CN101935671A - 腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，由构建向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体、引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体、构建标记基因标记核心蛋白穿梭载体、构建标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体、标记基因标记核心蛋白腺病毒的包装及纯化组成。本发明采用一种新的标记腺病毒核心蛋白的方法，该方法实现了对腺病毒核心蛋白真正意义的遗传水平上的荧光标记，这种标记方法删除了腺病毒基因组中的原有的核心蛋白基因，因此采用本发明的方法标记腺病毒核心蛋白，可以获得的100％被荧光蛋白标记的病毒颗粒。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法。
背景技术
腺病毒有三种核心蛋白，分别为pVII、pV和mu。这些核心蛋白与腺病毒基因组DNA结合，在腺病毒感染细胞后，核心蛋白会随着病毒基因组DNA进入细胞核。因此，如果对腺病毒的核心蛋白进行荧光蛋白的标记则可以观察到病毒感染细胞的整个过程。
由于腺病毒基因组DNA核心蛋白基因区域没有合适的限制性内切酶的位点，因此通过同源重组的方法对腺病毒核心蛋白进行成功的彻底的遗传标记非常困难。目前研究报道标记核心蛋白的方法是在不删除腺病毒基因组原有的核心蛋白基因的前提下，在腺病毒基因组E3区域插入CMV启动子启动的核心蛋白-荧光蛋白基因表达元件，通过这种方法研究获得了荧光标记核心蛋白的腺病毒。经过该方法标记的腺病毒基因组同时编码野生型核心蛋白和荧光标记的核心蛋白，这两种蛋白要竞争结合到腺病毒基因组DNA上，荧光标记后的核心蛋白由于分子量和蛋白体积变大，很难与野生型核心蛋白竞争，因此荧光蛋白标记的核心蛋白结合到病毒基因组DNA上的效率很低，这样得到病毒大部分是未经标记或部分标记的病毒颗粒。
发明内容
本发明所要解决技术问题在于克服上述荧光蛋白标记的核心蛋白结合到病毒基因组DNA上效率很低的缺点，提供一种能快速、腺病毒核心蛋白完全能够标记的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法。
解决上述技术问题采用的技术方案它是由下述步骤组成：
1、构建向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体
采用酶切连接的方式将合成的DNA片段连入pUC19质粒载体，pUC19质粒载体为市场上销售的商品，由英国NEB公司生产，获得的阳性克隆命名为pUG19M，采用聚合酶链式反应扩增核心蛋白DNA序列上下游序列，将获得的核心蛋白上下游DNA片段连入pUC19M载体；将含有一个酶切位点的筛选基因连入含有核心蛋白上下游序列的pUC19M载体，获得向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体。
2、引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体
将步骤1中获得的腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体经双酶切回收后与重组腺病毒载体质粒共转化Bj5183感受态细胞，经过鉴定后获得引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体。
3、构建标记基因标记核心蛋白穿梭载体
采用聚合酶链式反应获得标记基因的DNA序列，将标记基因序列连入含有核心蛋白上下游序列的pUC19M载体，经过鉴定获得标记基因标记核心蛋白的穿梭载体；
4、构建标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体
将步骤3中获得的标记基因标记核心蛋白的穿梭载体经双酶切回收后与经过线性化的引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体共转化Bj5183感受态细胞，经过鉴定后获得标记基因标记核心蛋白的腺病毒质粒载体。
5、标记基因标记核心蛋白腺病毒的包装及纯化
将线性化的标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体转染HEK293细胞，扩增、分离、纯化，得到标记基因标记核心蛋白的腺病毒，在冰箱内-80℃保存。
本发明的穿梭载体为任何含有核心蛋白开放阅读框上下游800bp～10kb DNA序列的任何载体。
本发明的筛选基因包括抗性基因或β-半乳糖苷酶基因。
本发明的标记基因包括荧光蛋白基因或荧光素酶基因。
本发明的核心蛋白DNA序列3’端引入的酶切位点为重组腺病毒载体本身所不含有的任何酶切位点。
本发明的重组腺病毒载体为下列载体中的任意一种：
(1)用数均分子量为4000～8000的聚乙二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体；
(2)腺病毒载体衣壳蛋白的遗传修饰或不修饰的重组腺病毒载体；
(3)条件复制型重组腺病毒载体；
(4)携带至少一个治疗基因或小干扰RNA的条件复制型的重组腺病毒载体；
(5)携带至少一个治疗基因或小干扰RNA的非复制型的重组腺病毒载体；
本发明的核心蛋白为腺病毒的核心蛋白Ⅶ或核心蛋白Ⅴ或核心蛋白Ⅹ。
本发明采用一种新的标记腺病毒核心蛋白的方法，该方法实现了对腺病毒核心蛋白真正意义的遗传水平上的荧光标记，这种标记方法删除了腺病毒基因组中的原有的核心蛋白基因，因此采用本发明的方法标记腺病毒核心蛋白，可以获得的100％被荧光蛋白标记的病毒颗粒。
附图说明
图1是用于组装核心蛋白pVII上下游同源臂的穿梭质粒载体示意图。
