CN101939047B - 可变电流密度单针电穿孔系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包括改进的电穿孔电极系统，其包括单个针状电极和环形或环状电极，其中电极的表面积的差异保证在被治疗组织的表面附近的电流密度的相当大的减小和对只在相邻于单针电极的终端部分的组织中的电穿孔充足的更集中的电流密度。因此，本发明保证以用于电穿孔的特定组织为目标，并且还将保证减小在被治疗组织中的电流的感觉。

Description

可变电流密度单针电穿孔系统和方法
发明领域
本发明通常涉及增加细胞的渗透性的电脉冲的使用，尤其是涉及用于将受控电穿孔电场施加到人和动物的体内组织以将药物化合物和核酸输送到其细胞的方法和设备。进一步地，本发明涉及用于执行电穿孔的改进和新颖的电极设计，该设计在遭受电穿孔的组织治疗部位附近提供聚焦的电流密度，同时在远离所述组织治疗部位处提供降低的电流密度的非电穿孔电场，该设计保证将电穿孔电脉冲聚焦在预定和可测量的组织容积中例如在骨骼肌肉和/或真皮和皮下组织中，同时另外保证到包含神经感觉细胞的哺乳动物表面组织的电流的相当大的减少。
发明背景
下面的描述包括可能在理解本发明中有用的信息。它并不承认任何这样的信息是现有技术或与目前主张的发明有关，或被明确地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
将疫苗和其它药剂施用到体组织内的传统方式是通过使用注射器和针头直接注射到肌肉或皮肤组织中。如在本领域中完全公开的，将电能电穿孔脉冲与直接注射结合保证这样的疫苗或制剂直接输送到组织内的细胞中。使用电穿孔电脉冲来这样直接输送到细胞可能对身体的新陈代谢和/或免疫系统的反应的质量有深远的临床效果，优于简单的注射器和针头注射的输送。而且，物质经由电穿孔进入细胞的直接输送的能力实现了对多肽编码的可表达裸DNA的有效输送，多肽有任何数量的功能，包括用于引起免疫反应的抗原，或可选地，用于影响导致临床效果的各种生物途径的新陈代谢。
虽然电穿孔技术允许物质到体内细胞区室的更先进的输送，如目前通常使用例如在美国专利6,041,252、6,278,895和7,245963中公开的组织穿透电极阵列所执行的，电穿孔过程对实际临床使用有至少两个明显的缺点。这些缺点包括，首先，需要使用多个引入外伤的针头来穿透皮肤屏障，以及其次，不能容易确定经受电穿孔的组织容积。使用间隔开的组织刺穿针状电极的传统电穿孔技术提供了被电穿孔的组织的相对展开的面积。一般，在使用间隔开的电极的阵列时经受电穿孔的组织容积比阵列的电极所限制的容积大。这是由于电力线穿过正电极和负电极之间的体内组织而自然流动。电穿孔力能够在阵列外部周围传播多远并不是容易可计量的。这使被细胞吸收药物的量的可计量测量很难。因此，就治疗剂量输送的控制而言，仍然需要量化经受电穿孔的组织的量，由此量化使用电穿孔输送到所述组织的细胞中的药物的剂量。
关于组织穿透，一般间隔开的针头阵列设计不仅也引起多个针头进入肉体的穿透的真实感觉，而且由于穿透电极的被暴露的导电长度，电穿孔脉冲的受体将经历明显的电击，即使被插入的针头的上部部分具有绝缘涂层。所谓上部部分在这里指的是与表面和真皮组织接触的针头的长度。通常，由于在两个被暴露的细长电极之间发送的脉冲建立穿过所述电极所穿透的肉体的整个深度的电场和电流的事实，电穿孔过程中的电脉冲很明显。因为皮肤组织拥有相当多的神经感觉细胞，目前认为在外部组织区域中的电击的感觉很明显。这个一般令人不快的感觉对诸如接种疫苗的应用中电穿孔的普遍接受和使用是缺点。进一步地，假定电击的任何感觉与经受某个强度的电流的组织面积或容积有关，则它将合理地出现，假定在哺乳动物中只使用单针的有效电穿孔是可能的，如本发明人在共同未决的专利申请序列号11/894,653中示出的，该专利在这里通过引用被全部并入，间隔开的电极阵列的使用使得超乎所需的、相当大的面积的组织受到电脉冲以及随之发生对感觉神经细胞的刺激。因此，在本领域中需要找到用于输送电穿孔脉冲同时减小对基于组织表面和皮肤的神经细胞的刺激。
就电能的电穿孔脉冲的明显感觉而言，感觉的水平也部分地归因于所使用的电极的设计和一般裸金属性质。例如，电极一般被构造在各种配置中，例如卡规、曲径电极、和用于将电脉冲输送到皮肤表面和在接近于皮肤的下层组织的非侵入式针头阵列、以及用于将电脉冲输送到深层组织的细长和穿透针头阵列。将电极直接放置在皮肤上或刺穿皮肤的做法将电极设置在经神经刺激而对疼痛的敏感度非常显著的组织的区域中。因此，在没有用于减小具有很密的感觉神经末梢的组织区域中的电流和电流密度的情况下，电击的感觉将可能保持。
因此，在本领域中仍然存在对电穿孔方法、电极和系统的需要，所述电穿孔方法、电极和系统可保证可计量地测量实际经受电穿孔的组织的容积的能力，以及保证相当大地减小定向在包含神经感觉细胞的组织中的电能，以便保证在治疗物质的电穿孔辅助的输送期间减小感觉细胞刺激的可能性。
发明概述
现在转到本发明的优点，所公开的是用于进行治疗物质到哺乳动物的体内组织的电穿孔辅助的输送的装置，治疗物质包括可表达核酸序列编码治疗多肽或核酸的治疗剂形式或其衍生物。在优选实施方式中，装置可用于直接向细胞输送链接到启动子的、并由此能够表达编码的多肽的DNA序列。在其它可选优选实施方式中，装置可用于输送包括RNA、RNAi、siRNA、microRNA和shRNA的治疗物质。物质还可包括可表达核酸序列编码细胞因子、激素和在对紊乱和疾病的治疗中有用的其它功能分子。
本发明还包括使用脉动电场来将治疗剂输送到包括皮肤的真皮和下层肌肉隔室的皮肤细胞中用于局部和全身治疗的体内方法。在本发明的特别优选的实施方式中，提供了用于将治疗剂引入体组织和细胞内的体内方法，例如真皮内的细胞和肌肉细胞，特别是真皮中的肌肉细胞和位于较深层组织中的骨骼肌肉细胞。被设想用在本发明方法上的治疗剂包括裸或配制核酸，包括RNAi、siRNA、microRNA和shRNA、多肽和化学治疗剂、以及可直接作为缓和剂使用的其它治疗剂(即，直接发挥治疗效果的治疗剂)、或作为具有较不直接效果的制剂(例如，引起免疫反应的基因编码多肽)。
在另一实施方式中，本发明的方法保证将电能的电穿孔脉冲以及非电穿孔电场输送到体内组织的能力，该电穿孔脉冲包括在经受电穿孔的组织治疗部位处或附近的高电流密度，而同时，非电穿孔电场具有远离所述组织治疗部位的相应地明显降低的或扩散的电流密度。特别地，如这里公开的，本发明装置包括下面进一步描述的单个组织穿透针状电极和相应的环形反电极，其包括在空间上相对于细长电极定位的平坦和通常圆形或卵形结构，使得细长电极优选地在中央并垂直于平坦环形电极表面，如图2所示。“环形”电极的实际形状可包括可变的几何形状，例如圆形、卵形、三角形、正方形、矩形、五边形、六边形等。
在另一实施方式中，单个中央细长电极具有组织穿透远端和安装到基底的近端。细长电极可为实心或管状的，在后面的情况下，所述电极能够通过其输送流体物质。在可选实施方式中，管状配置可包括有孔皮下注射针头(即，用于排出流体物质的口沿着针头的侧面)，或在可选的特别优选的实施方式中，管状电极可包括有孔针头，其中在管状针头的顶端处没有孔。在这样的布置中，通过管挤出的流体介质将不排出针头的顶端，而相反完全通过侧口。在另一实施方式中，侧口位于至少沿着管的导电远端0.1到1.5cm部分的细长电极上。在有关实施方式中，形成多个侧口的孔提供了均匀分布进入预期经受电穿孔的组织中的被注入的物质的惊人的能力，其中所述孔的直径小于大约120微米并以电极的每1cm长度通常有大约在10和100个之间、优选地在20和60个之间、且甚至更优选地在20和40个之间的孔的数量存在。该布置保证容易在流体上施加恒定的力/压力的能力，例如生命性地通过将拇指压力施加在与针头流体相通的注射器上的活塞上，并维持在沿着针头的有孔部分的整个长度的组织内的大致均匀的分布。
在又一些另外的有关实施方式中，针状电极相对于环形电极不被置于静止或固定位置上。更确切地，细长针状电极可经由在电极上端处的基底连接到储蓄器，例如皮下注射器或类似物，其中储蓄器和针状电极在垂直于环形电极表面的平面的平面中是可移动的，使得储蓄器和电极可由致动器机构移动，以便将针头/储蓄器相对于环形电极从第一位置移动到第二位置。第一位置包括静止位置，其中电极针头顶端放置成到环形电极表面的平面(即，预期接触组织的表面)并不比到环形电极的平面更远。在这样的位置上，针头不接触组织。第二位置包括延伸的位置，其中针头的顶端位于在组织的方向上远离环形电极的平面的0.5和4.0cm之间，这因此当环形电极与组织表面接触时将针头顶端置于组织内0.5和4.0cm之间的位置上。
就细长针状电极的管状电极实施方式而言，电极能够使可流动的介质例如注射物质从储蓄器通过电极的口(即，在针头的顶端处的口或可选地有孔的口)。可通过任何数量的方法产生连接，例如其中在电极端部处的基底包括塑料毂和一般皮下注射针头的锁定机构。在另一实施方式中，所述细长电极具有不导电表面，其沿着所述电极从针头基底安装件延伸到离针头远端的2.5和0.1cm之间内。在另一优选实施方式中，当所述电极与体组织接触时，电流将不沿着具有绝缘表面的电极的部分从电极传输到组织。在另一有关的实施方式中，绝缘表面可包括任何类型的电惰性物质。在特别优选的实施方式中，如本领域技术人员将理解的，可从生物相容以及绝缘的任何材料例如聚对二甲苯(paralene)、环氧树脂、橡胶、塑料、TeflonTM等中选择构成绝缘表面的材料。
根据本发明的优选实施方式，“环形”电极包括几个有用的特征。在第一实施方式中，电极通常具有环形或卵形形状和关于中央针状电极具有相对一致的对称布置的电极表面积。在优选实施方式中，预期与皮肤接触的环形电极具有至少大约2.5cm2或更大的表面积。在另一有关的实施方式中，环形电极的表面积与细长电极的导电部分的表面积成比例，以便当电脉冲在环形和细长电极之间被发送时保证在所述电极之间的电流密度的相当大的差异。特别地，在细长针状电极表面处的电流密度(IE)与在环形电极表面处的电流密度IR有关，由公式描述：
IE/IR＝(AR/AE)
其中IE是在细长电极处的电流密度(Amps/cm2)，其被表示为环形电极的表面积(AR)与细长电极的表面积(AE)的比率，且IR是在环形电极处的以Amps/cm2为单位的电流密度。因此，例如，如果电流是0.5Amps，且细长电极的表面积是0.20cm2以及环形电极的表面积是20cm2，则在电穿孔脉冲的持续时间期间环形电极的表面处的平均电流密度是0.0125Amps/cm2，以及针状电极处的平均电流密度是1.25Amps/cm2。对具有标称0.64mm直径和1.0cm非绝缘长度的23规格针头如下计算上面的细长电极的被暴露的表面积：
表面积＝(长度)x(周长)＝(1cm)x(2πR)＝(1cm)x(2)x(3.14159)x(0.032cm)＝0.20cm2
在特别优选的实施方式中，在所述细长电极上的所述绝缘表面的存在保证密度的电流的目标化或聚焦，其足以引起所述细长电极的远侧部分附近的细胞的电穿孔。在这样的实施方式中，细胞的电穿孔优选地发生在围绕所述电极的所述导电部分并朝着环形电极延伸到所述组织中一段距离的区域中，在该段距离处，降低的电流密度不能够支持足够的电能来引起细胞穿孔。换句话说，经受电穿孔的组织的区域是直接围绕细长针头上的导电区域并横向进入组织中和从其向上(即，朝着组织表面)到环形电极的至少在0.0到0.5cm的距离处的区域，取决于电穿孔能量脉冲的强度。当离所述细长电极的距离朝着环形电极增加时，电场强度和电流密度变得太低而不能引起电穿孔。在特别优选的实施方式中，电的感觉可能由于减小的电流密度而在组织或皮肤表面处极大地减小，其中该感觉与电流的密度有关。进一步地，假定细胞组织例如皮肤和肌肉组织(即，表皮、真皮、皮下、肌肉)拥有平均导电性，则现在可用实验方法确定从针状电极向外对细胞电穿孔到组织中给定的距离的、受到具有充足的场强和电流密度的电脉冲的组织的容积。这个进步允许待分配到预定的可定义的组织容积中的药物容积/剂量与期望治疗结果匹配。
