CN101932313A - Hedgehog激动剂在治疗肌骨骼相关障碍中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了诊断和治疗与Hedgehog途径相关的肌骨骼障碍的方法,所述的障碍包括但不限于肌营养不良(例如迪谢纳肌营养不良),该方法应用激动Sonic Hedgehog(shh)并且从而激动Hedgehog信号传导途径的药物。所述的激动剂包括例如本发明化合物(例如式I化合物)。本发明还提供了筛选能够增加肌肉和/或肌肉前体细胞增殖的药物的方法。
Description
发明背景
Hedgehog(Hh)信号传导首先是在果蝇中鉴定出来的,作为胚胎图式形成的一个重要的调节机制,或作为一个过程,通过该过程胚胎细胞形成有序的分化组织的空间排布(Nusslein-Volhard等人(1980)Nature 287,795-801)。在哺乳动物细胞中,已经鉴定出三种Hedgehog基因,Sonic Hedgehog(Shh)、India Hedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog(Dhh)。Hedgehog基因编码分泌性蛋白,其经历翻译后修饰,包括N-端的自催化剪切和脂质修饰(棕榈酰化)以及C-端的胆固醇修饰。
脂质修饰的N-端Hedgehog蛋白触发蛋白质途径的信号传导活性,并且通过来自信号传导细胞的可溶性Hedgehog蛋白的发送以及应答细胞的接收引起细胞与细胞的通信。在应答细胞中,12-通道跨膜受体Patched(Ptch)用作Hh信号传导的负调节物,并且7-通道跨膜蛋白Smoothened(Smo)用作Hh信号传导的正调节物。在静止状态下,游离的Ptch(即未被Hh结合的)以亚化学计量抑制Smo诱导的途径活性(Taipale等人(2002)Nature 418:892);但是,当结合配体Hh蛋白后,Smo的抑制被解除,并且产生的信号级联放大导致Gli转录因子(Gli1、Gli2和Gli3)的活化和核移位。
Hh信号转录的下游靶基因包括Wnts、TGFβ以及Ptc和Gli1,这些基因是正和负调节反馈回路的基础。数个细胞周期和增殖调节基因(例如c-myc、cyclin D和E)也在Hh信号传导的靶基因中。
Shh信号传导对于胚胎发育是至关重要的,并且特别是对于引发肌生成和肌祖细胞扩展是必需的(Duprez,D等人(1998)Development 125,495-505)(Cossu,G等人(1999)Embo J 18,6867-72)。尽管知之较少,但是最近的证据表明Shh信号传导在局部缺血或肌损伤后的成人肌肉中重新活跃(Pola,R.等人(2003)Circulation 108,479-85)。同时,已经证实重组Shh蛋白(rShh)促进从小鼠和鸡骨骼肌分离的肌卫星细胞(SC)的增殖(Koleva,M.等人(2005)Cell Mol Life Sci 62,1863-70)(Elia,D.(2007)Biochim Biophys Acta 1773,1438-46)。SC是骨骼肌中最具特征的固有干细胞,并且它们对于骨骼肌组织的内在再生提供一种方法(Collins,C.A.等人(2005)Cell Cycle 4,1338-41)(Tajbakhsh,S.(2005)Exp Cell Res 306,364-72)。但是,在损伤、遗传疾病或老化的情况中,这种再生能力降低了。Sonic hedgehog(Shh)信号传导对于胚胎肌发育过程中的前体细胞扩展至关重要,并且在肌损伤后的成年人中再次活化。
通常,卫星细胞在肌膜和基底层间的肌纤维边缘保持静止,但是可以响应肌肉刺激(例如锻炼或创伤)而活化(Bornemann,A.等人(1999)Neuropediatrics 30,167-75)。在人类中,认为卫星细胞的数量和活化潜力随着年龄的增长而降低(Sajko,S.等人(2004)J Histochem Cytochem 52,179-85)。另外,患有遗传疾病(例如肌营养不良)的患者可能遭受再生失败,这意味着卫星细胞更新不是无限的。
这些类型的肌病最终可以用基于细胞的疗法来治疗,但是,增强内源性干细胞增殖的药理学治疗具有显著的治疗价值。Hh信号传导途径的激动剂被认为作为肌损伤或疾病的治疗具有治疗功效,并且由此是本领域研究者的兴趣点,并且是较广泛的科学共同体。由于目前还没有化合物能够活化内源性肌卫星细胞,激动Shh的化合物(其能够以与重组Shh蛋白类似方法发挥作用)的鉴定对于治疗肌病和肌骨骼障碍是需要的。
发明概述
本发明通常涉及与Hedgehog途径相关的肌骨骼障碍的诊断和治疗,所述的障碍包括但不限于肌营养不良(例如迪谢纳肌营养不良),该方法应用激动Sonic Hedgehog(shh)并且从而激动Hedgehog信号传导途径的药物。所述的激动剂包括例如本发明化合物(例如式I化合物)。本发明的方法和化合物涉及例如通过活化独立于Shh配体的Smo受体来激动Hedgehog信号传导途径,并且包括将细胞与足量的本发明化合物(例如式I化合物)接触以激动正常的Shh活性,拮抗正常的Ptc活性,或激动smoothened活性(例如逆转或控制异常的生长状态)。
本发明的一个方面提供了应用化合物激动Hedgehog(配体)-非依赖性途径活化的可用方法。在某些实施方案中,本方法可以用于抵抗Hedgehog途径不需要的抑制的表型效应,例如由Hedgehog丧失功能、Ptc获得功能或smoothened丧失功能突变引起的。例如,本方法可以包括将细胞(体外或体内)与足量Shh激动剂、例如本发明化合物(例如式I化合物(例如Shh-Ag))或其它小分子接触,以激动Hedgehog-非依赖性活化途径。
本发明化合物(下面进一步描述)包括Hedgehog(例如Sonic Hedgehog)合成、表达、产生、稳定、磷酸化、细胞内再定位和/或活性的小分子激动剂。本发明化合物包括但不限于式I化合物。
本发明提供了测定已知上调sonic hedgehog途径的药物是否增加初级成肌细胞增殖(例如以PI3K/Akt-依赖方式)的方法,该方法包括:(i)将药物施用于非人类个体;和(ii)测定个体产生的初级成肌细胞增殖是否大于未施用药物的个体,从而测定药物是否增加初级成肌细胞增殖。
本发明提供了测定已知上调sonic hedgehog途径的药物是否促进卫星细胞(SC)增殖的方法,该方法包括:(i)将药物施用于非人类个体;和(ii)测定个体产生的卫星细胞(SC)增殖是否大于未施用药物的个体,从而测定药物是否促进卫星细胞(SC)增殖。
本发明进一步提供了治疗肌骨骼障碍的方法,该方法通过给患者施用治疗有效量的已知激动或另外上调sonic hedgehog途径并且测定具有增加细胞增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)的能力的药物而实现,其中该能力是通过下面方法来测定的,该方法包括(i)将药物施用于非人类个体;和(ii)测定个体产生的细胞增殖是否大于未施用药物的个体。
本发明进一步提供了抑制肌骨骼障碍发作的方法,该方法通过给需要的个体施用预防有效量的已知激动或另外上调sonic hedgehog途径并且测定具有增加细胞增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)的能力的药物而实现,其中该能力是通过下面方法来测定的,该方法包括(i)将药物施用给非人类个体;和(ii)测定个体产生的细胞增殖的增加是否大于未施用药物的个体。
本发明进一步提供了组合物,该组合物包含(a)可药用载体,和(b)已知上调sonic hedgehog途径并且测定具有增加细胞增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)的能力的药物,其中该能力是通过下面方法来测定的,该方法包括(i)将药物施用于非人类个体;和(ii)测定个体产生的细胞增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)的增加是否大于未施用药物的个体。
本发明进一步提供了制备品,该制备品包括其中具有已知上调sonic hedgehog途径并且测定具有增加细胞增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)的能力的药物的包装材料,和表示药物在抑制个体肌骨骼障碍发作中的用途的标签,其中这种能力是通过下面方法来测定的,该方法包括(i)将药物施用于非人类个体;和(ii)测定个体产生的细胞增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)的增加是否大于未施用药物的个体。
本发明进一步提供了制备品,该制备品包括其中具有已知上调sonic hedgehog途径并且测定具有增加细胞增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)的能力的药物的包装材料,和表示药物在治疗个体肌骨骼障碍中的用途的标签,其中这种能力是通过下面方法来测定的,该方法包括(i)将药物施用于非人类个体;和(ii)测定个体产生的细胞增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)的增加是否大于未施用药物的个体。