图2是核心蛋白pVII上下游同源臂连入穿梭质粒载体后的结构示意图。
图3是通过同源重组获得的引入特异SfuI酶切位点的腺病毒骨架载体结构示意图。
图4是核心蛋白pVII被红色荧光蛋白mCherry标记后的腺病毒载体的结构示意图。
图5是核心蛋白pVII被绿色荧光蛋白eGFP标记后的腺病毒载体的结构示意图。
图6是核心蛋白pVII被荧光素酶Luciferase标记后的腺病毒载体的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
以红色荧光蛋白(mCherry)标记核心蛋白pVII腺病毒载体的构建过程为例其构建方法步骤如下：
1、构建向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入单一酶切位点的穿梭载体
通过酶切连接方式将合成的DNA序列连入pUC19质粒载体，pUC19质粒载体为市场上销售的商品，由英国NEB公司生产，通过质粒提取酶切鉴定以及测序获得阳性克隆，将阳性克隆命名为pUC19M，载体结构如图1所示，由图1可见，合成的DNA序列包含以下酶切位点：XbaI-BamHI-SfuI-XhoI-ClaI。
以腺病毒基因组DNA为模板设计两对引物分别用来扩增用于同源重组的核心蛋白DNA序列上下游1500bp的DNA序列，上游DNA序列包含腺病毒的核心蛋白Ⅶ本身的DNA序列。P1-P4为两对引物的序列：
P1：ATCTAGACATTCCCGCACTGTTGGATGTGGACGCCTA
P2：TGGATCCACCTCCACCTCCGTTGCGCGGGGGGCGGGTGCG
P3：ACTCGAGATTGCAAGAAAAAACTACTTAGACTC
P4：TATCGATTGCGCCTGCAAGGCCACGGATGCAATT
聚合酶链式反应的条件是：94℃30秒，98℃10秒55℃5秒72℃2分钟，30个循环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的聚合酶链式反应产物与pGEMT-easy载体连接。连接条件为：pGEMT-easy载体0.5μl，聚合酶链式反应回收产物4μl，2×T4DNA快速连接酶缓冲液5μl，T4DNA快速连接酶0.5μl，25℃反应1个小时后转化感受态的DH5α细胞，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将所获得的阳性克隆分别命名为pGEMT/pVII no stop up和pGEMT/pVII HRdown。将pVII no stop up片段从pGEMT/pVII no stop up载体上经XbaI和BamHI双酶切下来，经1％的琼脂糖凝胶电泳回收后连入同样经XbaI和BamHI酶切过的穿梭载体中。连接条件是：4μl酶切纯化片段，5μl 2×T4DNA连接酶缓冲液，0.5μl酶切载体，0.5μl T4 DNA连接酶。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pUC19M pVII up shuttle。将pVII HR down片段从pGEMT/pVII HR down载体上经XhoI和ClaI双酶切下来，经1％琼脂糖凝胶电泳回收后连入同样经XhoI和ClaI双酶切的pUC19M pVII up shuttle载体中。连接条件是：4μl酶切纯化片段，5μl 2×T4DNA连接酶缓冲液，0.5μl酶切载体，0.5μl T4 DNA连接酶。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pUC19M pVII up down shuttle，该载体的结构如图2所示，由图2可见，核心蛋白pVII基因及其上下游基因序列连入pUC19M载体中。
将两端酶切位点为BamHI和SfuI位点的β-半乳糖苷酶基因(LacZa)表达元件连入经过BamHI和SfuI双酶切的pUC19M-pVII up down shuttle载体，该β-半乳糖苷酶基因(LacZa)表达元件也可采用氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素等筛选基因中的任意一种替换。连接条件是：4μl酶切纯化片段，5μl 2×T4DNA连接酶缓冲液，0.5μl酶切载体，0.5μl T4 DNA连接酶。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pUC19M-pVII up down/LacZa shuttle。
2、引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体
将pUC19M-pVII up down/LacZa shuttle经XbaI和ClaI双酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳回收大片段后与用数均分子量为4000～8000的聚乙二醇化学修饰的重组腺病毒质粒载体pAd5EB214共转化Bj5183感受态细胞，也可用不经数均分子量为4000～8000的聚乙二醇化学修饰的重组腺病毒载体，涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板并加入50μl的40mg/ml的X-gal进行蓝白斑筛选。经摇菌、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pAd5EB214/LacZa，该腺病毒骨架质粒载体中被引入单一SfuI的酶切位点，该载体的结构如图3所示，上述的单一SfuI的酶切位点，也可采用PacI、SwaI中的任意一个。由图3可见：穿梭载体的pVII up down/LacZaDNA序列与腺病毒骨架质粒同源重组后将SfuI位点引入腺病毒骨架质粒载体中。