在另一有关的实施方式中，环形电极被设计为“分离的”环形电极，其保证在发送电穿孔脉冲之前监控电极到皮肤表面上的正确放置的能力。特别地，环形电极电分离在两个或多个部分中，优选地在两个电力相等的半部分中。该布置允许电极靠着组织表面放置和所产生的感觉电信号感测电极的表面和组织表面之间的电阻。一旦按照在电极的每一半和组织表面之间的相对电阻所计算的，传感器确定电极适当地与组织表面接触，环形电极的两半就开始彼此电通信，细长针状电极部署在组织中，且电穿孔脉冲被输送到体内组织。该实施方式规定确保在输送电穿孔脉冲之前组织的电阻抗的效应相对于环形电极是一致的。在具有分离的环形阻抗传感器的备用和/或同时应用中，本发明设备还可包括与环形电极相关的压力传感器。在该实施方式中，在装置将被输送脉冲之前，压力传感器保证确定用户必须相对于设备的接触置于受验对象的组织表面上的压力的预定水平。感测该压力允许设备的用户知道设备何时相对于组织表面被正确地放置，以便对电穿孔能量脉冲维持良好的电接触。
在另一实施方式中，本发明装置可保证操纵组织表面被拉向本装置，用于产生与组织表面的一致的接触。在这个实施方式中，装置可配备有作为柔韧的隔膜形成的吸杯布置，该隔膜包括环形电极的中央部分。在这个实施方式中，隔膜如在玩具飞镖枪中的一样成形为吸杯，外圆周与环形电极的内圆周可密封地连接。另外的有关实施方式保证有助于杯的有效抽吸的产生，该杯可包括从环形电极的平面稍微向外拉杯而促动的弹簧，使得当环压住表面组织时，组织被向上拉到杯凹进部分中。在组织放置在杯凹进部分中之后，细长针状电极可被推动通过吸杯隔膜并进入组织中期望的深度。
在又一实施方式中，本发明装置提供对放置有细长电极的组织类型的感测。在优选实施方式中，本发明设备通过其细长电极配备有能够在针头插入组织中时测量所述组织的阻抗的传感器。因此，例如，当电极从一种组织类型移动到另一种时，例如从脂肪组织到深层肌肉组织，电极所感测的阻抗改变，从而提供电极已从一种组织例如脂肪组织移动到另一种，即，肌肉的直接指示。
在特别优选的有关实施方式中，本发明设备可编程为在组织类型内预定的位置处开始流体治疗物质通过电极中的侧口的输送。因此，例如，设备可在电极的顶端通过组织类型界面0.5和1.5cm之间以上或更深之后输送物质，即，例如一旦针头超过脂肪/肌肉组织界面，将被电穿孔的物质就可被排到肌肉组织中。在注射剂被预定输送到肌肉组织的特别优选的实施方式中，直到细长电极的顶端穿过脂肪/肌肉组织界面并进入肌肉组织中0.5和1.5cm之间时，流体才被排出。可选地，任何深度的穿透可被编程，以便可预先确定在物质的组织中的特定的输送位置。例如，可能希望根据指示输送到真皮组织、脂肪组织或肌肉组织。因此，另一实施方式是传感器可用于指示穿透针头的位置，用于将物质和电穿孔脉冲输送到组织的任何深度。
在又一些另外的实施方式中，本发明设备具有电子部件的新颖布置，使得设备是便携式的，并可在没有连接到固定的电能源例如墙壁电源插座的情况下使用。在优选实施方式中，本发明设备拥有具有2000uF(微法拉)的标称电容电位的至少一个电容器。在另一优选实施方式中，在将能量释放从电容器发送到电极之前，所述电容器可被充电到高达200伏的值。在特别优选的实施方式中，电路被设计成使电容器相对过充电，并当电容器放电时使用稳压电路，其允许在患者的脉冲周期的长度内的恒定的电压脉冲或相对整齐的方波脉冲，即使电容器电压由于电荷从电容器通过电极和被治疗组织的消耗而下降。因此，这样的布置允许模拟恒定的电流脉冲，即使它是被调节的电压放电。所谓“稳压”指的是在来自电容器的脉冲期间的向下调节的电压输出，其低于电容器被充电的电压，如图6所示。使用这样较低的电压允许脉冲电压在电容器的放电期间保持在恒定的输出处。在脉冲期间的电压降(ΔV)由下面的公式近似，其中“i”是进入被治疗的组织中的电流，“Q”是具有最大电容“C”的电容器上的电荷，以及“t”是脉冲长度。
i = dQ / dt ≅ CΔV / t p
Figure BPA00001185769700082
因此，稳压输出脉冲被设置在最大电压V减去脉冲(或脉冲串)两端的预期电压降ΔV之下，使得每个脉冲是相对整齐的方波，从而将实质上恒定的电压输送到组织。因为已确定在细长电极和环形电极之间看到的组织阻抗在整个被输送的脉冲中相当恒定(特别是就预期在治疗剂进入细胞的电穿孔输送中使用的脉冲来说)，实质上恒定的电压将导致在整个脉冲长度中进入组织的实质上恒定的电流。
在又一些另外的实施方式中，电路允许电容器直接通过固定电能源例如交流电源或通过感应或通过电池充电型单元来充电。
在又一个实施方式中，放置在细长电极上的电荷是带负电电极，而环形电极是带正电电极。所谓带负电指的是电子从其发射，而所谓带正电指的是电子被吸引到其。这个方面提供了保证将因从正电极产生的金属离子而进入体组织的正金属离子污染减到最小的新颖特征。如这里公开的，已发现，离子散发几乎唯一地发生在正电极。特别地，金属在电穿孔期间本质上只从正电极散发。因此，本发明提供了将能量的电穿孔电脉冲提供到体组织中的同时最小化可能有毒的金属离子污染生物环境的能力。虽然离子能够与电流的强度和脉冲的长度成比例地从环形电极散发，但在皮肤表面散发的金属离子将保留在皮肤屏障和身体的生物环境外部。
根据本发明的另一实施方式，提供了用于在受验对象中诱导免疫反应的方法，其包括将脉动电场施加到体组织内的细胞，特别是受验对象的真皮和/或肌肉细胞，并实质上同时将免疫反应诱导剂施用到所述体组织，使得免疫反应诱导剂被引入所述细胞中，从而在受验对象中诱导免疫反应。
根据本发明的又一实施方式，提供了用于对某些组织内的细胞电穿孔的治疗应用以将新陈代谢或其它全身效果引到受体的方法，所述组织包括例如受验对象的真皮内的肌肉细胞和下层骨骼肌肉细胞。例如，所设想的方法包括基因治疗处理，其中对可表达细胞因子或趋化因子或激素或具有直接治疗效果的其它多肽编码的基因施用到哺乳动物。
又一个实施方式设想结合电穿孔疗法使用的电极套件，所述套件具有环形电极组件，所述组件包括环形电极和细长中央电极，所述组件设计成连接到用于处理所述环形和细长电极组件并与流体注射剂的源和电能源一起使用它的设备。
在又一些另外的实施方式中，本发明的设备设计可适合于用在接种疫苗或以其他方式治疗家养牧群/食物源动物例如牛、羊、山羊和马中。在该实施方式中，环形电极设计有在其上的多个短的导电突出物。这样的突出物提供与针状电极的所需的总表面积比率并允许与皮肤表面组织的适当接触，突出物允许环形/表面电极穿透动物的毛、毛皮、头发或绒毛外层。
附图的简要说明
本说明书包括彩色地制成的至少一个附图。其中具有彩色附图的其拷贝将在请求和支付必要的费用时被提供。
图1示出电穿孔设备系统10的示意图，电穿孔设备系统10包括环形电极99(在这里环形在形状上被示为卵形)、支撑环形电极及其组件的手持便携式设备100、用于给与所述环形电极组件电通信的电容器(C)充电的充电单元101、用于设置脉冲参数并监控和记录脉冲条件和传递给所述电容器的电荷的量的计算机102操作的软件，该计算机由外部交流电源103或可选地DC电池(未示出)供电。
图2是在细长电极120和环形电极200之间的相对空间布置的一个例子的透视图。特别地，细长电极120置于相对于环形电极200垂直的平面中，使得细长电极120沿着在环形电极200中央的轴放置并与储蓄器140流体相通。细长电极120还包括不传导电流的部分130。该图还描绘了包括细长电极的近端的基底121以及用于支撑环形电极的基底201。
图3A、B和C是有关附图，其在图3A中示出在组织中的环形和细长电极的横截面表示。特别地，环形电极200被示为与组织表面15啮合，细长电极120具有在所述组织中的绝缘部分130。所示出的是归因于一般电穿孔能量脉冲的理论力线310，其在细长电极120处集中到较高的电流密度而在环形电极200的表面处较不集中。图3B示出了在所述针头120的远侧区域中的具有多个孔150的细长针头120的特写视图。该图还示出来自所述孔150的射出物140和理论电力线310。图3C是示出从中央高电流密度针状电极120辐射到低电流密度环形电极200的理论电力线310的顶视图。
图4A和B是示出分离的环形电极实施方式的透视图，其中环形电极被物理地分成两半，且其之间有小气隙152(图4A)，或被物理地分离但由绝缘基底160连接。在这些实施方式中，环形电极的每半彼此电绝缘。
图5A、B、C和D是对于各种有用形状的分离环形电极示出安装在支撑基底156中的分离的环形电极的电极侧155的平面图。
图6是示出为了获得相对平坦或恒定的电压放电的目的而将电容器充电到比在脉冲期间实际使用的电压电位高的电压电位而产生的被稳压电位的曲线。
图7是使用本发明的环形电极系统的被输送的物质的电穿孔团块的可能形状的示意图。
图8是环形电极支架201的横截面图，该环形电极支架覆盖环形电极200以及位于中央的柔韧吸杯210。如所示，在本实施方式中的吸杯210连接到相对于组件壳体205的一部分可滑动的弹簧215辅助的提升基底220。
图9A、B、C、D、E和F示出对25cc表面积环形和针状电极的放置的表示而叠置的绿色荧光蛋白质(GFP)染色照片，其示出如GFP染色所展示的组织中的电穿孔能量的实际焦点相应于图7中公开的理论预期结果，取决于脉冲的场强和相应的电流密度。在图9A(GFP染色)和9B(GFP和可见光场)中示出的是使用标称289mAmp/64伏脉冲的兔肌肉组织中的结果。图9C示出标称384mAmp/81伏脉冲，其中比图9A中更大的组织容积经受电穿孔脉冲。在图9D中示出的是在标称579mAmp/103伏脉冲之后的GFP染色，展示经受电穿孔的甚至更大的组织容积，且在图9E(GFP染色)和9F(GFP和可见光场)中示出的是在更大的组织容积电穿孔的标称758mAmp/138伏脉冲之后的GFP染色。
图10A和B是示出GFP(图10A)以及组合的GFP和可见光(图10B)的彩色照片，其中组织使用具有2.5cc表面积的环形电极受到189mAmp/58伏脉冲。如所示，组织容积被限制到紧密围绕细长电极的组织。
图11A和B示出描绘沿着细长管状电极杆的导电部分的孔的定位的示意图。孔的直径可在20和120微米之间。如所示，孔沿着针头长度(图11A)间隔开，且在针杆的圆周周围(图11B)相对于彼此成90度。
图12是示出在GFP通过60微米孔的注射的扩散之后肌肉组织中的混合荧光和可见光GFP染色的彩色照片。如所观察到的，注射物质的分布均匀地分散在肌肉组织中的针道周围。
图13A和B是设计成在将电穿孔脉冲输送到毛发、皮毛或绒毛覆盖的家养牧群动物中使用的可选的环形电极实施方式的透视图。在该实施方式中，环301不论是圆形、卵形、分离的与否都配备有可穿透毛发、皮毛、绒毛外层以接触动物的皮肤表面的多个导电突出物300。
图14A、B和C是示出对不同的组织类型界面特别是含脂肪组织或脂肪组织和肌肉组织的感测的曲线。在图14A中，在图14B中，在图14C中。
图15A、B、C和D是示出在将针头同时推到组织中并同时注入注射物质之后感测组织类型的过程的示意图。图15A示出用于在该配置中感测的电极在注射针头上。特别地，电极400与充当返回电极401的针头的顶端电绝缘。
图16A-E是示出使用具有多个突出物的环形电极对动物肌肉组织的成功电穿孔的GFP染色照片。各连续照片是相邻组织切片的照片。
图17A、B、C和D是示出对感测用于确定组织界面的组织电阻有用的针头的结构例子的图示。在图17A中，可构造一般注射器针头的顶端，其中顶端部分充当一个导电电极，而第二导电电极被包围在顶端电极周围，且这二者之间有绝缘材料。在图17B中，示出了双针头布置，其中本系统的中央针头实际上是两个紧密间隔开的输送管，且每个可充当单独的电极。在图17C和D中，示出了对双中央针头系统的两个额外的设计形式。在图17C中，所示电极可具有绝缘体，以便将感测只集中到电极顶端被推动过的区域，而在图17D中，电极不仅仅拥有绝缘部分，而且每个目前公开的本发明元件有孔口。
