高分辨率结构识别溶剂可接近残基。可与人源化有关之抗体之其它区：与CDR接触且在鼠与人类抗体之间不同的掩埋残基(在该等状况下，使用啮齿动物残基)；对于两结构域而言皆接近CDR安置且可在抗原结合中起作用之N末端区；即使在远距离下亦可起作用之静电相互作用。待取代之表面残基的选择由第一抗体可变区与来自第二物种之可用序列(个别或一致序列)的彼等之间的同源性匹配决定。
US 5639641及EP 0592106A1描述表面重建之替代方法。本文中，应改变为第二物种之彼等的溶剂可接近残基系使用与Padlan之彼者类似的程序识别，但分析较大数目之结构以获得各位置的平均可接近性。具有高于特定水平之可接近性之残基经检验且换为来自待使用抗体之物种之抗体的彼残基。待取代之残基的选择可来自具有全面同源性之抗体或来自仅考虑溶剂可接近性残基具有最高同源性之抗体。
WO 93/17105及US 5766686中所述之人源化方法识别一般可安全地改变为人类等效物之低风险残基。此等残基倾向于为溶剂可接近的，因此，若仅改变溶剂可接近性残基，则此方法将类似于表面重建方法。
已描述具有提供表面重建抗体或镶边抗体之实际结果的两种其它程序；参见EP 0438310A1及EP 0519596A1。
另一技术寻求识别及移除T细胞表位(称为″脱表位(detope)″)以便使有助于免疫反应之T不可获得或减少，对所引入抗体产生最小免疫反应(参见US 5712120；EP 0699755A2)。此方法中亦可能废除B细胞表位。
抗体人源化技术亦教示于″Antibody Engineering″(Kontermann及Dhubel编)，第40章第567-592页(O′Brien and Jones)中。
在一些实施例中，人源化抗体可为抗体片段(诸如，Fab)，其视情况与一或多种细胞毒性剂结合以产生免疫结合物。或者，人源化抗体可为全长抗体，诸如全长IgG1抗体。
抗体片段
本发明之范畴亦涵盖能与所选标靶结合之抗体片段(诸如，人源化抗体片段)(且包括Fv、ScFv、Fab′、F(ab′)2、dAbs)、基因工程设计之抗体(包括嵌合、CDR移植及人源化抗体)，及使用噬菌体展示或替代技术产生的经人工选择之抗体。小片段(诸如，dAbs、Fv及ScFv)由于其小尺寸及随之优良组织分布而具有诊断及治疗应用之有利特性。
在一些实施例中，抗体片段包含全长抗体之一部分，一般为其抗原结合或可变区。抗体片段之实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2及Fv片段，双功能抗体，线性抗体，单链抗体分子及由抗体片段形成之多特异性抗体。
在一些实施例中，″Fv″为含有完全抗原识别位点及抗原结合位点的最小抗体片段。此片段由处于紧密、非共价结合之一重链可变区结构域与一轻链可变区结构域之二聚体组成。自此等两个结构域之折迭散发出6个高变环(各自3个来自H及L链的环)，该等高变环提供用于抗原结合之氨基酸残基且赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使单个可变区(或仅包含三个对抗原具有特异性之CDR的半个Fv)亦具有辨识及结合抗原之能力，但亲和力比整个结合位点低。
在一些实施例中，提供本文所述之人源化抗体之片段。在一些实施例中，人源化抗体片段为抗原结合片段。在一些实施例中，人源化抗体之抗原结合片段与HCV结合。在一些实施例中，人源化抗体之抗原结合片段能与HCV E2蛋白、可溶性HCV E2蛋白或HCV E1蛋白与HCV E2蛋白之杂二聚体结合。在一些实施例中，HCV E2蛋白系来自选自由基因型1(例如，基因型1a及基因型1b)、基因型2(例如，基因型2a、基因型2b、基因型2c)、基因型3(例如，基因型3a)、基因型4、基因型5及基因型6组成之群的HCV基因型中之一或多者。
通常，此等片段展示以至少107，且更通常108或109之亲和力与抗原特异性结合。在一些实施例中，人源化抗体片段与可溶性HCV E2蛋白以介于1-100nM之间的结合亲和力结合。在一些实施例中，结合亲和力系介于约1-10nM、10-50nM或50-100nM中之任一者。在一些实施例中，结合亲和力为约5nM或约50nM。在一些实施例中，人源化抗体或其片段与HCVE1/HCV E2杂二聚体以介于1-100nM之间的结合亲和力结合。在一些实施例中，结合亲和力系介于约1-10nM、10-50nM或50-100nM中之任一者。在一些实施例中，结合亲和力为约5nM或约50nM。在一些实施例中，抗体之结合亲和力可(例如)藉由Munson等人，Anal.Biochem.，107：220(1980)中所述之斯卡查德分析测定。
在一些实施例中，此等片段展示(实质上)与本文所述之AP33单克隆抗体或人源化抗体相同之HCV中和活性。人源化抗体片段包括单独之重链、轻链、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc及Fv。片段系藉由重组DNA技术或藉由酶促分离或化学分离完整免疫球蛋白产生。
在一些实施例中，人源化抗体片段为功能片段。本文所述之人源化抗体之″功能片段″(诸如，人源化AP33抗体之功能片段)为以与产生其之完整全长分子实质上相同的亲和力与HCV保持结合且由诸如本文所述之彼等的活体外或活体内检定量测展示生物活性之彼等片段。在一些实施例中，如HCVpp及/或HCVcc中和检定所示，功能片段中和及/或抑制HCV。在一些实施例中，人源化抗体片段防止及/或抑制HCV E2蛋白与CD81的相互作用。在一些实施例中，人源化抗体片段防止及/或抑制HCV进入细胞。在一些实施例中，细胞为肝脏细胞，例如肝细胞。
已开发各种技术来产生抗体片段。传统上，此等片段系经由完整抗体之蛋白水解消化产生(参见，例如Morimoto等人，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117(1992)；及Brennan等人，Science，229：81(1985))。然而，此等片段现在可由重组宿主细胞直接产生。Fab、Fv及ScFv抗体片段均可表达于大肠杆菌(E.coli)中且由大肠杆菌分泌，因此可容易地产生大量此等片段。可自上文所讨论之抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，可自大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段且使其化学偶合以形成F(ab′)2片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一方法，F(ab′)2片段可自重组宿主细胞培养物直接分离。具有增加之活体内半衰期的包含救助受体结合表位残基之Fab及F(ab′)2片段系描述于美国专利第5,869,046号中。用于制造抗体片段之其它技术对熟练从业者将为显而易见的。在其它实施例中，所选抗体为单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利第5,571,894号；及美国专利第5,587,458号中。Fv及sFv为不具有恒定区之完整组合位点的仅有物种；因此，其适于在活体内使用期间减少非特异性结合。sFv融合蛋白可经构建在sFv之氨基或羧基末端处产生效应蛋白之融合。参见Antibody Engineering，Borrebaeck编，上文。抗体片段亦可为″线性抗体″，例如如美国专利第5,641,870中所述。该等线性抗体片段可具单特异性或双特异性。抗原结合抗体片段可藉由完整免疫球蛋白之酶促分离或化学分离产生。亦可藉由重组DNA技术制造片段(例如，King等人，1992 Biochem.J.281，317-323；Carter等人，1992 Biotechnology 10，163-167)。编码所选片段之核酸之区段系藉由以相关限制酶消化全长编码序列或藉由重新合成产生。
举例而言，可使用标准方法(诸如，彼等Harlow及Lane所述者(1988″Antibodies，A Laboratory Manual″，Cold Spring Harbor Laboratory，NY))以胃蛋白酶在pH 3.0-3.5下藉由蛋白水解消化自IgG分子获得F(ab′)2片段。
Fab片段可藉由有限还原自F(ab′)2片段获得，或藉由在还原剂存在下以木瓜酵素消化自整个抗体获得。
人源化抗体可以彼等熟习此项技术者显而易见的多种方式表征。此等包括藉由诸如ELISA之技术对其浓度进行物理量测，及藉由SDS-PAGE对抗体纯度进行物理量测。此外，多肽之功效可藉由侦测分子与HCV E2糖蛋白在溶液或固相系统中之结合来测定，诸如ELISA、表面等离子共振(例如，BIAcore)或免疫荧光检定。更特定言之，多肽之中和能力可针对HCV样本(代表6种已知基因型)以如本文所述之HCV pp中和检定(诸如HCVpp及HCVcc中和检定)测试。
双特异性抗体
双特异性抗体为对至少两个不同表位具有结合特异性之抗体。例示性双特异性抗体可与两个不同HCV表位结合。其它该等抗体可将HCV结合位点与另一蛋白质的结合位点组合。双特异性抗体亦可用于使细胞毒性剂定位于细胞。此等抗体具有HCV结合臂及结合细胞毒性剂(例如，沙泊宁(saporin)、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒素A链、甲氨喋呤或放射性同位素半抗原)之臂。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)之形式。
WO 96/16673描述双特异性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体且美国专利第5,837,234号揭示双特异性抗ErbB2/抗FcγRI抗体。双特异性抗ErbB2/Fcα抗体展示于WO 98/02463中。美国专利第5,821,337号教示双特异性抗ErbB2/抗CD3抗体。
制备双特异性抗体之方法为此项技术中已知。全长双特异性抗体之传统制造系基于两个免疫球蛋白重链-轻链对之共表达，其中两个链具有不同特异性(Millstein等人，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链及轻链之随机分配，因此此等杂交瘤(四源杂交瘤(quadromas))产生10种不同抗体分子之潜在混合物，其中仅一种具有正确双特异性结构。一般藉由亲和层析步骤进行之正确分子的纯化相当麻烦，且产量低。类似程序系于WO93/08829及Traunecker等人，EMBO J.，10：3655(1991)中揭示。
根据不同方法，将具有所要结合特异性之抗体可变区(抗体-抗原组合部位)与免疫球蛋白恒定区序列融合。优选地，融合系与包含至少部分铰链区、CH2区及CH3区之Ig重链恒定区之融合。优选为在至少一种融合中存在含有轻链接合所必需之位点之第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合体及(若需要)免疫球蛋白轻链之DNA插入单独表达载体中，且将其共转染至合适宿主细胞中。当在构建中所使用之三个多肽链的不等比率提供所要双特异性抗体之最佳产率时，此提供在实施例中调整三个多肽片段之相互比例的极大灵活性。然而，当等比率之至少两个多肽链的表达造成高产率或当比率对所要链组合之产率无显著影响时，可能将两个或全部三个多肽链之编码序列插入单个表达载体中。
在此方法之一优选实施例中，该等双特异性抗体包含一臂中之具有第一结合特异性之杂交免疫球蛋白重链以及另一臂中之杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)。已发现由于免疫球蛋白轻链仅存在于一半双特异性分子中提供一种简便之分离方式，因此此不对称结构促进所要双特异性化合物与非所要之免疫球蛋白链组合之分离。此方法揭示于WO94/04690中。产生双特异性抗体之其它细节参见(例如)Suresh等人，Methodsin Enzymology，121：210(1986)。
根据美国专利第5,731,168中描述之另一方法，一对抗体分子间之界面可进行基因工程以使重组细胞培养物回收之杂二聚体之百分比最大。优选界面包含至少一部分CH3域。在此方法中，第一抗体分子界面之一或多个小氨基酸侧链经较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)置换。藉由用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换大氨基酸侧链而在第二抗体分子之界面上产生与大侧链相同或类似尺寸的补偿″空腔″。此提供一种使杂二聚体之产率增加超过其它非所要终产物(诸如均二聚体)的机制。
双特异性抗体包括交联抗体或″杂结合″抗体。举例而言，杂结合物中抗体之一可与抗生蛋白偶合，其它抗体与生物素偶合。例如，该等抗体据称可使免疫系统细胞靶向非所要细胞(美国专利第4,676,980号)，且可用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。杂结合抗体可使用任何便利之交联方法制得。适合交联剂在此项技术中熟知，且与多种交联技术一起揭示于美国专利第4,676,980号中。
自抗体片段产生双特异性抗体之技术亦已描述于文献中。举例而言，可使用化学键联制备双特异性抗体。Brennan等人，Science，229：81(1985)描述一种其中完整抗体经蛋白水解产生F(ab′)2片段的程序。此等片段在二硫醇错合剂亚砷酸钠存在下还原以稳定邻近二硫醇且防止分子间二硫键形成。接着将所产生之Fab′片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。接着Fab′-TNB衍生物之一用巯基乙胺还原再转化为Fab′-硫醇，其与等莫耳量之另一Fab′-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。所产生之双特异性抗体可用作选择性固定酶之试剂。
此方面进展已促进自大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，该等片段可经化学偶合形成双特异性抗体。Shalaby等人，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)描述完全人源化双特异性抗体F(ab′)2分子之制备。各Fab′片段经大肠杆菌各别分泌，且在活体外经定向化学偶合以形成双特异性抗体。因此形成之双特异性抗体可与过度表达ErbB2受体之细胞及正常人类T细胞结合，以及激发人类细胞毒性淋巴细胞对人类乳房肿瘤标靶之溶胞活性。
亦已描述直接由重组细胞培养物制造且分离双特异性抗体片段之多种技术。举例而言，已使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。Kostelny等人，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。藉由基因融合将来自Fos及Jun蛋白之亮氨酸拉链肽与两种不同抗体之Fab′部分连接。在铰链区还原抗体均二聚体以形成单体，且接着使其再氧化以形成抗体杂二聚体。此方法亦可用于产生抗体均二聚体。Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)所述之″双功能抗体″技术为制备双特异性抗体片段提供替代机制。该等片段包含由连接子与VL连接之VH，该连接子太短从而不允许在同一链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个片段之VH及VL域与另一片段之互补VL及VH域配对，藉此形成两个抗原结合位点。亦已报导另一藉由使用单链Fv(sFv)二聚体制造双特异性抗体片段之策略。参见Gruber等人，J.Immunol.，152：5368(1994)。
涵盖具有两价以上的抗体。举例而言，可制备三特异性抗体。Tutt等人。J.Immunol.147：60(1991)。
多价抗体
与二价抗体相比，表达与抗体结合之抗原的细胞可更快地内化(及/或异化)多价抗体。本发明之抗体可为具有三个或三个以上抗原结合位点之多价抗体(IgM类别之抗体除外)(例如四价抗体)，多价抗体可藉由重组表达编码抗体多肽链之核酸容易地制得。多价抗体可包含二聚化域及三个或三个以上抗原结合位点。优选二聚化域包含Fc区或铰链区(或由其组成)。在此情形下，抗体将包含Fc区及在Fc区氨基末端之三个或三个以上抗原结合位点。本文之优选多价抗体包含三个至约八个，但优选四个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体包含至少一个多肽链(且优选两个多肽链)，其中多肽链包含两个或两个以上可变区。举例而言，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1为第一可变区，VD2为第二可变区，Fc为Fc区之一个多肽链，X1及X2表示氨基酸或多肽，且n为0或1。举例而言，多肽链可包含VH-CH1-可挠性连接子-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文之多价抗体优选另外包含至少两个(且优选四个)轻链可变区多肽。本文之多价抗体可(例如)包含约两个至约八个轻链可变区多肽。本文涵盖之轻链可变区多肽包含轻链可变区且视情形另外包含CL域。
其它氨基酸序列修饰
涵盖对本文所述HCV结合抗体之氨基酸序列修饰。举例而言，可需要改良抗体之结合亲和力及/或其它生物学特性。抗HCV抗体之氨基酸序列变体(诸如人源化AP33抗体)系藉由向抗HCV抗体核酸中引入适当核苷酸变化或藉由肽合成制备。该等修饰包括(例如)抗HCV抗体氨基酸序列内之残基缺失及/或插入及/或取代。进行缺失、插入及取代之任何组合以达成最终构建体，其限制条件为该最终构建体具有所要特征。氨基酸变化亦可改变抗HCV抗体之转译后过程，诸如改变糖基化位点之数目或位置。
适用于识别抗HCV抗体中作为诱变之优选位置的某些残基或区域之方法称为″丙氨酸扫描诱变″，如Cunningham及Wells Science，244：1081-1085(1989)所述。本文中，残基或标靶残基之群经识别(例如，带电残基，诸如arg、asp、his、lys及glu)且经中性或带负电氨基酸(最优选为丙氨酸或聚丙氨酸)替代以影响氨基酸与HCV抗原之相互作用。随后，藉由在取代位点处或为取代位点引入其它变体以改进彼等表明对取代具有功能敏感性之氨基酸部位。因此，当已预定用于引入氨基酸序列变化之位点时，突变之特性本身无需预定。举例而言，为分析给定位点之突变效能，在标靶密码子或区域进行ala扫描或随机诱变，且筛检所表达抗HCV抗体变体的所要活性。
氨基酸序列插入物包括长度为一个残基至含有一百个或更多残基之多肽之氨基及/或羧基未端融合体，以及具有单个或多个氨基酸残基之序列内插入物。未端插入物之实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基之抗HCV抗体或与细胞毒性多肽融合之抗体。抗HCV抗体分子之其它插入变体包括抗HCV抗体之N末端或C末端与酶(例如，对于ADEPT而言)或增加抗体之血清半衰期之多肽的融合体。