本发明的方法可以用于体外和/或体内例如在形成新的或再生的肌肉组织中调节细胞的增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)。在另一个特别的实施方案中,将细胞与本发明化合物(例如式I化合物)接触或将本发明化合物(例如式I化合物)引入细胞中导致促进细胞增殖和肌骨骼损伤或障碍的恢复。因此,另一个特别的实施方案提供了通过在损伤的或患病的肌细胞中应用本发明化合物(例如式I化合物)来激动Hh途径的方法。
附图简述
图1证实了Shh-Ag治疗诱导Gli1表达并且促进成肌细胞和卫星细胞的增殖。如图1A所示,Gli1 mRNA在Shh-Ag(10μM)治疗24小时后,在sonic-hedgehog敏感的莱迪希细胞系、TM3、初级小鼠成肌细胞(PM)、C2C12成肌细胞和分离的卫星细胞(SC)中上调。图表示平均值±标准差,并且相比载体处理=1来表示。*P<0.05。如图1B所示,Shh-Ag治疗(24小时)促进了初级成肌细胞的增殖,增加了细胞周期G2/M期中细胞的百分数。PI染色后,FACS分析的实例和图形概括均显示。*P<0.05。如图1C所示,用Shh-Ag治疗48小时诱导分离的SC的增殖,增加了总细胞数和BrdU掺入细胞的百分数。*P<0.05。
图2A描述了LY29002(1μM)、磷脂酰肌醇3-激酶/Akt途径抑制剂对Shh-Ag诱导的成肌细胞增殖的封闭作用。图2B显示了Shh-Ag或重组sonic hedgehog蛋白(rSHH)治疗(1μg/mL)后Gli1和Cyclin D1蛋白水平的增加完全被LY29002-介导的PI3K/AKT抑制所封闭。数值表示相比载体=100所得到的平均光密度测定得分。*P<0.05。
图3是体内试验设计的图形描述,本文进一步详述。6至8周龄野生型(WT)、DMDMDX或WT心脏毒素损伤的小鼠(Ctx-inj)接受两个连续的双向IM注射载体(10%DMSO/PBS)或Shh-Ag(500μM)至胫骨前肌(TA)或腓肠肌(GA),随后IP注射BrdU。将小鼠处死,然后在ctx-损伤后的3或7天收集肌肉用于免疫染色(TA)或FACS分析(GA);对于所有组n=4。
图4证实了Shh-Ag注射改善了心脏毒素-损伤后的再生。为了定量Shh-Ag活化的卫星细胞的增殖,将卫星细胞从治疗的肌肉(GA)中分离并且通过FACS分析检测BrdU表达。虽然卫星细胞的总百分数用Shh-Ag治疗后仅轻微增加,但是BrdU+卫星细胞的百分数则几乎翻倍(由4.8增至10.6%)。图表示细胞占整个单细胞制剂的平均百分数±标准差。*P<0.05。
发明详述
本发明涉及这样的发现:由Shh、patched(ptc)、gli和/或smoothened调节的信号转导途径可以被小分子调节、至少部分调节。虽然不希望结合任何特别理论,通过细胞-表面联合体(例如复合物)的改变来活化patched-smoothened途径可以是一种机制,这些药物通过这种机制发挥作用。
Hh途径被认为是通过patched和smoothened的联合体(例如蛋白质复合物的形式)来负调节的,这种联合体被hedgehog与patched的结合所破坏。因此,这些药物活化hedgehog途径的能力可以归因于这些分子与patched或smoothened的相互作用或结合的能力,从而破坏smoothened与patched的联合,或者至少促进那些蛋白质活化hedgehog、ptc和/或smoothened-介导的信号转导途径的能力。该作用模式(例如smoothened-依赖性途径的调节)区别于通过直接活化cAMP途径(例如通过与PKA、腺苷酸环化酶、cAMP磷酸二酯酶等结合或相互作用)来调节hedgehog途径的化合物。
在某些实施方案中,本文公开的hedgehog激动剂在hedgehog蛋白自身不存在的情况下调节hedgehog活性,例如化合物模拟hedgehog活性,而不是仅仅补充或增加hedgehog蛋白的活性,例如通过促进hedgehog与patched结合。这些化合物在本文指的是hedgehog-非依赖性激动剂并且单独可以模拟表型或由hedgehog治疗产生的效应。在其它实施方案中,本发明化合物增强hedgehog蛋白的活性,并且需要hedgehog蛋白的存在或添加,以观察表型或由hedgehog诱导产生的效应。这类hedgehog-依赖性激动剂可以在包含hedgehog蛋白的治疗制剂或治疗中应用,或者可以用于增加由用激动剂所治疗的细胞或组织天然产生的hedgehog蛋白的活性。本文公开的hedgehog激动剂可以诱导patched-smoothened复合物的解离或者破坏patched和smoothened之间的相互作用,例如通过与patched或smoothened结合,从而活化hedgehog途径。在某些实施方案中,本发明的组合物和方法应用作用于一种或多种靶细胞的细胞外膜的组分的化合物。
在某些实施方案中,在本发明中有用的hedgehog激动剂诱导hedgehog-依赖性转录调节,例如gli1或ptc基因的表达。因此这类激动剂可以诱导或增加由例如hedgehog蛋白水平的增加引起的hedgehog-依赖性途径活化。
因此,特别值得考虑的是,这些调节hedgehog、ptc或smoothened信号转导活性的小分子同样能够促进具有功能ptc-smo途径的细胞的增殖(或其它生物学效果)。在优选的实施方案中,该激动剂是具有分子量小于2500amu、更优选小于1500amu并且甚至更优选小于750amu的有机分子,并且能够诱导或增加至少某些hedgehog蛋白的生物学活性,特别优选在靶细胞内。由hedgehog激动剂活化的hedgehog途径可以定量化,例如通过检测与不存在激动剂的对照组相比,在激动剂的存在下ptc或gli-1转录的增加。例如增加至少5%、至少10%、至少20%或甚至至少50%可以表示hedgehog途径被试验化合物活化。
在某些实施方案中,用于本发明的化合物、例如上面描述的具有小于约1000nM、小于约100nM、小于约10nM或甚至小于约1nM的诱导或增加一种或多种Hh活性(例如上调ptc或gli表达)的EC50。示例性人Gli基因的编码序列包括例如GenBank登录号X07384的Gli-1基因序列和GenBank登录号AB007298的Gli-2基因序列。Gli或ptc表达水平可以例如通过测量mRNA水平(转录)或蛋白质水平(翻译)来测定。
另一方面,本发明提供了药物制剂,该药物制剂包含以足量配制的作为活性成分的hedgehog激动剂、ptc拮抗剂或smoothened激动剂。例如本文描述的,以促进体内增殖或其它生物学效果。
本发明涉及本发明化合物,包括式(I)化合物:
其中,由于化合价和稳定性允许,
Ar和Ar’独立地表示取代的或未取代的芳基或杂芳基环;
Y在每次出现时独立地是不存在或表示-N(R)-、-O-、-S-或-Se-;
X选自-C(=O)-、-C(=S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(=NCN)-、-P(=O)(OR)-、以及任选被1-2个基团例如低级烷基、链烯基或炔基取代的亚甲基;
M在每次出现时独立地表示取代的或未取代的亚甲基,例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(=O)-等,或者两个M一起表示取代的或未取代的乙烯或乙炔,其中Mj中某些或所有出现的M形成环状结构的全部或部分;
R在每次出现时独立地表示H或者取代的或未取代的芳基、杂环基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、炔基、链烯基或烷基,或者两个R一起可以例如与N形成4-至8-元环;
Cy’表示取代的或未取代的芳基、杂环基、杂芳基或环烷基,包括多环基团;
j在每次出现时独立地表示整数0至10、优选2至7;并且
i在每次出现时独立地表示整数0至5、优选0至2。
在某些实施方案中,M在每次出现时独立地表示取代的或未取代的亚甲基,例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(=O)-等。
在某些实施方案中,Ar和Ar’表示苯基环,例如未取代的或者被一个或多个包含杂原子例如O、N和S的基团取代。在某些实施方案中,Ar和Ar’中至少一个表示苯基环。在某些实施方案中,Ar和Ar’中至少一个表示杂芳基环,例如吡啶基、噻唑基、噻吩基、嘧啶基等。在某些实施方案中,Y和Ar’与Ar以间位和/或1,3-关系连接。
在某些实施方案中,Y在所有位置都不存在。在其中Y存在于一个位置的实施方案中,i优选表示整数1-2,在相邻的Mi中,如果i=0将导致两个出现的Y直接连接,或者一个出现的Y直接与N或NR2连接。