图18A和B是示出在使用本发明的方法和设备，即，使用平面环形电极和具有突出物的环形电极(梳妆电极)在兔组织中电穿孔之后，图18A中的质粒gWiz-SEAP(一种质粒编码分泌的碱性磷酸酶)的表达的结果。还示出了阴性对照和使用elgen设备的阳性对照。在图18B中，对使用相同输送条件的相同电极示出兔子中的抗-HBsAg抗体的引入。
本发明的详细描述
现在转到本发明的进一步的实施方式，如这里使用的，“生物相容”或“生物相容的材料”意指适合于引入到人体中用于治疗目的的材料。例如，关于电极和材料例如用于覆盖导电表面的绝缘材料，这样的覆盖物包括惰性的和不在哺乳动物的组织中引起刺激或过敏的材料。
如这里使用的，“注射物质”意指将被输送到靶组织的治疗剂的任何可注射的成分。如这里描述的，包括被设想用在本发明的实践中的注射物质的治疗剂非限制性地包括核酸、多肽、化学治疗剂等，例如贯穿本专利特许的任何核酸以及核酸序列编码多肽例如编码IL-2、IL-12、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、PSA、PSMA、PAP、MUC-1、Her-2、NS 3和4等、以及包括RNA、DNA、RNAi、siRNA、micro RNA和shRNA的核酸。为了本专利的目的，注射物质也可包括绿色荧光蛋白质(GFP)的DNA编码和在显现注射进组织中的材料的位置中使用的其它物质。注射物质还可包括药物配方，其包括盐、赋形剂(excepient)和用于可接受的缓冲的其他材料，如将被药物领域的技术人员理解的。
如这里使用的，对于与注射物质附随的组织中电能的电穿孔的应用，术语“实质上同时”意指电脉冲和注射物质在时间上合理接近地被一起输送到组织。优选地，注射物质在电能的电穿孔脉冲之前或与电能的电穿孔脉冲同时被施用。当应用多个电脉冲时，注射物质可在每个脉冲之前或之后或在电脉冲之间的任何时间被施用。
如这里使用的，术语″impulse(脉冲)″、″pulse(脉冲)″、″electricalimpulse(电脉冲)″、″electrical pulse(电脉冲)″、″electric pulse(电脉冲)″、″electropulse(电脉冲)″和其语法变形是可互换的，且都指电刺激。虽然各种术语以单数在这里被频繁地使用，术语的单数形式包括多个脉冲。优选的电脉冲是为了细胞膜的可逆穿孔的目的而施加的脉动电场。脉冲可为单极、双极、指数或方波或其它形式。被设想用在本发明的实践中的电脉冲包括在体组织内的特定位置上引起电穿孔的充足的电压、电流、电流密度和持续时间以及频率的那些脉冲。
环形电极系统
在第一实施方式中，本发明设备包括用于执行体内细胞的电穿孔的电极系统。在优选实施方式中，系统包括：(1)通常环形或卵形的正电极，(2)细长的组织穿透单针负电极，其包括导电和绝缘部分，所述单针电极被定位成沿着在所述环形电极中央的轴并垂直于环形电极的平面放置，使得电流可被引导到所述针状电极的远侧部分上的有限的电极表面区域，(3)用于将单针电极推动到组织中的机构，(4)用于通过所述细长针状电极注射包含有效量的治疗剂的机构，以及(5)用于给电容器充电的电能源，电容器的放电包括至少一个电脉冲，优选地为方波稳压脉冲，用于将电能的电穿孔脉冲输送到电极。
本发明的一般实施方式的例子在图1中示出。特别地，系统10包括与环形/针状电极相关的便携式手可操纵的壳体100、充电单元101、计算机软件系统102和电源103。该电源103可为A/C或D/C。
壳体元件100还包括推进器，其可使用凸轮、齿轮和/或杠杆或通过用于将单个细长电极从开始位置推动到末端位置的无生命性的装置例如电机来机械地操作，电极的该运动可为在大约0.5和4cm之间的移动。在优选实施方式中，单个细长电极120(图2)还充当注射针头。因此，注射针头120的至少一部分必须由拥有电导体的性质的材料形成。在优选实施方式中，推进器通过推动连接到针头的储蓄器本身来操纵细长针头。在特别优选的实施方式中，推进器操纵注射器的主体，以便注射器从开始位置到末端位置携带有组合电极/注射针头。
在特别优选的实施方式中，针状电极可被更改，以例如通过提供沿着其长度布置并接近针头顶端的一个或多个孔(即，有孔针头)来保证注射物质的径向输送，其中所述孔与注射针头的中空内部流体相通。针头120可由生物相容的金属例如不锈钢、金、银等形成。在另一优选的实施方式中，细长电极120可设计成使得在针头的顶端没有口，与一般注射器针头相反。在这样的实施方式中，口(孔)只位于电极杆的导电部分周围，使得从其排出的流体被直接引导至预定用于输送电能的电穿孔脉冲的区域中的组织，如图3B所示。与一般有孔针头相反(其中喷射出的流体主要从位于针头的顶端处的口(如果存在)流出，或可选地通过上部口或第一侧口流出，由于流体动力学，上部口或第一侧口与沿着针头路径的被挤出的流体接触，如水文领域的技术人员将完全理解的)，本发明的有孔针头由于孔的尺寸范围和顶端孔的消除而只使用用于注射流体注射物质的标称压力保证流体通过所述孔沿着具有所述口的针头的整个长度的均匀分布。所谓标称压力指的是从具有微米尺寸的孔的电极排出流体所需的压力仅仅是一般在通过标准皮下注射针头注射物质期间需要的压力。通过沿着针杆将孔依尺寸制造到在微米范围内的直径以及导电针头/电极的每1cm长度包括多个这样的孔来产生这个惊人的发现，所述多个孔是范围在10和100个之间、更优选地在20和60个之间以及甚至更优选地在20和40个之间的这样的孔。优选地，用于获得通过每个孔的流体的均匀挤出的孔直径是在20和120微米之间，更优选地在30和100微米之间，且甚至更优选地在30和80微米之间。特定的直径包括20、25、30、40、50、60、70、80、90和100微米以及其间的任何递增的直径。孔的数量优选地为导电电极长度的至少20/cm，更优选地为至少30/cm，且甚至更优选地为至少40/cm。如图11A和B所示，多个微米尺寸的孔可沿着针杆间隔开和从其呈圆柱形分布，如图11B所示，孔可在针头圆周周围以90度角间隔开，使得4个孔如所示彼此相对，或可在针头圆周周围以60度间隔开以每针头长度获得更多的孔。依然进一步地，孔可在螺旋配置中在针杆中形成，以便当例如使用孔的60度横截面放置时，孔不在针头的相同横截面中，而是与横截面交错开，使得孔沿着针杆的形成是以螺旋形式。如在图12中进一步公开的，来自GFP实验的结果示出在被挤出的材料的针道周围的一致分布，如GFP的圆柱形定位所指示的。在该实验中，转染的容积被测量为1.2cm3，组织受到间隔开200毫秒输送的两个连续的6o毫秒98V，768mAmp脉冲。
在又一些其它实施方式中，单针电极具有不导电的绝缘部分130。在特别优选的实施方式中，可由绝缘涂层例如生物相容的塑料、聚对二甲苯、TeflonTM、环氧树脂或将不允许电流通过的其它材料提供绝缘部分。仍然进一步地，所述细长电极的绝缘部分沿着其近侧区域位于所述电极上。特别地，细长电极有在近端(其与包含用于输送到体组织的注射物质的储蓄器流体相通)和离电极的远端0.1cm和2.5cm之间的绝缘表面。
在另一实施方式中，环形电极200能以具有对称性的任何平面形状形成，包括但不限于圆环、环形圆、椭圆环、矩形环、等腰三角形环、等边三角形环、正方形环、矩形环、五边形环、六边形环等，如例如在5A-D中所示的，只要电极在平面中形成，通常是对称的(即，具有可被识别为有可均匀地分成两个相对相等的导电部分的形状的形式)，并且至少在平面的一侧(即，面向放置有电极的身体表面的侧面)上是导电的，电极还有相对于环形结构例如洞或孔在中央的区域，该中央的区域没有导电材料或可选地为绝缘材料例如柔韧材料如橡胶或硅。在这样的柔韧材料存在的场合，这样的材料可进一步设计成充当吸杯，用于促使表面组织从组织表面被拉向外。在另外的实施方式中，形成环的中心的空的或绝缘区域允许细长电极通过其穿过，不管是通过洞并直接与表面组织接触，或可选地通过所述弹性吸杯材料并接着与所述组织接触。
在另一特征中，环形电极设计成使得它可被电绝缘地分成两半。特别地，环形电极被制造为两个分离的半部分或可包括通过绝缘基底连接在一起的两半(见图4A和B)。在这方面，环形电极半部分可彼此电绝缘，其电布置保证使用电极来监控环形电极与组织表面的电接触的质量的能力。用于实现感测接触的特定的电布置容易被电子领域的普通技术人员理解。在操作中，例如本发明装置的环形电极压住皮肤。环形电极系统电路包括分离的环的每半的电引线，且当通过每个电极半部分发送标称电信号时，可关于所检测的电流或可选地在电极和表面组织之间测量的电阻对每半进行阻抗检查。如果环形电极适当地靠着组织表面放置，则在每半中测量到的电阻或电流将本质上是相同的，指示用户将环形电极和设备均匀地应用于组织表面，以便当单个细长电极被推到组织中且电脉冲在细长电极和环形电极之间发送时，在细长电极和分开的环形电极的两半之间的电流相等。可使用很多分离的环形电极形状，包括例如在图5A-D中示出的形状。
对于在环形电极中央的空区域包括用于充当吸杯的橡胶或其它柔韧绝缘材料的实施方式，组织表面可通过抽吸机构被驱动到杯中，使组织靠着弹性材料被向上拉，从而保证组织与电极的额外的紧密和一致的接触，以支持组织表面和环形电极之间的一致的导电性。组织靠着吸杯的上拉进一步保证在不同的被治疗受验对象之间维持在注射物质的输送的深度上的一致性。当组织靠着吸杯被上拉时，细长针头可被推动而通过吸杯橡胶并进入组织中一致的预定深度。
如图8所示，例如，一机构可合并到环形电极组件中，该机构包括与环形电极基底201可密封地连接的弹性吸杯210。特别地，例如，相对于组件壳体基底205可滑动的弹簧215加载的提升基底220可连接到环形电极，用于帮助对吸杯外拉(从组织表面)，吸杯在使用中将保证向外拉组织表面。
在优选实施方式中，细长电极在其近端与包含注射物质的储蓄器流体相通。在另一优选实施方式中，本发明装置包括推进器机构，该推进器机构用于相对于所述壳体和环形电极从开始位置到末端位置推动细长电极以及可选地连接到其的所述储蓄器。优选地，被促动的细长电极的行进长度可大概在0.5和4cm之间。对于包括吸杯的实施方式，针头被引导以穿透吸杯并进入组织。
在又一附随和/或可选的实施方式中，环形电极系统可包括与环形电极相关的压力传感器，如电子和机械领域的技术人员将理解如何进行的。在该实施方式中，压力传感器布置成使得当环形电极压住组织表面时，传感器将测量对着所述组织施加到设备的物理压力。如果压力的值足够，则设备将能够启动向电极发送电能的电穿孔脉冲。在优选实施方式中，启动设备必需的压力可在0.5和1磅/平方英寸之间。如相应领域中的技术人员将理解的，本发明装置包括用于测量所述压力的用于确定对组织表面置于环形电极上的物理力的量的软件。应理解，这样的物理力的施加用来有助于环形电极和组织表面之间的良好电接触。对于包括吸杯的实施方式，这样的压力也有助于吸杯的功能，以便当抽吸被触发时，组织将容易被拉向所述吸杯。
在又一些另外的实施方式中，本发明保证当使用标准不锈钢组织穿透电极时避免使可能有毒的金属离子散发到哺乳动物的组织中的、在此之前还未发现的能力。尽管如在美国专利申请号10/516,757中公开的，已知涂金不锈钢电极的使用将保证在不锈钢中存在的有毒重金属不散发到组织中，但由于金的增加的成本以及金到电极的涂镀，金的使用并不如不锈钢那么理想。令人惊奇地，如这里公开的，可在组织穿透电极中使用不锈钢，其中如本案中，只有单个组织穿透电极和不穿透组织的相应反电极。在这种情况下，如果不锈钢穿透电极充当带负电电极，而非组织穿透电极例如这里公开的环形电极充电正电极，不锈钢穿透电极将使最小数量的金属离子散发到组织中。