3、构建红色荧光蛋白(mCherry)标记核心蛋白pVII穿梭载体
根据mCherry基因序列设计一对引物扩增mCherry基因，P1-P2为mCherry基因扩增引物：
P1：AAGATCTGGAGGTGGCGGAATGGTGAGCAAGGGCGAG
P2：TGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCAT
聚合酶链式反应的条件是：94℃30秒，98℃10秒55℃5秒72℃2分钟，30个循环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的聚合酶链式反应产物与pGEMT-easy载体连接。连接条件为：pGEMT-easy载体0.5μl，聚合酶链式反应回收产物4μl，2×T4DNA快速连接酶缓冲液5μl，T4DNA快速连接酶0.5μl，25℃反应1个小时后转化感受态的DH5α细胞，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pGEMT/mCherry。
将mCherry基因片段从pGEMT/mCherry载体上经BglII和SalI双酶切回收后连入经BamHI和XhoI双酶切的pUC19M pVII up down shuttle载体中。连接条件是：4μl酶切纯化片段，5μl 2×T4DNA连接酶缓冲液，0.5μl酶切载体，0.5μl T4DNA连接酶。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pUC19M pVII up down/mCherry shuttle。
4、构建红色荧光蛋白mCherry标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体
将pUC19M-pVII up down/mCherry shuttle质粒载体经ClaI和XbaI双酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳大片段后与经SfuI线性化的腺病毒骨架载体pAd5 EB214/LacZa共转化Bj5183，涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板并加入50μl的40mg/ml的X-gal用来蓝白斑筛选。经摇菌、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pAd5 EB214/mCherry，此载体即为红色荧光标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体，该载体的结构如图4所示，由图4可见，红色荧光蛋白基因mCherry插入在核心蛋白pVII下游，形成pVII-mCherry融合蛋白。
5、红色荧光蛋白mCherry标记核心蛋白pVII腺病毒的包装及纯化
将PacI线性化的荧光标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体pAd5 EB214/mCherry转染HEK293细胞，7-10天后收获病毒，经过HEK293细胞大量扩增后采用氯化铯密度梯度离心纯化病毒，获得mCHerry标记核心蛋白的腺病毒Ad5/pVII-mCherry，在冰箱内-80℃内保存。
实施例2
以绿色荧光蛋白(eGFP)标记核心蛋白pVII腺病毒载体的构建过程为例其构建方法步骤如下：
1、腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入单一的酶切位点的穿梭载体
以腺病毒基因组DNA为模板设计两对引物分别用来扩增用于同源重组的核心蛋白DNA序列上下游800bp的DNA序列，上游DNA序列包含腺病毒的核心蛋白Ⅶ本身的DNA序列。P1-P4为两对引物的序列：
P1：ATCTAGACGCGCCCGCCAGCCCCCACCATCACCACCG
P2：TGGATCCACCTCCACCTCCGTTGCGCGGGGGGCGGGTGCG
P3：ACTCGAGATTGCAAGAAAAAACTACTTAGACTC
P4：TATCGATGAGGCAACCGGGGACGTTTGTGTCTCC
聚合酶链式反应的条件是：94℃30秒，98℃10秒55℃5秒72℃1分钟，30个循环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的聚合酶链式反应产物与pGEMT-easy载体连接。
该步骤中的其他步骤与实施例1相同
2、引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体
引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体的构建过程与实施例1相同，获得成功引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体pAd5EB214/LacZa。
3、构建绿色荧光蛋白eGFP标记核心蛋白pVII穿梭载体
以绿色荧光蛋白eGFP基因序列为模板设计引物扩增eGFP基因，P1-P2为eGFP基因扩增引物：
P1：AAGATCTGGAGGTGGCGGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
P2：TGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC
聚合酶链式反应的条件是：94℃30秒，98℃10秒55℃5秒72℃2分钟，30个循环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的聚合酶链式反应产物与pGEMT-easy载体连接。连接条件为：pGEMT-easy载体0.5μl，聚合酶链式反应回收产物4μl，2×T4DNA快速连接酶缓冲液5μl，T4DNA快速连接酶0.5μl，25℃反应1个小时后转化感受态的DH5α细胞，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pGEMT/eGFP。
将eGFP基因片段从pGEMT/eGFP载体上经BgIII和SalI双酶切回收后连入经BamHI和XhoI双酶切的pUC19M pVII up down shuttle载体中。连接条件是：4μl酶切纯化片段，5μl 2×T4DNA连接酶缓冲液，0.5μl酶切载体，0.5μl T4DNA连接酶。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pUC19M-pVII up down/eGFP shuttle。
4、构建绿色荧光蛋白eGFP标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体
绿色荧光蛋白eGFP标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体的构建过程与实施例1相同，获得eGFP标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体：pAd5EB214/eGFP，该载体的结构如图5所示，由图5可见，绿色荧光蛋白基因eGFP插入在核心蛋白pVII下游，形成pVII-eGFP融合蛋白。
5、绿色荧光蛋白eGFP标记核心蛋白pVII腺病毒的包装及纯化
绿色荧光蛋白eGFP标记核心蛋白pVII腺病毒的包装及纯化与实施例1相同，最终获得eGFP标记核心蛋白pVII的腺病毒Ad5/pVII-eGFP。
本实施例中用于标记核心蛋白pVII的绿色荧光蛋白基因eGFP也可用黄色荧光蛋白基因YFP、蓝色荧光蛋白基因EBFP、青色荧光蛋白基因ECFP等荧光蛋白基因替换。
实施例3
以荧光素酶luciferase标记核心蛋白pVII腺病毒载体的构建过程为例其构建方法步骤如下：
1、构建腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3`端引入单一的酶切位点的穿梭载体
以腺病毒基因组DNA为模板设计两对引物分别用来扩增用于同源重组的核心蛋白DNA序列上下游10kb的DNA序列，上游DNA序列包含腺病毒的核心蛋白Ⅶ本身的DNA序列。P1-P4为两对引物的序列：
P1：ATCTAGAAAGGTCAACGCTGGTGGCTACCTCTCCGCG
P2：TGGATCCACCTCCACCTCCGTTGCGCGGGGGGCGGGTGCG
P3：ACTCGAGATTGCAAGAAAAAACTACTTAGACTC
P4：TATCGATTCGGCGAACGGGCAGTGCCGGCGGCGC
聚合酶链式反应的条件是：94℃30秒，98℃10秒55℃5秒72℃10分钟，30个循环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的聚合酶链式反应产物与pGEMT-easy载体连接。
该步骤中的其他步骤与实施例1相同。
2、引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体
引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体的构建过程与实施例1相同，获得成功引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体pAd5EB214/LacZa。
3、构建荧光素酶luciferase标记核心蛋白pVII穿梭载体
以荧光素酶luciferase基因序列为模板设计引物扩增luciferase基因，P1-P2为luciferase基因扩增引物：
P1：AAGATCTATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGG
P2：TTCTAGATTACACGGCGATCTTTCCGCCCTTCTTGG
聚合酶链式反应的条件是：94℃30秒，98℃10秒55℃5秒72℃2分钟，30个循环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的聚合酶链式反应产物与pGEMT-easy载体连接。连接条件为：pGEMT-easy载体0.5μl，聚合酶链式反应回收产物4μl，2×T4DNA快速连接酶缓冲液5μl，T4DNA快速连接酶0.5μl，25℃反应1个小时后转化感受态的DH5α细胞，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pGEMT/luciferase。
将luciferase基因片段从pGEMT/luciferase载体上经BglII和XbaI双酶切回收后连入经BamHI和XhaI双酶切的pUC19M pVII up down shuttle载体中。连接条件是：4μl酶切纯化片段，5μl 2×T4DNA连接酶缓冲液，0.5μl酶切载体，0.5μl T4DNA连接酶。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pUC19M pVII up down/luciferase shuttle。
4、构建荧光素酶luciferase标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体
荧光素酶luciferase标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体的构建过程与实施例1相同，获得luciferase标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体：pAd5EB214/luciferase，该载体的结构如图6所示，由图6可见，荧光素酶基因luciferasw插入在核心蛋白pVII下游，形成pVII-luciferase融合蛋白。