另一类型之变体为氨基酸取代变体。此等变体在抗HCV抗体分子中具有至少一个经不同残基置换之氨基酸残基。最引人关注之取代诱变位点包括高变区，但亦涵盖FR变化。标题″优选取代″下之表中展示了保守性取代。若该等取代导致生物活性变化，则可引入更多实质改变(表中命名为″例示性取代″，或下文参考氨基酸类别进一步描述)，且筛检产物。
表1
  初始残基  例示性取代   优选取代
  Ala(A)  Val；Leu；Ile   Val
  Arg(R)  Lys；Gln；Asn   Lys
  Asn(N)  Gln；His；Asp；Lys；Arg   Gln
  Asp(D)  Glu；Asn   Glu
  Cys(C)  Ser；Ala   Ser
  Gln(Q)  Asn；Glu   Asn
  Glu(E)  Asp；Gln   Asp
  Gly(G)  Ala   Ala
  His(H)  Asn；Gln；Lys；Arg   Arg
  Ile(I)  Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸   Leu
  Leu(L)  正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe   Ile
  Lys(K)  Arg；Gln；Asn   Arg
  Met(M)  Leu；Phe；Ile   Leu
  Phe(F)  Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr   Tyr
  Pro(P)  Ala   Ala
  Ser(S)  Thr   Thr
  Thr(T)  Val；Ser   Ser
  Trp(W)  Tyr；Phe   Tyr
  Tyr(Y)  Trp；Phe；Thr；Ser   Phe
  Val(V)  Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸   Leu
抗体生物特性之实质修饰可藉由选择取代来实现，该等取代在其维持以下各物之作用方面显著不同：(a)取代区域中多肽骨架之结构，例如薄片或螺旋构形；(b)分子标靶位点处之电荷或疏水性；或(c)侧链体积。可根据侧链特性之类似性将氨基酸分组(在A.L.Lehninger，Biochemistry，第二版，第73-75页，Worth Publishers，NewYork(1975)中)：
(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者，天然存在残基可基于共同的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链定向之残基：Gly、Pro；
(6)芳族性：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将必然使此等类别中之一员改变为另一类别。
一般亦可用丝氨酸取代与维持抗HCV抗体之适当构形无关的任何半胱氨酸残基以改良分子之氧化稳定性及防止异常交联。相反，可将半胱氨酸键添加至抗体中以改良其稳定性(尤其其中抗体为诸如Fv片段之抗体片段)。
取代变体之尤其优选类型涉及取代亲本抗体(例如，人源化抗体)之一或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步研究之所得变体应相对于产生其之亲本抗体具有经改良之生物特性。产生该等取代变体之便利方式包括使用噬菌体展示进行之亲和力成熟。简言之，使若干高变区位点(例如，6-7个位点)突变从而在各位点处产生所有可能之氨基取代。因此产生之抗体变体以单价方式自丝状噬菌体颗粒呈现为与封装于各颗粒中之M13之基因III产物的融合体。接着针对如本文所揭示之生物活性(例如，结合亲和力)筛检噬菌体展示之变体。为了识别供修饰之候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以识别明显有助于抗原结合之高变区残基。替代地或额外地，分析抗原-抗体复合物之晶体结构以识别抗体与HCV之间的接触点可为有益的。该等接触残基及邻近残基为用于根据本文中详述之技术取代的候选物。在产生该等变体后，如本文所述使变体组经受筛检，且可在一或多个相关检定中选择具有优越特性之抗体以供进一步研发。
另一类型之抗体氨基酸变体改变抗体之初始糖基化模式。人源化抗体或其片段可包含非氨基酸部分。举例而言，人源化抗体或其片段可经糖基化。该糖基化可于人源化抗体或其片段在宿主细胞或宿主生物体中表达期间自然发生，或可为人类干预产生之蓄意修饰。改变意谓删除抗体中发现之一或多个碳水化合物部分，及/或添加抗体中不存在之一或多个糖基化位点。
抗体之糖基化通常为N连接或O连接。N连接系指碳水化合物部分与天冬酰胺残基之侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸及天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸以外之任何氨基酸)为碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促连接之辨识序列。因此，多肽中此等三肽序列之任一者的存在产生潜在糖基化位点。经O连接之糖基化系指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者与羟基氨基酸连接，尽管亦可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸，但该羟基氨基酸最通常为丝氨酸或苏氨酸。
藉由改变氨基酸序列从而使其含有上述三肽序列中之一或多者来便利地实现在抗体中添加糖基化位点(对于N连接糖基化位点而言)。亦可藉由将一或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加至或取代初始抗体之序列来进行改变(对于O连接糖基化位点而言)。
编码抗HCV抗体之氨基酸序列变体之核酸分子系藉由此项技术中已知之多种方法制备。此等方法包括(但不限于)自天然来源分离(在天然存在之氨基酸序列变体之状况下)或藉由对早期制备之抗HCV抗体的变体或非变体形式进行寡核苷酸介导之(或定点)诱变、PCR诱变及序列盒诱变来制备。
对于效应功能(例如，为了增强抗体之抗原依赖性细胞介导之细胞毒性(ADCC)及/或补体依赖性细胞毒性(CDC))而言可能需要修饰本发明之拮抗剂。此可藉由在抗体之Fc区引入一或多个氨基酸取代达成。替代地或额外地，可将半胱氨酸残基引入Fc区，藉此允许在此区形成链间二硫键。因此产生之均二聚抗体可具有改良之内化能力及/或增强之补体介导细胞杀伤及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)及Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强之抗肿瘤活性之均二聚抗体亦可使如在Wolff等人，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中所述之杂双官能交联剂来制备。或者，抗体可经基因工程设计，其具有双重Fc区且可藉此具有增强之补体介导之溶解及ADCC能力。参见Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。
为了增加抗体之血清半衰期，吾人可将补救受体结合表位并入抗体(尤其为抗体片段)中，例如，如美国专利第5,739,277号中所述。如本文所用，术语″补救受体结合表位″系指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)之Fc区的表位，其负责增加IgG分子之活体内血清半衰期。
其它抗体修饰
本文涵盖抗体之其它修饰。举例而言，可将抗体与多种非蛋白聚合物中之一者(例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚环氧烷或聚乙二醇与聚丙二醇之共聚物)连接。抗体亦可包裹于例如藉由凝聚技术或界面聚合制备之微胶囊(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，包裹于胶状药物传递系统(例如，脂质粒、白蛋白微球体、微乳液、奈米颗粒及奈米胶囊)或巨乳液中。该等技术揭示于Remington′s PharmaceuticalSciences，第16版，Oslo，A.编(1980)中。
替代地或额外地，人源化抗体或其片段可经受其它化学修饰。一种如此所要修饰为添加一或多个聚乙二醇(PEG)部分。已展示聚乙二醇显著增加各种抗体片段之活体内半衰期(Chapman 2002 Adv.Drug Delivery Rev.54，531-545)。然而，抗体片段之随机聚乙二醇化可对片段对抗原之结合亲和力具有高度有害作用。为了避免此问题，需要将聚乙二醇化限于人源化抗体或其片段之特异性经靶向残基(参见，Knight等人，2004 Platelets 15，409-418及Chapman，如上文)。
具有所要特性之抗体的筛检
可如实验性实例中所述选择具有某些生物特征之抗体。
为了筛检与所关注抗体结合的HCV E2蛋白上之表位结合之抗体，可进行诸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow及David Lane编(1988)中所述之彼者的常规交叉阻断检定。此检定可用于测定测试抗体是否与本发明之抗HCV E2抗体结合同一位点或表位。替代地或额外地，可藉由此项技术中已知之方法进行表位定位。举例而言，抗体序列可经诱变(诸如，藉由藉由丙氨酸扫描)以识别接触残基。初始测试突变抗体与多克隆抗体之结合以确保适当折迭。在不同方法中，对应于HCVE2蛋白之不同区的肽可与该(等)测试抗体及具有特征化或已知表位之抗体一起用于竞争检定中。
在一些实施例中，亦可筛检抗体中和HCV感染之能力。在一些实施例中，HCV感染之中和系基于如本文所述之HCV假型颗粒(HCVpp)中和检定。HCVpp由装配于逆转录病毒或慢病毒核心颗粒上之未经修饰之HCV包封糖蛋白组成。HCVpp感染HCV包封蛋白依赖性物质中的肝癌细胞系及肝细胞。封装于HCVpp中之标记基因的存在允许快速且可靠测定抗体介导之中和。在一些实施例中，HCV感染之中和系基于如本文所述之感染人类肝癌细胞系之重组细胞培养物产生之HCV(HCVcc)中和检定。
II.多核苷酸
本发明亦提供多核苷酸。如本文可互换使用之″多核苷酸″或″核酸″系指任何长度之核苷酸的聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰之核苷酸或碱基及/或其类似物，或可由DNA或RNA聚合酶并入聚合物中之任何受质。多核苷酸可包含经修饰之核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。若存在修饰，则可在装配聚合物之前或之后对核苷酸结构进行修饰。
举例而言，多核苷酸可编码整个免疫球蛋白分子链，诸如轻链或重链。完全重链不仅包括重链可变区(VH)而且包括重链恒定区(CH)，其通常将包含三个恒定区：CH1、CH2及CH3；及″铰链″区。在一些状况下，需要存在恒定区。举例而言，当需要抗体来杀死HCV感染之细胞时，则需要存在完全恒定区来活化补体。然而，在其它状况下，可能不需要存在完全恒定区。
多核苷酸可编码可变轻链及/或可变重链。
可由该核苷酸编码之其它多肽包括抗原结合抗体片段，诸如单域抗体(″dAb″)、Fv、scFv、Fab′及F(ab′)2及″微型抗体″。微型抗体(通常)为已切除CH1及CK或CL域之二价抗体片段。因为微型抗体比习知抗体小，所以其在临床/诊断使用中应实现优选组织渗透，但因为其系二价的，所以其应比单价抗体片段(诸如，dAb)保留较高结合亲和力。因此，除非正文中另有规定，否则本文所用之术语″抗体″不仅涵盖全抗体分子，而且涵盖上文所述类型之抗原结合抗体片段。
尽管所编码之多肽通常将具有与AP33之彼等相同或实质上相同之CDR序列，但框架区将不同于AP33之彼等，其为人类来源的。本发明之多核苷酸因此优选将编码具有如本文相对于AP33之重链及/或轻链(若适当)所述之重链及/或轻链可变区的多肽。若所编码之多肽包含部分或完全重链及/或轻链恒定区，则此亦有利的为人类来源的。
优选所编码多肽之框架区的至少一者，且最优选框架区之每一者，将包含相对于人类接受者之氨基酸取代从而变得与AP33之彼等更类似，从而增加人源化抗体之结合活性。
优选地，所编码多肽中存在之各框架区相对于对应人类接受者框架将包含至少一个氨基酸取代。因此，举例而言，框架区相对于接受者框架区总共可包含3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸取代。有利地，突变为匹配鼠AP33框架中等效位置处存在之残基的回复突变。优选地，重链中具有6个回复突变且轻链中具有1个回复突变。
合适地，本发明之多核苷酸及/或多肽可经分离及/或纯化。在一些实施例中，多核苷酸及/或多肽为经分离之多核苷酸及/或多肽。术语分离意欲说明分子自其正常或天然环境移除或分离或以其不存在于其正常或天然环境中之方式制备。在一些实施例中，多核苷酸及/或多肽为经纯化之多核苷酸及/或多肽。术语纯化意欲说明已移除至少一些污染分子或物质。
合适地，多核苷酸及/或多肽实质上经纯化，使得相关多核苷酸及/或多肽构成组合物中存在之主要(亦即，最丰富)多核苷酸或多肽。
本发明因此采用重组核酸，其包含编码如本文所述之重链可变区及/或轻链可变区之插入物。根据定义，该等核酸包含编码单链核酸、由该等编码核酸及其互补核酸组成之双链核酸，或此等互补(单链)核酸本身。
亦可在AP33抗体之重链可变区及/或轻链可变区之外进行修饰。该突变核酸可为沉默突变体，其中一或多个核苷酸经具有编码相同氨基酸之新颖密码子的其它核苷酸置换。该突变序列可为退化序列。退化序列系在遗传密码子意义内退化，因为不受限数目之核苷酸经其它核苷酸置换而不使初始编码之氨基酸序列发生变化。该等经退化序列由于其对特异性宿主(尤其酵母、细菌或哺乳动物细胞)而言优选之不同限制位点及/或特定密码子频率而可适用于获得重链可变区及/或轻链可变区之最佳表达。
序列一致性或序列同源性
本发明涵盖使用与具有本文所定义之特定特性之多肽的氨基酸序列或编码该多肽之任何核苷酸序列具有一定程度之序列一致性或序列同源性的序列(下文称为″同源序列″)。本文中，术语″同系物″意谓与个体氨基酸序列及个体核苷酸序列具有某些同源性之实体。本文中，术语″同源性″可等同于″一致性″。
同源氨基酸序列及/或核苷酸序列应提供及/或编码保持抗体之功能活性及/或增强抗体活性之多肽。
在本文中，同源序列用于包括可与个体氨基酸至少75、85或90％一致性，优选至少95或98％一致性之氨基酸序列。通常，同系物将包含与个体氨基酸序列相同之活性位点等。尽管亦可关于相似性(亦即，具有类似化学特性/功能之氨基酸残基)考虑同源性，但在本发明内容中，优选关于序列一致性表达同源性。
在本文中，同源序列用于包括可与编码本发明之多肽的核苷酸序列(个体序列)至少75、85或90％一致性，优选至少95或98％一致性的核苷酸序列。通常，同系物将包含与个体序列编码相同活性位点等之序列。尽管亦可关于相似性(亦即，具有类似化学特性/功能之氨基酸残基)考虑同源性，但在本发明内容中，优选关于序列一致性表达同源性。
可藉由眼睛，或更一般藉助于容易获得之序列比较程序进行同源性比较。此等市售计算机程序可计算两个或两个以上序列之同源性百分比。
可对邻接序列计算同源性百分比，亦即将一序列与另一序列比对且将一序列中之各氨基酸直接与另一序列中之相应氨基酸(每次一个残基)比较。此称为″无间隙″比对。通常，仅在相对短数目之残基上进行该等无间隙比对。
尽管此为极简单且一致的方法，但其未虑及(例如)在其它一致序列对中，一个插入或缺失将使随后氨基酸残基失配，因此在进行整体比对时导致较大同源性百分比减少。因此，多数序列比较法经设计产生最佳比对，该等方法考虑可能插入及缺失而不使整个同源性计分过度恶化。此系藉由在序列比对中插入″间隙″从而尝试使局部同源性最大化来实现。
然而，此等更复杂方法对比对中存在之各间隙指定″间隙处罚″，从而对于相同数目之一致性氨基酸而言，具有尽可能少间隙的序列比对(反映两个比较序列之间的较高关联性)将实现比具有许多间隙者高的计分。通常使用″亲族间隙成本″，其对间隙之存在征收相对高成本且对间隙中各随后残基征收较少处罚。此为最常用间隙计分系统。高间隙处罚当然将产生具有较少间隙之最佳比对。多数比对程序允许修正间隙处罚。然而，当将该软件用于序列比较时优选使用默认值。
最大同源性百分比之计算因此首先需要产生考虑间隙处罚之最佳比对。用于进行该比对之合适计算机程序为Vector NTI(Invitrogen Corp.)。可进行序列比较之软件实例包括(但不限于)(例如)BLAST封装(参见Ausubel等人，(1999)Short Protocols in Molecular Biology，第4版-第18章)、BLAST 2(参见FEMS Microbiol Lett 174(2)：247-50(1999)；FEMS Microbiol Lett 177(1)：187-8(1999))、FASTA(Altschul等人，J.Mol.Biol.403-410(1990))及AlignX。至少BLAST、BLAST 2及FASTA可用于离线及在线研究(参见Ausubel等人，(1999)第7-58页至第7-60页)。
尽管可根据一致性量测最终同源性百分比，但比对法本身通常并不基于全有或全无对比较(all-or-nothing pair comparison)。实际上，一般使用成比例相似性计分矩阵，其为基于化学相似性或进化距离之各逐对比较指定计分。通常所用之该矩阵之实例为BLOSUM62矩阵-BLAST程序组之预设矩阵。Vector NTI程序一般使用公共默认值或自定义符号比较表(若提供)(更多细节参见使用者手册)。对于一些应用而言，优选使用Vector NTI封装之默认值。
或者，同源性百分比可使用Vector NTI(Invitrogen Corp.)中之多序列比对特征基于类似于CLUSTAL之算法(Higgins DG & Sharp PM，Gene 73(1)，237-244(1988))计算。
一旦软件产生最佳比对，则可计算同源性百分比，优选序列一致性百分比。软件通常作为序列比较之部分进行此举且产生数值结果。
若当测定序列一致性时使用间隙处罚，则优选将以下参数用于逐对比对。参见表2。
表2
 对于BLAST而言
 间隙开口  0
 间隙延伸  0
 对于CLUSTAL而言   DNA   蛋白质
 字长   2   1   K3
 间隙处罚   15   10
 间隙延伸   6.66   0.1
在一实施例中，可使用间隙处罚及间隙延伸如上文所定义设定之CLUSTAL。
合适地，在至少20个邻接核苷酸上，优选在至少30个邻接核苷酸上，优选在至少40个邻接核苷酸上，优选在至少50个邻接核苷酸上，优选在至少60个邻接核苷酸上，优选在至少100个邻接核苷酸上测定核苷酸序列之一致性程度。
合适地，核苷酸序列之一致性程度系在整个序列上测定。
杂交
在另一方面中，提供能与本文所述之核苷酸序列杂交(例如，特异性杂交)的核酸序列。