在本发明人的实验中，在生理盐水中，设置为负或正电极的标准不锈钢皮下注射针头对照设置为负或正电极的金电极被测试。在金电极被设置为负而不锈钢电极被设置为正的场合，在400mAmp电流和40伏的两个60毫秒电穿孔脉冲之后的溶液中存在的金属离子如下：0.035ppm(百万分率)的锰、0.200ppm的镍、小于0.003ppm的钼、0.413ppm的铬和0.977ppm的铁。相反，当在相同的条件下金电极被设置为正而不锈钢电极被设置为负时，实质上没有散发到溶液中的可检测到的金属离子，即，在每种情况下，不管是锰、镍、钼、铬还是铁，都被观察到小于0.003ppm。
在特别优选地实施方式中，环形电极的表面积与细长电极的表面积成比例。通常，环形电极表面积与针状电极表面积的比率分别为至少5∶1。优选地，环形电极与细长电极的表面积的比率在10∶1到1000∶1之间。10∶1的比率对用在受试人中是优选的，而在5∶1和10∶1之间的比率对用在牧群动物中是可接受的。在有关实施方式中，环形电极可具有在1cm2和100cm2之间的表面积，而细长电极的导电部分可具有在0.01cm和3.0cm之间的长度。对于具有这样的线性尺寸范围的细长电极，相应于这样的长度的表面积依赖于电极的规格(即，其相应的外径)。如在下面的清单A中示出的，细长电极表面积如所示使用公式：面积＝CL＝πDL来计算，其中D是直径而L是被暴露的长度：
Figure BPA00001185769700191
表中的黑体数字是以cm2为单位的面积。
对于有用的细长电极表面积的上面的列表，在特别优选的实施方式中，电极针头的规格可在22和24规格之间，对于高达4.0cm的插入深度，范围从大约0.1to0.6cm2。
对于上面的环形和细长电极表面积比率，这样的比率与电流密度相关，其中环形和细长电极之间的关系如前所述由下面的公式描述：
AR/AE＝IE/IR
其中，AR是环形电极的表面积，AE是细长电极的表面积，IE是细长电极处的平均电流密度，而IR是环形电极处的平均电流密度。因此，对于细长电极和环形电极的任何给定的表面积，比率直接与在细长电极和环形电极表面处可观测的电流密度成比例。在特别优选的实施方式中，环形电极与被暴露的细长电极的平均电流密度的比率被规定为有大概在从1000∶1到50∶1之间，更优选地在200∶1到100∶1之间的值。进一步地，这样的值比率直接与获得细长电极附近的电穿孔电能同时获得较接近于环形电极的非电穿孔电能相关。这样的比率进一步保证减少可用于刺激感觉神经细胞的电流，因而保证在环形电极附近的表面组织中的电击感觉的可能减少。这特别是当输送的电能脉冲有在(恒定电流放电脉冲的)0.01Amp和1.0Amp之间的标称电流时的情况。
如本领域技术人员可理解的，细长电极和环形电极的表面积中的差异保证在脉动时电流密度在位于电极之间的整个组织容积中是不一致的条件。特别地，如图3A、B和C所示的，电流密度在细长电极的非绝缘部分处非常高(至少高到足以保证相邻或接近于电极的细胞的电穿孔)，而在环形电极表面处明显降低。在其中环形电极组件设计有在一端的对称展开环形电极和在另一端的细长电极的导电部分的特别优选的实施方式中，主要归因于环形电极的对称形状，在垂直于细长电极的给定平面中的环形和细长电极之间的任何给定距离处的组织中建立的电流有相同的电流密度。进一步地，电流密度在朝着环形电极的每个递增测量点处的组织中相对均匀地降低。因此，本质上在组织周围并从细长电极延伸到组织中的给定平面中的所有组织将经受相同的比细长电极处的密度更低的电流密度。仍然进一步地，预定经受电穿孔的组织的区域是沿着在细长电极的导电区域中针道的组织并从其延伸到组织中一段足以变得电穿孔的距离的组织(即，取决于局部场强，位于离沿着电极的不绝缘部分的针道至少0和0.5cm之间的至少一些细胞受到电穿孔)。电穿孔将出现的、从针道进入组织的距离取决于所使用的脉冲能量以及其它因素。脉冲的场强越高，电穿孔出现的阈值点朝着环形电极进入组织就越远。
对于与本发明中的未受损组织的电穿孔有关的场强现象，直观化与“场强”有关的“电流密度”的方法如下。对于面积为1cm2和其两端100伏电位并进一步分离开长度L＝1cm的两个平行板的理论条件，如下所示：
Figure BPA00001185769700201
电场线和电流的方向由箭头示出。对于平行的板电极，在板之间的平均场强为V/L＝100伏/1cm＝100V/cm。板之间的电流取决于其间的组织的阻抗。如果该阻抗假定为100ohms，则板之间的电流为I＝V/R＝100/100＝1.0Amp。这将导致I/A＝1000mAmps/1cm2的电流密度。对于不同的电极配置和不同的组织阻抗，场强和电流密度之间的关系将不同；然而，它们将大致彼此成比例地变化。在细长电极和环形电极的配置中，电流密度的测量可更容易用于确定有效的电穿孔。这个阈值用实验方法在兔肌肉中被测量为接近300mAmps/cm2。经受在阈值之上的电流密度的组织将被电穿孔，而在阈值之下的组织不被电穿孔。通过确定表示该阈值的组织的三维区域内的边界，该边界内的容积和形状可被预测来电穿孔。
如图9A到F所示，被暴露给电穿孔能量脉冲的组织的容积可本质上逐步递进，而不将电穿孔能量扩散在组织的可测量的距离/容积之外。在图9A中，原型发明设备在新西兰白兔腿四头肌肌肉中测试，给以64V脉冲相关的289mAmp实际测量的脉动，在图9C中，较大的组织容积使用与81V脉冲相关的384mAmp实际测量被电穿孔。在图9D中更大的组织容积使用与103V脉冲相关的579mAmp实际测量被电穿孔，以及在图9E中，更大的组织容积在与138V脉冲相关的758mAmp测量被电穿孔。在图9B和F中，公开了单独GFP荧光和GFP与可见光照片，其示出治疗区进入肌肉组织的电穿孔扩散行为。在这些实验(图9A、B、C、E和F)的每个中，280ul(微升)容积的GFP编码质粒DNA溶液被注射到兔肌肉中，后面紧接着是必需的脉冲。在图9D中，只有70ul GFP DNA被用于示出电穿孔将包括含有GFP DNA的所有组织容积(即，未达到注射剂的饱和)。因此，在图9D中，所测量的实际电穿孔的容积比图9B和E中的小(见表II)，即使在图9B中被注射的容积大约多2/3且电能较小，而在图9E中被注射的容积为大约多2/3且电能较大。这个实验的环形电极导电表面积大约为25cm2，而细长电极导电表面积大约为0.22cm2。
环形电极表面积与电流密度相关，如下面的表I所示。表I示出配备有卵形环形电极的系统的图，该电极具有25cm2的表面积和不同的所施加的场强。
表I
注意：按照公式I＝V/R，电极电流基于标称组织阻抗292Ω(被计算为所获得的组织的阻抗测量231Ω-380Ω的平均值)。
表I示出在环形(RE)和细长(EE)电极处的电流密度的计算。在这些计算中，对于细长电极，使用在22规格针头(0.7mm OD
Figure BPA00001185769700221
0.4mm ID)和23规格针头(0.64mm.OD
Figure BPA00001185769700222
0.1mm ID)之间的皮下注射针头的表面积的平均值。特别地，各种规格的针头具有下面的尺寸：
22ga，.028”ODx25.4＝0.71mm
23ga，.025”ODx25.4＝0.64mm
其中面积＝CL＝πDL＝3.14159x0.07cmx1cm＝0.22cm2(22规格针头，在针头的总长度中，在计算中使用远端1cm，因为它是电极的非绝缘部分)。23规格针头的面积为例如0.20cm2。
可使用其它规格针头，例如24ga，0.022”ODx25.4＝0.56mm、25ga，0.020”ODx25.4＝0.51mm和26ga，0.018”ODx25.4＝0.46mm。对于每个规格，可产生电流密度的相同类型的比率，然而没有在这里示出。
表I还示出电穿孔设备的电流密度(the Elgen electroporation device，Inovio Biomedical公司，San Diego，如在2003年6月3日提交的美国专利申请序列号10/612,304中公开的，并在这里通过引用被全部并入)，该电穿孔设备使用具有0.44cm2的表面积的22规格的两个2cm长度(全部2cm都是非绝缘的)的针状电极，从而表面积比本发明的细长电极的表面积大。关于Elgen设备计算，很清楚，在0.5cm距离处的两个非绝缘平行细长电极之间的标称场强保持在能够产生相当大的神经刺激的高值(大约100V/cm)处，而本发明的环形电极处的场强为该值的大1/50(在0.29和2.42V/cm之间)。
所施加的场强(V/cm)可被解释为在针头和环形电极之间在其间最近距离(在1cm处被任意计算)处的伏特。例如，在本发明设备的电极之间的距离范围可在至少1和4cm之间，针头顶端和环形电极上的最远的外边缘之间测量为4cm(在这里对上面公开的25cm2环形电极计算)。在细长电极和环形电极之间以V/cm为单位的确切“场强”不能容易被计算，因为场强在电极之间不是恒定的，而是从细长电极朝着具有宽阔的横向剖面的环形电极表面减小。然而，可对例如在Elgen设备中使用平行电极的系统进行这样的计算。在这样的设备中，因为电极表示电流的界限分明的平行源，且由于场的均匀性质(模拟两个平行的电极板)，可确定电流密度(mAmp/cm2)和场强。该比率或关系可用于估计在接近于针头的最强点处的、环形电极布置的等效场强。该比率例如如下被计算。间隔开0.5cm的Elgen设备电极两端的50V放电导致100V/cm的场强。使用在Elgen设备的两个电极之间的100Ω的组织的阻抗值导致公式I＝V/R＝50/100＝500mA。使用2cm长度和大约0.44cm2的表面积的两个22规格针头导致I/A＝500mA/0.44＝1136mA/cm2的电流密度。因此，电流密度(1136mA/cm2)和场强(100V/cm)之间的比率是11.4。该值在表I中被反映。
表I中的数据因此表明，使用本发明的环形电极系统，电流密度和以V/cm为单位的场强可减小到在体组织，即，包含感觉神经细胞的皮肤组织的区域中的临界值。在所施加的50伏电压处，在环形电极处经受的V/cm仅为0.61，而所施加的100V电压导致在仅为1.2V/cm的环形电极处的V/cm。甚至在所施加的电压高至200的场合，在环形电极处的V/cm仅为2.4伏。相反，在现有技术Elgen设备两端只施加50V在两个电极处经受100V/cm。如在美国专利6,041,252、6,278,895和7,245963的任何一个中公开的，例如通过将绝缘体添加到电极的一部分来只减小在Elgen或其它类似电极布置中的细长针头的导电部分的面积将不降低V/cm，而是实际上有可能增加它。因此，在本发明的中央电极上绝缘体的使用实质上不同于在现有技术组织穿透电极中所应用的。
其中使用较小的环形电极尺寸，例如环形电极的表面积为2.5cm的本发明的另外的例子被示为保证对用于电穿孔的组织容积的相同控制。使用其中环形电极具有相对小的直径的环形电极实施方式中，电流被引导为较少地横向通过组织并较多地沿着细长电极的附近区域，类似于非环形单针系统，例如在这里通过引用全部并入的未决的美国专利申请序列号11/804,703中公开的。如在图10A和B中公开的，在新西兰白兔四头肌肌肉中使用200mA设置(在189mA和58V测量)的实验导致被电穿孔的狭窄的组织容积。在这里，细长电极处的平均电流密度计算为189mA/0.22cm2＝859mA/cm2，且环形电极处的平均电流密度计算为189mA/25cm2＝7.6mA/cm2。因此，不管环形电极具有小或更大的尺寸，经受电穿孔的组织容积都可用实验方法被预先确定，例如通过测量在组织中的GFP表达，以及使被电穿孔的组织容积与治疗物质的注射容积/浓度相关。
