CN101923069A

CN101923069A - 一种判别不同产地中华绒螯蟹的方法

Info

Publication number: CN101923069A
Application number: CN2010102201543A
Authority: CN
Inventors: 杨健; 刘洪波; 徐跑
Original assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2010-06-28
Filing date: 2010-06-28
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2030-06-28
Also published as: CN101923069B

Abstract

本发明涉及一种判别不同产地中华绒螯蟹的方法，特征是：捕捞不同水域的中华绒螯蟹，放入冰箱内保存；解冻后取蟹背甲左侧的第三步足作元素分析，于干燥箱中烘至恒重；将干样用玛瑙研钵研磨使其均一化，置于干燥器室温中；称取干样装入消解管，消解管中加入浓硝酸消解；将上述消解好的样本转移至定量瓶中，再用纯水定容为待测溶液；测定待测溶液中微量元素的浓度值，并计算出中华绒螯蟹第三步足干样中的相应浓度值。本发明的分析方法可靠，精度良好；能有效地区别了分别产自江苏阳澄湖、涌湖、长荡湖和江西军山湖的中华绒螯蟹群体，并建立了各地域中华绒螯蟹特有的微量元素地理“指纹”库和判别函数方程。

Description

一种判别不同产地中华绒螯蟹的方法

技术领域

本发明涉及一种不同产地中华绒螯蟹体内多种微量元素的判别方法，能较为系统而快速地建立不同水域产中华绒螯蟹体内多种微量元素的积累特性及其地理环境特征；利用这些特性可以较有效地快速判别来自于不同产地的中华绒螯蟹资源群体等内容，属于生物监测环境技术领域。

背景技术

“原产地”是指某商品来源于某地区，且该商品的特定质量、信誉或者其他特征主要由该地区的自然因素或人文因素所决定。对于水产品来说，一个水域的地理环境和自然环境条件必然决定了这个水域所生产的水产品具备特有的质量与品味。随着人们生活水平的提高，消费者对名特优新水产品的需求急剧增加，而来自于原产地水产品种的市场价值(如知名度、质量、附加值、安全性)远远高于同类其它产品，因此，市场上冒用知名品种的名称、产地或混入类似品种的现象频频发生。这不仅使原产地水产品生产单位利益受损，也误导了消费者，使消费者的权益受到严重的侵害。因此，加强对水产品原产地快速判定的开发研究是水产品质量安全建设的源头保障。相关技术的应用可保障加工企业、消费者获得产品的真实信息，是市场准入的基础。同时，水产品原产地品牌建设不仅有利于增强区域水产品的竞争力，有利于促进区域内的产业集群发展，也有利于该区域其它相关产业的发展。

原产地保护在国际上也受到了空前的关注。在美国和欧洲国家，农产品地理标志已成为各地特色经济的一张特色品牌。日本于2000年率先颁布了农业标准法规即《农林产品统一及正确标签法》，该法明确规定生鲜农林产品必须正确标注产品名称、产地、进口产品特别要标注原产国等，否则将被视为违法。该法规的颁布极大地推动了日本在快速判别农林产品类别及原产地方面的技术研究。可惜的是，我国渔业科技界相关技术尚属空白。

河蟹因味鲜价高是近年来我国水产养殖的主要热点之一。江苏省河蟹养殖面积610万亩，位居全国第一。在生鲜水产品中，能够形成较完善的、以原产地保护为品牌标识的养殖种类还不多，而河蟹却是个例外。江苏阳澄湖产大闸蟹早已声名远播，享誉海内外。250克单只“阳澄湖”牌公蟹售价达150元，是普通蟹的30倍。在巨大经济利益的驱动下，市场上假冒该品牌的名称、产地或混装的现象屡有发生，使消费者的利益蒙受了巨大损失。目前中华绒螯蟹的判别研究主要是形态、分子生物技术等。通过形态判别，可将中华绒螯蟹与日本绒螯蟹两个亚种区分开，长江水系与辽河水系可区分。但不同产地的中华绒螯蟹形态差异较小，形态数据测量很难将它们区分开。应用RAPD、微卫星、线粒体基因等分子生物学技术，鉴定不同水域中华绒螯蟹。不同水系中华绒螯蟹的基因多态性位点并不明显，因而并不能将其区分开。俗话说一方水土养一方蟹，影响蟹体内微量元素富积的关键因素是其在水体和地质环境中的背景值。这些背景值的差异将导致采自不同地点的蟹体其来自生境的十数到几十种微量元素浓度高低和分布类型(即“指纹”)各异。这就为区别其原产地提供了可能。因此，如果能利用微量元素的环境“指纹”开发出一种快速鉴别不同水域原产河蟹的方法，无疑将为保护原产地大闸蟹，提供给消费者最优质水产品提供保障和服务。