本文所用之术语″杂交″应包括″核酸链与互补链经碱基配对结合之过程″。杂交条件系基于核酸结合复合物之融合温度(Tm)(如Berger及Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，152，Academic Press，San Diego CA))所教示，且赋予如下文所述之经定义″严格性″。
最大严格性通常出现于低于Tm约5℃下；高严格性在低于Tm约5℃至约10℃下；中等严格性在低于Tm约10℃至约20℃下；且低严格性在低于Tm约20℃至约25℃下。如彼等熟习此项技术者将理解，最大严格性杂交可用于识别或侦测一致性核苷酸序列，而中等(或低)严格性杂交可用于识别或侦测类似或相关序列。
合适地，能与本文所述之核苷酸序列杂交之核酸序列为在严苛条件(例如，50℃及0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH 7.0})下能在与本文所述之核苷酸序列杂交之序列。
合适地，本文呈现能在高度严苛条件(例如，65℃及0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0})下与核苷酸序列杂交之核酸序列。
本发明亦系关于与可与本发明核苷酸序列杂交之序列互补之核苷酸序列(包括本文呈现之彼等的互补序列)。
本发明范畴内亦包括能在中等至最大严格性条件下与本文呈现之核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
III.重组抗体之表达
亦提供编码本文所述之抗HCV抗体及其片段(诸如人源化AP33抗体)的经分离核酸，包含核酸之载体及宿主细胞及用于制造抗体之重组技术。本文所述之抗体可藉由重组表达制造。
编码本文所述之轻链及重链可变区之核酸视情况与恒定区连接，且插入至表达载体中。轻链及重链可克隆入相同或不同表达载体中。编码免疫球蛋白链之DNA区段与确保免疫球蛋白多肽之表达的表达载体中之控制序列可操作地连接。表达控制序列包括(但不限于)启动子(例如，天然结合或异源启动子)、信号序列、增强子组件及转录终止序列。
合适地，表达控制序列为能转化或转染真核宿主细胞(例如，COS细胞-诸如COS 7细胞-或CHO细胞)之载体中的真核启动子系统。将载体并入至适当宿主后，将宿主保持于适于高水平表达核苷酸序列及收集与纯化交叉反应性抗体之条件下。
此等表达载体通常可作为游离体或宿主染色体DNA之完整部分在宿主生物体中复制。
选择基因组份-通常，表达载体含有选择标记物(例如，耐安比西林性(ampicillin-resistance)、耐潮霉素性(hygromycin-resistance)、耐四环素性(tetracycline resistance)、耐卡那霉素性(kanamycin resistance)或耐新霉素性(neomycin resistance))以允许侦测彼等经所要DNA序列转化之细胞(例如参见，Itakura等人，US 4,704,362)。在一些实施例中，选择基因编码如下蛋白质，其(a)赋予抗抗生素或其它毒素(例如安比西林、新霉素、甲氨喋呤或四环素)性，(b)补充营养缺乏或(c)提供不可自复杂培养基获得之关键营养，例如编码杆菌之D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择流程之一实例利用药物使宿主细胞之生长停滞。经异源基因成功转化之彼等细胞产生呈现药物抗性之蛋白质且因此在选择方案中存活。该显性选择之实例使用药物新霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)及潮霉素。
适用于哺乳动物细胞之可选标记物的另一实例为使得能够识别胜任吸收编码本文所述之抗AP33抗体(诸如，人源化AP33抗体)之核酸的细胞之彼等，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I及III(优选为灵长类动物金属硫蛋白基因)、腺苷脱胺酶、鸟氨酸脱羧酶等。
举例而言，首先藉由在含有甲氨喋呤(Mtx)(DHFR之竞争性拮抗剂)之培养基中培养所有转化体来识别经DHFR选择基因转化的细胞。适当宿主细胞(当采用野生型DHFR时)为缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如，ATCC CRL-9096)。
或者，可藉由在含有针对可选标记物之选择剂(诸如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素(kanamycin)、新霉素或G418)的培养基中进行细胞生长来选择经编码本文所述之抗体、野生型DHFR蛋白及另一可选标记物(诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共转化之宿主细胞(尤其含有内源DHFR之野生型宿主)。参见美国专利第4,965,199号。
用于酵母的合适选择基因系存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等人，Nature，282：39(1979))。trp1基因提供缺乏在色氨酸中生长之能力的酵母的突变株(例如ATCC第44076号或PEP4-1)之选择标记，Jones，Genetics，85：12(1977)。接着，酵母宿主细胞染色体组内存在trp1损伤藉由在无色氨酸存在下生长来提供用于侦测转化的有效环境。同样，Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)由具有Leu2基因之已知质粒补充。
此外，由1.6μm环形质粒pKD1产生之载体可用于克鲁维拉酵母(Kluyveromyces yeast)转化。或者，用于大规模制造重组牛凝乳酶之表达系统经报导可用于乳酸克鲁维拉菌(K.lactis)，Van den Berg，Bio/Technology，8：135(1990)。亦已揭示用于藉由克鲁维拉菌之工业菌株分泌成熟重组人类血清白蛋白之稳定多拷贝表达载体。Fleer等人，Bio/Technology，9：968-975(1991)。
信号序列组份-本文所述之抗HCV抗体(诸如，人源化AP33抗体)不仅可直接重组产生，亦可作为具有异源多肽之融合多肽产生，该异源多肽优选为信号序列或在成熟蛋白或多肽之N末端具有特异裂解位点之其它多肽。所选异源信号序列优选为可由宿主细胞辨识及处理(亦即由信号肽酶裂解)之信号序列。信号序列可经选自(例如)碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或热稳定型肠毒素II前导子之群的原核信号序列取代。对于酵母分泌而言，天然信号序列可经(例如)WO 90/13646所述之酵母转化酶前导子、α因子前导子(包括糖酵母(Saccharomyces)及克鲁维拉菌α因子前导子)或酸性磷酸酶前导子、白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导子或信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导子(例如，单纯疱疹gD信号)。
该前体区之DNA在阅读框架中与编码本文所述之抗HCV抗体(诸如，人源化AP33抗体)的DNA接合。
复制起点-表达载体及克隆载体皆含有使载体能在一或多个所选择之宿主细胞中复制之核酸序列。一般而言，在克隆载体内，此序列为使载体能独立于宿主染色体DNA复制之序列，且包括复制起点或自主复制序列。该等序列对于多种细菌、酵母及病毒而言为熟知的。自质粒pBR322复制之起点适于多数格兰氏阴性细菌(Gram-negative bacteria)，2μ质粒起点适于酵母，且各种病毒起点(SV40、多形瘤、腺病毒、VSV或BPV)适用于哺乳动物细胞中之克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点组份(通常可仅使用SV40起点，因为其含有早期启动子)。
启动子组份-表达及克隆载体一般含有宿主生物体辨识之启动子且该启动子与编码本文所述之抗体(诸如，人源化AP33抗体)的核酸可操作地连接。适用于原核宿主之启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶及乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统及杂交启动子(诸如tac启动子)。然而，其它已知细菌启动子亦适用。用于细菌系统之启动子亦将含有与编码抗HCV抗体之DNA可操作性连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知用于真核生物之启动子序列。实际上所有真核基因均具有位于转录起始位点上游约25至30个碱基处之富AT区。发现于多种基因之转录起始处上游70至80个碱基处的另一序列为CNCAAT区，其中N可为任何核苷酸。多数真核基因的3′端处为AATAAA序列，该序列可为编码序列之3′端增加聚A尾的信号。所有此等序列均合适地插入至真核表达载体中。
与酵母宿主一起使用的合适启动子序列之实例包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶之启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶及葡萄糖激酶。
作为具有由生长条件控制转录之额外优势之可诱导启动子的其它酵母启动子系用于以下各物之启动子区：醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关之降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及负责麦芽糖与半乳糖利用之酶。用于酵母表达之合适载体及启动子进一步描述于EP 73,657中。酵母增强子亦有利地与酵母启动子一起使用。
自哺乳动物宿主细胞内的载体转录本文所述之抗HCV抗体(诸如，人源化AP33抗体)系(例如)藉由自诸如多形瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、B型肝炎病毒且最优选地猿病毒40(SV40)之病毒的染色体组、异源哺乳动物启动子(例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、热休克启动子获得之启动子控制，其限制条件为该等启动子与宿主细胞系统可兼容。
便利地获得SV40病毒之早期及晚期启动子，其为亦含有SV40病毒复制起点之SV40限制片段。便利地获得人类巨细胞病毒之即刻早期启动子，其为HindIII E限制片段。用于使用牛乳头状瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA之系统揭示于美国专利第4,419,446号中。此系统之修饰描述于美国专利第4,601,978号中。在来自单纯疱疹病毒之胸苷激酶启动子之控制下在小鼠细胞中表达人类β干扰素cDNA亦参见Reyes等人，Nature 297：598-601(1982)。或者，可使用劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)之长末端重复序列作为启动子。
增强子组件组份-藉由较高真核生物转录编码本文所述之抗HCV抗体(诸如，人源化AP33抗体)之DNA通常藉由向载体中插入增强子序列来增强。现已知多种来自哺乳动物基因(血球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰岛素)之增强子序列。然而，吾人通常将使用来自真核细胞病毒之增强子。实例包括复制起点(bp 100-270)后侧之SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧之多形瘤增强子及腺病毒增强子。关于用于活化真核启动子之强化组件，亦可参看Yaniv，Nature 297：17-18(1982)。增强子可在HCV结合抗体编码序列之位置5′或3′剪接至载体内，但优选位于启动子之5′位点。
转录终止组份-用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或来自其它多细胞生物体之有核细胞)之表达载体亦将含有终止转录及稳定mRNA所必需的序列。此等序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA之5′且有时3′非转译区获得。一种适用之转录终止组份为牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO 94/11026及其中所揭示之表达载体。
含有多核苷酸序列(例如，可变重链及/或可变轻链编码序列及可选之表达控制序列)之载体可藉由熟知方法转移至宿主细胞，该等方法视细胞宿主类型而变化。举例而言，通常将氯化钙转染用于原核细胞，而可将磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、生物弹道学或基于病毒之转染用于其它细胞宿主。(一般参见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual ColdSpring Harbor Press，第2版，1989)。用于使哺乳动物细胞转化之其它方法包括使用聚凝胺(polybrene)、原生体融合、脂质粒、电穿孔及微注射(一般参见，Sambrook等人，上文)。对于产生转基因动物而言，转基因可显微注射至已受精卵母细胞中，或可并入至胚胎干细胞之染色体组中，且将该等细胞之核转移至去核卵母细胞中。
当在单独表达载体上克隆重链及轻链时，将载体共转染以获得整个免疫球蛋白之表达及装配。表达后，整个抗体、其二聚体、个别轻链及重链或其它免疫球蛋白形式可根据此项技术之标准程序纯化，该等程序包括硫酸铵沈淀、亲和力管柱、管柱层析法、HPLC纯化、凝胶电泳及其类似程序(一般参见，Scopes，Protein Purification Springer-Verlag，N.Y.，(1982))。对于医药用途而言，至少约90至95％均质性的实质上纯免疫球蛋白为优选，且最优选为98至99％或更高均质性。
构建体
本发明进一步提供包含如本文所述之多核苷酸的核酸构建体。
通常，构建体将为允许在合适宿主中表达由多核苷酸编码之多肽的表达载体。构建体可包含(例如)一或多种以下物质：在宿主中具有活性之启动子；一或多个调节序列，诸如增强子；复制起点；及标记物，优选为可选择之标记物。宿主可为真核宿主或原核宿主，尽管优选为真核宿主(且尤其为哺乳动物)。合适启动子之选择将明显在一定程度上取决于所用宿主细胞，但可包括来自人类病毒(诸如，HSV、SV40、RSV及其类似物)之启动子。多数启动子对彼等熟习此项技术者而言系已知的。
构建体可包含编码多肽之多核苷酸，该多肽包含三个轻链高变环或三个重链高变环。或者，多核苷酸可编码多肽，该多肽包含藉由适当长度之合适可挠性连接子结合在一起的三个重链高变环及三个轻链高变环。另一可能性为单个构建体可包含编码两个单独多肽(一者包含轻链环且一者包含重链环)之多核苷酸。单独多肽可独立地表达或可形成单个常见操纵子之部分。
该构建体可包含一或多个调节特征，诸如增强子、复制起点及一或多个标记物(可选择或其它)。该构建体可采取质粒、酵母人工染色体、酵母微小染色体之形式，或整合入病毒(尤其，对人类不具病原性之减毒病毒或类似物)染色体组之所有或部分中。
该构建体可经便利地调配用于向哺乳动物(优选人类)个体安全投与。通常，其将以复数个等分试样形式提供，各等分试样含有用于使至少一个正常成年人类个体有效免疫之足够构建体。
构建体可以液体或固体形式提供，优选为在使用前以无菌水性液体复水之冻干粉末形式。
构建体可经具有增加个体响应于构建体投与之免疫反应(例如，由特异性抗体滴度量测)之作用的佐剂或其它组份调配。
载体
术语″载体″包括表达载体及转化载体及穿梭载体。
术语″表达载体″意谓能活体内或活体外表达之构建体。
术语″转化载体″意谓能由一实体转移至另一实体(其可为该物种或可为不同物种)之构建体。若构建体能由一物种转移至另一物种(诸如，由大肠埃希氏菌(Escherichia coli)质粒转移至诸如芽孢杆菌属(genus Bacillus)之细菌)，则转化载体有时称为″穿梭载体″。其甚至可为能由大肠杆菌质粒转移至植物之农杆菌(Agrobacterium)之构建体。
载体可转化至如下文所述之合适宿主细胞中以提供本发明所涵盖之多肽的表达。因此，在另一方面中本发明提供制备用于本发明之多肽的方法，该方法包含在提供由编码多肽之编码序列之载体表达的条件下培养以如上文所述之表达载体转化或转染之宿主细胞，且回收所表达之多肽。
载体可为(例如)具有复制起点、视情况表达该多肽之启动子及视情况启动子之调节子的质粒、病毒或噬菌体载体。
载体可含有一或多个此项技术中熟知之可选择之标记基因。
宿主细胞
本发明进一步提供宿主细胞(诸如活体外宿主细胞)，其包含本文所述之多核苷酸或构建体。宿主细胞可为(例如)细菌、酵母或其它真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
本发明亦提供转基因多细胞宿主生物体，其已经遗传学操作从而产生本发明之多肽。生物体可为(例如)转基因哺乳动物生物体(例如，转基因山羊或小鼠细胞系)。
大肠杆菌为可使用之原核宿主。其它微生物宿主包括杆菌，诸如枯草杆菌(Bacillus subtilis)；及其它肠内菌科，诸如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)；及多种假单胞菌种(Pseudomonas species)。在此等原核宿主中，吾人亦可制造表达载体，其通常将含有与宿主细胞兼容之表达控制序列(例如，复制起点)。此外，将存在许多各种熟知启动子，诸如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或噬菌体λ之启动子系统。该等启动子通常视情况与操纵基因(operator sequence)一起控制表达，且具有用于起始且完成转录及转译之核糖体结合位点序列及其类似序列。
可将其它微生物(诸如，酵母)用于表达。糖酵母(Saccharomyces)为具有合适载体之优选酵母宿主，该等载体视需要具有表达控制序列(例如，启动子)，复制起点、终止序列及其类似物。典型启动子包括3-磷酸甘油酸激酶及其它糖解酶。诱导性酵母启动子尤其包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C及负责麦芽糖及半乳糖利用之酶的启动子。
除微生物外，哺乳动物组织细胞培养物亦可用于表达及产生如本文所述之人源化抗体或其片段，且在一些状况下，此为优选的(参见Winnacker，From Genes to Clones，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.(1987)。对于一些实施例而言，真核细胞(例如，COS7细胞)可为优选的，因为在此项技术中已研发能分泌异源蛋白质(例如，完整免疫球蛋白)之多种合适宿主细胞系，且包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞，优选骨髓瘤细胞系或经转化B-细胞或杂交瘤。