5、荧光素酶luciferase标记核心蛋白pVII腺病毒的包装及纯化
荧光素酶luciferase标记核心蛋白pVII腺病毒的包装及纯化与实施例1相同，获得luciferase标记核心蛋白pVII的腺病毒Ad5/pVII-luciferase。
实施例4
在以上的实施例1～3的步骤1中，所用的pVII no stop up片段用pVno stop up片段替换，pVIIHR down片段用pV HR down片段替换，pGEMT/pVII HR down载体用pGEMT/pV HR down载体替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤2中，所用的pUC19M-pVII up down/LacZashuttle用pUC19M-pV up down/LacZa shuttle替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤3中，所用的pUC19MpVII up down shuttle载体用pUC19M-pV up down shuttle载体替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤4中，所用的pUC 19M-pVII up down/mCherry shuttle质粒载体用pUC 19M-pV up down/mCherry shuttle质粒载体替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤5中，所用的pVII腺病毒质粒载体用pV腺病毒质粒载体替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。构建成腺病毒核心蛋白遗传标记载体。
实施例5
在以上的实施例1～3的步骤1中，所用的pVIIno stop up片段用pXno stop up片段替换，pVIIHR down片段用pX HR down片段替换，pGEMT/pVII HR down载体用pGEMT/pX HR down载体替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤2中，所用的pUC19M-pVII up down/LacZa
shuttle用pUC 19M-pX up down/LacZa shuttle替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤3中，所用的pUC19M-pVII up down shuttle载体用pUC19M-pX up down shuttle载体替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤4中，所用的pUC 19M-pVII up down/mCherry shuttle质粒载体用pUC19M-pX up down/mCherry shuttle质粒载体替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤5中，所用的pVII腺病毒质粒载体用pX腺病毒质粒载体替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。构建成腺病毒核心蛋白遗传标记载体。
实施例6
在以上的实施例1～5的步骤2中，所用的经数均分子量为4000～8000的聚乙二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体用腺病毒载体衣壳蛋白的遗传修饰或不修饰的重组腺病毒载体替换。其他步骤与相应的实施例相同。构建成腺病毒核心蛋白遗传标记载体。
实施例7
在以上的实施例1～5的步骤2中，所用的经数均分子量为4000～8000的聚乙二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体用条件复制型重组腺病毒载体替换。其他步骤与相应的实施例相同。构建成腺病毒核心蛋白遗传标记载体。
实施例8
在以上的实施例1～5的步骤2中，所用的经数均分子量为4000～8000的聚乙二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体用携带2个治疗基因的条件复制型重组腺病毒载体替换，也可用携带1个小干扰RNA的条件复制型的重组腺病毒载体替换。其他步骤与相应的实施例相同。构建成腺病毒核心蛋白遗传标记载体。
实施例9
在以上的实施例1～5的步骤2中，所用的经数均分子量为4000～8000的聚乙二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体用携带1个治疗基因的非复制型重组腺病毒载体替换，也可用携带2个小干扰RNA的条件复制型的重组腺病毒载体替换。其他步骤与相应的实施例相同。构建成腺病毒核心蛋白遗传标记载体。
Claims (7)
1.一种腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于它是由下述步骤组成：
(1)构建向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体
采用酶切连接的方式将合成的DNA片段连入pUC19质粒载体，获得的阳性克隆命名为pUC19M，采用聚合酶链式反应扩增核心蛋白DNA序列上下游序列，将获得的核心蛋白上下游DNA片段连入pUC19M载体；将含有一个酶切位点的筛选基因连入含有核心蛋白上下游序列的pUC19M载体，获得向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体；