发明内容

本发明的目的在于克服形态测量、分子生物技术等方法的不足之处，提供一种新的不同产地中华绒螯蟹体内多种微量元素的判别方法，利用电感耦合等离子质谱仪测定不同产地中华绒螯蟹中多种微量元素的浓度及其高低分布类型，并将这些浓度及类型值归纳出产地的微量元素地理“指纹”特征，并利用这些特征来进行原产地判别；该方法所取得的结果稳定性好，可重复性高、系统误差小，可判别性强，不仅克服了目视、遗传学等方法无法判别的局限，而且显示出了其快速的优势。

按照本发明提供的技术方案，一种判别不同产地中华绒螯蟹的方法，采用以下工艺步骤：

1、野外采集捕捞不同水域的中华绒螯蟹，立刻放入清洁的塑料自封袋中并在0～4℃保存，在此温度条件下尽快运回实验室保存；

2、中华绒螯蟹样本前处理方法：

(1)、野外采集并运回实验室保存采集的中华绒螯蟹个体整体标本转移于-18～-20℃冰箱内保存，待用；

(2)、取出中华绒螯蟹标本解冻后统一取蟹背甲左侧的第三步足作元素分析，用纯水冲洗6～8遍，于80℃～100℃的干燥箱中烘24～26h至恒重为中华绒螯蟹第三步足干样；将中华绒螯蟹第三步足干样用玛瑙研钵将干燥后的组织研磨使其均一化，置于干燥器(室温)中待用；

(3)、称取0.1～0.2g中华绒螯蟹第三步足干样装入特氟纶(Teflon)消解管，每个消解管中加入1.0～2.0ml浓硝酸，浓硝酸百分浓度为63.02％(MOS级，国药集团化学试剂有限公司，金属离子含量≤0.0002％)，再用意大利Milestone ETHOS A T260型微波消解仪消解35～45min。

(4)、消解好的样本小心转移至定量瓶中，再用纯水定容至200～400mL为待测溶液，纯水出水的水质为电阻率18.2MΩ.cm。

3、采用电感耦合等离子质谱仪测定待测溶液中微量元素的浓度值，并计算出中华绒螯蟹第三步足干样中的相应浓度值；

将待测溶液导入电感耦合等离子质谱仪进行浓度测定；同时测定待测溶液中的钠、镁、铝、钾、钙、锰、铁、铜、锌、锶、钡和铊的浓度；用元素标准添加回收法确定上述各种元素的回收率；用判别线形函数值区别各水域中华绒螯蟹。