在一些实施例中，宿主细胞为脊椎动物宿主细胞。适用哺乳动物宿主细胞系之实例为经SV40转化之猴肾脏CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人类胚胎肾脏细胞系(用于在悬浮液培养物中生长之293或次克隆之293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾脏细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))或CHO-DP-12细胞系；小鼠塞托利细胞(sertolicell)(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾脏细胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲绿猴肾脏细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人类宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾脏细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；及人类肝癌细胞系(Hep G2)。
或者，可将抗体编码序列并入至用于引入转基因动物之染色体组中的转基因中且随后在转基因动物之奶中表达(例如参见，Deboer等人，美国专利第5,741,957号，Rosen，美国专利第5,304,489号及Meade等人，美国专利第5,849,992号)。合适转基因包括与来自乳腺特异性基因(诸如酪蛋白或β乳球蛋白)之启动子及增强子可操作地连接之轻链及/或重链之编码序列。
或者，本文所述之抗体可在转基因植物中产生(例如，烟草、玉米、大豆及紫苜蓿)。改良之植物抗体载体(Hendy等人(1999)J.Immunol.Methods231：137-146)及与增加可转化作物物种结合之纯化策略使该等方法成为产生不仅用于人类及动物疗法，而且亦用于工业应用之重组免疫球蛋白(例如，催化抗体)的实际且有效方式。此外，已展示植物产生之抗体为安全且有效的且避免使用动物产生之材料。此外，植物及哺乳动物细胞产生之抗体的糖基化模式之间的差异对抗原结合或特异性几乎不具有或不具有作用。此外，在接受植物产生之分泌二聚IgA抗体之局部经口应用的患者体内未观测到毒性或HAMA之证据(参见Larrick等人(1998)Res.Immunol.149：603-608)。
可于细菌中产生全长抗体、抗体片段及抗体融合蛋白，当不需要糖基化及Fc效应功能时，诸如当治疗抗体与细胞毒性剂(例如毒素)结合且免疫结合物自身展示肿瘤细胞破坏之有效性时尤其如此。全长抗体在循环中具有较长半衰期。在大肠杆菌中之产生更快且更具成本效益。抗体片段及多肽在细菌中之表达参见(例如)美国专利第5,648,237号(Carter等人)、美国专利第5,789,199号(Joly等人)及美国专利第5,840,523号(Simmons等人)，此等专利描述用于最佳表达及分泌之转译起始区(TIR)及信号序列，此等专利以引用的方式并入本文中。表达后，自大肠杆菌细胞糊状物可溶部分中分离抗体且其可视同型而定(例如)经由蛋白A或G管柱纯化。可类似于纯化(例如)表达于CHO细胞中之抗体之方法来进行最终纯化。
用于表达糖基化抗HCV抗体(诸如，人源化AP33抗体)之合适宿主细胞系由多细胞生物体产生。无脊椎动物细胞之实例包括植物及昆虫细胞。已识别出多种杆状病毒株及变体与来自诸如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)及家蚕(Bombyxmori)之宿主的相应被动侵入昆虫宿主细胞。多种用于转染之病毒株系可用的，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica NPV)之L-1变体及家蚕NPV之Bm-5病毒株，且该等病毒在本文中可用作根据本发明之病毒，尤其用于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞转染。
抗体纯化
当使用重组技术时，抗体可于细胞内、周质空间中产生或直接分泌至培养基中。若抗体于细胞内产生，则作为第一步，例如藉由离心或超滤移除宿主细胞或已溶解片段之微粒碎片。Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述用于分离分泌至大肠杆菌周质空间中的抗体之程序。简言之，细胞糊状物系在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺酰基氟(PMSF)存在下经约30min解冻。可藉由离心分离移除细胞碎片。在抗体分泌至培养基中之状况下，一般首先使用市售蛋白浓缩过滤器(例如Amicon或MilliporePellicon超滤装置)浓缩来自该等表达系统之上清液。诸如PMSF之蛋白酶抑制剂可包括于前述步骤中之任一者中以抑制蛋白质水解且抗生素可包括在内以防止外来污染物生长。
由该等细胞所制备之抗体组合物可使用(例如)羟磷灰石层析、凝胶电泳、渗析及亲和力层析来纯化且亲和力层析为优选纯化技术。蛋白A作为亲和配位体之适用性视存在于抗体中之任何免疫球蛋白Fc域的物种及同型而定。蛋白A可用于纯化基于人类γ1、γ2或γ4重链之抗体(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同型及人类γ3(Guss等人，EMBO J.5：15671575(1986))。亲和力配位体所附着之基质最通常为琼脂糖，但可使用其它基质。与使用琼脂糖可达成之流动速率及处理时间相比，诸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯之机械稳定基质允许更快之流动速率及更短之处理时间。当抗体包含CH3域时，BakerbondABXTM树脂(J.T.Baker；Phillipsburg，N.J.)适用于纯化。视待回收之抗体而定，用于蛋白质纯化之其它技术亦可用，诸如在离子交换管柱上分馏、乙醇沈淀、逆相HPLC、二氧化硅层析、肝素SEPHAROSETM层析、以阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸管柱)层析、层析聚焦、SDS-PAGE及硫酸铵沈淀。
继任何初步纯化步骤之后，可使用pH值为约2.5-4.5之间的溶离缓冲液使包含所关注之抗体及污染物之混合物经受低pH疏水性相互作用层析，且优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行。
IV.抗体偶联物
可使抗体与细胞毒性剂(诸如，毒素或放射性同位素)偶联。在某些实施例，毒素优选为卡奇霉素(calicheamicin)、美登素类化合物(maytansinoid)、海兔毒素(dolastatin)、奥瑞他汀E(auristatin E)及其类似物或衍生物。
优选药物/毒素包括DNA毁坏剂、微管聚合或解聚合之抑制剂及抗代谢物。优选细胞毒性剂之类别包括(例如)酶抑制剂(诸如，二氢叶酸还原酶抑制剂及胸苷酸合成酶抑制剂)、DNA嵌入剂、DNA断裂剂、拓扑异构酶抑制剂、蒽环霉素药物家族、长春花药物、丝裂霉素、博莱霉素(bleomycin)、细胞毒性核苷、喋啶药物家族、二炔剂(diynene)、鬼臼毒素及分化诱发剂。彼等类别之尤其有用之成员包括(例如)甲氨喋呤、甲喋呤、二氯甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、胞嘧啶阿拉伯糖苷、美法仑(melphalan)、环氧长春碱(leurosine)、异长春碱(leurosideine)、放线菌素(actinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、羟道诺红霉素(doxorubicin)、N-(5，5-二乙酰氧基戊基)羟道诺红霉素、吗啉基-羟道诺红霉素、1-(2-氯乙基)-1，2-二甲烷磺酰肼、N8-乙酰基亚精胺、氨基蝶呤甲喋呤、埃斯培拉霉素(esperamicin)、丝裂霉素C(mitomycin C)、丝裂霉素A、放线菌素、博莱霉素、洋红霉素、氨基蝶呤、泰来霉素(tallysomycin)、鬼臼毒素及鬼臼毒素衍生物(诸如，依托泊苷(etoposide)或磷酸依托泊苷)、长春碱、长春新碱、长春地辛(vindesine)、紫杉酚、紫杉德(taxotere)、视黄酸、丁酸、喜树碱、卡奇霉素、苔藓虫素、西非洛他汀(cephalostatin)、安丝菌素(ansamitocin)、阿托新(actosin)、美登素类化合物(诸如DM-1)、美登素(maytansine)、美登素醇(maytansinol)、N-去甲基-4，5-去环氧基美登素醇、C-19-脱氯美登素醇、C-20-羟基美登素醇、C-20-脱甲氧基美登素醇、C-9-SH美登素醇、C-14-烷氧基甲基美登素醇、C-14-羟基或乙酰氧基甲基美登素醇、C-15-羟基/乙酰氧基美登素醇、C-15-甲氧基美登素醇、C-18-N-脱甲基美登素醇及4，5-脱氧基美登素醇、奥瑞他汀(诸如奥瑞他汀E、M、PHE及PE)；海兔毒素，诸如海兔毒素A、海兔毒素B、海兔毒素C、海兔毒素D、海兔毒素E(20-表及11-表)、海兔毒素G、海兔毒素H、海兔毒素I、海兔毒素1、海兔毒素2、海兔毒素3、海兔毒素4、海兔毒素5、海兔毒素6、海兔毒素7、海兔毒素8、海兔毒素9、海兔毒素10、脱氧海兔毒素(deo-dolostatin)10、海兔毒素11、海兔毒素12、海兔毒素13、海兔毒素14、海兔毒素15、海兔毒素16、海兔毒素17及海兔毒素18；西非洛他汀，诸如西非洛他汀1、西非洛他汀2、西非洛他汀3、西非洛他汀4、西非洛他汀5、西非洛他汀6、西非洛他汀7、25′-表-西非洛他汀7、20-表-西非洛他汀7、西非洛他汀8、西非洛他汀9、西非洛他汀10、西非洛他汀11、西非洛他汀12、西非洛他汀13、西非洛他汀14、西非洛他汀15、西非洛他汀16、西非洛他汀17、西非洛他汀18及西非洛他汀19。
美登素类化合物为藉由抑制微管蛋白聚合发挥作用之有丝分裂抑制剂。美登素最先系自东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离(美国专利第3,896,111号)。随后，发现某些微生物类亦产生美登素类化合物，诸如美登素醇及C-3美登素醇酯(美国专利第4,151,042号)。合成美登素醇及其衍生物及类似物(例如)揭示于美国专利第4,137,230号；第4,248,870号；第4,256,746号；第4,260,608号；第4,265,814号；第4,294,757号；第4,307,016号；第4,308,268号；第4,308,269号；第4,309,428号；第4,313,946号；第4,315,929号；第4,317,821号；第4,322,348号；第4,331,598号；第4,361,650号；第4,364,866号；第4,424,219号；第4,450,254号；第4,362,663号及第4,371,533号中，其揭示内容系以引用的方式明确并入本文中。
美登素及美登素类化合物已偶联与肿瘤细胞抗原特异性偶联之抗体。含有美登素类化合物之免疫偶联物及其治疗用途揭示于(例如)美国专利第5,208,020号、第5,416,064号及欧洲专利EP 0 425 235 B1中，其揭示内容系以引用的方式明确并入本文中。Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：8618-8623(1996)描述包含连接至针对人类结肠直肠癌之单克隆抗体C242之美登素类化合物(命名为DM1)的免疫偶联物。发现偶联物对所培养之结肠癌细胞具有高细胞毒性且在活体内肿瘤生长检定中展示出抗肿瘤活性。Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)描述免疫偶联物，其中美登素类化合物经由二硫化物连接子与偶联至人类结肠癌细胞系上之抗原的鼠抗体A7偶联，或与偶联HER-2/neu致癌基因之另一鼠单克隆抗体TA.1偶联。
此项技术中已知许多用于制备抗体-美登素类化合物偶联物之连接基团，包括(例如)彼等揭示于美国专利第5,208,020号或欧洲专利0 425 235 B1，及Chari等人.Cancer Research 52：127-131(1992)中者。连接基包括二硫基团、硫醚基团、酸不稳定性基团、光不稳定性基团、肽酶不稳定性基团或酯酶不稳定性基团，如上文识别之专利中所揭示二硫基团及硫醚基团优选。
抗体与美登素类化合物之偶联物可使用多种双功能蛋白偶联剂制得，该等蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-甲酸酯、亚氨基硫雑环戊烷(IT)、酰亚胺酯之双功能衍生物(诸如己二亚氨酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双迭氮基化合物(诸如双(对迭氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮盐衍生物(诸如双-(对重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)及双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。尤其优选之偶联剂包括提供二硫键之N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人，Biochem.J.173：723-737(1978))及N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)。
可视连接类型而定将连接子附接于美登素类化合物分子之各位置处。举例而言，可藉由使用习知偶联技术与羟基反应形成酯键。反应可发生于具有羟基之C-3位置、经羟甲基改质之C-14位置、经羟基改质之C-15位置及具有羟基之C-20位置处。在一优选实施例中，键结形成于美登素醇或美登素醇类似物之C-3位置处。
所关注之另一免疫偶联物包含与一或多个卡奇霉素分子偶联之抗HCV抗体(诸如人源化APP-33抗体)。卡奇霉素家族之抗生素能够在亚皮莫耳浓度下产生双链DNA断裂。有关卡奇霉素家族偶联物之制备，参见美国专利第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号及第5,877,296号(均颁予AmericanCyanamid Company)。可使用之卡奇霉素之结构类似物包括(但不限于)γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG及θ1 1(Hinman等人。Cancer Research 53：3336-3342(1993)，Lode等人。Cancer Research 58：2925-2928(1998)及前述颁予AmericanCyanamid之美国专利)。可与抗体偶联之另一抗肿瘤药物为QFA，其为抗叶酸剂。卡奇霉素与QFA皆具有细胞内作用位点且不易于跨过质膜。因此，细胞经由抗体介导之内化作用摄取此等药剂显著增强其细胞毒性作用。
放射性同位素
为选择性破坏HCV感染细胞，抗体可包含高放射性原子。可使用多种放射性同位素产生放射性偶联抗HCV抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。当偶联物系用于诊断时，其可包含用于闪烁造影研究的放射性原子，例如Tc99m或I123；或用于核磁共振(NMR)成像(亦称为磁共振成像，mri)之自旋标记物，又诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以已知方式将放射性标记或其它标记并入偶联物中。举例而言，肽可生物合成，或可藉由使用合适氨基酸前驱物进行化学氨基酸合成(例如涉及以氟-19置换氢)来合成。诸如Tc99m或I123、Re186、Re188及In111之标记可经由肽中之半胱氨酸残基附接。可经由赖氨酸残基附接钇-90。可使用IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57来并入碘-123。″Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy″(Chatal，CRCPress 1989)详细地描述其它方法。
抗体与细胞毒性剂之偶联物可使用多种双功能蛋白偶联剂制得，该等蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-甲酸酯、亚氨基硫雑环戊烷(IT)、酰亚胺酯之双功能衍生物(诸如己二亚氨酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双迭氮基化合物(诸如双(对迭氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮盐衍生物(诸如双-(对重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)及双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。举例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science，238：1098(1987)中所述制备。碳14标记之1-异硫氰氧基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种用于使放射性核苷酸与抗体偶联之例示性螯合剂。参见WO 94/11026。连接子可为促进细胞毒性药物在细胞中释放之″可裂解连接子″。举例而言，可使用酸不稳定连接子、肽酶敏感性连接子、光不稳定连接子、二甲基连接子或含有二硫化物之连接子(Chari等人.CancerResearch 52：127-131(1992)；美国专利第5,208,020号)。
V.医药组合物
适用于本发明之医药组合物可包含治疗有效量之人源化抗体或其片段及医药学上可接受之载剂、稀释剂或赋形剂(包括其组合)。
该等医药组合物可用于人类或动物用途中的人用药及兽用药，且通常将包含任何一或多种医药学上可接受之稀释剂、载剂或赋形剂。治疗用途之可接受之载剂或稀释剂在医药技术中为熟知的，且描述于(例如)Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编，1985)中。可接受之载剂、赋形剂或稳定剂在所采用剂量及浓度下对接受者无毒且包括：缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；氯苄烷铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，诸如甘氨酸、麸胺酰胺、天冬酰氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单醣、二醣及其它醣类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；盐形成性抗衡离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；及/或非离子界面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