在某些实施方案中,Cy’是取代的或未取代的芳基或杂芳基。在某些实施方案中,Cy’直接与X连接。在某些实施方案中,Cy’是取代的或未取代的二环或杂芳基环,优选都是二环和杂芳基,例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并吡啶等。在某些实施方案中,Cy’是至少被取代的或未取代的芳基或杂芳基环取代的单环芳基或杂芳基环,即形成二芳基系。在某些实施方案中,Cy’包括两个取代的或未取代的芳基或杂芳基环,例如相同的或不同的,直接通过一个或多个键相连,例如形成二芳基或二环系。
在某些实施方案中,X选自-C(=O)-、-C(=S)-和-S(O2)-。
在某些实施方案中,R表示H或低级烷基,例如H或Me。
在某些实施方案中,NR2表示伯胺或者分别被一个或两个低级烷基、芳基或芳烷基取代的仲胺或叔胺,优选伯胺或仲胺。
在某些实施方案中,Ar或Ar’上的取代基选自卤素、低级烷基、低级链烯基、芳基、杂芳基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、酰基氨基、氰基、硝基、羟基、叠氮基、磺酰基、亚砜(sulfoxido)、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚磺酰氨基、磷酰基、膦酸酯、次膦酸酯、-(CH2)p烷基、-(CH2)p链烯基、-(CH2)p炔基、-(CH2)p芳基、-(CH2)p芳烷基、-(CH2)pOH、-(CH2)pO-低级烷基、-(CH2)pO-低级链烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)pSH、-(CH2)pS-低级烷基、-(CH2)pS-低级链烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)pN(R)2、-(CH2)pNR-低级烷基、-(CH2)pNR-低级链烯基、-NR(CH2)nR以及上述基团的保护形式,其中p和n在每次出现时独立地表示整数0至10、优选0至5。
如下面进一步描述的,本发明化合物可以如美国专利公布US20050070578和相关同族专利中描述的那样制备,将其所有内容并入本文作为参考。
在某些实施方案中,Shh-Ag是本发明化合物(例如式I化合物),如下:
在本文描述中,术语“治疗”包括预防性或防止性治疗以及治愈性或疾病抑制性治疗,包括治疗处于本发明障碍(例如肌骨骼障碍(例如肌营养不良))风险中的患者以及病人。该术语进一步包括用于延迟疾病进程的治疗。
“抑制和/或逆转”例如肌骨骼障碍(例如肌营养不良),申请人表示消除所述的肌骨骼障碍(例如肌营养不良),或者与治疗前或没有治疗相比,使所述病症严重程度降低。
本文所用的“治愈”表示通过治疗引起患者的肌骨骼障碍(例如肌营养不良)减轻或其行为发作的减轻。
术语“预防”或“防止”表示阻止肌骨骼障碍(例如肌营养不良)的发作或复发。
“治疗”表示治疗、防止和预防,并且特别表示给患者施用药物或进行医学处理,用于预防(防止)或治愈或减轻疾病或病或病症或甚至在患病的患者情况中的事件的发作程度或可能性。
“诊断”表示诊断、预后、监测、表征、选择患者(包括临床试验中的参与者),并且鉴定处于或患有特别障碍或临床事件或那些最可能对特别治疗响应的患者,或评估或监测患者对特别治疗的响应。
“个体”或“患者”表示需要治疗病症、障碍或疾病的哺乳动物、优选人。
本文所用的“本发明化合物”包括但不限于式I化合物。本发明化合物包括本文所列的特别列出的化合物,包括在本发明的实施例中所列的那些。
本文所用的“延迟进程”表示在肌骨骼障碍(例如肌营养不良)的前期或早期给患者施用本发明化合物(例如式I化合物)防止疾病进一步发展,或与没有施用活性化合物的疾病发展相比,延缓了疾病的发展。
本文所用的“有机小分子”是分子量小于3千道尔顿并且优选小于1.5千道尔顿的有机化合物(或与无机化合物(例如金属)络合的有机化合物)。
本文所用的“报告”基因可以与术语“标志基因”互换应用,并且它是一种核酸,其易于检测和/或编码易于检测的基因产物,例如荧光素酶。
转录和翻译控制序列是DNA调节序列,例如启动子、增强子、终止子等,其提供了宿主细胞中编码基因的表达。在真核细胞中,多聚腺苷酸化信号是控制序列。
“启动子序列”是能够结合细胞内RNA聚合酶并且启动下游(3’方向)编码序列转录的DNA调节区。对于定义本发明的目的,启动子序列的3’端与转录起始位点相连,并且向上游(5’方向)延伸,包括启动高于背景可检测水平的转录所需的最小数量的碱基或元件。发现启动子序列中具有转录起始位点(方便地例如通过核酸酶S1作图来定义)以及用于RNA聚合酶结合的蛋白结合域(共有序列)。
编码序列在细胞内的转录和翻译控制序列“控制之下”,当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA时,然后mRNA被trans-RNA剪接并且翻译成编码序列编码的蛋白质。
短语“可药用”表示分子实体和组合物,当施用于人时,其是生理学可耐受的并且通常不产生过敏或类似的不良反应,例如恶心、头晕等。优选的是,本文所用的术语“可药用”表示经联邦管理机构或州政府批准的或美国药典或其它广泛公认的药典列出的,用于动物并且更特别是用于人。
术语“载体”表示稀释剂、佐剂、赋形剂或载体,化合物与其一起施用。这类药用载体可以是无菌液体,例如水和油,包括石油、动物、植物或合成来源的,例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或水溶液、盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液优选用作载体,特别是用于可注射溶液剂。适合的药用载体在E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物学)”中有描述。
本文所用的短语“治疗有效量”表示足以减少至少约15%、优选至少50%、更优选至少90%并且最优选阻止宿主的活性、功能和响应中的临床上显著的缺陷的量。可选择的是,治疗有效量足以引起宿主中临床显著病症/症状的改善。
“试剂”表示可以用于制备药物和诊断组合物的所有物质,或者其可以是化合物、核酸、多肽、片段、同种型、变体,或者可以独立用于这些目的的其它物质,所有这些符合本发明。
本文所用的“类似物”表示有机小分子化合物、核苷酸、蛋白质或多肽,其与具有本发明所需的活性和疗效的化合物、核苷酸、蛋白质或多肽具有类似或相同的活性或功能(例如抑制肿瘤生长),但无需包含与优选实施方案的序列或结构类似或相同的序列或结构。
“衍生物”表示化合物、蛋白质或多肽,其包含由氨基酸残基置换、缺失或增加的引入而改变的母体蛋白质或多肽的氨基酸序列,或者由核苷酸置换或缺失、增加或突变的引入而修饰的核酸或核苷酸。衍生的核酸、核苷酸、蛋白质或多肽与母体多肽具有类似或相同的功能。
“激动剂”和“模拟剂”可以是增加、便于、促进或引起通过途径的信号传导(例如Hh信号传导)和/或防止蛋白质相互作用和络合物形成的药物。
本文所用的“肌骨骼障碍”包括骨疾病(例如代谢性骨疾病)、滑囊炎、软骨疾病、关节疾病、肌强直、神经性肌强直、恶病质和消瘦、局部缺血、波伦综合征、肌营养不良(例如迪谢纳和贝克肌营养不良以及肢带型肌营养不良)、肌骨骼畸形、肌病(例如先天性肌病、炎性肌病、中央核性肌病、肌管性肌病和代谢性肌病(例如糖原沉积病、脂肪沉积障碍))、骨关节炎、骨软骨炎、成骨不全、骨髓炎、骨坏死、骨硬化、骨质疏松症和脊柱侧凸。本文所用的“肌骨骼障碍”还包括肌肉或骨骼损伤以及与遗传病和/或老化相关的肌肉或骨骼障碍。
术语“烷基”表示具有1至20个碳原子的直链或支链烃基,优选1至7个碳原子的低级烷基。示例性烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、异己基、庚基、4,4-二甲基戊基、辛基等。优选C1-C4-烷基。
如果没有另外定义,分别与有机基团或化合物相连的术语“低级”在本文中通常定义为具有至多并且包括7个、优选至多并且包括4个并且有利地是一个或两个碳原子。其可以是直链或支链的。
术语“任选取代的烷基”表示具有1至20个碳原子的未取代或取代的直链或支链烃基,优选1至7个碳原子的低级烷基。示例性未取代的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、异己基、庚基、4,4-二甲基戊基、辛基等。
术语“取代的烷基”表示被一个或多个下列基团取代的烷基:卤素(例如F、Cl、Br和I)、羟基、烷氧基、烷氧基烷氧基、芳基氧基、环烷基、烷酰基、烷酰基氧基、氨基、取代的氨基、烷酰基氨基、巯基、烷基硫代、芳基硫代、烷基硫羰、烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、氨基磺酰基、硝基、氰基、羧基、氨基甲酰基、烷氧基羰基、芳基、芳烷氧基、胍基、杂环基(例如吲哚基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯烷基、吡啶基、嘧啶基)等。
术语“低级烷基”表示如上述具有1至7个、优选1至4个碳原子的那些烷基。术语“卤素”或“卤代”表示氟、氯、溴和碘。
术语“烷氧基”或“烷基氧基”表示烷基-O-。