所述的电感耦合等离子质谱仪测定时所设定的状态：氦气模式(氦气流速为4.5mL/min)，等离子气、载气和补气流速分别为15、0.8、0.26L/min。

所述的微量元素为钠、镁、铝、钾、钙、锰、铁、铜、锌、锶、钡和铊。

所述微量元素的含量即钠、镁、铝、钾、钙、锰、铁、铜、锌、锶、钡和铊的浓度值见附表。

根据测定后微量元素的浓度值，建立判别函数方程，通过求解判别函数值(Z)，可以判别中华绒螯蟹属于哪个水域。

本发明与已有技术相比具有以下优点：

本发明选用江苏省阳澄湖、滆湖、长荡湖和江西省军山湖等湖区产中华绒螯蟹第三步足作为判别对象，前处理方法比较简单，经标准化的前处理方法获得中华绒螯蟹第三步足待测溶液后，可以运用大型精密分析仪器电感耦合等离子质谱仪(美国Agilent7500ce型)，快速而精确地同时测定其中多种微量元素浓度，可较为快速地了解不同产地中华绒螯蟹的微量元素浓度的高低“指纹”、组分特点、地理特征并建立基于上述数据而建立不同产地中华绒螯蟹的判别公式。该方法所取得的结果稳定性好，可重复性高、系统误差小，可判别性强，不仅克服了目视、遗传学等方法无法判别的局限，而且对取样对象不会造成致命伤害，并有快速检测、精确判定的优势。

本发明的可靠性和精度用元素标准添加回收法来确认，回收率为93.51％～116.45％。证明分析方法可靠，精度良好。利用钠、镁、铝、钾、钙、锰、铁、铜、锌、锶、钡和铊的浓度水平和高低分布“指纹”以及差异，有效地区别了分别产自阳澄湖、滆湖、长荡湖和军山湖的中华绒螯蟹群体，并建立了各地域中华绒螯蟹特有的微量元素地理“指纹”库和判别函数方程。

具体实施方式：

下面本发明将结合实施例作进一步描述：

实施例一：本发明一种判别不同产地中华绒螯蟹的方法，采用以下工艺步骤：

阳澄湖、滆湖的中华绒螯蟹样本(各6只)采自于2008年12月，均在0～4℃条件下保存。

样本先测量体长、体重等生物学数据。然后放于-20℃冰箱内保存随用。解冻后取第三步足用超纯水(美国密理博公司，Milliprore-Simplicity个人型超纯水系统，出水电阻率18.2MΩ.cm)冲洗6遍，于80℃的干燥箱中烘24h至恒重；将第三步足干样研磨成粉末均一化(即制成粉末状干样)，置于干燥器(室温)中待用(可随用)。

精称粉末状每个中华绒螯蟹第三步足干样0.1g装入特氟纶(Teflon)消解管，每个消解管中加入10mL浓硝酸，浓硝酸百分浓度为63.02％(MOS级，国药集团化学试剂有限公司，金属离子含量≤0.0002％)，再用意大利Milestone ETHOS A T260型微波消解仪消解35min。消解好的样本小心转移至定量瓶中，再用超纯水定容至200mL为待测溶液，超纯水出水的水质为电阻率18.2MΩ.cm。

采用电感耦合等离子质谱仪(美国安捷伦公司，Agilent ICP-MS 7500ce型)测定指示中华绒螯蟹第三步足干样中微量元素的含量和检验监测效果。在氦气(纯度99.999％)模式下，将待测溶液导入电感耦合等离子质谱仪(燃气氩气的纯度99.999％)进行浓度测定。测定时仪器所设定的状态：氦气模式(氦气流速为4.5mL/min)，等离子气、载气和补气流速分别为15、0.8、0.26L/min；同时测定待测溶液中的钙、钠、镁、钾、铁、锶、钡、锌、锰、铝、铜和铊的浓度；用元素标准添加回收法确定上述各种元素的回收率。有效测得阳澄湖和滆湖中华绒螯蟹第三步足样本中钠、镁、铝、钾、钙、锰、铁、铜、锌、锶、钡和铊的水平。两水域中华绒螯蟹上述元素浓度高低分布“指纹”有显著的地理差异。根据这些地理差异特征，建立了两水域中华绒螯蟹种群微量元素“指纹”的判别线形函数。