可关于所欲投与途径及标准医药规范选择医药载剂、赋形剂或稀释剂。与载剂、赋形剂或稀释剂一样(或另外)，该等医药组合物可包含任何合适之黏合剂、润滑剂、悬浮剂、涂覆剂或增溶剂。
可在该医药组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料以及甚至芳香剂。防腐剂之实例包括苯甲酸钠、山梨酸及对羟基苯甲酸酯。亦可使用抗氧化剂及悬浮剂。
视不同传递系统而定，可存在不同组合物/调配物需求。作为实例，可调配适用于本发明之医药组合物以使用微型泵或藉由黏膜途径进行投与，例如调配为鼻喷雾或吸入气雾剂或口服溶液，或调配为非经肠制剂，其中将该组合物调配为可注射形式，而藉由(例如)静脉内、肌肉内或皮下注射进行传递。或者，可设计该调配物以便经多种途径进行投与。
人源化抗体或其片段亦可用于与环糊精组合。已知环糊精可与药物分子形成包涵体及非包涵体复合物。药物-环糊精复合物之形成可修改药物分子之溶解度、解离速率、生物可用性及/或稳定性。药物-环糊精复合物一般适用于大多数剂型及投药途径。作为与药物直接复合之替代，环糊精可用作辅助添加剂，例如用作载剂、稀释剂或增溶剂。α-环糊精、β-环糊精及γ-环糊精为最常用的，且合适实例描述于WO-A-91/11172、WO-A-94/02518及WO-A-98/55148。
若需要，亦可将医药组合物并入至脂质粒、微球体或其它聚合物基质中。例如，由磷脂或其它脂质组成之脂质粒为无毒、生理学上可接受且可代谢之载剂，其相对易于制造及投与。
亦可将抗体包裹于例如藉由凝聚技术或界面聚合制备之微胶囊(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，包裹于胶状药物传递系统(例如，脂质粒、白蛋白微球体、微乳液、奈米颗粒及奈米胶囊)或巨乳液中。该等技术揭示于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980)中。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂之合适实例包括含有拮抗剂之固体疏水性聚合物的半透性基质，该等基质呈成型物品之形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质之实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美国专利第3,773,919号)、L-麸氨酸与乙基-L-麸氨酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)构成的可注射微球体))及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
待用于活体内投与之调配物必须为无菌的。其易于藉由经无菌过滤膜进行过滤来实现。
人源化抗体或其片段甚至可在所治疗之个体体内原位制备。在此方面中，编码该人源化抗体或其片段之核苷酸序列可藉由使用非病毒技术(例如，藉由使用脂质粒)及/或病毒技术(例如，藉由使用逆转录病毒载体)传递，使得该蛋白质自该核苷酸序列得以表达。
该等医药组合物可用于本文所述之任何方法。
医药组合物可在彼等易感染HCV之个体(例如，人类)中使用，亦即防止或降低/减少HCV感染之发生。
医药组合物可在彼等已感染HCV之个体(例如，人类)中使用，亦即治疗HCV感染。该治疗可促进病毒自彼等急性或慢性感染之个体(包括经历肝移植之感染患者)的清除。
因此，本发明在另一方面中提供用于治疗及/或预防C型肝炎病毒感染之方法，其包含使用人源化抗体或人源化抗体片段或医药组合物。合适地，向个体投与有效量之人源化抗体或人源化抗体片段或医药组合物。在一些实施例中，以治疗有效量投与人源化抗体或人源化抗体片段以实现有益临床结果，包括(但不限于)改善一或多种HCV感染症状或HCV感染之方面。在一些实施例中，以治疗有效量投与人源化抗体或人源化抗体片段以减少HCV之病毒滴度及/或病毒负荷。
亦提供人源化抗体或其片段或医药组合物用于治疗及/或预防个体之C型肝炎病毒感染。
亦提供人源化抗体或其片段或医药组合物之用途，其系用于制造用以治疗及/或预防个体之C型肝炎病毒感染的组合物。
抗体可以(例如)免疫血清形式投与或更优选可为经纯化重组或单克隆抗体。制造具有所要特异性之血清或单克隆抗体之方法对于彼等熟习此项技术者而言为常规且熟知的。熟习此项技术者理解抗体可藉由各种途径(包括(例如)注射、插管、经由栓剂)经口或局部投与，其中后一者可为被动(例如，藉由直接涂覆含有抗体之软膏或粉末)或主动的(例如，使用鼻喷雾或吸入剂)。若需要，则抗体亦可作为局部喷雾投与，在该状况下组合物之一种组份为适当推进剂。
本文所述之人源化抗体及其片段可根据已知方法投与个体，诸如藉由静脉内投与(例如以快速输注(bolus)或藉由连续输注一段时间)、藉由皮下、肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内或吸入途径投与，一般藉由静脉内或皮下投与。
优选地，所投与之抗体经实质上纯化(例如，优选至少95％均质性，更优选至少97％均质性，最优选至少98％均质性，如SDS-PAGE所判断)。
合适地，被动免疫方案可便利地包含投与本文所述之人源化抗体或其片段及/或投与抗体与其它抗病毒治疗化合物组合。最近，该等被动免疫技术已安全地用于治疗HIV感染(Armbruster等人，J.Antimicrob.Chemother.54，915-920(2004)；Stiegler及Katinger，J.Antimicrob.Chemother.51，757-759(2003))。
本发明之主动或被动免疫法应可保护或治疗个体抵抗HCV基因型1-6中任一病毒的感染，例外为极偶然之突变分离株(诸如下文UKN5.14.4例示者)，该分离株含有几个与上文定义之一致肽表位之氨基酸不同的氨基酸。
在一些实施例中，人源化抗体或其片段可与第二治疗剂组合投与。在一些实施例中，第二治疗剂为抗病毒治疗剂。在一些实施例中，人源化抗体或其片段系与第二治疗剂组合、相继、同时、连续、轮流或间歇投与。在一些实施例中，投与人源化抗体或其片段与第二治疗剂之组合改善一或多种HCV症状、降低及/或抑制病毒滴度及/或病毒负荷，及/或防止HCV超过单独以人源化抗体或其片段或第二治疗剂治疗。
VI.诊断
在另一方面中，提供一种测定或侦测样本中HCV之存在的诊断测试设备及方法。该设备可包含一或多种如本文所述之人源化抗体或其片段作为试剂。例如，抗体可固定于固体支撑物上(例如在微量滴定检定盘上或微粒支撑物上)且用于自样本(例如血液或血清样本或其它临床试样-诸如肝脏活组织检查)″捕获″HCV颗粒。所捕获之病毒颗粒接着可藉由(例如)添加与所捕获之病毒颗粒偶联的另一经标记试剂来侦测。便利地，检定可采用ELISA形式，尤其夹层型ELISA形式，但原则上可采用任何其它检定格式(例如，放射免疫检定，西方墨点法)，包括免疫层析或测深尺型检定。
对于诊断目的而言，本文所述之人源化抗体或其片段可经标记或未经标记。未经标记之抗体可与其它经标记之抗体(第二抗体)组合使用。或者，抗体可直接经标记。可采用多种标记物-诸如放射核种、氟、酶、酶受质、酶辅因子、酶抑制剂、配位体(尤其半抗原)等。可获得多种类型之免疫检定且该等检定为彼等熟习此项技术者所熟知。
因为本文所述之人源化抗体或其片段可与来自基因型1-6中任一者之HCV偶联，所以检定设备及相应方法应能够侦测样本中由此等基因型中之任一者表示的HCV。
在一些实施例中，将样本与对照样本比较。在一些实施例中，对照样本系来自已知感染HCV之个体。在一些实施例中，已知个体感染一或多种选自由基因型1(例如，基因型1a及基因型1b)、基因型2(例如，基因型2a、基因型2b、基因型2c)、基因型3(例如，基因型3a)、基因型4、基因型5及基因型6组成之群的HCV基因型。在一些实施例中，对照样本系来自已知未感染HCV之个体。
在一些实施例中，所述治疗方法中之任一者系基于藉由本文所述之人源化抗体或其片段中之任一者测定或侦测样本中之HCV。如本文所用，″基于″包括(1)如本文所述评定、测定或量测个体特征(且优选选择适于接收治疗之个体)；及(2)投与如本文所述之治疗。
在一些实施例中，提供识别个体是否适于以人源化抗体或其片段治疗之方法。
药剂(agent)
在另一方面中，提供用于识别可改良或增强本文所述之人源化抗体或其片段之中和活性功效之药剂的检定方法。
本文提供用于识别可改良或增强人源化抗体或其片段针对C型肝炎病毒之中和活性功效之药剂的检定方法，该方法包含以下步骤：(a)使该人源化抗体或其抗原结合片段与待测试之药剂接触；及(b)判定该药剂是否改良或增强人源化抗体或其抗原结合片段中和C型肝炎病毒传染性之功效。
在一些实施例中，将药剂改良或增强人源化抗体或其片段针对C型肝炎病毒之中和活性功效的能力与对照比较。在一些实施例中，对照为不存在药剂之状况下的人源化抗体或其片段。在一些实施例中，对照为具有安慰剂(例如，水、盐水、糖水等)之人源化抗体或其片段。
如本文所用，术语″药剂″可为单个实体或其可为实体组合。
药剂可为有机化合物或其它化学品。药剂可为可自任何合适来源(天然或人工)获得或产生之化合物。药剂可为氨基酸分子、多肽或其化学衍生物或其组合。药剂甚至可为多核苷酸分子-其可为有义或反义分子。药剂甚至可为抗体。
药剂可自化合物库(可包含肽以及其它化合物，诸如小有机分子)设计或获得。
以实例之方式，药剂可为天然物质、生物巨分子或由生物材料(诸如，细菌、真菌或动物(尤其哺乳动物)细胞或组织)制成之提取物、有机或无机分子、合成药剂、半合成药剂、结构或功能仿真物、肽、肽模拟物、衍生剂(derivatized agent)、自整个蛋白质裂解之肽或合成学上合成之肽(诸如(以实例之方式)使用肽合成器或藉由重组技术或其组合)、重组剂、抗体、天然或非天然药剂、融合蛋白或其等效物及其突变体、衍生物或组合。
通常，药剂将为有机化合物。通常，有机化合物将包含两个或两个以上烃基。本文中，术语″烃基″意谓包含至少C及H且可视情况包含一或多个其它合适取代基之基团。该等取代基之实例可包括卤基-、烷氧基-、硝基-、烷基、环状基团等。除了取代基为环状基团之可能性之外，取代基之组合可形成环状基团。若烃基包含以上C，则彼等碳不必彼此连接。举例而言，碳中之至少两者可经由合适元素或基团连接。因此，烃基可含有杂原子。合适杂原子对彼等熟习此项技术者将显而易见且包括(例如)硫、氮及氧。对于一些应用而言，药剂优选包含至少一个环状基团。环状基团可为多环基团，诸如非稠合多环基团。对于一些应用而言，药剂包含该等与另一烃基连接之环状基团中之至少一者。
药剂可含有卤基。在本文中，″卤基″意谓氟、氯、溴或碘。
药剂可含有烷基、烷氧基、烯基、伸烷基及伸烯基中之一或多者-其可为非支链或支链。
VII.治疗用途
人源化抗HCV抗体及其片段或包含其之医药组合物适用于减少、消除或抑制HCV感染且可用于治疗至少部分由HCV感染表征的任何病理学病况。人源化抗体及其片段及/或医药组合物可用于治疗HCV感染。人源化抗体及其片段及/或医药组合物亦可用于预防HCV感染之方法中。
术语″C型肝炎病毒″或″HCV″为此项技术中熟知且系指为黄病毒家族之肝炎病毒属(genus Hepacivirus)之一员的病毒。HCV为具有约55-65nm之直径的脂质包膜病毒，其在直径中具有正链RNA染色体组。C型肝炎病毒物种分为6种基因型(1-6)，在各基因型内具有若干子类型。在一些实施例中，个体感染有一或多种选自由基因型1(例如，基因型1a及基因型1b)、基因型2(例如，基因型2a、基因型2b、基因型2c)、基因型3(例如，基因型3a)、基因型4、基因型5及基因型6组成之群的HCV基因型。在北美，主要为基因型1a，接着为1b、2a、2b及3a。在欧洲，主要为基因型1b，随后为2a、2b、2c及3a。基因型4及5几乎全部发现于非洲。
本文提供治疗人类体内C型肝炎病毒感染之方法，该方法包含投与有效量之本文所述之其人源化抗体片段。在一些实施例中，″治疗″为获得有益或所要结果(包括临床结果)之方法。对本发明之目的而言，有益或所要临床结果包括(但不限于)以下结果中之一或多者：减少由疾病产生之一或多种症状、减轻疾病程度、使疾病稳定(例如，预防或延迟疾病恶化)、延迟或减缓疾病进程、改善疾病状态、减少治疗疾病所需之一或多种其它药物的剂量及/或提高生活质量。
在一些实施例中，本文所述之人源化抗HCV抗体及其片段或包含其之医药组合物适用于治疗急性HCV感染之方法。在一些实施例中，治疗急性HCV感染包括减轻、消除或抑制急性HCV感染。本文所用之术语″急性C型肝炎病毒感染″或″急性HCV感染″系指HCV感染后的前6个月。在一些实施例中，患有急性HCV感染之个体将不会显现任何症状(亦即，无急性HCV感染症状)。60％至70％之间的患有急性HCV感染之个体在急性期不显现任何症状。在一些实施例中，患有急性HCV感染之个体将显现症状。在一些实施例中，本文所述之治疗方法改善急性HCV感染之一或多种症状(例如，减少该等症状之发生率、减少该等症状之持续时间、降低或减轻该等症状之严重程度)。在少数经历急性期症状之患者中，症状一般为轻微的且非特异性的，且很少导致C型肝炎之特异性诊断。急性C型肝炎感染之症状包括食欲降低、疲劳、腹部疼痛、黄疸、瘙痒及流感样症状。在一些实施例中，患有急性HCV感染之个体经基因型1之HCV感染。基因型1之急性HCV感染(injection)期间的治疗具有90％以上的成功率，而治疗时间为慢性感染所需之治疗时间的一半。
在一些实施例中，本文所述之人源化抗HCV抗体及其片段或包含其之医药组合物适用于治疗慢性HCV感染之方法。在一些实施例中，治疗慢性HCV感染包括减轻、消除或抑制慢性HCV感染。本文所用之术语″慢性C型肝炎病毒感染″或″慢性HCV感染″系指经HCV感染持续6个月以上。在一些实施例中，本文所述之治疗方法改善慢性HCV感染之一或多种症状(例如，减少该等症状之发生率、减少该等症状之持续时间、降低或减轻该等症状之严重程度)。慢性HCV感染症状包括疲劳、显著体重减轻、流感样症状、肌肉疼痛、关节疼痛、间歇性低烧、瘙痒、睡眠障碍、腹部疼痛(尤其右上四分体)、食欲改变、恶心、腹泻、消化不良、认知改变、抑郁、头疼及情绪波动。一旦慢性HCV发展为肝硬化，可出现一般由降低之肝功能或增加之肝循环压力引起的信号及症状(此系称为门静脉高压症之病状)。肝硬化之可能信号及症状包括腹水、挫伤及易出血、骨痛、静脉曲张(尤其在胃部及食道)、脂肪粪(脂肪痢)、黄疸及称为肝性脑病之认知障碍症候群。在一些实施例中，慢性HCV感染可导致肝细胞癌(HCC)。慢性HCV感染可进一步分为两种类型(其中一者或两者包括于本文提供之治疗方法中)：慢性活动性HCV感染及慢性持久性HCV感染。慢性活动性HCV感染为对肝脏造成活动性损伤之HCV。慢性持久性HCV感染为目前不对肝造成损伤之慢性HCV感染，尽管可能存在预先存在之肝损伤。
在一些实施例中，可在肝移植之前、同时或之后向感染HCV之个体投与人源化抗体或其片段。
在任一种治疗方法的一些实施例中，本文所述之人源化抗HCV抗体及其片段或包含其之医药组合物适用于治疗方法中，该等治疗方法包括抑制HCV感染之一或多个方面。在一些实施例中，HCV感染为慢性HCV感染。在一些实施例中，HCV感染为急性HCV感染。在一些实施例中，本文所述之方法抑制与HCV有关之实验室发现(例如，血液中的ALAT、AST及GGTP含量)、病毒复制、病毒滴度、病毒负荷或病毒血症。
在一些实施例中，本文所述之方法抑制或降低病毒滴度。″病毒滴度″在此项技术中已知且表明给定生物样本中之病毒量。在一些实施例中，本文所述之方法抑制或降低病毒血症。″病毒血症″在此项技术中已知为血流中存在病毒及/或血液或血清样本中存在病毒滴度。在一些实施例中，本文所述之方法抑制或降低病毒负荷。″病毒负荷″系指个体血液中C型肝炎病毒之量。C型肝炎病毒负荷测试(称为病毒RNA测试或HCV RNA测试)之结果一般表示为国际单位/mL(IU/mL)或RNA拷贝数/mL。认为具有1,000,000IU/mL或更高之C型肝炎病毒负荷的个体具有高病毒负荷。病毒量(例如，病毒滴度或病毒负荷)由各种量测表示，包括(但不限于)病毒核酸量、病毒颗粒之存在、复制单元(RU)、空斑形成单元(PFU)。一般而言，对于诸如血液及尿之液体样本而言，测定每单位液体(诸如毫升)之病毒量。对于诸如组织样本之固体样本而言，测定每重量单位(诸如，公克)之病毒量。测定病毒量之方法为此项技术中已知且亦在本文中描述。
在一些实施例中，经本文所述之人源化抗体及其片段及/或医药组合物治疗之个体处于迅速HCV感染进程之风险中。经报导影响HCV疾病进展速率之因素包括年龄(年龄增加与更迅速之进展有关)、性别(男性比女性具有更迅速之疾病进展)、饮酒(与增加之疾病进展速率有关)、HIV共感染(与显著增加之疾病进展速率有关)及脂肪肝(肝细胞中存在脂肪已与增加之疾病进展速率有关)。
在任一种方法之一些实施例中，个体产生抗HCV抗体。在一些实施例中，可侦测到抗HCV抗体，例如抗HCV抗体可由ELISA侦测到。在一些实施例中，个体产生之抗HCV抗体为中和抗体。在一些实施例中，个体产生之抗HCV抗体为非中和抗体。
本文所述之人源化抗体及其片段及/或医药组合物亦可用于预防HCV感染之方法中。在一些实施例中，人源化抗体及其片段及/或医药组合物可用于在易于感染HCV之个体体内预防HCV感染之方法中。在一些实施例中，人源化抗体及其片段及/或医药组合物亦可用于在暴露于或潜在暴露于HCV之个体体内预防HCV感染之方法中。″暴露″于HCV表示遭遇或潜在遭遇可导致HCV感染之HCV。一般而言，经暴露个体为已藉由可传播HCV之途径暴露于HCV的个体。在一些实施例中，个体已暴露于或潜在暴露于患有HCV感染之个体的血液或来自可能感染HCV或可能未感染HCV之个体的血液(亦即，血液暴露之HCV感染状态未知)。HCV通常由血液至血液接触传播。在一些实施例中，个体已藉由(但不限于)使用血液产品(例如，输血)、″针刺″事故、共享药物针头、鼻吸药(snorting drugs)、性伴侣、医原性药品或牙齿暴露、身体穿刺及纹身使用之针或母亲患有HCV感染之儿童而暴露于或潜在暴露于HCV。在预防方法之一些实施例中，本文所述之人源化抗体及其片段将在暴露或潜在暴露于HCV约1天、1周或1个月中之任一者时或之内投与。
在本文所述方法中之任一者的一些实施例中，个体为人类或黑猩猩。在一些实施例中，个体为人类。HCV仅感染人类及黑猩猩。
在本文所述方法中之任一者的一些实施例中，该方法包含投与人源化抗体或其片段以及第二治疗剂。在一些实施例中，第二治疗剂为抗病毒治疗剂。在一些实施例中，该方法包含将人源化抗体或其片段与第二治疗剂组合、相继、同时、连续、轮流或间歇投与。在一些实施例中，包含投与人源化抗体或其片段与第二治疗剂之组合的该方法改善一或多种HCV症状、降低及/或抑制病毒滴度及/或病毒负荷，及/或防止HCV的程度超过单独以人源化抗体或其片段或第二治疗剂治疗。
