CN101928672A

CN101928672A - 层出镰刀菌

Info

Publication number: CN101928672A
Application number: CN 201010216221
Authority: CN
Inventors: 王兴红; 杨玲玲
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2010-07-02
Filing date: 2010-07-02
Publication date: 2010-12-29

Abstract

本发明涉及一种能诱导龙血树产生血竭的真菌。本发明中所述的真菌命名为层出镰刀菌(Fusarium prolifertum YIM-71213)，该菌株已在国家知识产权局专利局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2010年5月16日，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010085。将本发明、本发明的菌丝体以及菌丝体的提取物放置于龙血树的新鲜伤口处，可以诱导龙血树的木质部分和龙血树的树叶产生血竭。和未接种本发明的对照组相比，最高可使龙血树增加血竭产量7倍。

Description

层出镰刀菌

所属技术领域：本发明属于生物制药领域，涉及一种能够诱导龙血树产生血竭的真菌。

技术背景

血竭(Dragon’s blood或Resina Draconis)是一种传统名贵中药，有活血化瘀、镇痛止血、消炎抗菌等功效，在我国有悠久的用药历史，但历来依靠进口。在自然状态下，龙血树树干木质部在受到损伤后，植物会产生防御反应，形成防御性物质来抵抗微生物侵染，这种防御性物质经提取后就是药用血竭。1972年我国医药工作者在云南、广西等地发现了能产生血竭的剑叶龙血树[Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen]。1999年国家药品监督管理局颁布的国家标准中(WS3-082(Z-016)-99(Z))，血竭以一类新药材收载。随着需求的增长，野生龙血树资源遭到了严重破坏。龙血树生长极为缓慢，几十年树龄的树干才能用于血竭生产，而且血竭产量很低。通过人工繁殖龙血树，再用微生物来诱导龙血树高效产生血竭的办法是解决血竭药源问题最重要的途径。现在已经有多家企业在规模化种植龙血树，但尚未有高效的、可供产业化应用的诱导龙血树产生血竭的技术。

在诱导龙血树产生血竭方面，刘宝等人申请了《一种快速获得龙血竭原料的方法(CN101138305A)》的专利，介绍了一种通过割伤龙血树使龙血树产生血竭的方法。杨本鹏等人申请了《一种人工栽培龙血树诱导生产血竭的方法(CN101032207A)》的专利，其主要原理是在龙血树的伤口上施用植物激素来促进血竭的分泌。在伤口上接种微生物，也可以刺激龙血树产生较多的血竭，王兴红等人发表了相关的研究论文(王兴红，江东福，马萍等，真菌与龙血树血竭形成关系的初步研究，中国青年科学技术论文精选，中国科学技术出版社，1994，11，500-503；江东福，马萍，王兴红等，龙血树真菌群及其对血竭形成的影响，1995，云南植物研究，17(1)：79-82。)；宋启示等人据此原理也申请了《一种田间人工诱导生产龙血竭的方法(CN1817105A)》、《一种龙血竭人工诱导剂及其制备方法(CN1821387A)》、《一种龙血竭的人工培育方法(CN1821388A)》的专利。杨本鹏等人还提出了利用组织培养方法生产血竭的专利申请《运用龙血树组织培养生产血竭的方法(CN1316876C)》。针对利用龙血树树叶诱导产脂问题，王兴红提出了《一种碱处理龙血树活叶片诱导血竭产生的方法(200810233619.1)》、《一种真菌诱导龙血树活叶片产生血竭的方法(200910094565.X)》的专利申请。但这些专利申请中，并未涉及到用层出镰刀菌诱导龙血树产生血竭方法，而且这些专利中涉及到的方法或诱导菌株在诱导龙血树产生血竭时，其产量增加一般仅在1倍左右，诱导效果不够理想。本发明涉及到一种能够高效诱导龙血树产生血竭的新菌株-层出镰刀菌，根据已有的实验数据，和未接种本发明的对照组相比，使用本发明最高可以诱导龙血树多增加血竭产量7倍。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够高效诱导龙血树产生血竭的微生物——层出镰刀菌。

本发明所述的真菌命名为层出镰刀菌(Fusarium proliferatum YIM 71213)，保藏编号为CCTCC NO：M2010085。

本发明所述的层出镰刀菌系从我国云南西双版纳采集的龙血树上分离得到。现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位(保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2010年4月16日，保藏编号为CCTCC NO：M2010085。

本发明所述的层出镰刀菌在大多数培养基上生长良好，在PDA培养基上，菌落生长迅速，产生白色气生菌丝，气生菌丝致密、纤细，毡状。气生菌丝为白色、淡紫色、紫色，基内菌丝由无色变为深紫色。无大型分生孢子；在单生瓶状小梗上产生大量小型分生孢子，一般为卵形，一到三隔，呈假头状或链状排列；无厚垣孢子。培养温度：20-28℃。本发明的系统发育关系见图3。本发明的部分ITS序列如下：