本发明设备的另外的实施方式包括测量经受电穿孔的组织的容积的能力。这个方面提供了优于现有电穿孔系统的明显优点，因为现在可能预先确定将被暴露给电能的电穿孔脉冲的组织的容积。因此，所输送的物质的量可按经受电穿孔的预定组织容积来给药。如这里讨论的，环形电极系统保证细长电极和环形电极之间的可变电流。该布置允许电穿孔能量远离细长电极扩散到组织中预定的平均距离和因此获得可测量的组织容积(细长电极的导电部分的长度是已知的，通过计算并通过现有的经验实验可确定离开电极出现电穿孔的距离)。这两者都应如这里所示的相关。因为来自任何电脉冲的力线通常从中央或核心位置向外和从细长电极的导电部分向上被引导到横向定位的环形电极，组织的实际电穿孔容积将通常是圆柱形的或甚至圆锥形的、杯或碗形的，如图7所示。进一步地，电穿孔能量扩散到组织中的距离取决于电脉冲的强度和生物组织的自然电阻。在优选实施方式中，可使用具有在1和200V之间的值的任何水平的电能脉冲，或可选地，可为恒定的电流-在细长电极处在0.01和1.0amp之间的安培数计算任何水平的电能脉冲。
可根据经验通过测量受到GFP表达的组织的量来进行计算进入组织的、电场强度将足以使细胞穿孔的距离，因而计算出受到这样的场强的组织容积。如表II所示，被影响的组织的容积与用于计算圆锥形或锥形容积的标准公式不相关。更确切地，所影响的容积依赖于生物组织的电阻和其它物理参数。而且，经受电穿孔的容积对被注入组织的GFP编码质粒是高度敏感的。也如表II所示，其中四分之一的容积(70ul对280ul)被注入，经受电穿孔的组织容积明显大于注有足够浓度的GFP质粒的区域。这可被计算，假定所使用的较大电流(579mA对384mA)只使大约一半的组织容积表达GFP，然而如果使用足以充满组织的GFP的量(即，280ul)，则经受GFP表达的组织容积将在1.4和1.9cm3之间。因此，必须使用足以完全充满被测试的组织的区域的GFP质粒或其它类似的指示剂的容积来进行对电穿孔组织的容积进行经验计算。
表II
Figure BPA00001185769700251
数字被四舍五入到最接近于1/10。*小环＝2.5cm2，**大环＝25.0cm2，#基于理论的标准公式V＝bh＝(pi x r2)h；$锥形容积的基于理论容积的公式V＝1/3pixr2h；％-使用具有GFP染色的组织的所有切片计算的实际容积。
使用确定经受电穿孔的组织的可能容积的能力，现在可使待输送的物质的容积/浓度与可用于直接通过临时穿孔细胞吸收所述物质的组织中的细胞的容积匹配。这个优点允许正确的给药并避免过多或不足的给药以及防止治疗材料的浪费。换句话说，本发明保证根据对被暴露给具有任何给定电流和标称场强的电穿孔脉冲的细胞的容积的了解来输送例如所计算的“有效剂量”的可表达核酸的能力，以及知道能够被所述细胞容积完全吸收的被输送的材料的容积的能力。
本发明装置还包括用于提供足以引起组织中的电穿孔的电能的充电的机构。在特别优选的实施方式中，所述机构包括位于所述装置中、具有在1000和2,200uF(微法拉)之间的电容的电容器。电容器可放置在设备壳体中，例如在包括手可操纵的壳体的部分中，并与电极和电能源电通信。在另一优选实施方式中，电能源可为外部源例如固定交流电(墙壁电源插座)或电池组。进一步地，通过使用经由外部能量源本身可赋能的充电单元给电容器充电，可针对在任何特定的治疗方式中使用的特定治疗参数按需要将电容器预先赋能到预定的电容。在特别优选的实施方式中，电容器被充电到高达200伏。
电路部件
电控制电路(未示出)连接到细长电极针头120和环形电极200，以产生从电容器发送的期望电脉冲，引起电穿孔和被注射物质到靶组织中的细胞的电穿孔增加的输送。
电路可包括一般在1.5和9伏之间的电池、可存储足够的能量和电压以便它可在期望输出持续时间内提供期望电穿孔输出电压的电容器、以及给电容器充电到正确的电压并控制输出脉冲电压和持续时间的控制电路。
在示例性实施方式中，电路布置保证将电容器充电到一电压，当在设定的一段时间被放电时该电容器提供足以使细胞在原位电穿孔的电能量脉冲。电容器的放电可被调节，以便保证双极放电或单极放电。例如，在单极布置中的放电可被调节，以保证在脉冲时间段内维持所设定的电压脉冲。特别地，在设备被设置为在100毫秒内产生100伏的一个实施方式中，例如，脉冲将有如图6所示的波形。在这样的布置中，设备配备有能够在100毫秒内提供例如1Amp的电容器，且在该脉冲结束时必须保持在100伏之上，以便使用电容器的电压来产生100伏输出的电压调节器不退出调节。作为例子，在一个实施方式中，本发明设备可包括1000微法拉电容器。如电子领域的技术人员将理解的，等式VxC＝Q描述了获得100伏输出所需的能量，其中V是伏特，C是微法拉，而Q是库仑。特别地，为了在100毫秒脉冲内以经调节的恒定100V电位获得放电，根据公式Q＝CV对电容器的电压充电必须为200伏，即，V＝200，C＝2200，Q＝0.44。在该实施方式的变形中，可能有两个或多个脉冲的系列，在所述脉冲系列结束时电容器的电压仍然在100伏之上，使得输出不对该系列内的任何脉冲退出调节。
实质上任何电容器值可用于在本发明设备中使用的电路。例如，用于放电0.1库仑电荷的100uF(微法拉)电容器需要该电容器被充电到高出患者的调节目标电压1000伏。可选地，相同的放电可使用只被充电到高出调节目标电压10伏的10,000uF电容器来完成。在本发明的情况下，在一个实施方式中，可使用具有大约在2000到4000uF之间的电容的电容器，其在这样的情况下保证100伏的100毫秒脉冲。提供前述脉冲所需要的电压为大约150伏，取决于电极之间的组织阻抗。
在本发明设备的一个实施方式中，电路包括：1)微处理器，其控制充电和放电过程并管理控制和安全电路；2)充电电路，其由微处理器控制并使电容器达到在期望的电穿孔脉冲时间段内的所计算的正确电压，其中当电容器达到期望电压电位时，微处理器关闭充电电路；3)充电电容器；4)受微处理器控制的线性调节器，其可被快速开启和关闭，以便它可提供被编程到微处理器中的电压和持续时间的脉冲；5)安全和监控电路，其保护电路不受滥用并且还检查和保证为了安全起见当电压被请求时电压才出现在输出上。
在另外的有关实施方式中，充电电路可包括电流限制反激调节器。在这样的电路中，稳定电压被设置到比对用于使组织电穿孔的任何电压电平所需的高的值。电流限制允许对电池的使用寿命的优化。如果电荷从电池移走地太快，则电池使用寿命明显缩短。为了最大化电池使用寿命，对短的充电时间，设置对调节器的电流限制。在9伏电池的情况下，例如，最佳电流是大约200mA，而对于100伏，是120毫秒电穿孔输出。在这种情况下，充电时间为大约15秒。
在另外的实施方式中，电容器被充电到线性调节器所需的最佳电压，例如在下面的公式中的电荷与电压比(Vout)，(1+4.5t)+10伏，其中Vout是电穿孔输出电压而t是总的电穿孔脉冲持续时间(即，所有电穿孔输出脉冲的时间的和)。通过给电容器充电到该等式描述的电压，电路有未被输送到电穿孔过程的最小的能量损耗量。
在另一实施方式中，可使用宽带线性调节器，其中用于确定输出电压的电压参考由微处理器内的脉冲宽度调节电路提供。当电路关闭时，微处理器导出的脉冲宽度调节占空比为零。对于电穿孔脉冲持续时间，来自微处理器的脉冲宽度调节输出被设置到相应于期望调节值的值，即，平均值乘以等于脉冲输出值的调节器的增益。在期望电穿孔脉冲结束时，脉冲宽度调节输出再次被设置为零。
在另外的实施方式中，本发明设备电路包括安全和监控电路。如果检测到任何故障，在该电路中的安全开关可关闭输出。在该实施方式中，在脉冲被应用于电极之前，微处理器测量输出电压。处理器接着在脉冲期间测量输出脉冲电压幅度。在优选实施方式中，电压测量必须在预期电压输出的10％内。微处理器进一步在测量脉冲的电流并且还在脉冲结束时测量电压，以验证脉冲正确地终止。对于上述被测试的条件中的每个，如果任何这样的条件不在特定的参数内，设备产生脉动的能力终止，且用户被告知系统错误。故障的类型可为：输出短路、输出电压不正确、输出周期太长等。
在又一些另外的实施方式中，控制微处理器包括软件编程能力，包括模拟转数字输入的参数，以及给存储电容器充电和放电以如所述管理电路的控制线。设备电路还包括EEPROM(电可擦除可编程只读存储器)以允许用户通过使用计算机接口来改变在软件中记录的脉冲计时和设置，从而改变输出脉冲持续时间和电平。在另外的实施方式中，可保存脉冲的输出值，即使到板的电力被移除。值被校验求和，以不允许错误的值来控制输出。
电源所提供的电信号的波形可为指数衰减的脉冲、正方形脉冲、单极脉冲或脉冲串、双极振荡脉冲或这些脉冲形式的任何的组合。标称电场强度可从大约10V/cm到大约200V/cm，其分别相应于大约0.05Amp到1.0Amp的电流。可使用很多不同的特定脉冲能量，例如10V/cm、15V/cm、20V/cm、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190和200V/cm。每个这样的脉冲电压和场强在每个细长电极和环形电极处有相应的电流密度以及将受到足以使细胞电穿孔的电脉冲的相应的组织容积。
脉冲长度可为大约10毫秒到大约100毫秒。特别是，可使用特定的范围和时间，例如10毫秒、20ms、30ms、40ms、50ms、60ms、70ms、80ms、和90ms。还可能有任何期望数量的脉冲，一般是1到100个脉冲，更一般地是2到6个脉冲，甚至更通常为2到4个脉冲。脉冲之间的时间间隔可为任何期望的时间，例如1秒或更小，更一般地为10毫秒或更小，甚至更通常为5毫秒或更小。波形、电场强度和脉冲持续时间也可依赖于细胞的类型和将经由电穿孔进入细胞的分子的类型。每个脉冲波形具有特别的优点；与指数衰减波形脉冲比较，方波形脉冲在将化合物传输到哺乳动物细胞中提供增加的效率。优选地，所使用的波形是指数或方波单极脉冲。
除了如上公开的环形电极组件和伴随的电路部件以外，本发明装置可以有各种另外的功能。例如，该装置可具有用于指示装置功能和状态设置的数据显示器，各种脉冲参数设置例如包括电压、电容、脉冲持续时间、脉冲之间的时间延迟、脉冲波类型、所应用的脉冲的数量以及所应用的脉冲的参数(例如，电压、电容、脉冲持续时间、脉冲波类型、脉冲的数量)或其组合。这样的显示器可为视觉的、听觉的或其组合。例如，单个可听到的“嘀嘀声”可指示“装置准备好”，两个可听到的“嘀嘀声”可指示脉冲被正确地应用，而三个可听到的“嘀嘀声”可指示故障或脉冲没有被应用或被不正确地应用。视觉显示器包括模拟或数字字母数字显示器(例如，LCD、LED等)，如在手表中的，并且还可包括照明装置，其用于例如通过白光、LCD或电致发光灯(例如，INDIGLO.TM.)的电致发光背光、或通过各种荧光或放射性照明成分等的低光可视化。
额外的“用户友好的”功能包括控制装置例如用于控制电脉冲的软件以及用于调节参数(例如，通过按钮、旋钮、杠杆开关、调节控制盘等)的装置，所述参数包括例如脉冲持续时间、电压、电容、场强、数量、波类型等。用于调节、设置、存储或获取一个或多个脉冲参数的装置也包括在其中。这样的装置包括传统机械电子控制(例如，控制每个参数的选择器开关，其中开关具有多个设置：示例性脉冲长度设置，例如5msec、10msec、25msec、35msec、50msec)以及例如通过如例如在手表中的按钮接口控制的芯片控制(例如，通常在计算机工业中使用的硅晶片类型)。还设想了供用户和/或制造商可编程的设置以控制这里阐述的各种脉冲参数的可选地可从装置移除的芯片。这样的芯片的储存能力足以提供对各种参数的实质上无限的细微控制，以及为不同的布置、用户等储存不同的脉冲参数设置。当这里所述的本发明装置的各种电子功能中的每种功能可被计算机芯片控制和管理时，如果需要，芯片提供另外合并软件的选择，所述软件可选地是用户可编程的。