在该等方法中之任一者的一些实施例中，人源化抗体或其片段包含选自由SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18组成之群的可变重链域及选自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20组成之群的可变轻链域。在一些实施例中，人源化抗体之片段系选自由Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、scFv、Fv及双功能抗体组成之群。在一些实施例中，人源化抗体或其片段与HCV结合。在一些实施例中，人源化抗体或其片段能与HCV E2蛋白、可溶性HCV E2蛋白或HCV E1蛋白与HCV E2蛋白之杂二聚体结合。在一些实施例中，人源化抗体或其片段与HCV E2蛋白结合。在一些实施例中，HCV E2蛋白系来自选自由基因型1(例如，基因型1a及基因型1b)、基因型2(例如，基因型2a、基因型2b、基因型2c)、基因型3(例如，基因型3a)、基因型4、基因型5及基因型6组成之群的HCV基因型中之一或多者。在一些实施例中，人源化抗体或其片段抑制HCVE2蛋白与CD81的相互作用。在一些实施例中，人源化抗体或其片段防止及/或抑制HCV进入细胞。在一些实施例中，细胞为肝脏细胞，例如肝细胞。
VIII.监测治疗过程
亦提供监测罹患或易患HCV感染之患者体内的治疗的方法，亦即监测向患者投与之治疗过程。该等方法可用于监测有症状患者的治疗性治疗及无症状患者的预防性治疗。详言之，该等方法适用于监测被动免疫(例如，量测所投与抗体之含量)。
一些方法涉及在投与一定剂量之药剂之前测定(例如)患者体内HCV感染之水平或概况的基线值，且将此与治疗后之概况或水平的值比较。便利地，HCV感染之水平或概况可以本文所述之人源化抗体或其片段测定。水平或概况之值的显著增加(亦即，大于同一样本之重复量测中的典型实验误差容限，表示为该等量测之平均值的一标准偏差)表明正治疗结果(亦即，所投与之药剂已达成所要反应)。若免疫反应之值未显著改变或降低，则表明负治疗结果。
IX.临床试验
可进行单剂量I期试验来测定本文所述之人源化抗体或其片段或包含其之医药组合物在个体(优选人类)体内的安全性。人源化抗体或其片段系以增加之剂量向不同患者投与，自假定功效之约0.01水平开始，且由因子3增加直至实现有效小鼠剂量之约10倍水平。
可进一步进行II期试验以测定治疗功效。选择患有HCV感染之患者。其它选择标准为患者可能自研究持续期间幸存且缺乏复杂问题(诸如，使用可能产生干扰之伴随药物)。可使用患者之血液概况监测疾病进程。在基线量测后，患者开始接受治疗。将其随机分组且以人源化抗体或其片段或安慰剂以双盲方式(blinded fashion)治疗。至少每6个月对患者进行监测。藉由治疗组中相对于安慰剂组中HCV感染进程的显著减少来判定功效。
X.试剂盒及制造物品
亦可提供试剂盒与抗体一起用于保护或侦测细胞活性或所选抗原之存在。因此，人源化抗体或其片段可以冻干形式在容器中单独或与对所要细胞类型特异之其它抗体一起提供。
可与标记物或毒素结合之抗体或未结合之抗体与缓冲液(诸如Tris、磷酸盐、碳酸盐等)、稳定剂、杀生物剂、惰性蛋白(例如，血清白蛋白)或类似物一起包括于试剂盒中。一般而言，此等材料将以抗体之量计少于约5重量％存在，且一般又以抗体浓度计至少约0.001重量％之总量存在。通常，需要包括惰性增量剂或赋形剂来稀释活性成份，其中赋形剂可以总组合物的约1至99重量％存在。
本发明亦提供诊断试剂盒，例如研究、侦测及/或诊断试剂盒。该等试剂盒通常含有如本文所述之人源化抗体或其片段。合适地，抗体经标记或试剂盒中包括第二标记试剂。优选地，试剂盒经用于进行所欲应用(例如，用于进行活体内成像检定)之说明标记。
在一些实施例中，试剂盒含有包装插页。包装插页系指通常包括于治疗性产品之商业包装中且含有关于使用该等治疗产品之适应症、用法、剂量、投药、禁忌症及/或警告之信息的说明书。在一实施例中，包装插页表明组合物系用于治疗HCV感染。在一些实施例中，包装插页提供以本文所述之治疗、预防或诊断方法中之任一者使用人源化抗体或其片段之说明书。
本文提供包含本文所述之人源化抗体或其片段之制造物品。在一些实施例中，制造物品包含容器及容器上或与容器相联之标签或包装插页。合适容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器等。容器可由多种材料(诸如，玻璃或塑料)形成。该容器固持对治疗病况有效之组合物且可具有无菌入口埠(例如该容器可为具有可由皮下注射针刺穿之塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。或者，制造物品可另外包含一包含医药学上可接受之缓冲液的第二容器，该等缓冲液诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲生理食盐水、林格氏溶液(Ringer′s solution)及右旋糖溶液。其可另外包括商业及使用者观点而言所需之其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针及注射器。
XI.一般重组DNA方法学技术
除非另外说明，否则本发明采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA及免疫学的习知技术，该等技术在一般熟习此项技术者能力之内。该等技术在文献中得以解释。例如参见J.Sambrook，E.F.Fritsch及T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Books 1-3，Cold SpringHarbor Laboratory Press；Ausubel，F.M等人。(1995及定期增刊；CurrentProtocols in Molecular Biology，第9、13及16章，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree及A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley & Sons；M.J.Gait(编)，1984，OligonucleotideSynthesis：A Practical Approach，Irl Press；及D.M.J.Lilley及J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and PhysicalAnalysis of DNA Methods in Enzymology，Academic Press。此等一般文本中之每一者以引用的方式并入本文中。
本发明现将以实例之方式进一步描述，其意欲用于帮助一般熟习此项技术者实施本发明且不欲以任何方式限制本发明范畴。
实施例
意欲纯粹例示本发明且因此不应认为以任何方式限制本发明之实例亦描述及详述上文论述之本发明之方面及实施例。前述实例及详细说明系以说明方式而非限制方式提供。
实施例1
材料及方法
人源化V基因之克隆
重链V区(参见实例2)经HindIII及ApaI限制酶位点克隆入pG1D200中。类似地，轻链V区经HindIII及BamHI位点克隆入pKN100中。在37℃下在多核(Promega)限制消化缓冲液中以20单位HindIII及ApaI消化5μg DNA历时2h，制备用于接合之pG1D200载体。接着，在37℃下添加1单位虾碱性磷酸酶历时30min，且在65℃下灭活历时20min。接着根据制造商说明将载体制剂在Qiaquick(Qiagen)管柱上纯化。载体以50μl溶离。类似地，藉由在37℃下在缓冲液E(Promega)中以20单位HindIII及BamHI消化5μg DNA历时1h来制备pKN100载体。将DNA以虾碱性磷酸酶处理且如上文所述纯化。藉由GENART在载体pGA4或pGA1中提供包括突变V区之V区DNA。插入物DNA(约4μg)系如上文所述消化且藉由凝胶电泳自载体纯化重链及轻链片段。自凝胶切除适当带且根据制造商说明在Qiaquick管柱(Qiagen)上纯化且以50μl溶离。藉由使1μl载体与1或3μl插入物DNA在1×连接酶缓冲液(Promega)及10单位连接酶(Promega)中混合来进行接合。将反应物在14℃下培育隔夜且使用2.5μl使50μl DH5α感受态细胞(Invitrogen)转化。
定点突变
藉由向GENEART AG外来引入诱变来进行定点突变，其中例外为嵌合重链突变体AP33Y47W及Y47F。嵌合重链诱变系使用以下寡核苷酸进行：
AP33_Y47F_F：AATAAACTTGAGTTCATGGGATACATAAGT(SEQ ID NO：41)
AP33_Y47F_R：ACTTATGTATCCCATGAACTCAAGTTTATT(SEQ ID NO：42)
AP33_Y47W_F：GAATAAACTTGAGTGGATGGGATACATAAG(SEQ ID NO：43)
AP33_Y47W_R：CTTATGTATCCCATCCACTCAAGTTTATTC(SEQ ID NO：44)。
诱变PCR反应使用最终浓度为0.5μM之寡核苷酸，以及20ngVH.pG1D200(嵌合重链构建体)及1×融合母混合物(NEB)。PCR条件为：98℃历时30s，接着98℃历时10s循环12次，55℃历时15s，72℃历时2m 15s。一旦PCR反应完成之后，在37℃下向各PCR反应中添加20单位DpnI历时1h。使用2μl PCR消化混合物使50μl XL-1蓝色感受态细胞(Stratagene)转化。
将重组嵌合及人源化重链RHA、RHbcdefgh(RHb-h)及人源化轻链RKA及RK2bc分别克隆入抗体表达载体pG1D200及pKN100中。质粒DNA系使用适当Qiagen质粒纯化试剂盒制备。
电穿孔
将Cos7细胞生长且在转染前一天以1∶3划分。将生长期Cos7细胞胰蛋白酶化且在PBS中洗涤且以每毫升107个细胞再悬浮于PBS中，且将700μl细胞等分入电穿孔比色管(Bio-Rad)中。将5μg重链及轻链构建体之每一者与细胞混合且在1.9KV及25μF下电穿孔。将细胞保持于室温下历时10min以回收且添加至10cm2组织培养盘上的8ml DMEM(具有Glutamax(Invitrogen)/10％FCS/盘尼西林(Penicillin)500U/ml/链霉素(Streptomycin)500μg/ml)中。在3天后采集上清液且藉由ELISA分析抗体浓度。
IgG 1  ELISA
将Maxisorp培养盘涂覆以0.4μg/ml山羊抗人类IgG抗体且在4℃下储存不超过1个月。使用前，将培养盘在PBS/0.02％Tween 20(v/v)中洗涤3次，接着在PBS/0.02％Tween 20(v/v)/0.2％(w/v)BSA中阻断。将培养盘如先前洗涤且使用二倍稀释以一定浓度范围添加样本上清液且在37℃下培育1h。将培养盘如先前洗涤且以山羊抗人类κ轻链过氧化酶结合物(Sigma)以1∶5000倍稀释液培育。将培养盘如先前洗涤，接着添加150μL K Blue One-Step受质(Neogen)。10min后，以50μL Red Stop溶液(Neogen)使反应停止且在655nm下量测光学密度。
肽ELISA
将ELISA培养盘(Nunc Maxisorp)以Streptavadin(Sigma S0677)(100mMNa2HPO4，50mM柠檬酸中之10μg/ml，pH 5.0，每孔100μl)涂覆且在4℃下储存历时多达1个月。使用前，将培养盘在PBS/0.1％(v/v)Tween 20中洗涤3次且在37℃下以200μl PBS/2％ BSA(w/v)阻断历时1h。接着将培养盘如上文洗涤且在37℃下添加100μl肽(SEC缓冲液中0.5μg/ml)历时1h。所有肽包括经结合生物素连接子序列GSGK-生物素。将培养盘如上文使用且以SEC缓冲液中之连续2倍稀释液添加100μl抗体上清液且培育1h。将培养盘如上文洗涤且在37℃下与HRP结合之抗人类κ抗体(Sigma)一起以1∶5000稀释(100μl/孔)一起培育1h。将培养盘如上文洗涤且添加150μl TMB One-Step K-Blue受质(Neogen)历时10min且在室温下在暗处储存。以50μl Red Stop溶液(Neogen)使反应停止。在655nm下量测光学密度。
制备用于HCVpp感染检定之抗体
为了进行HCVpp实验，将来自COS7细胞转染上清液之抗体藉由蛋白A纯化法纯化且浓缩。对于各嵌合或人源化抗体而言：将Prosep-vA珠粒(Millipore)再悬浮且将400μl添加至10ml抛弃式层析管柱(Pierce)且以20mlPBS洗涤。将COS7转染上清液(约150ml)在重力流动下添加至管柱。随后将管柱以PBS(20ml)洗涤且以0.5ml Immunopure IgG溶离缓冲液(Pierce)溶离。将溶离液以20μl1M Tris/HCL pH 7.6中和且在4℃下在3L PBS中之0.5mlSlide-A-Lyser(Pierce)中渗析隔夜。
HCV伪颗粒感染检定
藉由以编码HCV糖蛋白序列、MLV gag-pol及荧光素酶报导体之质粒转染HEK细胞，接着将改良性培养基浓缩且藉由经20％蔗糖之垫超速离心部分纯化来制备基因型1、2、3、4及6之HCVpp。参见Owsianka A.等人，J Virol79：11095-104(2005)。以类似方式制备基因型5之HCVpp，其中例外为因为不利影响基因型5伪颗粒之传染性而省略经蔗糖梯度之部分纯化步骤。将各抗体在细胞培养基中之3倍稀释液与HCVpp混合且将抗体/HCVpp混合物在37℃下培育1h，且接着添加至三个重复槽孔中之人类肝癌Huh-7标靶细胞中。在37℃下培育4h后，将接种物移除且以新鲜培养基置换。3天后，将细胞溶解且检定荧光素酶活性。不存在抗体之状况下多个孔经HCVpp感染，且所有结果表示为此″无抗体″对照物的百分比。以下实验中所用之HCV的基因型展示于表3中。
表3(先前61/006,066中之表1)：HCV之基因型及嵌合及人源化抗体之IC50及IC90。
分子模型AP33
RCSB蛋白数据库中与AP33最接近之VH及VK结构分别为1DQD_H(84％一致性)及1EGJ_L(91％一致性)。1DQD_H VH及1EGJ_L VK结构组合为单个模板结构。将AP33序列(表4)与组合之模板序列比对。重链及κ轻链CDR长度与AP33之彼等一致(例外为H3环)。AP33之同源性模型系基于此经组合模板使用Modeler软件产生。参见Fiser A.等人，Protein Sci 9：1753-73(2000)；Fiser A.及Sali A.，Methods Enzymol 374：461-91(2003)；及Sali A.及BlundellTL.，J Mol Biol 234：779-815(1993)。
表4(先前61/006,066中之表2)：使用重及轻蛋白序列来模拟AP33抗体。
  AP33_H(117个氨基酸)
  EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGSTYYN
  LSLRSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCALITTTTYAMDYWGQGTSVTVS
  AP33_L(111个氨基酸)
  NIVLTQSPVSLAVSLGQRATISCRASESVDGYGNSFLHWFQQKPGQPPKLLIYLASNLNS
  GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNVDPWTFGGGTKLEIK
结果
描述HCV属于6种基因型，但进一步细分为子基因型。经感染个体携带一堆自初始感染转变而来的变体基因型。AP33结合的HCV蛋白E2蛋白之区域在HCV基因型中显著保守，因此AP33抗体展示交叉基因型特异性。因此，重要的是确保人源化AP33保持物种交叉反应性。
测试人源化抗体之最有效方法为重复以AP33进行之实验(Yagnik A.T.等人，Proteins 40：355-66(2000))，该等实验展示阻断Huh-7细胞的HCV伪颗粒感染。然而，伪颗粒感染研究需要相对大量抗体，其若应用至人源化加工期间产生的大量变体则产生物流问题。因此，使用肽ELISA分析来针对多种HCV基因型对抗体变体进行初始筛检。
D3肽为Anonymous，J Viral Hepatology 6：35-47(1999)识别之在HCV基因型中保守的序列；肽B1、C1、H3及G3代表替代HCV基因型变体且肽H6为噬菌体展示识别之AP33的模拟表位。将此等肽中之每一者用作探针来量测人源化之成功性且表5中展示序列。
表5(先前61/006,066中之表3)：人源化AP33之结合分析中所用之肽。
  肽   名称   基因型
  Q L I N T N G S W H I N G S G K-生物素   D3   全部
  N . . . . . . . . . . . G S G K-生物素   B1   2b
  . . . . . . . . . . V . G S G K-生物素   C2   1a
  . . . . S . . . . . . . G S G K-生物素   H3   2a，4
  . . V . . . . . . . . . G S G K-生物素   G3   1a，3
  V E L R N L G G T W R P G S G K-生物素   H6   模拟表位
实施例2-AP33RHA之人类VH框架之选择
在微调、规范及VL界面残基(VCI残基)与AP33 VH具有最高一致性且与CDR1及2具有相同尺寸的人类VH序列展示于图14中且用于选择最佳供体框架。参见Foote J及Winter G.，J Mol Biol 224：487-99(1992)及Chothia C.等人，J Mol Biol 186：651-63(1985)。亦展示FW一致性计分。亦已省略为人源化抗体、小鼠抗体或scFv之序列，其中例外为A03907，即D1.3小鼠抗-溶菌酶VH。界面残基倾向于远离CDR掩蔽，而微调及规范残基倾向于与CDR接近。
关于整体VCI一致性，U86525具有最高计分(对于VCI计分而言17中之14，且对于框架计分而言86中之80)(图14)。顶部18个人类序列均具有14之VCI计分，而框架计分自86中之61或更少变化。与小鼠抗体序列比较时最不具保守性之VCI残基差异系在位置71及94(Kabat编号)。
完全人类VH序列之分析(图15及16)展示U86525、S67826、42071、42069、42068、S67827在FW不具有异常Cys或Pro残基。然而，U86525比S67826含有更多非保守残基差异(亦即，残基23、40、81及92：使用图16之编号)。因此选择由具有CLL淋巴瘤之患者产生之S67826抗体VH(Mierau R.等人，Rheumatol Int 12：23-31(1992))用作供体小鼠AP33VH CDR之框架接受者来产生AP33RHA。图13展示AP33H与S56827之间的比较。