阳澄湖：Y_YC＝-0.063C_Na+0.085C_Mg+4.532C_Al+0.394C_K+0.024C_Ca+1.658C_Mn+0.031C_Fe+5.701C_Cu+5.235C_Zn+0.371C_Sr-2.416C_Ba-109.575C_Tl-3120.162，滆湖：Y_GH＝-0.058C_Na+0.081C_Mg+3.696 C_Al+0.382C_K+0.021C_Ca+1.522C_Mn+0.098C_Fe+5.709C_Cu+4.958C_Zn+0.41C_Sr-2.182C_Ba-75.137C_Tl-2931.212；C_Na，C_Mg，C_Al，C_K，C_Ca，C_Mn，C_Fe，C_Cu，C_Zn，C_Sr，C_Ba，C_Tl中C代表干重浓度值，下标字母分别表示元素钠、镁、铝、钾、钙、锰、铁、铜、锌、锶、钡和铊(下同)。利用本发明所获得数据可以较客观地区别阳澄湖和非阳澄湖不同产地的中华绒螯蟹，判别准确率达100％，判别效果良好。

实施例二：本发明一种判别不同产地中华绒螯蟹的方法，采用以下工艺步骤：

阳澄湖、长荡湖的中华绒螯蟹样本(各6只)采自于2008年12月，均在0～4℃条件下保存。

样本先测量体长、体重等生物学数据。然后放于-18℃冰箱内保存随用。解冻后取第三步足用超纯水(美国密理博公司，Milliprore-Simplicity个人型超纯水系统，出水电阻率18.2MΩ.cm)冲洗7遍，在90℃的干燥箱中烘25h至恒重；将第三步足干样研磨成粉末均一化(即制成粉末状干样)，置于干燥器(室温)中待用(可随用)。

精称粉末状每个中华绒螯蟹第三步足干样0.15g装入特氟纶(Teflon)消解管，每个消解管中加入15mL浓硝酸，浓硝酸百分浓度为63.02％(MOS级，国药集团化学试剂有限公司，金属离子含量≤0.0002％)，再用意大利Milestone ETHOS A T260型微波消解仪消解40min。消解好的样本小心转移至定量瓶中，再用超纯水定容至300mL为待测溶液，超纯水出水的水质为电阻率18.2MΩ.cm。

采用实施例一的电感耦合等离子质谱仪(美国安捷伦公司，Agilent ICP-MS 7500ce型)有效测得阳澄湖和长荡湖中华绒螯蟹第三步足干样中钠、镁、铝、钾、钙、锰、铁、铜、锌、锶、钡和铊的水平。两水域中华绒螯蟹上述元素浓度高低分布“指纹”有显著的地理差异。根据这些地理差异特征，建立了两水域中华绒螯蟹种群的微量元素“指纹”的判别函数。

阳澄湖：Y_YC＝-0.063C_Na+0.085C_Mg+4.532C_Al+0.394C_K+0.024C_Ca+1.658C_Mn+0.031C_Fe+5.701C_Cu+5.235C_Zn+0.371C_Sr-2.416C_Ba-109.575C_Tl-3120.162，长荡湖：Y_GH＝-0.025C_Na+0.073C_Mg+3.127C_Al+0.317C_K+0.022C_Ca+2.377C_Mn-0.125C_Fe+5.581C_Cu+6.989C_Zn+0.245C_Sr-2.302C_Ba+65.599C_Tl-2956.434；同样证明了利用本发明所获得数据可以较客观地区别不同产地的中华绒螯蟹，判别准确率达100％，判别效果良好。

实施例三：本发明一种判别不同产地中华绒螯蟹的方法，采用以下工艺步骤：

阳澄湖的中华绒螯蟹样本(6只)采自于2008年12月，江西省军山湖的中华绒螯蟹样本(6只)采自于2009年11月，均在0～4℃条件下保存。

样本先测量体长、体重等生物学数据。然后放于-18℃冰箱内保存随用。解冻后取第三步足用超纯水(美国密理博公司，Milliprore-Simplicity个人型超纯水系统，出水电阻率18.2MΩ.cm)冲洗8遍，在100℃的干燥箱中烘26h至恒重；将第三步足干样研磨成粉末均一化(即制成粉末状干样)，置于干燥器(室温)中待用(可随用)。