除了上述用户友好的特征以外，本发明装置保证安全控制。因此，在另一实施方式中，本发明进一步提供了用于防止施加过多的脉冲电压、持续时间、场强和/或脉冲的数量的装置。被动或主动中止或中断电路的任何装置可合并到电路路径中，这些装置包括保险丝、电路断路器开关等或主动监控各种脉冲参数并中止或中断电路以防止过多的脉冲电压、持续时间、场强、脉冲数被施加的设备。电子设备领域的技术人员将知道如何合并这样的特征以及防止施加过多的脉冲电压、持续时间、场强、数量的其它保护元件。
本发明进一步提供执行治疗剂从设备的中央针头到靶组织中的注射的先进方法。特别地，配备有用于将注射针头推动到组织中并通过针头从储蓄器注射治疗剂的推进器和致动器的本发明设备设计成感测针头进入的组织类型，本质上确定组织类型之间的界面点。这特别允许设备的用户有把握将物质输送到特定的组织中。从历史观点上说，疫苗通过手注射被输送到皮下肌肉，以便获得足够的免疫反应。然而，如果疫苗沉积在肌肉上的脂肪层(脂肪组织)中，则因而产生的免疫性可能被损害并导致滴定量太低而不能对抗疫苗打算供以治疗的感染。完全理解，不同长度的针头对到达人体内的肌肉组织是必要的。在没有正确的医疗培训的情况下，不正确的长度的针头可能被错误地使用。即使对于很多第一代自动注射设备，仅由于没有方法来确定适当的针头插入以输送到特定的组织例如肌肉组织，而不能获得正确的输送。在本发明中，设备能够感测和确定注射针头何时进入肌肉组织，其后开始注射治疗物质。在优选实施方式中，通过当针头进入组织表面时测量组织的电阻抗来完成感测。随着针头插入组织中时，使用1伏或更小的小高度容忍(甚至可能察觉不到)的电脉冲以小的增量测量组织的阻抗。阻抗将根据每个组织类型的特征和插入的深度变化。通常，肌肉组织的阻抗低于真皮和脂肪组织的阻抗。当到达较低的电阻区时，电阻相应地下降。电阻读数的性质可对照来自历史数据的组织类型的数据库应用，并通过这样的比较建立可能的组织类型和每个特定注射的界面，在目前的情况下是在脂肪和肌肉组织之间的界面。在优选实施方式中，设备可设计成直到针头行进到肌肉中一段小距离后才开始治疗剂从储蓄器的输送。这允许注射可在期望组织类型中安全地开始时的合理的肌肉缓冲区。在优选实施方式中，治疗剂的注射在所感测的肌肉组织的进入之后开始，并在针头进一步插入时继续，以便导致在一段固定距离、优选地大约1cm内的一致的注射，导致围绕针头的周围组织中的药物的柱状体。由于最大量的药物接近于电极并在靶组织中，所以这是对进一步电穿孔的理想情况。可使用测量组织厚度的可选方案，仅列举两个例子，包括通过类似的探针和超声传感器管理的高频信号。
在附图14A、B和C中以及在下面进一步描述了本发明的组织类型感测方法。简要地，低压(大约1V或更小)或低电流脉冲在针头以小的增量运动(0.1mm到多达2mm插入长度增量)插入期间通过本发明针头被发送。感测可被编程为感测到大约2cm的总行进长度。在本发明中，中央针头可被构造成拥有两个电极，即，放置在针头端部附近的正和负引线。特别地，针头本身可充当一个电极，而第二电极在附近的第二位置连接，如通常在图15A中元件400和401所示的。图17A是详细表示，其中针头构造有被绝缘材料B分开的两个电引线A和C。可选地，可按另一形式执行组织感测，其中中央针头实际上是两个紧密间隔开的平行注射针头(如图17B、C和D所示)。在这样的布置中，单独的针头可充当用于感测组织电阻的分开的电极。进一步地，然而，在这样的配置中，在组织感测期间，这些电极是正极性，而在电穿孔步骤期间，两个针头可都以相同的极性产生脉动，且相反的极性将是环形电极。仍然进一步地，感测组织界面的该方法可适用于其中试图输送治疗物质的组织的类型对其功效很关键的、使用电穿孔的任何系统。核酸是这种治疗剂。DNA必须被输送到肌肉隔室的细胞而非脂肪组织中，以正确地起作用。因此，本发明的组织感测方法的使用可适用于使用至少一个组织穿透输送管的电穿孔设备。在使用单针的场合，它必须设计有两个电极。在使用多于一个的组织穿透针头的场合，不同的针头可用于组织类型感测。在任一情况下，输送/感测电极可具有绝缘和有孔的口。
用于感测组织电阻的电脉冲只需要长到足以允许对电压和电流的精确采样，可使用欧姆定律(V＝IR；V是伏特，I是以安培为单位的电流，而R是以欧姆为单位的电阻)从该采样计算阻抗。对于一般的针头插入速率，20msec的脉冲长度可满足这些要求。如果探针被插入均匀的无限物质中，电阻将随着深度渐进地降低到材料的特征电阻，针头直径和导电性有微小影响。组织层以这种方式表现，如在图14A中看到的，其中针头探针插入猪脂肪层中，其最初测量为大约1700欧姆并衰减到大约300欧姆。图14A中的第二条曲线示出插入猪肌肉层中的针头并显示衰减到接近100欧姆的较低阻抗。这些测量使用21规格、2英寸针头获得，并从组织表面到24mm的深度以2mm增量来测量。对每个增量，测试脉冲是20msec、100V。用图表示通过多种组织类型层的感测，针头被推动通过一层脂肪，之后通过下层肌肉，导致曲线最初与脂肪的曲线匹配，但很快转变到与肌肉相关的曲线。图14B添加一曲线，其来自于使用如上面的相同脉冲和测量参数穿过4mm厚的脂肪层插入肌肉组织。注意，当达到肌肉的较低阻抗时，测量很快从脂肪曲线转变到肌肉曲线。使用自动针头插入设备对无活性牛肉执行类似的实验，以有限增量处产生的脉冲测量。具有50msec的持续时间的10V的脉冲用于测量沿着以大约0.2mm增量连续的针头插入产生的电流。图14C示出纯脂肪和肌肉的类似的曲线或区域。纯脂肪最初读数是大约2500Ω，并在5mm到10mm的插入深度处衰减到大约1000Ω。纯肌肉最初读数在1000和2000Ω之间，但很快在5mm的插入深度衰减到500Ω以及在15mm的插入深度之外衰减到大约250Ω。该曲线表明，可能使用脂肪厚度的历史数据来确定最佳位置，在该位置处确定组织界面被通过(特别是脂肪/肌肉界面)以及注射可在期望组织中开始。
本发明设备可被编程以通过使用组织类型感测信息以几种方法开始治疗剂的注射。例如，注射可在感测到指示电阻下降到等于肌肉曲线的读数的读数时开始，导致从距实际肌肉/脂肪界面相对大的距离处输送物质到肌肉组织中。可选地，基于深度的、相关于肌肉或相关于与渐进衰减不一致的电阻的快速下降的电阻值可用作开始注射的信号。一旦通过足够灵敏度的上面的方法确定了到肌肉的转变，注射过程就以前面描述的序列之一开始。如果希望额外的插入，则电阻测量不再被需要也不被执行，如果希望，只将针头更远地推动到组织中，同时注射治疗剂。
仍然进一步地，因为本发明的装置包括诸如组织界面感测的实施方式，设备可包括生命性的或无生命性的/电机驱动的机械致动器，用于独立地将细长针头向前推动到待治疗的组织中，而不同时推动注射物质通过管状针头。特别地，推进器可将针头推动到组织中，同时软件用于感测在针头顶端处的组织中的电阻。在图15A-D中提供了这种方法的示意图。在图15A中，装置设置成当用于推动针头的致动器将针头引导到组织中时感测组织界面。在图15B中，当针头通过组织界面时，软件引导装置，以将针头继续推动经过检测到的组织界面到组织中一段预定的距离。在图15C中，当传感器检测到组织界面被经过时，如本领域普通技术人员将认识到的，装置可被编程为当针头在组织内被推到更远的末端位置(图15D)时开始注射物质，保证了相对均匀分布的注射物质。这个方面要求在该位置的装置具有将针头向前推到组织中的同时将待输送的物质注射到组织中的能力。
对于环形电极，如早些时候在图13中提到的，该电极可被特别设计成用在畜牧业中。特别地，因为牧群动物例如牛、绵羊、山羊和马有毛发、毛或绒毛覆盖的身体，在不必在治疗动物之前剃动物的毛皮的情况下，设计成接触皮肤表面的环形电极将不是有用的。因为这样的要求在大牧群操作中很麻烦，剃毛皮不是一个选择。因此，本发明提供了对环形电极的可选设计。在优选实施方式中，对动物使用的环形电极可设计有多个短的、非组织穿透突出物，其容易被推到动物的毛/毛发/绒毛覆盖的兽皮，并找到其通过毛皮覆盖物接触皮肤的终端部分。遵循本发明的各种元件，中央组织穿透针头的导电部分的表面积和突出物的顶端的总表面积之间的比率应维持在分别至少1∶5和1∶10之间。
如图13所示，包括多个突出物的环形电极能够使毛皮覆盖的动物电穿孔。如图16A到E所示，电穿孔是大范围的。如16A到E是被电穿孔的肌肉组织的相邻切片，电穿孔使用具有所述突出物的环形电极、并使用758mAmp、138伏、针头：突出物面积电极布置的电极表面积比率，其中所述比率为至少1∶5。在这个实验中，在300ul盐水中30ug的gWiz-GFP被注射到兔四头肌肌肉中，之后进行电穿孔。兔子在5天后被处死，且肌肉样本以1.25mm的厚度进行切片并通过荧光显微镜分析。这些结果可与图9E和F中所示的使用相同的脉冲条件的结果比较。
也对动物执行上面执行的电穿孔，以测试SEAP的表达和对质粒编码乙型肝炎抗原的免疫反应。如图18A所示，使用环形电极、梳状环形电极和双针电穿孔设备(Elgen，Genetronics，Inc.San Diego CA)来执行电穿孔实验。如所示，电穿孔和因而产生的SEAP表达对每个环、梳状环和Elgen是可比较的。质粒gWiz-SEAP以300ul盐水中的200ug注射。对照有注射，只是没有电穿孔。每个的脉冲参数如下，梳状：600mA，2px60ms；环：600mA，2px60ms；Elgen：400mA，2px60ms。在图18B中，通过考虑终点滴定量来测试抗-HBs IgG表达。质粒gWiz-SEAP使用300ul盐水中的300ug质粒来注射，在第0天有初始免疫，在第30天增强。如所示，所有的测试实验表明，本发明不管使用简单的环形电极还是梳状电极都工作得很好。
方法
根据本发明，提供了用于将治疗剂引入皮下和更深的体组织中的体内方法，特别是引入在这些组织中的横纹肌细胞和/或平滑肌细胞。本发明的方法包括将脉动电场施加到所述细胞支承组织，实质上同时将所述输送物质施加到所述组织，使得所述输送物质被引入所述细胞。
在有关实施方式中，本发明提供了用于通过将核酸输送到靶组织并将至少一个电脉冲施加到靶区域来将核酸引入优选地人的真皮和肌肉的细胞中的方法。电脉冲具有充足的电压和持续时间以引起电穿孔，以便核酸可透入细胞和被编码的多肽中，从而被表达为转基因分子。核酸成分的生物表达导致所输送的基因的转录和转译，使得靶细胞重新合成基因产物。治疗应用包括：例如遗漏或欠表达基因的增加；具有治疗价值的基因的表达(例如，通过表达受体以结合过表达基因的产物来抑制有害基因的作用)；基因的表达，其产物引起期望免疫反应；等等。
如本领域技术人员将理解的，对治疗性多肽编码的核酸的有效表达通常要求核酸序列与调节序列可操作地相关。设想用在本发明的实践中的调节序列包括启动子、增强子等。如本领域技术人员还将认识到的，甚至当启动子序列可操作地与治疗性核酸相关时，表达也可进一步通过可操作地关联增强子元素等被增加。
通过由本发明的方法引入分子来调节细胞中基因的表达可能是合乎需要的。术语“调节”设想当基因被过表达时抑制基因的表达，或当基因被欠表达时增加表达。在细胞增殖紊乱与基因的表达相关的场合，例如，可使用干扰在转译水平处的基因的表达的核酸序列。该方法利用例如反义核酸、核酶或三重制剂通过使用反义核酸或三重制剂掩蔽该mRNA或通过使用核酶使它分裂来阻止特定mRNA的转录或转译。
设想用在本发明的实践中的核酸包括裸DNA、裸RNA、裸质粒DNA、超螺旋或线性的RNAi、siRNA、microRNA和shRNA、以及包覆的DNA或RNA(例如，在脂质体、微球体等中)。如本领域技术人员将理解的，也可使用与质粒混合以便“浓缩”DNA分子的粒子或分子。
反义核酸是对特定的mRNA分子(见例如，Weintraub，ScientificAmerican，262：40，1990)或任何其他核酸序列互补的DAN或RNA分子。在细胞中，反义核酸与相应的mRNA杂交，形成双链分子。反义核酸干扰mRNA的转译，因为细胞将不转译双链的mRNA。大约15个核苷酸的反义低聚物是优选的，因为它们容易合成，且当被引入靶细胞中时与较大的分子相比更不可能引起有害效应。抑制基因的体内转译的反义方法的使用在本领域中是公知的(见例如，Marcus-Sakura，Anal.Biochem.，172：289，1988)。