实施例3-AP33RHA之前导序列的选择
初始人源化是将Kabat CDR 1、2及3自AP33VH移植入接受者S67826Kabat FW 1、2、3、4中(图18)。此序列需要添加来自种系基因VH4-59之信号肽，其与S67826具有最接近之序列一致性(图17)。吾人将SignalP(Foote J.及Winter G.，J Mol Biol 224：487-99(1992))(V2.0.b2)用于确认：此前导子(图17)位于S67826 FW1序列之前时将以信号肽酶切割。图18展示藉由将AP33CDR插入人类FW中来产生AP33RHA蛋白及DNA序列。AP33RHA的DNA序列包括其前导子展示于下文中(先前61/006,066中之表13)：
ca
ggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtgactccatcagt
atccggcagcccccagggagggcactggagtggatagga
cgggtcaccatatcagtagacacgtcta
agaaccagttctccctgaggctgagctctgtgaccgctgcggacacggccatgtattactgtgcgaga
tggggccaagggaccacggtcaccgtctcc(SEQ ID NO：105)
具有前导子之AP33RHA DNA序列。斜体大写字母文本表示前导序列，小写字母文本表示FW，且大写字母黑体文本表示CDR序列。
包括VH4-59信号肽之AP33RHA的完全蛋白及DNA序列展示于图19中。
实施例4-AP33RKA及AP33RK2之人类VK框架的选择
人类种系VK基因与AP33K的比较揭示其皆不具有与CDR1相同之规范环长度(图20)。以校正CDR1环长度自吾人之人类轻链基因数据库识别之彼等序列为人源化抗体或scFv(图21)。选择具有不匹配CDR1长度但具有匹配CDR2/3长度且在微调、规范及VH界面残基(VCI计分)处具有与AP33VK最高之一致性的人类VK序列且与其与AP33VK的FW一致性计分一起展示于图22中。已忽略为人源化抗体、小鼠抗体或scFv之序列。
图23A展示与AP33VK最佳匹配之人类VK的完全序列。此等序列之ClustalW比对展示于图23B中，且表示保守残基。由于不存在与AP33匹配之人类规范CDR1环长度，吾人选择两个具有不同环CDR1长度之人类框架。序列X61125(Chothia C.等人，J Mol Biol 186：651-63(1985))具有最高VCI计分，比AP33长两个残基之CDR1及在位置80处具有与AP33VK匹配的丙氨酸。为此等原因，吾人选择此序列作为第一供体框架来产生AP33RKA。AY685279(Ghosh S.等人，J Immunol 174：2860-9(2005))具有比AP33短4个残基之CDR1且在位置80处具有彼种系家族常见之脯氨酸。此外，AY685279具有高VCI及框架计分且在其序列中不具有异常脯氨酸或半胱氨酸残基。在此等标准下，选择AY685279作为第二框架供体来产生AP33RK2。
实施例5-AP33RKA及AP33RK2之前导序列的选择
与X61125最近的人类种系VK基因为VKIV-B3，其将为前导序列之天然选择。对此与X61126之FW1邻接之前导子使用推测性SignalP算法(Nielsen H.等人，Protein Eng.10：1-6(1997))展示信号蛋白酶切割应在正确位置(图27)。类似地，与AY685279最近的种系基因为VKI-012/02。同样，当与AY685279之FW1邻接时，预测VKI-012/02之前导序列经正确切割(图28)。
实施例6-AP33RKA、AP33RK2、AP33RK3及AP33RK4序列之产生
图30中展示将AP33VK CDR之蛋白质及DNA序列与B3前导子之DNA序列(AP33RKA)一起插入至X611251之FW 1、2、3及4之间。图31中展示将AP33VK CDR之蛋白质及DNA序列与VKI-012/02之DNA序列一起插入至AY685279之FW 1、2、3及4之间。图34-36中展示各别前导序列经附接之完全AP33RKA及AP33RK2序列。
基于分别成为人源化κ轻链RK3及RK4之人类序列AB064133及AB064072测试两个其它轻链框架。AB064133之选择展示于图24-26及29中。VCI残基在图13中定义，而RK3及RK4两者的蛋白质及DNA序列展示于图32-34与37-38中。因为其系来自不同种系家族(亦即，Vκ5)，所以选择RK3。尽管AB064072为Kabat VKIV子群的一员(其用于重组抗体构建体时历史上经不良表达)，但先前已展示此特异性人类框架序列在吾人办理下在为人源化抗体之部分时良好表达。
实施例7-重组重链及轻链之表达
重组抗体V区由瞬时转染之Cos7细胞表达。使用嵌合AP33重链或轻链DNA构建体作为正对照且以适当人源化抗体构建体链共转染。最初，测试未突变RHA及RHb-h(其中所有7个非保守微调区VC均回复突变)及RKAbd及RK2bc。RK2bc的两个冲突VC残基皆回复突变。轻链RKA的两个残基经置换；位置107处之VC残基Y36F及因此Asn高度异常，其亦经Lys(RKAbd)置换。应注意RKAbd表达极低且低于可行实验及商业水平(表9)。在随后实验中，对RKAbd进行修饰，包括移除潜在剪接位点突变G380C，且将前导序列由前导子B3换为L11(表6中所示)，在吾人经验中L11在其它轻链基因中有效作业。此外，另外已报导氨基酸取代D9S对于援救VKIV基因表达为有效的。参见Saldanha J.W.等人J Mol Biol Immunol 5391(22436)：487709-99719(1992)。此等修饰对于将表达水平恢复至高于背景均无效。
表6(先前61/006,066中之表4)：RKA之前导序列。
表9(先前61/006,066中之表34)：人源化轻链之表达。COS 7细胞由所述抗体构建体转染。
  重链RHb-h   抗体产量   对照转染嵌合抗体(VH/VL)
  RKAbd/VH   未侦测到   1008ng/ml
  RKAbd(前导子+D9S)/VH   未侦测到   1415ng/ml
  RK2bc/VL   389ng/ml   3335ng/ml
  RK2bc/RHb-h   1555ng/ml   3335ng/ml
  RK2b/RHb-h   1552ng/ml   849ng/ml
  RK2b/RH-C   1222ng/ml   1036ng/ml
  RK3/VH   39ng/ml   1518ng/ml
  RK3/RHb-h   2.3ng/ml   1518ng/ml
  RK4/RHb-h   124ng/ml   5161ng/ml
此外，替代轻链构建体RK3及RK4亦展示极低水平之表达(表9)。仅RK2可以适于产生人源化抗体之水平表达。
实施例8-RHb-h/RK2bc与E2肽之结合
使用来自Cos7转染之上清液比较人源化抗体RHb-h/RK2bc与嵌合抗体的结合。参见图1。
抗体与H6模拟表位结合的结果表明将微调区(Foote J.及Winter G.，J MolBiol 224：487-99(1992))及规范残基(Chothia C.等人，J Mol Biol 186：651-63(1985)，及Chothia C.等人，Nature 342：877-83(1989))引入至RHA中对于结合而言为必要的。与抗体RHb-h/Vl结合之H6肽与嵌合抗体(Vh/Vl)正对照最接近且优于完全人源化RHb-h/RK2bc抗体，表明人源化轻链不如嵌合轻链佳。此由当与嵌合轻链RHA/Vl比较时RHA/RK2bc的尤其不良之结合强调。
此实验之结论为，重链RHb-h保留AP33VH中对抗原结合而言关键的多数结构特征，但人源化轻链较不佳。然而，预计不存在具有相同L1环长度之小鼠轻链基因的人类直系同源物为人源化之潜在问题。
实施例9-人源化重链界面残基Q39介导之重链与轻链之间的界面不造成次最佳结合
轻链之不良功能的一个解释为重链与轻链之间的界面残基不兼容。参见Chothia C.等人，J Mol Biol 186：651-63(1985)。RHb-h中位置39处之界面麸酰氨酸残基回复突变为小鼠等效物赖氨酸且新重链表示为RHI。
与RK2bc或嵌合轻链配对之RHI的结合未能改良与H6肽之结合，表明界面残基Q39K不造成图2中所示的次最佳结合。
实施例10-RHb-h与一系列E2肽之结合
为了估算人源化抗体与不同HCV基因型之结合，将表5中所示之肽用作一系列E2变体的替代。与嵌合轻链Vl配对之RHb-h结合之肽展示于图3B中。如图3A中所示，结果展示人源化重链与一系列肽结合，但不如嵌合抗体Vh/Vl有效。实际上，人源化抗体看似不与肽B1结合。结果表明置换重链中之非保守规范及微调区残基不足以保持完全范围之肽抗原结合。
有趣的是，应注意具有变体AP33表位之肽具有保守变化，例如B1将Gln置换成Asn且肽酶C2及G3系将Ile置换成Val。此等较小残基之保守性变化可表示表位之收缩。此产生AP33及人源化抗体上之抗原接触残基可经改变以给予其更大之抵达的可能性。其作用可为增强抗体与彼等包括较短表位残基且展示与AP33较弱结合之HCV基因型之结合。亦重要的是注意尽管人源化抗体不能与B1肽结合，但在HCV传染性分离株中未发现此序列。
实施例11-识别RK2之最小突变
仅存在2个非保守且在RK2轻链突变(突变b(Y36F)及突变c(G68R))之VC残基。各VC突变回复突变为人类等效残基Y36及G68。结果(图4)展示突变b对于轻链活性为必要的，而突变c并非如此。
实施例12-识别重链人源化必需之最少VC变化数
为了识别RHb-h人源化必需之最少VC突变残基数，各突变b、c、d、e、f、g、h回复突变为图7及8中所示的初始人类序列。亦参见图42A-G。
表7(先前61/006,066中之表5)：VC突变之表。
  抗体链   突变名称   小鼠残基   人类残基
  RK2   b   F36   Y36
  RK2   c   R68   G68
  RH   b(S30T)   T30   S30
  RH   c(W47Y)   Y47   W47
  RH   d(I48M)   M48   I48
  RH   e(V67I)   I67   V67
  RH   f(V71R)   R71   V71
  RH   g(F78Y)   Y78   F78
  RH   h(R94L)   L94   R94
表8(先前61/006,066中之表6)：人源化抗体突变及其序列识别。
藉由比较不同版本之人源化抗体与表5中所述之肽的结合来评定突变之作用。结果展示于图5中且藉由将各资料组表示为与H6之最大结合的百分比来标准化。来自抗体RH-F之结果表明VC突变F(V71R)的不存在显著影响抗体之结合。因此，尽管存在人类至小鼠序列的所有其它VC突变，但位置71处的精氨酸对于最佳结合而言为必要的。在可侦测结合之所有状况下，RH-F与肽的结合更弱。然而，藉由回复突变变体与肽G3之结合亦识别对结合亲和力而言重要的初始突变S30T(b)、I48M(d)及V67I(e)。突变F78Y(g)及R94L(h)基本上难以区分(相较于RHb-h标准时，回复突变时仅呈现极少结合)且因此看似对于肽结合而言不关键。然而，抗体版本RH-C导致超过所有变体(包括RHb-h)的与肽G3及C2的结合增加(图6)。在此状况下，突变c(W47Y)不存在且保持人类色氨酸残基(但存在VC突变S30T、I48M、V67I、V71R、F78Y及R94L)。在此基础上，选择含有重链变体RH-C之人源化抗体用于在HCVpp检定中测试且与RHb-h比较。亦包括人源化抗体RH-H(其中不存在突变h(R94L))以供在HCVpp检定中测试。R94L突变为支撑H3环之规范及微调区残基，且吾人期望测定H3环中断是否不利影响HCVpp感染的抑制。此等重链系与人源化轻链变体RK2b共表达。
实施例13-HCV伪颗粒感染检定
在HCVpp感染检定中测试三个人源化抗体。所有人源化重链均与轻链RK2b配对。尽管肽结合数据表明重链RHb-h、RH-C与RH-H之间几乎不存在差异，但图7及8中所示之数据表明RH-C为HCVpp感染之最佳抑制剂。RH-C抗体在抑制HCVpp感染时至少与正对照嵌合AP33一样有效，但其它人源化抗体RHb-h及RH-H显著较不有效。四个实验之IC50及IC90展示于表3中且展示对于所有基因型，人源化抗体展现与嵌合抗体极类似的IC50与IC90值。
此结果为出人意料的，因为RH-C中之回复突变位置(亦即，残基位置47)为微调及界面残基两者，表明初始人类FW中发现之色氨酸残基可改良重链与轻链之间的界面，或可更优选支撑H2环，或可进行上述两者(图9及10)。此外，色氨酸残基可扩充图9中识别之亲脂性区域且可能有助于结合。
已展示AP33表位中存在之色氨酸残基对于AP33结合而言至关重要。参见Tarr A.W.等人，Hepatology 43：592-601(2006)。小鼠重链残基Y47之位置展示于图10中，图10亦展示在人源化抗体中亦已突变之微调及规范残基的位置。Y47残基直接位于CDR亲脂性区域下部且合理推测Y47W突变有助于填充亲脂性区域之碱基处的间隙。
一种可能有助于阐明由Y47W突变介导之改良结合之本质的方法为抗体E2结合之动力学分析。然而，吾人已不能进行RH-C与E2蛋白之间相互作用的动力学分析。纯化时，HCV E2蛋白形成聚集体。不幸的是，迄今未市售之单体E2蛋白质对于量测与抗体之结合亲和力而言为必要的。
来自肽分析之数据表明重链版本RH-G与RH-H之结合之间存在极少差异。在HCV伪颗粒实验中测试此等与RH-C组合之版本将为引人关注的。似乎对结合及抑制可能存在正作用，因为此等残基分别可帮助支撑H2及H3环。
实施例14-嵌合突变体AP33Y47F及Y47W之分析
为了进一步研究残基Y47对结合之贡献，制备两个嵌合重链突变体Y47W及Y47F。此等突变体皆与嵌合轻链V1结合表达且在HCVpp感染检定及肽结合中与AP33比较。来自肽结合实验之数据(图11)表明藉由以苯丙氨酸或色氨酸取代使残基酪氨酸47更具疏水性可改良与一些E2肽，尤其肽B1(基因型2a)的结合。然而，当抗体用于图12所示之针对基因型1a(来自分离株1aH77.20)的HCVpp感染检定时，不存在藉由Y47W或Y47F突变而引起的抑制增强。因此可推断RH-C中经改良之Y47W突变对人源化特异，尽管需要对多种基因型进行其它HCVpp感染检定来判断AP33中之Y47W突变一般是否可改良抗体的感染抑制效能。
实施例15
材料及方法
将以下材料及方法用于实施例15A-C中所述之实验。
杆状病毒表达之可溶性E2(sE2)的产生
sE2表达：可溶性E2(sE2)系藉由如先前所述在氨基酸661(sE2661)处截断使跨膜域缺失来产生。参见Roccasecca，R.等人，J Virol 77：1856-67(2003)。将sE2661克隆入杆状病毒转移载体中，该载体系在27℃下以BacPak6线性化病毒DNA(BD Clontech)共转染至无ESF921蛋白培养基(Expression Systems，LLC)中培养的黏着Sf-9昆虫细胞中。使用标准杆状病毒法将所得病毒储备液扩增两次，随后将其用于大规模蛋白质制造中。制造系在WaveTM生物反应器(GE Bioscience)中进行。使10L T.ni Pro细胞(Expression Systems，LLC)培养物生长至每毫升2×106个细胞且以50mL如上文制备之病毒储备液感染。在感染48小时后藉由以3000xg离心15min来采集上清液，且经0.2μM过滤器过滤随后进行纯化。
sE2纯化：将10L杆状病毒上清液以50mL Nickel-NTA树脂分批配料。以PBS+0.3M NaCl中之250mM咪唑自树脂溶离HIS-标记之可溶性E2。将溶离物稀释于20mM乙酸钠，pH 5.0中且装载于34mL SpFF阳离子交换管柱上，且在乙酸缓冲液中以0.3M NaCl溶离蛋白质。接着将溶离液装载于PBS+0.15M NaCl中的24mL S200凝胶过滤管柱上且渗析至PBS缓冲液中。在使用质谱的Source Decay中，N末端与所分泌蛋白质的预期N末端匹配。
测定AP33/RH-C/RK2b对HCV E2之亲和力
BIAcore检定：BIAcore A100仪器上的表面电浆共振(SPR)量测用于测定可溶性E2(sE2)与抗体结合之亲和力。采用将人源化抗体捕获于抗人类Fc感应器芯片表面，随后注射变化浓度之sE2的格式。如制造商建议，使用胺化学试剂将抗人类Fc抗体与感应器芯片表面共价连接。藉由以30μL/min之流动速率注射60μL 0.5μg/mL溶液来捕获人源化抗体。收集感应图用于sE2溶液的60μL注射，随后监测解离历时480s。藉由注射3M MgCl2的15μL等分试样使感应器芯片表面再生，导致抗体-抗原复合物自捕获抗体解离。以1.56nM至50nM浓度范围的sE2以2倍增量重复量测。所有量测包括实时减去来自无捕获之抗E2抗体的参考流槽的数据。亦减去单独注射缓冲液的感应图。电泳缓冲液为Hepes缓冲之生理食盐水，pH 7.2，且温度为25℃。以1∶1朗缪尔结合模型(Langmuir binding model)使用制造商供应之软件来分析此等数据，从而测定动力学常数。
斯卡查德分析(Scatchard analysis)：使用放射性配位体细胞结合检定测定RH-C/RK2b对作为表达于293T细胞表面之E1E2杂二聚体的部分的HCVE2的亲和力。使用Iodogen方法使抗HCV抗体RH-C/RK2b及RH-C/RK2b Fab碘化。藉由凝胶过滤使用NAP-5管柱自游离125I-Na纯化放射性标记之抗HCV抗体。经纯化RH-C/RK2b及RH-C/RK2b Fab抗体分别具有17.96μCi/μg及55.21μCi/μg的比活性。将含有固定浓度之碘化抗体及降低浓度之连续稀释未标记抗体的50μL体积竞争反应混合物置于96孔培养盘中。根据制造商推荐将293T细胞以Fugene6转染剂(Roche)转染。将细胞以25μg/mL质粒+100μL Fugene6试剂在无任何补充之最终体积25mL的Freestyle培养基(Invitrogen，Gibco)中转染。转染48h后使用Sigma细胞解离缓冲液将细胞自培养盘分离，以结合缓冲液(具有2％FBS之50∶50 DMEM/F12、50mMHEPES，pH 7.2及2mM迭氮化钠)洗涤且以0.2mL结合缓冲液中2×105个细胞之大致密度添加至50μL竞争反应混合物中。各具有细胞之竞争反应物中碘化抗体之最终浓度为RH-C/RK2b约200pM及RH-C/RK2b Fab约500pM，且具有细胞之竞争反应物中未标记抗体之最终浓度在500nM开始且接着藉由1∶2倍减少10次浓度而变化。将具有细胞之竞争反应物在室温下培育2h。一式三份检定各浓度之未经标记抗体的具有细胞之竞争反应物。培育后，将竞争反应物转移至Millipore Multiscreen过滤培养盘且以结合缓冲液洗涤4次自经结合碘化抗体分离游离物。将滤液在Wallac Wizard 1470γ计数器(PerkinElmer Life and Analytical Sciences Inc.)上计数。使用NewLigand软件(Genentech)评估结合数据，该软件使用Munson及Robard的拟合算法(Munson，P.J.及D.Rodbard，Anal Biochem 107：220-39(1980))来测定抗体之结合亲和力。