术语“芳基”或“芳”表示在环部分含有6至12个碳原子的碳环单环或二环芳烃,例如苯基、萘基、四氢萘基和联苯基,每一个可以任选被1至4个(例如1个或2个)取代基取代,所述的取代基例如烷基、卤素、三氟甲基、羟基、烷氧基、烷酰基、烷酰基氧基、氨基、取代的氨基、烷酰基氨基、巯基、烷基硫代、硝基、氰基、羧基、羧基烷基、氨基甲酰基、烷氧基羰基、烷基硫羰、烷基磺酰基、氨基磺酰基等。
术语“芳烷基”表示与烷基相连的芳基,例如苄基。
术语“卤素”或“卤代”表示氟、氯、溴和碘。
术语“卤代烷基”表示被卤素单或多取代的烷基,例如三氟甲氧基。
术语“亚烷基”表示通过单键连接的1至6个碳原子的直链桥(例如-(CH2)x-,其中x是1至6),其可以被1至3个低级烷基取代。
术语“被O、S、N-(H、烷基或芳烷基)间断的亚烷基”表示被O、S、N-(H、烷基或芳烷基)间断的2至6个碳原子的直链,例如(亚甲基或亚乙基)氧基(亚甲基或亚乙基)、(亚甲基或亚乙基)硫代(亚甲基或亚乙基)或者(亚甲基或亚乙基)亚氨基(亚甲基或亚乙基)。
术语“环烷基”表示3至8个碳原子的环烃基,例如环戊基、环己基或环庚基。
术语“烷酰基氧基”表示烷基-C(O)-O-。
术语“烷基氨基”和“二烷基氨基”分别表示(烷基)NH-和(烷基)2N-。
术语“烷酰基氨基”表示烷基-C(O)-NH-。
术语“烷基硫代”表示烷基-S-。
术语“烷基硫羰”表示烷基-S(O)-。
术语“烷基磺酰基”表示烷基-S(O)2-。
术语“氨基甲酰基”表示-C(O)-氨基或-C(O)-取代的氨基。
术语“烷氧基羰基”表示烷基-O-C(O)-。
术语“酰基”表示烷酰基、芳酰基、杂芳酰基、芳基-烷酰基、杂芳基烷酰基等。
术语“杂芳基”或“杂芳”表示芳族杂环,例如单环或二环杂环芳基,例如吡咯基、吡唑基、咪唑基、唑基、噻唑基、异唑基、噻唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲哚基、苯并噻唑基、苯并唑基、苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并呋喃基等,其任选被1至4个(例如1个或2个)取代基取代,所述的取代基例如低级烷基、低级烷氧基或卤素,所述的杂环的连接点位于杂环的碳原子上。优选的杂芳基残基是1-甲基-2-吡咯基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-噻唑基、2-咪唑基、1-甲基-2-咪唑基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基或2-喹啉基。
术语“烷酰基”表示例如C2-C7-烷酰基,特别是C2-C5-烷酰基,例如乙酰基、丙酰基或新戊酰基。
术语“芳烷氧基”表示与烷氧基相连的芳基。
术语“芳基磺酰基”表示芳基-SO2-。
术语“芳酰基”表示芳基-CO-。
术语“羰基”是公认的表示包括可以用以下通式表示的基团:
其中X是键或者表示氧或硫,并且R11表示氢、烷基、链烯基、-(CH2)m-R8或可药用盐,R’11表示氢、烷基、链烯基或-(CHH2)m-R8,其中m和R8如上面定义的。当X是氧并且R11或R’11不是氢时,通式表示“酯”。当X是氧并且R11如上面定义的时,基团在本文表示羧基,并且特别是当R11是氢时,通式表示“羧酸”。当X是氧并且R’11是氢时,通式表示“甲酸酯”。通常,当上式的氧原子被硫代替时,通式表示“硫代羰基”。当X是硫并且R11或R’11不是氢时,通式表示“硫代酯”。当X是硫并且R11是氢时,通式表示“硫代羧酸”。当X是硫并且R11’是氢时,通式表示“硫代甲酸酯”。另一方面,当X是键并且R11不是氢时,上式表示“酮”基团。当X是键并且R11是氢时,上式表示“醛”基团。
术语“杂环基”表示任选取代的、完全饱和的或不饱和的、芳族或非芳族环基,例如其是4至7元单环、7至11元二环或者10至15元三环系,其在至少一个含碳原子的环上具有至少一个杂原子。包含杂原子的杂环基团的每个环可以具有1、2或3个选自氮原子、氧原子和硫原子的杂原子,其中氮和硫杂原子还可以任选被氧化,并且氮杂原子还可以任选被季铵化。杂环基可以在任何杂原子和碳原子上连接。
术语“杂环基”表示3-至10-元环结构、更优选3-至7-元环,其中环结构包含1至4个杂原子。杂环还可以是多环。杂环基包括例如噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、异苯并呋喃、色烯、呫吨、吩噻、吡咯、咪唑、吡唑、异噻唑、异唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、中氮茚、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、1,5-二氮杂萘、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩砒嗪、吩噻嗪、呋咱、吩嗪、吡咯烷、四氢呋喃(oxolane)、四氢噻吩(thiolane)、唑、哌啶、哌嗪、吗啉、内酯、内酰胺例如氮杂环丁酮和吡咯烷酮、磺内酰胺、磺内酯等。杂环可以在一个或多个位置被上述取代基取代,所述的取代基例如卤素、烷基、芳烷基、链烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰氨基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷基硫代、磺酰基、酮、醛、酯、杂环基、芳族或杂芳族基团、-CF3、-CN等。
示例性的二环杂环基包括吲哚基、苯并噻唑基、苯并唑基、苯并噻吩基、奎宁环基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、中氮茚基、苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、苯并吡喃基、噌啉基、喹喔啉基、吲唑基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基(例如呋喃并[2,3-c]吡啶基、呋喃并[3,2-b]吡啶基]或呋喃并[2,3-b]吡啶基)、二氢异吲哚基、二氢喹唑啉基(例如3,4-二氢-4-氧代-喹唑啉基)等。
示例性三环杂环基包括咔唑基、苯并吲哚基(benzidolyl)、菲咯啉基、吖啶基、菲啶基、呫吨基等。
术语“杂环基”还包括取代的杂环基。取代的杂环基表示被1、2或3个下列基团取代的杂环基:
(a)烷基;
(b)羟基(或保护的羟基);
(c)卤素;
(d)氧代(即=O);
(e)氨基或取代的氨基;
(f)烷氧基;
(g)环烷基;
(h)羧基;
(i)杂环基氧基;
(j)烷氧基羰基,例如未取代的低级烷氧基羰基;
(k)氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基;
(l)巯基;
(m)硝基;
(n)氰基;
(o)亚磺酰氨基、亚磺酰氨基烷基或亚磺酰氨基二烷基;
(p)芳基;
(q)烷基羰基氧基;
(r)芳基羰基氧基;
(s)芳基硫代;
(t)芳基氧基;
(u)烷基硫代;
(v)甲酰基;
(w)芳基烷基;或
(x)被烷基、环烷基、烷氧基、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或卤素取代的芳基。
术语“杂环基氧基”表示通过氧桥连接的杂环基。
术语“杂芳基”或“杂芳”表示芳族杂环,例如单环或二环芳基,例如吡咯基、吡唑基、咪唑基、唑基、异唑基、噻唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲哚基、苯并噻唑基、苯并唑基、苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并呋喃基等,其任选被例如低级烷基、低级烷氧基或卤素取代。
术语“杂芳基磺酰基”表示杂芳基-SO2-。
术语“杂芳酰基”表示杂芳基-CO-。
术语“酰基氨基”是公认的并且表示可以用以下通式表示的基团:
其中R9表示氢、烷基、链烯基、-(CH2)m-R8,或R9与它连接的N原子一起形成环结构中具有4至8个原子的杂环;R8表示芳基、环烷基、环烯基、杂环或多环;并且m是零或范围为1至8的整数。R’11表示氢、烷基、链烯基或-(CH2)m-R8。
术语“取代的氨基”表示被烷基、芳烷基、芳基、杂芳基、环烷基、环烷基烷基、杂芳烷基单-或独立地二取代的氨基,或者被低级亚烷基二取代的氨基,或者被被O、S、N-(H、烷基、芳烷基)等间断的低级亚烷基二取代的氨基。
本发明的任何酸性化合物的可药用盐是与碱形成的盐,即阳离子盐,例如碱金属和碱土金属盐,例如钠、锂、钾、钙、镁以及铵盐,例如铵、三甲基铵、二乙基铵和三-(羟基甲基)-甲基铵盐。
类似地,如果碱性基团(例如氨基或吡啶基)组成结构的部分,那么酸加成盐(例如无机酸、有机羧酸和有机磺酸(例如盐酸、甲磺酸、马来酸)的盐)是可能的。
如果碱性基团(例如吡啶基)组成结构的部分,那么本发明化合物的可药用盐特别是酸加成盐,例如无机酸、有机羧酸和有机磺酸(例如盐酸、甲磺酸、马来酸等)的盐。
取决于取代基的性质,本发明化合物具有一个或多个不对称碳原子,并且因此作为外消旋体(racernates)和其(R)和(S)对映异构体存在。所有这些都在本发明范围内。优选的是更具活性的对映异构体,其典型地指定为S-构型(在碳上是NR6R7取代基)。