使用停止转录的寡核苷酸被称为三重策略，因为低聚物缠绕在双螺旋DNA周围，形成三链螺旋。因此，这些三重化合物可设计成识别在选定基因上的唯一位置(Maher，等人，Antisense Res.和Dev.，1(3)：277-281，1991；Helene，C.，Anticancer Drug Design，6(6)：569，1991)。相应地，对三重形成有用的核酸的电穿孔也被设想在本发明的范围内。
核酶是拥有以与DNA限制核酸内切酶类似的方法使其它单链RNA分裂的能力的RNA分子。通过对这些RNA编码的核苷酸序列的更改，可能操纵识别RNA分子中的特定核苷酸序列并使它分裂(Cech，J.Amer.Med.Assn.，260：3030，1988)的分子。该方法的主要优点是只有具有特定序列的mRNA被失活，因为核糖体是序列特定的。
有两种基本类型的核酶，即，四膜虫型(Hasselhoff，Nature，334：585，1988)和“锤头”型。四膜虫型核酶识别在长度上是四个碱基的序列，而锤头型核酶识别在长度上在11-18个碱基的范围内的碱基序列。识别序列越长，序列将唯一地出现在靶mRNA物类中的可能性就越大。因此，对于使特定mRNA物类失活，锤头型核酶优于四膜虫型核酶，且18碱基识别序列优于较短的识别序列。
本发明还提供了基因治疗的方法，其用于治疗被特定的基因或其缺乏介导的细胞增殖或免疫紊乱。术语“细胞增殖紊乱”表示恶性以及非恶性的细胞群，其常常表现为在形态上和遗传上不同于周围的组织。这样的治疗通过将特定的同义或反义多核苷酸引入失调的细胞中来获得其治疗效果。多核苷酸的输送可使用重组表达载体例如嵌合性病毒来实现，或多核苷酸可例如作为“裸”DNA来输送。
本发明的多核苷酸序列是在被细胞吸收以后具有治疗效果的DNA或RNA序列。设想用在本发明的实践中的核酸可为双链DNA(例如，质粒、粘粒、噬菌体、病毒、YACS、BACS、其它人造染色体等)或单链DNA或RNA。核酸可为非复合的(即，“裸的”)或复合的(例如，与化学剂如脂质(例如，阳离子的)、树状大分子或便于DNA渗透到组织中并通过细胞膜的其它多聚物、或类似物)。DNA也可与蛋白质络合物一起包覆或配制。
本身是治疗性的多核苷酸的例子是反义DNA和RNA、对反义RNA的DNA编码、或代替不完全的或有缺陷的内源性分子的对tRNA或rRNA的DNA编码、或类似物。本发明的多核苷酸也可对治疗多肽编码。如这里使用的，“多肽”被理解为多核苷酸的任何转译产物，而不管尺寸如何，以及不论糖基化的或还是以其他方式改性的。被设想为用在本发明的实践中的治疗性多肽(作为主要例子)包括可补偿动物中不完全的或有缺陷的物类的那些多肽，或通过毒性效应起作用以限制或移除来自身体的有害细胞的那些多肽。
还包括的是对代谢酶和蛋白质编码的多核苷酸，例如血凝固化合物(例如，因子VII、VIII或IX)等。
根据本发明的另一实施方式，提供了用于将免疫反应引入受验对象的方法。该实施方式的发明方法包括将脉动电场施加到受验对象的真皮和下层肌肉细胞，同时将免疫反应诱导剂施加到真皮和/或肌肉细胞实质上，使得免疫反应诱导剂被引入细胞中，从而在受验对象中诱导免疫反应。如这里使用的，“免疫反应诱导剂”意指任何制剂，当其被引入受验对象的真皮和/或肌肉细胞中时导致免疫反应，不管这样的反应是细胞反应、体液反应还是两者。被设想用在本发明的实践中的免疫反应诱导剂包括可表达核酸和多肽。
可表达DNA和mDNA可被输送到细胞以在其中形成多肽转译产物。如果核酸操作性地与适当的调节序列相关，则编码蛋白质的增强的合成是可获得的。被设想用在本发明的实践中的DNA或RNA编码多肽包括免疫性多肽、病原体衍生的蛋白质、血凝固因子、肽类激素等。肽类激素包括例如降血钙素(CT)、甲状旁腺激素(PTH)、促红细胞生成素(Epo)、胰岛素、细胞因子、生长激素、生长因子等。被设想用在本发明的实践中的淋巴因子包括肿瘤坏死因子、白介素1、2和3、淋巴毒素、巨噬细胞活化因子、移动抑制因子、集落刺激因子、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素和其分型。被设想用在本发明的实践中的血凝固因子包括因子VIII或因子IX。
当输送到细胞的DNA或mRNA对免疫性肽编码时，可应用发明方法，以实现对抗传染原包括细菌、细胞内病毒、肿瘤细胞等的提高和更有效的免疫。用在本发明中的治疗性多核苷酸也可对具有免疫性的多肽编码，具有免疫性的多肽可充当内生免疫原(即，包含抗原的多肽)以诱导体液免疫反应、细胞免疫反应诱导剂反应、或两者。用于诱导这样的反应和对特定反应的目标特定的细胞的方法例如在美国专利号5,589,466中被描述。根据本发明使用的多核苷酸也可对抗体编码。在这方面，术语“抗体”包括任何种类的完整免疫球蛋白、具有双或多抗原或表位特性的嵌合抗体和混合抗体、以及片段例如F(ab).sub.2、Fab′、Fab等，包括其中的混合片段。还包括在“抗体”含义内的是这样的片段的轭合物以及所谓的抗原结合蛋白质(单链抗体)，如例如在美国专利号4,704,692中描述的，该专利由此在这里通过引用被全部并入。
因此，根据本发明方法介绍了对抗体的可变区域编码的孤立的多核苷酸，以使被治疗的受验对象能够在原位产生抗体。对于关于获得抗体编码多核苷酸的例证性方法，见Ward等人Nature，341：544-546(1989)；Gillies等人，Biotechnol.7：799-804(1989)。抗体又例如通过结合与病原体相关的表面抗原施加治疗效果。可选地，编码抗体可为抗独特型抗体(结合其它抗体的抗体)，如例如在美国专利号4,699,880中描述的。这样的抗独特型抗体可结合被治疗的个体内的内生或外来抗体，从而改善或防止与免疫反应相关的病理状况(例如，在自身免疫性疾病例如狼疮等的情况中)。
用在本发明的实践中的多核苷酸序列对治疗性或免疫原性多肽编码是目前优选的。这些多核苷酸可结合对控制治疗性或免疫原性多肽的表达的调节蛋白质编码的其它多核苷酸序列来使用。这样使用的调节蛋白质可用本领域技术人员已知的任何数量的调节方式起作用，例如通过结合到DNA以便调节其转录，通过结合到信使RNA以增加或降低其稳定性或转译效率，等等。
输送到体内细胞的多核苷酸材料可采取任何数量的形式，且本发明不限于对任何特定多肽的任何特定的多核苷酸编码。对大量生理活性肽和抗原或免疫原编码的包含基因的质粒被设想用在本发明的实践中，并可容易被本领域技术人员获得。
各种病毒载体也可用在本发明的实践中并包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘、RNA病毒等。病毒为RNA病毒例如逆转录酶病毒是目前优选的。优选地，逆转录酶病毒载体是鼠科或鸟类逆转录酶病毒的衍生物。单个外来基因可被插入的逆转录酶病毒载体的例子包括但不限于莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维氏鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、小鼠乳腺瘤病毒(MuMTV)和劳氏肉瘤病毒(RSV)。当受验对象是人时，可使用载体例如长臂猿白血病病毒(GaLV)等。额外的逆转录酶病毒载体的数量可合并多个基因。所有这些载体可传输或合并基因用于可选标记，以便可识别转导细胞。在其它实施方式中，载体可包括只包含启动子和在通过本发明装置的方法引入之后在细胞中被表达的基因序列的线性核酸构造物。
治疗性肽或多肽也可包括在本发明的治疗方法中。例如，免疫调节剂和其它生物反应改性剂可被施用以被细胞合并。如这里使用的，术语“生物反应改性剂”包括在对免疫反应改性中涉及的物质。免疫反应改性剂的例子包括化合物例如淋巴因子等。淋巴因子包括例如肿瘤坏死因子、各种白介素例如IL-1、2和3、淋巴毒素、巨噬细胞活化因子、移动抑制因子、集落刺激因子、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素和其分型。
根据本发明的另一实施方式，提供了结合电穿孔治疗使用的电极套件，每个套件包括其中描述的电极的部件。例如，在一个方面，提供了包括环形电极系统的电极套件，环形电极系统包括环形电极组件，其中所述组件具有中央细长注射针头，可选地包括沿着其长度布置并接近针头顶端的一个或多个孔，其中孔与注射针头的中空内部流体相通，所述细长注射针头具有其中的远侧导电部分。进一步地，这样的电极套件可配备有各种环形电极设计和尺寸中的任何一个，包括用在人皮肤或毛皮覆盖的动物上的那些相容的环形电极。
实例I：显示对组织的电穿孔的焦点的兔研究
在本例中，使用在兔四头肌肌肉中的绿色荧光蛋白质(GFP)质粒-DNA的表达展示了用于电穿孔肌肉输送的环形电极系统的功效。
特别地，以对GFP蛋白质编码的200μL(微升)质粒-DNA的注射和1.6cm的针头穿透深度使用作为输送针头的细长电极来处理成年新西兰白公兔(n＝2)。该实验在合并可选实施方式的环形电极系统之间分配，特别地：
第一个兔子使用用于注射并作为细长电极的22g或23g注射针头接收4次注射(每一次进入左和右四头肌肌肉的上和下部分)。这四次注射之一使用Elgen设备(非环形电极)中的两个平行的非绝缘22g针头。在其余三次注射中，环形电极是具有10cm2的表面积的卵形铜电极。输送针状电极的上部部分涂有紫外固化的环氧树脂(Loctite 4304)，在针头的远侧顶端上留下大约0.8-1.0cm暴露的金属用于生物组织中的电极导电，以只在肌肉的靶部分中集中电流。电极引线在注射器针头的底部处连接到近侧针头的充足部分，以允许与电脉冲发生器的电通信。
第二个兔子接收四次注射，每一次使用22g或23g注射针头进入右和左四头肌肌肉的上和下部分。绝缘体放置在使用22g导引器套的注射针头上，在针头的远侧顶端上留下大约0.8cm暴露的金属用于生物组织中的电极导电，以只在肌肉的靶部分中集中电流。针头的底部也连接到脉冲发生器，如在第一个兔子试验中的。环形电极是具有20cm2的表面积的卵形铜环形电极。实验设置在表III中示出。
表III
Figure BPA00001185769700401
Q相当于四头肌肌肉
为了执行电穿孔，使用Inovio Elgen模型1000发生器(Genetronics，Inc.，San Diego，Ca)，并将标准电极凝胶(Lectron II导电凝胶)涂到与测试动物皮肤表面接触的环形电极的表面。Elgen脉冲发生器被设置成在针头和环形电极之间输送两个分开250msec时间间隔(4Hz)的60msec持续时间脉冲。脉冲振幅通过大约400mA最大电流或50V或100V最大电压被控制。在组织中获得的电流和电压被测量并记录，且计算出表观组织阻抗，如表IV中所公开的。
表IV
Figure BPA00001185769700402
Figure BPA00001185769700411
关键词：LU＝左上四头肌肌肉；LL＝左下四头肌肌肉；RU＝右上四头肌肌肉；RL＝右下四头肌肌肉；SH＝被屏蔽的套；UV＝被屏蔽的UV环氧树脂；2个针头＝标准ELGEN；10cm2＝小电极板；20cm2＝大电极板。
当计算脉冲参数时，本领域技术人员将认识到在脉冲中被发送的实际电压的变化与设置在仪器标度盘上的值的关系，例如，53V相对于54V。该变化是由于仪器的特定的电子灵敏度。在任何情况下，在电穿孔期间组织的阻抗的平均值从电穿孔的输出数据来计算，如表IV所示。考虑到脉冲形状，所计算的平均值接近于真实值，即，单级方波(未示出)相对于电流和电压降相当平坦，且在每个脉冲中始终只有阻抗的轻微降低。