传染性细胞培养物HCV(HCVcc)之产生
编码全长HCVcc染色体组的质粒的产生：Jc1(J6/C3)及Con1/C3之全长HCV染色体组系藉由Gene Oracle Inc.(Mountain View，CA)的外部采办使用HC-J6(CH)(J6)、JFH-1及Con1之DNA序列如NCBI数据库中所述化学合成[HC-J6(CH)(纯系pJ6CF)、Con1及JFH-1的寄存编号分别为AF177036、AJ238799及AB047639]。编码与JFH-1NS2-NS5B区融合之J6及Con1结构区(NS2之核-E1-E2-p7-部分)的嵌合HCVcc病毒系如先前所述产生(Pietschmann，T.等人，Proc Natl Acad Sci U S A 103：7408-13(2006))。为了制备Con1/C3-neo HCVcc，含有5′-未转译区(UTR)，随后抗新霉素基因及侧接有EcoRI及PmeI限制位点的脑心肌炎病毒内部核糖体入口位点(EMCVIRES)元素之DNA片段系藉由Gene Oracle Inc.(Mountain View，CA)之外部采办化学合成。编码Con1/C3-neo HCVcc的质粒系藉由以EcoRI及PmeI消化产生。使用独特EcoRI及XbaI限制位点将Jc1(J6/C3)及Con1/C3-neo DNA片段均接合至pUC19载体中以产生pUC-Jc1及pUC-Con1/C3-neo。
活体外转录反应：将pUC-Jc1及pUC-Con1/C3-neo质粒以位于HCV染色体组之3′端的XbaI消化。使用最终体积300μl之20U XbaI将30μg pUC-Jc1及pUC-Con1/C3-neo在37℃下消化隔夜。第二天，如先前所述使用酸性酚提取RNA。参见Kapadia，S.B.等人.J Virol 81：374-83(2007)。使用T7 Megascript试剂盒(Ambion)根据制造商推荐进行活体外转录反应。如先前所述，使用酚/氯仿及乙醇沈淀提取HCV RNA。参见Kapadia，S.B.等人，J Virol 81：374-83(2007)。将RNA储存于-70℃下。
HCVcc储备液之产互：在5％CO2气氛下在37℃下将Huh-7.5细胞在完全达尔伯克改良伊格尔培养基(complete Dulbecco′s modified Eagle′smedium)(c-DMEM)(补充有10％胎牛血清[FBS]、100U/ml盘尼西林、100mg/ml链霉素、2mM L-麸胺酰胺及0.1mM非必需氨基酸)中培养。转染当天，将细胞胰蛋白酶化，以Opti-MEM培养基(Gibco)洗涤两次且以每毫升107个细胞之最终浓度再悬浮于Opti-MEM中。将400μl细胞(4×106个细胞)+10μg活体外转录之Jc1或Con1/C3-neo RNA添加至0.4cm电穿孔比色管(BioRad)中。使用Gene Pulser(BioRad)使用以下参数进行电穿孔：0.27kV，100Ohm及950μF。将比色管在室温下培育10min以允许细胞复原，随后将细胞转移至一个含有c-DMEM之T162烧瓶中。当培养物达到所要融合之80-90％时，将细胞胰蛋白酶化且裂解。在转染后3天开始采集上清液，使其澄清且如先前所述使用TCID50计算法量测传染性病毒滴度。参见Lindenbach，B.D.等人，Science309：623-6(2005)。将上清液等分且储存于-70℃下。
HCV伪颗粒(HCVpp)之产生
质粒：如先前所述使用一些修饰产生表达HCV基因型1a(H77)、1b(Con1)及2a(J6)之E1及E2糖蛋白之质粒(Hsu，M.等人，Proc Natl Acad Sci USA 100：7271-6(2003))。简言之，将编码E1及E2之区域(且含有来自HCV核之C末端的信号肽)克隆入pRK哺乳动物表达载体中以分别产生表达质粒pRK-H77、pRK-Con1及pRK-J6。A8.9封装质粒最初由来自Greg Hannon的Genentech(Cold Spring Harbor Labs)/David Baltimore(Cal Tech)获得。参见Zufferey等人，Nature Biotechnology 15：871-875(1997)。FCMV-Luc-IRES-dsRED质粒为经修饰pFUGW质粒，其系由来自Greg Hannon之Genentech(Cold Spring Harbor Labs)获得，且编码分别由HCMV启动子及IRES元素驱动之萤火虫荧光素酶及DsRed。
HCVpp系如先前所述使用一些修饰在HEK 293T细胞中产生(Bartosch，B.等人，J Exp Med 197：633-42(2003))。简言之，在前一天将2.5×106个293T细胞接种于10cm培养盘中。第二天，根据制造商推荐使用Lipofectamine2000(Invitrogen)将细胞以FCMV-Luc-IRES-DsRed质粒(5μg)、A8.9转移载体(10μg)及pRK-H77、pRK-Con1或pRK-J6质粒(1μg)共转染。转染6h后，将OptiMEM培养基(Invitrogen，Gibco)以c-DMEM置换。转染2天后，采集上清液，使其澄清，且藉由超速离心进一步纯化(3000rpm历时5min)且用于传染性检定中。将5×103个Huh-7.5细胞接种于白壁96孔培养盘(Costar)中。第二天，以适当HCVpp稀释使细胞转换。感染72h后，将细胞溶解于1×溶解缓冲液中且根据制造商推荐使用荧光素酶检定系统(Promega)量测荧光素酶活性。
测定抗体与HCV E2之结合的ELISA检定
E2裂解物之制备：根据制造商推荐使用Lipofectamine 2000将293T细胞以10μg pRK-H77、pRK-Con1或pRK-J6质粒瞬时转染。转染48h后，将细胞以PBS洗涤，且接着溶解于1μL溶解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.4；150mMNaCl；1mM EDTA；0.5％ NP-40；20mM碘乙酰胺)中。在振荡下将裂解物在4℃下培育20min且离心分离5min。接着使用澄清上清液涂覆ELISA培养盘。
HCVE2 ELISA：如先前所述进行ELISA检定。参见Owsianka，A.等人，JVirol 79：11095-104(2005)。简言之，将96孔Immulon 2培养盘以每孔100μLPBS中之0.25μg雪花莲(Galanthus nivalis)凝集素(GNA，Sigma)涂覆且在室温下培育隔夜。第二天，将培养盘以含有0.02％Tween-20之PBS(PBST)洗涤3次，以稀释于PBST之细胞裂解物涂覆且在室温下培育2h。将慢性HCV感染患者血清之稀释液稀释于2％脱脂奶粉/PBST中且在室温下培育1h。以PBST洗涤3次后，以PBST中之1∶1000倍稀释率添加每孔100μL抗人类HRP结合之二次抗体且在室温下培育1h。将各孔以PBST洗涤6次且将各孔以100μLTMB受质在暗处在室温下培育30min。藉由添加每孔50μL 0.5M H2SO4使反应停止且使用Synergy 2培养盘读取器(BioTek Instruments)量测A450。
HCVcc感染检定
每孔涂覆5×103个Huh-7.5细胞在96孔培养盘中进行感染。第二天，在感染复数(MOI)＝0.3下以Jc1或Con1/C3-neo HCVcc感染细胞。为了识别中和HCVcc之抗体，将抗体在c-DMEM中稀释至150μg/ml且在单独96孔培养盘中制备7份抗体之3倍缓冲液。将HCVcc与抗体稀释液组合且在37℃下预培育1h，随后接种天然Huh-7.5细胞。感染3天后采集总RNA且如下文所述使用RT-qPCR测定HCV RNA复制(作为HCV/GAPDH cDNA之比率量测)。
HCV感染之定量
HCVcc RNA复制：对于在96孔培养盘中进行之实验而言，根据制造商说明使用SV96总RNA分离系统(Promega)提取总RNA。将来自各孔之RNA溶离至100μL无RNase水中且使用Taqman逆转录试剂试剂盒(AppliedBiosystems)将4μL RNA逆转录。RT-qPCR系使用5μL cDNA在25μL反应物中使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)进行。在所有反应中，管家基因甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(GAPDH)之表达系作为扩增功效及标准化之内部内因性对照来测定。HCV及GAPDH之引子及探针如下：
GT1b有义引子，5′-CTGCGGAACCGGTGAGTACA-3′；(SEQ ID NO：55)
GT1b反义引子，5′-TGCACGGTCTACGAGACCTCC-3′；(SEQ ID NO：56)
GT1b探针，6FAM-ACCCGGTCGTCCTGGCAATTCC-MGBNFQ；(SEQ ID NO：57)
GT2a有义引子，5′-CTTCACGCAGAAAGCGCCTA；(SEQ ID NO：58)
GT2a反义引子，5′-CAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′；(SEQ ID NO：59)
GT2a探针，6FAM-TATGAGTGTCGTACAGCCTC-MGBNFQ；(SEQ ID NO：60)
GAPDH有义引子，5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′；(SEQ ID NO：61)
GAPDH反义引子，5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′；(SEQ ID NO：62)
GAPDH探针，VIC-ATGACCCCTTCA TTGACCTC-MGBNFQ。(SEQ ID NO：63)
荧光系使用7500HT实时PCR机(Applied Biosystems，CA)监测。
传染性HCVcc之滴度：感染细胞上清液中存在之传染性HCVcc系如先前所述量测。参见Lindenbach，B.D.等人，Science 309：623-6(2005)。简言之，藉由将5×103个Huh-7.5细胞接种于聚-L-赖氨酸涂覆之96孔培养盘中来进行滴定。第二天，将细胞以最终体积100μL之10倍稀释上清液培育。3天后，将细胞以PBS中的4％三聚甲醛固定且如先前所述以抗HCV核抗体C7-50(Abcam)免疫染色(Kapadia，S.B.等人，J Virol 81：374-83(2007))。根据先前所述Reed及Muench之方法计算滴度。参见Lindenbach，B.D.等人，Science 309：623-6(2005)。
来自慢性HCV感染患者之血清对RH-C/RK2b介导之中和的作用
为了测定来自慢性HCV感染患者之血清是否拮抗RH-C/RK2b介导之活体外HCV感染的中和，使用HCVpp系统进行中和检定。在37℃下在10％胎牛血清(FBS)、10％正常人类血清(NHS)或10％来自慢性HCV感染患者之血清(CHCHS-1、2及3)存在下将HCVpp以不同浓度之RH-C/RK2b培育1h。将接种于96孔培养盘中之Huh-7.5细胞以HCVPP：抗体混合物培育。转换4h后，将培养基以含有10％FBS加补充物之c-DMEM置换用于剩余检定。3天后，将细胞溶解且如上文所述量测荧光素酶活性。使用如上文所述之ELISA测定抗-HCV E1/E2抗体含量。
实施例15A：由RH-C/RK2b中和HCVcc及HCVpp
为了测定RH-C/RK2b是否抑制HCV进入及感染，在Huh-7.5细胞中使用HCVpp及HCVcc进行中和检定。使用AP33作为对照。为了识别RH-C/RK2b对HCV进入的特异性抑制，在AP33或RH-C/RK2b存在下培育含有来自GT1b(Con1)或GT2a(J6)之E1E2序列的HCVpp。RH-C/RK2b等效抑制Con1及J6HCVpp进入(对于Con1及J6HCVpp而言分别为EC50＝0.511μg/mL及0.793μg/mL)。参见图39A-C。此外，将两种HCVpp基因型之RH-C/RK2b中和与AP33所见之中和(对于Con1及J6HCVpp而言分别为EC50＝1.417μg/mL及2.066μg/mL)(图39A-C)。
为了测定RH-C/RK2b是否中和传染性细胞培养物病毒(HCVcc)，以AP33及RH-C/RK2b进行类似中和检定。AP33将Con1及J6HCVcc抑制至与先前针对含有来自多种基因型之E1E2序列之HCVpp所述相当之含量(Owsianka，A.等人，J Virol 79：11095-104(2005))。尽管RH-C/RK2b将Con1HCVcc感染抑制至与AP33相当之水平(图40A及C)，但RH-C/RK2b抑制J6HCVcc至少约4.7倍优于AP33(图40B-C)。
实施例15B：抗HCV E2抗体对E2之亲和力量测
在其它实验中，AP33及RH-C/RK2b对可溶性E2(sE2)之亲和力系藉由BIAcore检定测定。AP33及RH-C/RK2b皆以类似亲和力与sE2结合(AP33为约5-8nM且RH-C/RK2b约为3.8nM)。比较而言，各抗体之Fab片段以约50nM之亲和力与sE2结合。除了与sE2蛋白结合，测定AP33及RH-C/RK2b与表达于293T细胞表面上之E1E2杂二聚体的结合。因为已知以编码E1E2之质粒转染之293T细胞在其细胞表面表达功能E1E2杂二聚体，所以进行斯卡查德分析来测定RH-C/RK2b与RH-C/RK2b Fab之亲和力。RH-C/RK2b及RH-C/RK2bFab与细胞表面表达之E2的亲和力(分别为约5及约50nM)与上文所述之BIAcore检定中sE2所见之亲和力相当。参见表10。
表10：抗体亲和力(nM)
实施例15C：来自慢性HCV感染患者之血清不拮抗RH-C/RK2b介导之中和
为了测定含有抗HCV抗体之慢性患者血清是否可拮抗RH-C/RK2b之中和能力，在10％正常人类血清(NHS)或来自慢性HCV感染患者之血清(CHCHS-1及-2)存在下使用Con1HCVpp进行中和检定。RH-C/RK2b与人类血清来源无关地将HCV感染抑制至相当水平(图41A)。为了测定此等慢性HCV感染之患者血清是否含有基因型1b之抗体，使用来自GT1b(Con1)E1E2转染之293T细胞的裂解物进行ELISA检定。将在10μg/mL之初始浓度下开始之RH--C/RK2b的3倍稀释液用作对照。尽管NHS未侦测到与E2之结合，但以两种慢性HCV感染之患者血清均侦测到剂量依赖性结合，表明其含有Con1HCV E1E2反应性抗体。参见图41B。此等结果表明尽管患者血清中存在抗HCV抗体，但其不干扰RH-C/RK2b活体外中和HCV之能力。
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在以上说明书中所提及之所有公开案以引用的方式并入本文中。显然彼等熟习此项技术者在不背离本发明之范畴及精神的状况下可对本发明所述之方法及系统进行各种修改及变更。尽管已关联特定优选实施例描述本发明，但应了解所主张之本发明不应受该等特定实施例过度限制。实际上，对于彼等熟悉生物化学或相关领域者而言显而易见的用于执行本发明之所述模式的各种修改旨在处于以下申请专利范围之范畴内。

Claims (22)

1.与C型肝炎病毒E2蛋白结合的人源化抗体或该抗体的抗原结合片段，其中该人源化抗体或该抗体的抗原结合片段的可变重链域选自由SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18组成的群，且该人源化抗体或该抗体的抗原结合片段的可变轻链域为SEQ ID NO：7；或者其中该人源化抗体或该抗体的抗原结合片段的可变重链域选自由SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：13、及SEQ ID NO：18组成的群，且该人源化抗体或该抗体的抗原结合片段的可变轻链域为SEQ ID NO：19。
2.权利要求1的人源化抗体或该抗体的抗原结合片段，其中该抗原结合片段系选自由Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、scFv、Fv及双价抗体(diabody)组成的群。
3.一种核酸，其编码权利要求1的人源化抗体或该抗体的抗原结合片段的可变重链域及可变轻链域。
4.权利要求3的核酸，其中该核酸选自由SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、及SEQ ID NO：39组成的群。
5.一种核酸，其与权利要求3的核酸互补。
6.载体，包含权利要求3的核酸。
7.权利要求6的载体，其中该载体进一步包含表达控制序列，所述序列与编码可变重链域及可变轻链域的核酸可操作地连接。
8.重组细胞，含有权利要求6的载体。
9.权利要求8的重组细胞，其中该细胞为真核细胞。
10.权利要求9的重组细胞，其中该真核细胞为CHO细胞。
11.产生人源化抗体或该抗体的抗原结合片段的方法，其包含使含有权利要求3的核酸的重组细胞生长，使得该细胞表达所编码的可变重链域及可变轻链域；及回收该表达的人源化抗体或该抗体的抗原结合片段。
12.权利要求11的方法，其进一步包含分离及/或纯化所回收的人源化抗体或该抗体的抗原结合片段。
13.一种药物组合物，其包含权利要求1的人源化抗体或该抗体的抗原结合片段及药学上可接受的载剂或赋形剂。
14.一种试剂盒，其包含权利要求1的人源化抗体或该抗体的抗原结合片段，及使用该人源化抗体或该抗体的抗原结合片段的说明书。
15.权利要求1的人源化抗体或该抗体的抗原结合片段在制备治疗或预防人类C型肝炎病毒感染的药物组合物方面的用途。
16.权利要求15的用途，其中该抗原结合片段系选自由Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、scFv、Fv及双价抗体组成的群。
17.权利要求15的用途，其中该C型肝炎病毒感染为急性C型肝炎病毒感染。
18.权利要求15的用途，其中该C型肝炎病毒感染为慢性C型肝炎病毒感染。
19.权利要求15的用途，其中治疗该C型肝炎病毒感染是降低病毒负荷。
20.权利要求15的用途，其中所述药物组合物是与第二治疗剂组合的药物组合物。
21.一种识别药剂的方法，所述药剂是增强权利要求1的人源化抗体或该抗体的抗原结合片段对C型肝炎病毒的中和活性功效的药剂，该方法包含以下步骤：
(a)使该人源化抗体或该抗体的抗原结合片段与欲测试的药剂接触；及
(b)判定该药剂是否增强该人源化抗体或该抗体的抗原结合片段中和C型肝炎病毒感染性的功效。
22.权利要求1的人源化抗体或该抗体的抗原结合片段在制备测定样本中是否存在C型肝炎病毒的试剂盒方面的用途。
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