精称粉末状每个中华绒螯蟹第三步足干样0.2g装入特氟纶(Teflon)消解管，每个消解管中加入20mL浓硝酸，浓硝酸百分浓度为63.02％(MOS级，国药集团化学试剂有限公司，金属离子含量≤0.0002％)，再用意大利Milestone ETHOS A T260型微波消解仪消解45min。消解好的样本小心转移至定量瓶中，再用超纯水定容至400mL为待测溶液，超纯水出水的水质为电阻率18.2MΩ.cm。

采用实施例一的的样本前处理及测试步骤，用电感耦合等离子质谱仪(美国安捷伦公司，Agilent ICP-MS 7500ce型)有效测得阳澄湖和军山湖中华绒螯蟹第三步足干样中钠、镁、铝、钾、钙、锰、铁、铜、锌、锶、钡和铊的水平。两水域中华绒螯蟹上述元素浓度高低分布“指纹”有显著的地理差异。根据这些地理差异特征，建立了两水域中华绒螯蟹种群的微量元素“指纹”的判别函数。

阳澄湖：Y_YC＝-0.063C_Na+0.085C_Mg+4.532C_Al+0.394C_K+0.024C_Ca+1.658C_Mn+0.031C_Fe+5.701C_Cu+5.235C_Zn+0.371C_Sr-2.416C_Ba-109.575C_Tl-3120.162，军山湖：Y_GH＝-0.045C_Na+0.087C_Mg+4.465C_Al+0.326C_K+0.025C_Ca+2.124C_Mn-0.224C_Fe+6.107C_Cu+6.649C_Zn-0.272C_Sr-1.843C_Ba-30.452C_Tl-2962.351；同样证明了利用本发明所获得数据可以较客观地区别不同产地的中华绒螯蟹，判别准确率达100％，判别效果良好。

Claims

1.一种判别不同产地中华绒螯蟹的方法，其特征是：采用以下工艺步骤：

(1)、野外采集捕捞不同水域的中华绒螯蟹，立刻放入清洁的塑料自封袋中并在0～4℃保存，在此温度条件下尽快运回实验室保存中华绒螯蟹个体整体标；

(2)、中华绒螯蟹样本前处理方法：

(a)、野外采集并运回实验室保存采集的中华绒螯蟹个体整体标本转移于-18～-20℃冰箱内保存，待用；

(b)、取出中华绒螯蟹标本解冻后统一取蟹背甲左侧的第三步足作元素分析，用纯水冲洗6～8遍，于80℃～100℃的干燥箱中烘24～26h至恒重为中华绒螯蟹第三步足干样；将中华绒螯蟹第三步足干样用玛瑙研钵将干燥后的组织研磨使其均一化，置于干燥器中待用；

(c)、称取0.1～0.2g中华绒螯蟹第三步足干样装入特氟纶消解管，每个消解管中加入1.0～2.0ml浓硝酸，浓硝酸百分浓度为63.02％，再用微波消解仪消解35～45min；

(d)、消解好的样本转移至定量瓶中，再用纯水定容至200～400mL为待测溶液，纯水出水的水质为电阻率18.2MΩ.cm；

(3)、采用电感耦合等离子质谱仪测定待测溶液中微量元素的浓度值，并计算出中华绒螯蟹第三步足干样中的相应浓度值；

将待测溶液导入电感耦合等离子质谱仪进行浓度测定；同时测定待测溶液中的钠、镁、铝、钾、钙、锰、铁、铜、锌、锶、钡和铊的微量元素浓度；用元素标准添加回收法确定上述各种元素的回收率；用判别线形函数值区别各水域中华绒螯蟹；

根据测定后微量元素的浓度值，建立判别函数方程，通过求解判别函数值(Z)，判别中华绒螯蟹属于哪个水域。

2.如权利要求1所述的一种判别不同产地中华绒螯蟹的方法，其特征是：所述的电感耦合等离子质谱仪测定时所设定的状态，氦气模式：氦气流速为：4.5mL/min，等离子气流速为：15L/min；载气流速为：0.8L/min；补气流速为：0.26L/min。

3.如权利要求1所述的一种判别不同产地中华绒螯蟹的方法，其特征是：所述的微量元素为钠、镁、铝、钾、钙、锰、铁、铜、锌、锶、钡和铊。