在关于本发明的环形电极的使用的各种观测中，一个现象是清楚的，即，环形电极表面积越大，表观组织阻抗就越低，而其它参数如下：较高的电压与较低的表观组织阻抗相关，针状电极的绝缘增加了表观组织阻抗，环氧树脂绝缘具有比塑料外壳更高的阻抗，且环形电极系统阻抗指示比对Elgen设备的裸针状电极系统更高的表观组织阻抗。
具有长度为大约2cm并分开大约0.4cm的两个针头的Elgen设备导致在100和200ohm之间的表观组织阻抗。具有使用1cm被暴露的顶端的23规格针头以及在20和40cm2之间的表面环形的、具有环形配置的单个针头导致在200和350ohm之间的表观组织阻抗，如表IV中数据集5到8所示的。此数据的重要性是，相对于使用Elgen设备的双插入细长电极或其它类似的双插入电极阵列，使用本发明装置的表观组织阻抗是仅仅稍微高于使用环形电极系统的所观测的阻抗。因此，所有参数在双针系统和本发明环形电极装置之间相等，本发明装置独特地保证对细胞的穿孔足够的电流密度中的差别，允许将脉冲能量只聚焦到组织的被聚焦的区域。
现在转到GFP基因表达结果，试验兔子在电穿孔程序期间使用克他命/甲苯噻嗪的静脉内施用麻醉，被允许培育大约三天以准许GFP基因表达，接着使用静脉内注射戊巴比妥施无痛致死术，在其后四头肌肌肉从动物移除并被切片、检查和在荧光镜和/或可见光下照相。在所测试的每个肌肉中，GFP表达清楚地存在。针道在大多数图像中是清楚可见的，显示被注射的材料和电穿孔程序的良好协同定位。例如，最低电压(53伏)给出良好的GFP表达，被测量的电流在100mA。相反，具有双针电极Elgen设备的50到100伏电穿孔设置一般在400mA和1Amp之间或更大被输送。因此，在确认本发明中，由于使细长电极的近端部分绝缘并将大的反电极放置在皮肤表面上，使电穿孔能量聚焦在深层肌肉组织中的细长针头的未绝缘部分附近，而不是在穿透皮肤和下层肌肉的两个针状电极附近和之间，因此，本发明需要较少的能量(低电流、高阻抗)。换句话说，电穿孔远离皮肤聚焦，使得由于在皮肤处的明显较低的电流密度，在皮肤处电的感觉应最小。在图9A到F中示出了在所检查的所有GFP表达实验中看到的结果的如上所述的例子。图9B和F示出荧光场以及混合荧光和可见光。如清楚地可见的，电穿孔被局部化到深层肌肉组织。
敏感度
在又一些另外的实施方式中，当环形电极的表面积增加时，表面组织中的感觉应降低。根据关于电流密度的前面讨论，在优选实施方式中环形电极可大约在细长电极的表面积的5和1000倍之间。因此，因为疼痛主要被认为是取决于电流密度，与细长电极将引起的感觉比较，在环形电极处的感觉可能明显减小。
在这里公开和声明的所有布置和方法可被作出并执行，无需根据本公开进行过度实验。虽然本发明的布置和方法依照优选实施方式被描述，对本领域技术人员来说显然，变形可适用于这些布置和方法以及在这里描述的方法的步骤中或步骤序列中，而不偏离本发明的精神和范围。更具体地，所述实施方式在所有方面应为认为仅仅是例证性的而不是限制性的。对本领域技术人员明显的所有类似的替换和更改被认为在所附权利要求所限定的本发明的精神和范围内。
在说明书中提到的所有专利、专利申请和出版物表示本发明所涉及的本领域普通技术人员的水平。所有专利、专利申请和出版物，包括被要求优先权或另一利益的那些在这里通过引用被并入到好像每个单独的出版物被特别和单独地指示为通过引用并入的相同程度。
在这里例证性地描述的本发明可在没有在这里特别公开的任何元件的情况下被实践。因此，例如，在这里的每个实例中，术语“包括”、“主要由...组成”和“由...组成”中的任何一个可用其它两个术语中的任一个代替。被使用的术语和表达用作描述而不是限制的术语，且意图不是这样的术语和表达的使用暗示排除其中整体或部分地示出和描述的特征的等效形式，而是应认识到，在所主张的本发明的范围内的各种更改是可能的。因此，应理解，虽然本发明被优选实施方式和可选的特征公开，本领域技术人员可求助于这里公开的概念的更改和变形，且这样的更改和变形被认为在所附权利要求所限定的本发明的范围内。

Claims (40)

1.一种用于将分子输送到哺乳动物的细胞中的电穿孔系统，包括：
a)几何平面环形电极，其上带有多个导电突出物，所述多个导电突出物适于与表面接触；
b)组织穿透细长电极，其具有近端和远端，所述细长电极具有其中的非导电部分，所述非导电部分位于所述近端和离所述远端2.5和至少0.1cm之间处之间，所述非导电部分包括在所述细长电极上的绝缘体涂层或绝缘材料；
c)壳体，其与所述环形电极和细长电极相关，所述壳体包含与所述环形电极和所述细长电极电通信的电路、与所述电路电通信的至少一个电容器、以及用于在0.5和4cm之间的行进长度的线性运动中驱动所述细长电极的致动器；
d)充电单元，其用于给所述电容器充电；以及
e)计算机，其与所述充电单元电通信，所述计算机包括能够对所述系统执行编程功能的软件。
2.如权利要求1所述的系统，其中所述环形电极电绝缘地分成两个导电半部分。
3.如权利要求2所述的系统，还包括用于感测在所述环形电极的每个所述半部分和组织表面之间的电阻的电路。
4.如权利要求1所述的系统，还包括用于感测被施加到靠着组织表面的所述环形电极的压力的电路。
5.如权利要求1所述的系统，其中所述环形电极的所述几何形状从椭圆环、圆环、等腰三角形环、等边三角形环、正方形环、矩形环、五边形环和六边形环组成的组中选择。
6.如权利要求5所述的系统，其中所述环形电极具有用于传导电流的、与所述细长电极的表面积成比例的表面积，环形电极：细长电极表面积比率的所述比例从由5：1、10∶1、100：1和1000：1组成的组中选择。
7.如权利要求1所述的系统，其中所述细长针状电极是管状的并能够将流体介质从所述近端引导到所述远端，所述近端与储蓄器流体相通，而所述远端具有沿着所述细长针状电极的长度定位的多个孔，所述长度包括在所述细长针状电极的所述远端部分的1.0和1.5cm之间。
8.如权利要求7所述的系统，其中所述孔具有从120微米、100微米、90微米、80微米、70微米、60微米、50微米、40微米、30微米和20微米组成的组中选择的直径。
9.如权利要求8所述的系统，其中所述多个孔的数量从细长针状电极的导电部分的长度的每厘米10和100个孔之间以及每厘米20和60个孔之间的组中选择。
10.如权利要求9所述的系统，其中所述致动器从电机、机械驱动的致动器和生命性地驱动的致动器中选择。
11.如权利要求10所述的系统，其中所述致动器能够驱动所述细长电极线性运动并将流体介质从储蓄器通过所述细长电极中的腔驱动到在所述细长电极的远端部分处的多个口并驱动出所述口。
12.如权利要求1所述的系统，其中所述细长电极是负电极。
13.一种用于体内电穿孔的可变电流密度电极系统，包括：
a)几何平面环形电极，其上带有多个导电突出物，所述多个导电突出物适于与表面接触；
b)部分绝缘的细长针状电极，其中所述细长针状电极沿着其一端的一部分是导电的；
c)从在1000：1和5：1之间的范围组成的组中选择的在所述环形电极和所述细长针状电极之间的表面积比率；
d)用将所述细长针状电极和所述环形电极与用于给所述电极供能的电源连接的电路，
其特征在于，当所述电极系统通过提供体组织中的电脉冲被启动时，在所述细长针状电极处或附近的所述组织中的电流密度高于在所述环形电极处或附近的所述组织中的电流密度。
14.如权利要求13所述的可变电流密度电极系统，其中所述环形电极具有在1cm2和100cm2之间的表面积。
15.如权利要求13所述的系统，其中所述针状电极具有在0.01cm和2.5cm之间的导电长度。
16.如权利要求15所述的系统，其中所述针状电极具有在0.05和1.00cm2之间的导电表面积。
17.如权利要求13所述的系统，其中所述部分绝缘的细长针状电极的绝缘部分在近端到其远端的0.1到2.5cm内之间。
18.如权利要求17所述的系统，其中所述绝缘部分从塑料、聚对二甲苯、TeflonTM和环氧树脂组成的组中选择。
19.如权利要求13所述的系统，其中所述环形电极电绝缘地分成两个电气相等的导电部分。
20.如权利要求13所述的系统，其中所述环形电极带有正电荷，且其中所述细长针状电极带有负电荷。
21.如权利要求20所述的系统，其中当电穿孔脉冲放电到所述组织中时，所述细长针状电极带负电荷导致金属离子从所述细长针状电极到所述体组织中的可忽略的散发。
22.如权利要求19所述的系统，其中所述环形电极具有从椭圆环、圆环、等腰三角形环、等边三角形环、正方形环、矩形环、五边形环和六边形环组成的组中选择的几何形状。
23.如权利要求13所述的系统，其中所述细长针状电极是管状的并能够从储蓄器引导流体介质，所述细长针状电极具有沿着所述电极的长度定位的多个孔，所述长度包括在所述细长针状电极的远端部分的1.0和1.5cm之间。
24.如权利要求23所述的系统，其中所述孔具有从120微米、100微米、90微米、80微米、70微米、60微米、50微米、40微米、30微米和20微米组成的组中选择的直径。
25.如权利要求24所述的系统，其中所述多个孔在细长针状电极长度的每厘米20和60个之间。
26.如权利要求1所述的系统，所述组织穿透细长针状电极是管状的并且能够从储蓄器引导流体介质，所述电极具有沿着所述细长针状电极的长度定位的多个孔，所述长度包括在所述细长针状电极的远端部分的1.0和1.5cm之间。
27.如权利要求26所述的系统，其中所述孔具有从120微米、100微米、90微米、80微米、70微米、60微米、50微米、40微米、30微米和20微米组成的组中选择的直径。
28.如权利要求27所述的系统，其中所述多个孔的数量从细长针状电极长度的每厘米10和100个孔之间以及每厘米20和60个孔之间的组中选择。
29.如权利要求l的系统，所述环形电极包括具有组织接触表面和非接触表面的平面导电基底，其中所述基底在所述组织接触表面上还包括均匀地放置在整个所述基底表面上并与所述基底表面接触的多个导电细长非组织穿透突出物。
30.如权利要求29所述的系统，其中所述非组织穿透突出物每个都有包括表面积的远端。
31.如权利要求30所述的系统，其中每个突出物的所述表面积被加在一起作为至少5倍于单个组织穿透细长电极的表面积的总组织接触表面积。
32.如权利要求1所述的系统，其中所述细长电极是管状的并能够将流体介质从所述近端引导到所述远端，所述近端与储蓄器流体相通。
33.如权利要求32所述的系统，其中所述远端包括沿着所述细长针状电极的长度定位的多个孔，所述长度包括在所述细长针状电极的所述远端部分的1.0和1.5cm之间。
34.如权利要求33所述的系统，其中所述孔具有从120微米、100微米、90微米、80微米、70微米、60微米、50微米、40微米、30微米和20微米组成的组中选择的直径。
35.如权利要求34所述的系统，其中所述多个孔的数量从细长针状电极长度的每厘米10和100个孔之间以及每厘米20和60个孔之间的组中选择。
36.如权利要求13所述的系统，其中所述细长针状电极是管状的并能够将流体介质从所述细长针状电极的近端引导到其远端，所述近端与储蓄器流体相通。
37.如权利要求36所述的系统，其中所述远端包括沿着所述细长针状电极的长度定位的多个孔，所述长度包括在所述细长针状电极的所述远端部分的1.0和1.5cm之间。
38.如权利要求37所述的系统，其中所述孔具有从120微米、100微米、90微米、80微米、70微米、60微米、50微米、40微米、30微米和20微米组成的组中选择的直径。
39.如权利要求38所述的系统，其中所述多个孔的数量从细长针状电极长度的每厘米10和100个孔之间以及每厘米20和60个孔之间的组中选择。
40.如权利要求11所述的系统，其中所述驱动产生允许所述流体介质以相等的流动动力学通过每个孔的压力，使得均匀容积的流体在所述细长针状电极周围喷射。
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