本发明涉及以下发现:例如通过本发明化合物(例如式I化合物)激动Hedgehog途径可以导致初级成肌细胞和卫星细胞(SC)增殖的增加。本发明还涉及以下发现:例如通过本发明化合物(例如式I化合物)激动Hedgehog途径(例如PI3K/Akt途径)的途径上游可以导致初级成肌细胞和卫星细胞(SC)增殖的增加。
本发明通常涉及应用激动Sonic Hedgehog(shh)并且从而激动Hedgehog信号传导途径的药物诊断和治疗与Hedgehog途径相关的肌骨骼障碍,包括但不限于肌营养不良(例如迪谢纳肌营养不良)。所述的激动剂包括例如本发明化合物(例如式I化合物)。本发明的方法和化合物涉及激动Hedgehog信号传导途径,例如通过活化Smo受体非依赖性Shh配体;并且包括将细胞与足量的本发明化合物(例如式I化合物)接触,以激动正常的Shh活性,拮抗正常的Ptc活性或激动smoothened活性(例如逆转或控制异常生长状态)。
本发明的一个方面制定可利用的方法,该方法应用化合物用于激动Hedgehog(配体)-非依赖性途径活化。在某些实施方案中,本方法可以用于抵抗Hedgehog途径的不需要的抑制的表型效应,例如由Hedgehog丧失功能、Ptc获得功能或smoothened丧失功能突变引起的。例如,本方法可以包括将细胞(体外或体内)与足量的Shh激动剂、例如本发明化合物(例如式I化合物(例如Shh-Ag))或其它小分子接触,以激动Hedgehog-非依赖性活化途径。
本发明化合物(下面进一步描述)包括Hedgehog(例如Sonic Hedgehog)合成、表达、产生、稳定、磷酸化、细胞内再定位和/或活性的小分子激动剂。本发明化合物包括但不限于式I化合物。
本发明提供了测定已知上调sonic hedgehog途径的药物是否增加初级成肌细胞增殖(例如以PI3K/Akt-依赖方式)的方法,该方法包括:(i)将药物施用于非人类个体;和(ii)测定个体产生的初级成肌细胞增殖是否大于未施用药物的个体,从而测定药物是否增加初级成肌细胞增殖。
本发明提供了测定已知上调sonic hedgehog途径的药物是否促进卫星细胞(SC)增殖的方法,该方法包括:(i)将药物施用于非人类个体;和(ii)测定个体产生的卫星细胞(SC)增殖是否大于未施用药物的个体,从而测定药物是否促进卫星细胞(SC)增殖。
测定已知上调sonic hedgehog途径的药物是否可以增加初级成肌细胞或卫星细胞增殖的方法可以包括测量Gli1 mRNA水平,因为Gli1是Hedgehog下游转录因子,并且因此是Hedgehog途径活性的报道基因(Gli-1基因序列具有GenBank登录号X07384,并且Gli-2基因序列具有GenBank登录号AB007298)。所述的测定方法可以包括Cyclin D1(确定的细胞周期调节剂)和Gli转录靶点。所述的测定方法还可以包括Pax7(转录因子)和肌卫星细胞(SC)的标志物(Seale,P.等人(2000)Cell 102,777-86)。
任何上述方法(例如筛选方法)可以在体外或体内进行。例如,所述的方法可以在培养的分离细胞、例如TM3细胞(已经很好建立的Shh-敏感细胞系)以及在任何数量的肌或肌前体细胞中进行。所述的肌或肌前体细胞可以包括初级成肌细胞(PM)、C2C12成肌细胞和分离的卫星细胞(SC)。进一步例如,所述的方法可以在肌病的动物模型中进行,包括但不限于DMDMDX小鼠,,其是肌营养不良模型。根据本文描述的方法,肌细胞和组织可以从所述的动物模型中获得。
本发明进一步提供了治疗肌骨骼障碍的方法,该方法通过给患者施用治疗有效量的已知激动或另外上调sonic hedgehog途径并且测定具有增加细胞增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)的能力的药物,其中该能力是通过下面方法来测定的,该方法包括(i)将药物施用于非人类个体;和(ii)测定个体产生的细胞增殖是否大于未施用药物的个体。
本发明进一步提供了抑制肌骨骼障碍发作的方法,该方法通过给需要的个体施用预防有效量的已知激动或另外上调sonic hedgehog途径并且测定具有增加细胞增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)的能力的药物,其中该能力是通过下面方法来测定的,该方法包括(i)将药物施用于非人类个体;和(ii)测定个体产生的细胞增殖的增加是否大于未施用药物的个体。
本发明进一步提供了组合物,该组合物包含(a)可药用载体,和(b)已知上调sonic hedgehog途径并且测定具有增加细胞增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)的能力的药物,其中该能力是通过下面方法来测定的,该方法包括(i)将药物施用于非人类个体;和(ii)测定个体产生的细胞增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)的增加是否大于未施用药物的个体。
本发明进一步提供了制备品,该制备品包括其中具有已知上调sonic hedgehog途径并且测定具有增加细胞增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)的能力的药物的包装材料,和表示药物在抑制个体肌骨骼障碍发作中的用途的标签,其中这种能力是通过下面方法来测定的,该方法包括(i)将药物施用于非人类个体;和(ii)测定个体产生的细胞增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)的增加是否大于未施用药物的个体。
本发明进一步提供了制备品,该制备品包括其中具有已知上调sonic hedgehog途径并且测定具有增加细胞增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)的能力的药物的包装材料,和表示药物在治疗个体肌骨骼障碍中的用途的标签,其中这种能力是通过下面方法来测定的,该方法包括(i)将药物施用于非人类个体;和(ii)测定个体产生的细胞增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)的增加是否大于未施用药物的个体。
本发明的方法可以用于体外和/或体内例如在形成新的或再生的肌肉组织中调节细胞的增殖(例如初级成肌细胞和/或卫星细胞(SC)的增殖)。在另一个特别的实施方案中,将细胞与本发明化合物(例如式I化合物)接触或者将本发明化合物(例如式I化合物)引入细胞中导致促进细胞增殖和肌骨骼损伤或障碍的恢复。因此,另一个特别的实施方案提供了通过在损伤的或患病的肌细胞中应用本发明化合物(例如式I化合物)用于激动Hh途径的方法。
Hedgehog途径
Hedgehog(Hh)信号传导首先是在果蝇中被鉴定出来的,作为胚胎图式形成的一个重要的调节机制,或者作为一个过程,通过该过程胚胎细胞形成有序的分化组织的空间排布(Nusslein-Volhard等人(1980)Nature 287,795-801)。在脊椎动物发育过程中,Hedgehog信号传导分子家族成员介导许多重要的短-和长-期图式形成过程。图式形成是活性,通过该活性,胚胎细胞形成有序的分化组织的空间排布。通过细胞内源谱系和细胞外部信号传导的相互作用,更高有机体的机体复杂性在胚胎发生过程中出现。从机体计划的早期确立到器官系统的图式形成,再到组织分化过程中不同细胞类型的产生,诱导的相互作用对于脊椎动物发育的胚胎图式形成是必需的。
脊椎动物的Hedgehog基因家族包括三个成员,其存在于哺乳动物中,称为Desert(Dhh)、Sonic(Shh)和Indian(Ihh)Hedgehog,所有这些基因编码分泌性蛋白质。这些不同Hedgehog蛋白质包括信号肽、高度保守的N-端结构域和差异较大的C-端结构域。生物化学研究已经表明Hh前体蛋白的自我蛋白酶解是通过内部硫酯中间体进行的,随后其在亲核取代中被裂解。可能是亲核基团是小的亲脂分子,其与N-肽的C-末端共价结合,再将其连到细胞表面。生物学内涵是深奥的。连接的结果是,在产Hedgehog的细胞表面产生高局部浓度的N-端Hedgehog肽。该N-端肽对于短-和长-期Hedgehog信号传导活性都是必需的和足够的。
Hh信号传导转录的下游靶基因包括Wnts、TGFβ以及Ptc和Gli1,这些基因是正和负调节反馈回路的基础。数个细胞周期和增殖调节基因(例如c-myc、cyclin D和E)也在Hh信号传导的靶基因中。
Hedgehog基因编码分泌性蛋白质,其经历翻译后修饰,包括N-端的自催化剪切和脂质修饰(棕榈酰化)以及C-端的胆固醇修饰。脂质修饰的N-端Hedgehog蛋白触发蛋白质途径的信号传导活性,通过信号传导细胞中可溶性Hedgehog蛋白的发送以及应答细胞的接收产生细胞与细胞通信。在应答细胞中,12-通道跨膜受体Patched(Ptch)用作Hh信号传导的负调节物,并且7-通道跨膜蛋白Smoothened(Smo)用作Hh信号传导的正调节物。在静止状态下,游离的Ptch(即未被Hh结合的)以亚化学计量抑制Smo诱导的途径活性(Taipale等人(2002)Nature 418:892);但是,当结合配体Hh蛋白后,Smo的抑制被解除,并且产生的信号级联放大导致Gli转录因子(Gli1、Gli2和Gli3)的活化和核移位。