(2)引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体
将步骤(1)中获得的腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体经双酶切回收后与重组腺病毒载体质粒共转化Bj5183感受态细胞，经过鉴定后获得引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体；
(3)构建标记基因标记核心蛋白穿梭载体
采用聚合酶链式反应获得标记基因的DNA序列，将标记基因序列连入含有核心蛋白上下游序列的pUC19M载体，经过鉴定获得标记基因标记核心蛋白的穿梭载体；
(4)构建标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体
将步骤(3)中获得的标记基因标记核心蛋白的穿梭载体经双酶切回收后与经过线性化的引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体共转化Bj5183感受态细胞，经过鉴定后获得标记基因标记核心蛋白的腺病毒质粒载体；
(5)标记基因标记核心蛋白腺病毒的包装及纯化
将线性化的标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体转染HEK293细胞，扩增、分离、纯化，得到标记基因标记核心蛋白的腺病毒，在冰箱内-80℃保存。
2.按照权利要求1所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于：所说的穿梭载体为任何含有核心蛋白开放阅读框上下游800bp～10kb DNA序列的任何载体。
3.按照权利要求1所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于：所说的筛选基因包括抗性基因或β-半乳糖苷酶基因。
4.按照权利要求1所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于：所说的标记基因包括荧光蛋白基因或荧光素酶基因。
5.按照权利要求1所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于：所说的核心蛋白DNA序列3’端引入的酶切位点为重组腺病毒载体本身所不含有的任何酶切位点。
6.按照权利要求1所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于：所说的重组腺病毒载体为下列载体中的任意一种：
(1)用数均分子量为4000～8000的聚乙二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体；
(2)腺病毒载体衣壳蛋白的遗传修饰或不修饰的重组腺病毒载体；
(3)条件复制型重组腺病毒载体；
(4)携带至少一个治疗基因或小干扰RNA的条件复制型的重组腺病毒载体；
(5)携带至少一个治疗基因或小干扰RNA的非复制型的重组腺病毒载体。
7.按照权利要求1或2所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于：所说的核心蛋白为腺病毒的核心蛋白Ⅶ或核心蛋白Ⅴ或核心蛋白Ⅹ。
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Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 《J Gen Virol》 200512 Le LP et al "Fluorescently tagged canine adenovirus via modification with protein IX-enhanced green fluorescent protein" 第86卷, 第12期 2 * |
| 《J Natl Cancer Inst》 20060201 Le LP et al "Dynamic monitoring of oncolytic adenovirus in vivo by genetic c 第98卷, 第3期 2 * |
| 《Molecular Therapy》 200404 Meulenbroek RA et al "Use of adenovirus protein IX (pIX) to display large polypeptides on the virion--generation of fluorescent virus through the incorporation of pIX-GFP" 第9卷, 第4期 2 * |
| 《Virology》 20060801 Le LP et al "Core labeling of adenovirus with EGFP" 第351卷, 第2期 2 * |
| 《中国矫形外科杂志》 200903 熊蠡茗 等 "Recombinant adenovirus carrying tissue inhibitor of metalloprote inase - 3 gene regulates the matr ix of rabbit intervertebral disc in vivo" 第17卷, 第5期 2 * |
| 《郧阳医学院学报》 200906 张蕾 等 "携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒的构建及其在人血管平滑肌细胞中的表达" 第28卷, 第3期 2 * |
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