TAGAGGAAGT AAAAGTCGTA ACAAGGTCTC CGTTGGTGAA CCAGCGGAGG GATCATTACC

GAGTTTACAA CTCCCAAACC CCTGTGAACA TACCAATTGT TGCCTCGGCG GATCAGCCCG

CTCCCGGTAA AACGGGACGG CCCGCCAGAG GACCCCTAAA CTCTGTTTCT ATATGTAACT

TCTGAGTAAA ACCATAAATA AATCAAAACT TTCAACAACG GATCTCTTGG TTCTGGCATC

GATGAAGAAC GCAGCAAAAT GCGATAAGTA ATGTGAATTG CAGAATTCAG TGAATCATCG

AATCTTTGAA CGCACATTGC GCCCGCCAGT ATTCTGGCGG GCATGCCTGT TCGAGCGTCA

TTTCAACCCT CAAGCCCCCG GGTTTGGTGT TGGGGATCGG CAAGCCCTTG CGGCAAGCCG

GCCCCGAAAT CTAGTGGCGG TCTCGCTGCA GCTTCCATTG CGTAGTAGTA AAACCCTCGC

AACTGGTACG CGGCGCGGCC AAGCCGTTAA ACCCCCAACT TCTGAATGTT GACCTCGGAT

CAGTA

本发明诱导龙血树产生血竭的一般工艺流程为：

一、按常规的真菌培养方法配制固体或液体马铃薯培养基并接种层出镰刀菌(Fusarium proliferatum YIM 71213)。二、在龙血树的树干或根的部位，用人工方法剥去外层树皮，露出白色木质部，将培养好的真菌菌丝连同固体培养基可直接接种于龙血树的木质部；或者将由液体发酵产生的菌丝体从发酵液中滤出后，直接接种于龙血树的木质部；或将菌丝体用水提取后，其水提取物经浓缩后放置于龙血树的木质部；三、在龙血树的活叶片上使用本发明的方法是，用培养好的本发明固体菌种或液体培养基中的菌丝体直接放置于龙血树的活叶片上，叶片也可以预先用针损伤以增强诱导效果。四、用塑料布包裹龙血树的接种部位进行保湿；四；诱导龙血树2-3周后，血竭形成；五、收获产生血竭的部位，干燥后用乙醇或甲醇提取，提取物经干燥后即得血竭。本发明要解决的技术问题是利用本发明诱导龙血树产生血竭的特性，高效诱导龙血树产生血竭，解决龙血树资源的可持续利用问题。

本发明所述的龙血树，包括整个龙血树属(Dracaena)可以用来产生血竭的所有植物，如剑叶龙血树[Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen]，索科特拉龙血树[Dracaena cmnabari Balf.f.]，龙血树[Dracaena draco L.]，阿拉伯龙血树[Dracaena schizantha]，小花龙血树或海南龙血树[Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep]，岩棕[Dracaena loureiri]等植物。

本发明所述的龙血树，是指有生命力的活的龙血树，只有龙血树在生活状态时，才会形成血竭，即血竭的形成是一个活细胞对损伤的反应。

本发明所述的损伤，是在龙血树树干或根上打孔，因为龙血树的树皮不是血竭形成的部位，真菌无法穿透龙血树厚厚的树皮。在龙血树的叶上，可以用针刺的办法损伤龙血树。

本发明所述的固体培养基，可以是马铃薯琼脂平板培养基，也可以是其它植物材料的固体培养基，配制后经灭菌、接种、培养而成。

本发明所述的用塑料包裹龙血树的接种部位，主要目的是保持真菌培养物的湿度，延缓培养基的干燥速度，以利于微生物能生长更长的时间。若不保湿，菌体在空气中很快就会因为干掉而死亡，从而使菌体失去侵染诱导作用。

本发明要解决的技术问题是：一种新的诱导龙血树产生血竭的诱导菌株，具有比现有报道的诱导方法更好的诱导效果。

有益效果是：有利于提高珍贵龙血树的利用率，提高人工种植龙血树生产血竭的经济效益，使人工种植龙血树来生产血竭具有经济可行性。

本发明所述的镰刀菌命名为层出镰刀菌，已于2010年4月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位简称：CCTCC，保藏编号为M2010085，保藏单位地址：武汉珞珈山，武汉大学内，邮政编码430072。

附图说明

附图1.菌株的假头状小型分生孢子

附图2.菌株链状的小型分生孢子

附图3.本发明和其它同属近缘种的系统发育关系

具体实施方式：

1、按常规方法配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基，按常规方法灭菌30分钟后，冷却，接种层出镰刀菌菌株(Fusarium proliferatum YIM-71213)，培养5天后，本发明长满培养基，将生长好的真菌接种于损伤后的树干上，并用塑料布包裹真菌培养物和树干，3周后出现红色血竭，继续培养叶片2个月，割取产脂部位，含脂部位经干燥后，用甲醇提取，经旋转蒸发干燥后即得红色血竭。

2、配制麦麸培养基，按麦麸重量百分比110％的比例加入洁净的清水，1个大气压灭菌1个小时后，冷却，接种本发明(Fusarium proliferatum YIM-71213)，28℃培养一周，直接放置于叶片的较嫩部位，2-3周后叶片形成血竭，待2-3个月后，割取含脂叶片，去掉叶片未产生血竭的绿色部分，保留红色含脂部分，干燥后用95％的乙醇提取，提取物经干燥后即得血竭。

Claims

1.一种层出镰刀菌，其特征在于命名为层出镰刀菌(Fusariumproliferatum YIM71213)，现在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2010年4月16日，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010085。

2.根据权利要求1所述的层出镰刀菌及其菌丝体、以及从菌丝体中提取的水溶性成分，可以诱导龙血树属植物的木质部或叶片产生血竭。