当跨膜蛋白受体Patched(Ptc)抑制Smoothened(Smo)的稳定、磷酸化和活性时,出现无活性的Hedgehog信号传导途径。转录因子Gli(Hh信号传导的下游组分)被阻止与细胞质蛋白(包括融合的(Fu)和融合的抑制剂(Sufu))相互作用进入核内。结果是,Hedgehog靶基因的转录活化被抑制。通过三种哺乳动物配体(Dhh、Shh或Ihh)中任何一个与Ptc结合来引起途径的活化。
通过Hh结合的配体改变了Smo和Ptc的相互作用,逆转了Smo的抑制,从而Smo从细胞内的内部结构移至质膜。Smo定位至质膜以Hh-非依赖方式触发Hh途径靶基因的活化(Zhu等人(2003)Genes Dev.17(10):1240)。Smo活化的级联导致转录因子Gli的活化形式易位至核内。通过易位的核Gli引起Smo的活化激活了Hh途径靶基因表达,包括Wnts、TGFβ以及Ptc和Gli自身。
该过程还可以以天然的配体-非依赖方式发生,例如通过施用Shh激动化合物、重组Shh蛋白或其它Shh模拟物。
已知Hh信号传导以组织特异性和剂量依赖方式调节多种生物学过程,例如细胞增殖、分化和器官形式。在神经管的发育中,Shh在底板中表达并且支配特别亚型的神经元(包括运动神经元和多巴胺能神经元)的分化。Hh调节神经元祖细胞(例如小脑颗粒细胞和神经干细胞)的增殖。
Hh信号还在正常组织稳态和再生中发挥重要作用。在小鼠模型中,损伤后Hh途径在例如视网膜、胆管、肺、骨和前列腺组织中被活化。Hh途径在毛囊、骨髓和中枢神经系统(CNS)的某些区域内不断活化,并且良性前列腺增生和湿黄斑变性中的血管形成需要Hedgehog途径活性。
骨骼肌含有残留的干细胞,最具特征的是肌卫星细胞(SC),其提供一种方式用于骨骼肌组织的固有再生。但是,在损伤、遗传病或老化的情况中,这种再生能力被降低。Sonic hedgehog(Shh)信号传导对于胚胎肌肉发育过程中前体细胞的扩展是至关重要的,并且成年肌损伤后能够再次活化。
施用和药物组合物:
本发明涉及包含式I化合物的药物组合物在治疗性(和,在本发明更广的方面,预防性)治疗肌骨骼障碍中的用途。
通常,本发明化合物将以治疗有效量通过本领域已知的任何有用并且可接受的方式单独或者与一种或多种治疗剂组合施用。治疗有效量很大程度上取决于疾病的严重程度、个体的年龄和相对健康、所用的化合物功效和其它因素而不同。通常,以日剂量从约0.03至2.5mg/kg体重表明全身获得满意的结果。在更大的哺乳动物(例如人)中,所示的日剂量范围从约0.5mg至约100mg,方便地例如以每天至多四次的分剂量或以缓释形式来施用。对于口服施用,适合的单位剂型包含约1至50mg活性成分。
本发明化合物可以作为药物组合物通过任何常规途径来施用,特别是肠内施用,例如口服,例如片剂或胶囊剂形式;或非肠道施用,例如可注射溶液剂或混悬剂形式;局部施用,例如洗剂、凝胶剂、软膏剂或乳膏剂形式,或鼻内或栓剂形式。包含游离形式或可药用盐形式的本发明化合物以及至少一种可药用载体或稀释剂的药物组合物可以以常规方式通过混合、制粒或包衣方法来制备。例如,口服组合物可以是片剂或明胶胶囊剂,其包含活性成分和a)稀释剂,例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸;b)润滑剂,例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁或钙盐和/或聚乙二醇;对于片剂还包含c)粘合剂,例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮;如果需要d)崩解剂,例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐,或泡腾混合物;和/或e)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。可注射组合物可以是等渗水溶液或混悬液,并且栓剂可以由脂肪乳或混悬液来制备。
该组合物可以是灭菌的和/或包含佐剂,例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。另外,它们还可以包含其它在治疗上有价值的物质。对于透皮应用,适合的制剂包含有效量的本发明化合物和载体。载体可以包括可吸收的可药用溶剂,以帮助通过宿主皮肤。例如,透皮装置是绷带形式,包括背衬膜、包含化合物并任选载体的储库,任选速率控制屏障以历经延长的时间周期以可控和预设的速率将化合物递送至宿主皮肤,并且这意味着将装置固定在皮肤上。还可以应用基质透皮制剂。对于局部应用,例如施用于皮肤和眼睛,适合的制剂优选是本领域众所周知的水溶液剂、软膏剂、乳膏剂或凝胶剂。这些制剂可以包含增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
本发明化合物可以以治疗有效量与一种或多种治疗剂组合施用(药物组合)。例如,与免疫调节剂或抗炎性物质或其它抗肿瘤治疗剂一起可以出现协同作用。当本发明化合物与其它治疗组合施用时,共同施用的化合物的剂量当然将取决于所用的共同药物的类型、所用的特别药物、所治疗的病症等而不同。
本发明还提供了药物组合,例如药盒,其包含a)第一种药物,其是游离形式或可药用盐形式的本文公开的本发明化合物,和b)至少一种共同药物。该药盒可以包含施用说明书。
本文所用的术语“共同施用”或“组合施用”等表示包括给单个患者施用所选的治疗剂,并且表示包括治疗方案,其中药物无需通过相同的施用途径或在相同的时间点施用。
本文所用的术语“药物组合”表示通过混合或组合多于一种活性成分形成的产品并且包括活性成分的固定和非固定组合。术语“固定组合”表示活性成分、例如式I化合物和共同药物均是以单个实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”表示活性成分、例如式I化合物和共同药物均是以分开的实体同时、共同或没有特定时间限制地依次施用于患者,其中这类施用在患者机体内提供了2种化合物的治疗有效水平。后者还应用于联合疗法,例如施用3种或更多种活性成分。
制备本发明化合物的方法
本发明化合物可以制备成可药用酸加成盐,通过将化合物的游离碱形式与可药用无机或有机酸反应。可选择的是,本发明化合物的可药用碱加成盐可以通过将化合物的游离酸形式与可药用无机或有机碱反应来制备。
可选择的是,本发明化合物的盐形式可以应用原料或中间体的盐来制备。
本发明化合物的游离酸或游离碱形式可以分别从相应的碱加成盐或酸加成盐形式来制备。例如可以将酸加成盐形式的本发明化合物通过用适合的碱(例如氢氧化铵溶液、氢氧化钠等)处理而转化为相应的游离碱。碱加成盐形式的本发明化合物可以通过用适合的酸(例如盐酸等)处理而转化为相应的游离酸。
本发明化合物的前药衍生物可以通过本领域普通技术人员已知的方法来制备(例如,进一步的详细描述参见Saulnier等人,(1994),Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,第4卷,第1985页)。
本发明化合物的保护的衍生物可以通过本领域普通技术人员已知的方法来制备。可应用于保护基的产生和去除的技术的详细描述可以参见T.W.Greene,“Protecting Groups in Organic Chemistry(有机化学中的保护基)”,第3版,John Wiley and Sons,Inc.,1999。
本发明化合物可以方便地制备成或在本发明的方法中形式溶剂化物(例如水合物)。本发明化合物的水合物可以应用有机溶剂(例如二氧芑、四氢呋喃或甲醇)从水/有机溶剂混合物中通过重结晶来方便地制备。
本发明化合物可以制备成它们各自的立体异构体,通过将化合物的外消旋混合物与旋光活性拆分剂反应,以形成非对映异构体化合物对,分离非对映异构体并且回收旋光纯对映异构体。对映异构体的拆分可以应用本发明化合物的共价非对映异构体衍生物来进行,优选可分离的复合物(例如结晶非对映异构体盐)。非对映异构体具有不同的物理性质(例如熔点、沸点、溶解度、反应性等),并且可以容易地利用这些不同性来分离。非对映异构体可以通过色谱法、或优选通过基于溶解度差异的分离/拆分技术来分离。然后通过任何不会引起外消旋化的实用方法来回收旋光纯的对映异构体和拆分剂。可用于从消旋化合物中拆分化合物的立体异构体的技术的更详细的描述可以参见Jean Jacques,Andre Collet,Samuel H.Wilen,“Enantiomers,Racemates and Resolutions(对映异构体、消旋体和拆分),”John Wiley And Sons,Inc.,1981。
实施例
本发明通过下列代表性的实施例进一步举例说明,而非限制,实施例用于说明本发明,而不能理解为限制。除非另外说明,所述的实施例应用下列物质和方法:
细胞:TM3和C2C12细胞从ATCC获得,根据供应商的说明繁殖,并且维持在亚汇合状态。初级成肌细胞和分离的卫星细胞在添加20%胎牛血清和1%青霉素/链霉素而不含βFGF的Ham’s F10培养基中生长。将所有细胞铺在预先包被胶原的平皿(MatTek)上或铺在用大鼠尾部胶原I型(BD)处理的塑料培养皿上。
RNA和qRT-PCR:为了分析基因表达,将细胞用介质(DMSO)或10nM Shh-Ag处理24小时。根据供应商说明,将总RNA用RNEasy Miniprep试剂盒(Qiagen)分离、DNAse处理(RQ1,Promega)并且反转录(iScript,Biorad)。定量PCR根据供应商说明应用Taqman基因表达分析(Applied Biosystems)在ABI7500Fast系统中进行。基因表达变化应用比较的ΔΔCT方法来计算。
蛋白质表达:对于详细的蛋白质提取和分析,请参见在线的补充方法。Western所用的抗体是抗Gli1、总Akt、磷酸化Akt-Ser473(细胞信号传导)和Cyclin D1(Abcam)的兔多克隆抗体。
成肌细胞和卫星细胞的分离:初级小鼠成肌细胞是如本文描述的那样从小鼠后肢肌肉中分离的。肌卫星细胞是从4-6周龄C57BL/6J小鼠的后肢肌肉中分离的。将肌肉剖分并且在DMEM中用保险刀片切碎。将切碎的肌肉置于含30mL分离溶液(0.1%胶原酶D、0.25%胰蛋白酶,在DMEM中)的50mL Falcon管中,并且在37℃下搅动20分钟。分离后,加入500μL胎牛血清以封闭胰蛋白酶活性,并且将样品通过37μM滤器。将溶液在DMEM中稀释2倍,通过70μM滤器,以1000RPM下离心15分钟,并且将随后的沉淀物重新悬浮于1%FCS/PBS中。然后将多配体聚糖4阳性卫星细胞应用ARIA-UV细胞分选仪(BD)通过荧光活化细胞分选系统(FACS)来分离。
小鼠:所有小鼠方案经诺华生物医学研究所的动物管理和应用委员会批准。野生型(C57BL/6J)和C57BL/10DMDMDX小鼠从Jackson Labs获得。所有分析在约6-8周龄的雄性小鼠上进行。
心脏毒素诱导的再生:肌肉再生是通过将40μL(TA)或100μL(GA)的心脏毒素(10μM Naja atra;Sigma)注射到WT C57BL/6J小鼠各自的胫骨前肌或腓肠肌中来诱导的。
Shh-Ag处理:将20μL(TA)或50μL(GA)的介质(10%DMSO/PBS)或500μM Shh-Ag注射到各自的胫骨前肌或腓肠肌,每天一次,连续注射2天。
BrdU处理:为了处理分离的SC,在介质或Shh-Ag处理24小时后,将1∶100稀释的5-溴脱氧尿苷(BrdU)标记试剂(10mg/mL;Invitrogen)加入至培养基中。然后将细胞再温育5小时,固定,探测BrdU,用含Dapi的介质(Vector Labs)封固,然后如材料与方法中描述的那样成像。将四次重复试验的三个随机图像用于分析总细胞(Dapi)和BrdU+细胞数。对于体内递送,在第二次介质或Shh-Ag肌内注射后腹膜内(IP)注射100μL的BrdU。
FACS分析:本研究中应用下列抗体:APC-缀合的抗-CD45(BD)、PE-缀合的抗-Syndecan 4(BD)和FITC-缀合的抗-BrdU(BioVision)。将处理的小鼠的肌肉如描述的那样剖分并且分离。为了分选卫星细胞用于进一步试验,在ARIA(BD)介导的细胞分选后将APC-缀合的抗多配体聚糖4用于阳性筛选细胞。为了分析相关的BrdU表达,将分离的细胞在1%在PBS中的多聚甲醛中固定15分钟,并且在-20℃下保存在70%ETOH中。然后将细胞在吐温20溶液(0.2%,在PBS中;Sigma)中透化处理10分钟,洗涤并且与描述的抗体温育30分钟,然后用LSRII(BD)进行FACS分析。
免疫染色法:本研究中应用下列抗体:抗-层粘连蛋白兔多克隆抗体(1∶25;Sigma)、抗-BrdU大鼠单克隆抗体(1∶100;Abcam)和抗-Pax7小鼠单克隆抗体(1∶25;DSHB,爱荷华大学)。将肌肉剖分并且在10%福尔马林/PBS中固定过夜,进行石蜡包埋处理,并且切成10μM切片。然后应用Discovery XT系统(Ventana)将肌肉切片封闭并且用上述抗体染色。图像是应用ScanScope XT扫描仪获得的并且用Aperio ImageScope 6.25软件(Aperio Technologies)分析。
免疫荧光法:为了免疫荧光染色,将上述抗体与抗小鼠、大鼠和/或山羊的缀合的二抗(Alexa Fluor 488/555,1∶400;Invitrogen)一起应用。随后将切片封固在含DAPI(Vector Labs)的介质中并且应用AxioImager显微镜(Zeiss)成像。
统计学:所有数值都以平均值±标准差(s.d.)表示。为了测定两组(介质与Shh-Ag处理)间的显著性,我们采用非配对student t-检验来进行比较,P<0.05认为有统计学意义。
蛋白质表达:将细胞收集在裂解缓冲液(20mM Tris,pH 7.5、150mMNaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1%Nonidet NP-40、1mM β-甘油磷酸、1mM Na3VO4、1μg/mL亮抑酶肽和1mM PMSF)中,并且用BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce)测量蛋白质浓度。电泳分离应用20-60μg蛋白质在4-12%小型胶(Invitrogen)上进行。将蛋白质转移至PVDF膜上,用5%blotto[5%在TBST(Tris-缓冲盐水,1%Tween 20)中的奶粉]封闭1小时,随后与一抗在4℃下温育过夜。温育过夜后,将膜在TBST中洗涤30分钟,然后用抗兔抗体在室温下探测45分钟。再次在TBST中洗涤30分钟后,将斑点用ECL显像。一旦获得适合的图像,将膜用考马斯蓝染色,以证实所有泳道中相当的载量。光密度测定应用AlphaEase软件(Alpha Innotech)进行。
成肌细胞分离:将两至三周龄的雄性C57/BL/6J pups用于本试验。将小鼠用CO2安乐死。然后将从踝关节至髋部的皮肤和筋膜去除,以暴露出下面的肌肉。将双腿的肌肉(腘旁腱、四头肌、胫骨前肌、趾长伸肌、腓肠肌和比目鱼肌)小心取下,设法去除任何腱和非肌肉组织。将剖分的肌肉置于含PBS的无菌10cm2平皿中,并且洗涤以除去毛发和其它残留物。然后将肌肉转移至无菌35cm2平皿中,并且加入1.5mL胶原酶/分散酶溶液,以消化组织。应用无菌一次性器皿将组织埋入适当平滑的浆中,随后在37℃下温育12分钟。然后应用5mL塑料吸管将它们捣碎,以匀化混合物。将温育和捣碎步骤再重复一次。
将消化的组织混合物用5mL吸管进一步捣碎15至20次,然后装入70μm滤器。将过滤的混合物以1000rpm离心5分钟。将细胞沉淀物重新悬浮于3mL生长培养基中并且置于60mm2非胶原包被的平皿上。将平皿在37℃下温育2至4小时,使得成纤维细胞贴壁,而大多数成肌细胞仍然在悬浮液中。然后将含有成肌细胞的上清液从非胶原包被的平皿中取出,并且种在胶原包被的平皿中。将细胞每天用生长培养基饲养,当单层细胞达到70%融合时将其分离,以富集和扩大成肌细胞。3至4周富集后获得相对纯的成肌细胞群。
实施例1:体外测定Shh-Ag对Shh信号传导的作用
为了测定Shh-Ag是否能够活化肌细胞中的Shh信号传导,已经很好建立的Shh-敏感细胞系TM3以及三种其它鼠肌细胞系:初级成肌细胞(PM)、商购的C2C12成肌细胞和分离的SC中的靶基因和下游功能基因(Gli1)的表达是通过定量PCR分析测量的。根据上面描述的方法和方案,将介质(DMSO)和Shh-Ag处理(10μM)的细胞中的Gli1基因表达进行比较,通过实时taqman分析测量并且归一化至GAPDH水平。
如图1所示,24小时的Shh-Ag处理(10μM)显著地增加了所有细胞系检查中的Gli1 mRNA水平(即在TM3细胞中超过40倍,并且在成肌细胞和肌管中分别超过20倍)。图1A显示在TM3细胞中为41.79±3.09;在PM细胞中为23.09±3.21;在C2C12细胞中为7.80±1.24;以及在SC中为8.14±2.01(分别是相对于归一化至GAPDH后等于1的介质的倍数改变)。尽管基线Gli1表达水平在分化的肌管中非常低(参见,例如图1C),但是该数据与其它细胞类型一致,其中Shh信号传导随着分化而降低,这意味着肌管保留对Shh活化响应的能力。Shh-Ag处理对商购可获得的C2C12细胞系也具有类似的作用。
在建立Shh-Ag处理可以诱导Shh信号传导后,Shh-Ag对细胞增殖的作用通过荧光活化细胞分选(FACS)分析来检验。Shh-Ag处理(10nM)诱导初级成肌细胞24小时后,碘化丙啶(PI)染色和FACS分析证实细胞周期G2/M期的细胞百分数增加(参见例如图1B;34.4±0.48对39.6±0.61)。然后,在Shh-Ag处理48小时后,评价分离的卫星细胞的促有丝分裂活性,并且发现SC数量显著增加,以及掺入增殖标志物BrdU的SC的百分数增加了两倍(参见例如图1C;分别为100±2.8对121±5.8和100±24.7对214±17.8)。
为了解释所观察到的Shh-Ag介导的对肌细胞增殖的作用的分子机理,检验了与磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt信号传导途径的可能的协同作用。经PI3K/Akt的胰岛素样生长因子I(IGF-1)信号传导是已知的骨骼肌促细胞分裂原,并且rShh-介导对肌细胞增殖的诱导已经显示出需要Akt活化(Elia,D.等人(2007)Biochim Biophys Acta 1773,1438-46)(Coolican,S.A.等人(1997)J Biol Chem 272,6653-62)。
Shh-Ag与IGF-1共同处理没有显著增加成肌细胞增殖,但是用LY294002(有效的PI3K/Akt信号传导途径抑制剂)处理完全封闭了细胞增殖(参见例如图2A)。LY294002处理还封闭了Shh-Ag和rShh-介导的Gli1蛋白质水平的诱导(参见例如图2B),进一步支持了Akt在调节下游Shh活化中的作用。细胞周期蛋白D1(确定的细胞周期调节剂和Gli转录靶标)也在Shh-Ag处理后显示出升高的蛋白质表达(参见例如图2A)。另外,观察到在成肌细胞和分离的SC中Shh-Ag处理后细胞周期蛋白D1 mRNA表达增加超过50%。这些结果与Shh和其它生长信号传导途径(例如表皮生长因子)协同性共刺激细胞周期蛋白D1的观察结果一致(Kasper,M.等人(2006)Mol Cell Biol 26,6283-98)。综合来看,这些结果证实了Shh-Ag处理是取决于诱导下游标靶和促进肌前体细胞增殖的PI3K/Akt信号传导途径。
实施例2:肌内注射Shh-Ag诱导体内卫星细胞增殖
Shh-Ag体内试验是通过直接肌内(IM)注射Shh-Ag至小鼠骨骼肌来进行的。将野生型(WT)或DMDMDX小鼠(肌营养不良模型)的胫骨前肌(TA)或腓肠肌(GA)注射20μL(TA)或40μL(GA)的介质(10% DMSO/PBS)或Shh-Ag(500μM),每天一次,连续注射两天。第二次IM注射后立即给小鼠腹膜内(IP)注射100μL的BrdU。BrdU注射后24小时,将小鼠处死并且收集它们的肌肉,并且制备用于FACS分析(GA)或免疫染色(TA)。为了免疫染色,将肌肉切片用抗-层粘连蛋白探测,以标记基底层,同时用抗-BrdU探测,以鉴定增殖的细胞,并且用苏木素染料处理,以染色所有的细胞核。
对于BrdU染色,当WT介质注射的肌肉切片是阴性时,Shh-Ag注射的肌肉显示出BrdU+前体细胞。有趣的是,当DMDMDX肌肉显示出高的BrdU+染色背景时,Shh-Ag注射似乎促进更高的单核细胞浸润。为了确定通过Shh-Ag处理刺激的固有增殖的细胞(BrdU+)是否真正是卫星细胞(SC),我们将切片对Pax7(转录因子并且是肌肉SC的标志物)进行染色。同样地,Pax7+SC正好位于WT和DMDMDX肌肉的边缘。如预期那样,连续再生的DMDMDX肌肉显示出大量的Pax7+SC和中央有核的肌纤维;但是,一些非特异性染色也出现在大量细胞损伤的区域。
由于核表达的Pax7/BrdU的共可视化是困难的,因此进行荧光共染色,以确定Shh-Ag处理的肌肉中BrdU+细胞是否真正是Pax7+SC。在WT介质注射的肌肉切片中,对于BrdU,所有表达Pax7的SC是阴性,而Pax7+/BrdU+双阳性细胞在WT Shh-Ag注射的肌肉中易于看到。在DMDMDX肌肉中,在正常未处理条件下,大多数SC是BrdU+,但是Shh-Ag处理极大地增加了Pax7-/BrdU+细胞的数量。综合来看,这些结果证实在WT肌肉中,Shh-Ag注射直接活化了SC增殖,但是在连续再生状态的DMDMDX肌肉中,表达Pax7的SC的增殖响应已经最大化。
由于DMDMDX肌肉的异常病理状态,研究了Shh-Ag处理对WT肌肉再生的作用,采用已经很好建立的心脏毒素诱导的损伤模型(Cooper,R.N.等人(1999)J Cell Sci 112,2895)(Meeson,A.P.等人(2004)Stem Cells 22,1305-20)。响应单个心脏毒素(ctx)损伤,发现Shh-Ag处理显著增加了再生早期BrdU+细胞的数量。另外,Pax7和BrdU的荧光共染色证实了与介质对照相比,在Shh-Ag处理的肌肉中更大百分比的表达PAx7的SC是Pax7+/BrdU+双阳性。
为了定量SC增殖的诱导,收集ctx-损伤的和Shh-Ag处理的肌肉样品(GA)并且进行FACS分析。基于CD45-和Syndecan4+表达,门控单细胞肌肉悬浮液,通常应用肌肉SC鉴定物,然后分析产生的群的细胞内BrdU定位(参见例如图4)。Shh-Ag处理仅适当地增加了肌肉样品中SC的总百分比,但是增加了超过两倍百分数的增殖的(BrdU+)SC((参见图3);对于总百分数:13.06±0.31对16.15±1.57,对于BrdU+百分数:4.82±0.33对10.67±1.87)。
为了确定该早期卫星细胞增殖的Shh-Ag活化是否导致肌肉再生的持续改善,将肌肉如上述那样处理并且在ctx-损伤后的较晚时间点(7天)分析。用抗-层粘连蛋白和BrdU共染色的纵向肌肉切片证实在Shh-Ag处理的肌肉中BrdU+、中央排列的细胞核增加(参见图3)。由于骨骼肌细胞核是有丝分裂后的,BrdU+肌细胞核表示增殖的前体,其最终与再生的肌纤维融合并且促成再生的肌纤维。BrdU+肌细胞核的增加清楚地证实了Shh-Ag处理后早期SC活化的功能影响。
Claims (11)
1.治疗肌骨骼障碍的方法,该方法包括给患者施用治疗有效量的Sonic Hedgehog(Shh)途径激动剂。
2.权利要求1的方法,其中所述的Shh激动剂包括式(I)化合物:
其中,由于化合价和稳定性允许,
Ar和Ar’独立地表示取代的或未取代的芳基或杂芳基环;
Y在每次出现时独立地是不存在或表示-N(R)-、-O-、-S-或-Se-;
X选自-C(=O)-、-C(=S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(=NCN)-、-P(=O)(OR)-、以及任选被1-2个基团例如低级烷基、链烯基或炔基取代的亚甲基;
M在每次出现时独立地表示取代的或未取代的亚甲基,例如-CH2-、-CHF-、-CHOH--CH(Me)-、-C(=O)-等,或者两个M一起表示取代的或未取代的乙烯或乙炔,其中Mj中某些或所有出现的M形成环状结构的全部或部分;
R在每次出现时独立地表示H或者取代的或未取代的芳基、杂环基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、炔基、链烯基或烷基,或者两个R一起可以例如与N形成4-至8-元环;
Cy’表示取代的或未取代的芳基、杂环基、杂芳基或环烷基,包括多环基团;
j在每次出现时独立地表示整数0至10、优选2至7;并且
i在每次出现时独立地表示整数0至5、优选0至2。
3.权利要求2的方法,其中所述的Shh激动剂是Shh-Ag。
4.权利要求1的方法,其中所述的肌骨骼障碍是肌营养不良。
5.权利要求1的方法,其中所述的肌骨骼障碍是肌病。
6.诊断肌骨骼障碍的方法,该方法包括给患者施用治疗有效量的Sonic Hedgehog(Shh)途径激动剂。
7.权利要求6的方法,其中所述的Shh激动剂包括式(I)化合物:
其中,由于化合价和稳定性允许,
Ar和Ar’独立地表示取代的或未取代的芳基或杂芳基环;
Y在每次出现时独立地是不存在或表示-N(R)-、-O-、-S-或-Se-;
X选自-C(=O)-、-C(=S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(=NCN)-、-P(=O)(OR)-、以及任选被1-2个基团例如低级烷基、链烯基或炔基取代的亚甲基;
M在每次出现时独立地表示取代的或未取代的亚甲基,例如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(=O)-等,或者两个M一起表示取代的或未取代的乙烯或乙炔,其中Mj中某些或所有出现的M形成环状结构的全部或部分;
R在每次出现时独立地表示H或者取代的或未取代的芳基、杂环基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、炔基、链烯基或烷基,或者两个R一起可以例如与N形成4-至8-元环;
Cy’表示取代的或未取代的芳基、杂环基、杂芳基或环烷基,包括多环基团;
j在每次出现时独立地表示整数0至10、优选2至7;并且
i在每次出现时独立地表示整数0至5、优选0至2。
8.权利要求7的方法,其中所述的Shh激动剂是Shh-Ag。
9.权利要求6的方法,其中所述的肌骨骼障碍是肌营养不良。
10.权利要求6的方法,其中所述的肌骨骼障碍是肌病。
11.测定试验药物是否增加初级成肌细胞增殖的方法,该方法包括(i)将已知上调Sonic Hedgehog(Shh)途径的试验药物施用于非人类个体;和(ii)测定个体产生的初级成肌细胞增殖是否大于未施用药物的个体,从而测定药物是否增加初级成肌细胞增殖。
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