CN101921787A - 日本血吸虫腺苷脱氨酶基因、其编码蛋白及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种日本血吸虫腺苷脱氨酶基因及其编码蛋白，日本血吸虫腺苷脱氨酶基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；日本血吸虫腺苷脱氨酶，具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由这些蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。此外，本发明还公开了该日本血吸虫腺苷脱氨酶基因及其编码蛋白的用途，本发明的日本血吸虫腺苷脱氨酶可应用于制备血吸虫疫苗、筛选药物、制备抗血吸虫抗体及血清学诊断方面，日本血吸虫腺苷脱氨酶基因可应用于基因治疗方面。

Description

日本血吸虫腺苷脱氨酶基因、其编码蛋白及应用

技术领域

本发明涉及生物基因领域，具体地涉及一种日本血吸虫腺苷脱氨酶基因、其编码蛋白及应用。

背景技术

血吸虫病由血吸虫的感染引起，在世界上有76个国家，受感染者约1.5亿。致病的血吸虫有3种，既日本血吸虫(Schistosoma japonicum)，曼氏血吸虫(S.mansoni)和埃及血吸虫(S.haematobium)。在我国流行的是日本血吸虫。血吸虫病的流行给人民身体健康和经济发展都造成巨大的损失，因此，防治血吸虫病、开发研制血吸虫临床诊断试剂和抗血吸虫的药物具有巨大的社会和经济效益。

日本血吸虫作为寄生虫能在人体和动物体内存在很多年而不被宿主的免疫机制杀死，与它的免疫逃避能力有关。其免疫逃避机制有抗原模拟、抗原伪装和免疫调节。其中免疫调节指的是血吸虫的蛋白能够调节、干扰(主要是抑制)宿主的免疫系统，使其不能发挥正常的免疫攻击效能，从而有利于血吸虫的生存。

血吸虫的排泄/分泌抗原(Excretory/Secretory protein，ESP)就是一类可以发挥免疫调节作用的蛋白质。这些蛋白来自血吸虫的表皮和肠道上皮，或者是特化的排泄/分泌器官。血吸虫各个虫期都产生这类蛋白。ESP是潜在药物靶点和疫苗分子，因为抑制这些蛋白可以干扰血吸虫的免疫逃避机制从而增强宿主的免疫杀灭功能；ESP是潜在的诊断分子，因为这些蛋白游离于宿主的血液中，可以很方便地用现有手段检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种日本血吸虫腺苷脱氨酶基因。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种日本血吸虫腺苷脱氨酶基因的编码蛋白。

本发明要解决的技术问题之三是提供上述种日本血吸虫腺苷脱氨酶基因及编码蛋白的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一方面，提供了一种日本血吸虫腺苷脱氨酶基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

所述的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.2所示序列的蛋白。

在本发明的另一方面，提供了一种日本血吸虫腺苷脱氨酶，具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。

本发明利用蛋白质组学手段，通过直接分析感染动物(兔子)的血液，发现日本血吸虫的腺苷脱氨酶蛋白(Adenosine deaminase，Accession number：AY812940.1)在宿主血液中也存在，是其ESP的成分之一，表明该蛋白可能在血吸虫的免疫调节、免疫逃避方面发挥重要作用；这也使它成为很好的诊断标记分子。这是国际上首次发现腺苷脱氨酶出现在日本血吸虫的ESP中。

在本发明的另一方面，提供了日本血吸虫腺苷脱氨酶的用途，包括：作为免疫原，可应用于制备血吸虫疫苗；作为潜在的药物作用靶点，应用于筛选化学和其他种类药物；作为特异性血吸虫抗原，应用于制备抗血吸虫抗体；日本血吸虫腺苷脱氨酶还可应用于血清学诊断方面；日本血吸虫腺苷脱氨酶基因，可应用于基因治疗方面。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一、方法：

1、感染动物，制备感染血清

在血吸虫流行区中收集自然感染的阳性湖北钉螺(Oncomelania hupensis hupensis)，将钉螺浸入水中，加以光照，收集浮在水面上的尾蚴。新西兰大白兔剃去腹部的毛，露出皮肤；取日本血吸虫1000条尾蚴，经裸露的兔子皮肤感染兔子。收集感染后第42天的动物血液，制备血清。

2、感染动物血清蛋白的提取

用6倍体积的冷丙酮加入到血清中，沉淀血清中的蛋白，离心收集蛋白沉淀(5000rpm，5分钟)，溶解沉淀用50mM Tris-HCl(pH 8.3)，5mM EDTA，1mM phenylmethyl sulfonylfluoride(苯甲基磺酰氟化物，PMSF)，0.5％sodium dodecyl sulfate(十二烷基硫酸钠，SDS)，0.5mM二硫苏糖醇(DTT)，0.5％SDS，利用超声波促进蛋白溶解。

3、血清蛋白的酶解过程：

血清蛋白混合物加入终浓度10mM DTT，室温反应30分钟，再加入终浓度55mM的碘乙酰氨置暗处反应15分钟，用去离子水稀释5-10倍，按1∶50的体积比例加入修饰的测序级牛胰酶，37℃酶解过夜。

4、血清蛋白酶解肽段混合物用强阳离子交换柱(Strong Cation Exchange，SCX)进行分级：

SCX柱的平衡和清洁：SCX柱在每次使用前，先用高盐溶液(500mM/25％ACN，pH 3.0)过柱，然后用(H2O/25％ACN，pH 3.0)平衡。清洗柱则用高盐溶液。

酶解后的肽段样品用SCX平衡溶液(水，30％乙腈pH3.0)稀释，预先配制好不同浓度的NH₄HCO₃盐溶液(10mM～500mM)，用注射器将样品推过SCX色谱柱(4.0mm×150mm POROS 50HS column(Sciex-Applied Biosystems))，再依次用配好的盐溶液，按照浓度从低到高的顺序，洗脱SCX柱上结合的肽段，分别收集各个洗脱的组分，用真空浓缩仪将溶液体积抽减20-30μl左右。

5、质谱鉴定

每个组分的肽混合物上样到一个反相捕获柱(C18，5μm，

300μm i.d×5mm，LC Packings)，在20μl/min的流速下脱盐。然后这个捕获柱和一个分析用的75μm×150mm C18柱(LC Packings)相连接，肽混合物就在200nl/min的流速下，从这个柱子上洗脱进入装有Protana NanoES的电喷雾离子源的QSTAR pulser i中。Agilent 1100毛细液相系统(Agilent Technologies)用来提供流动相A(0.5％乙酸/水)和流动相B(0.5％乙酸/乙腈)，线性梯度是60分钟内5％B到50％B，30分钟内50％B到90％B，然后是在90％B停留15分钟。在分析柱后通过一个不锈钢的两通(Valco Instrument)连接一个10μm直径的PicoTip纳喷雾头(New Objective)，加上2500-3000伏的喷雾电压，以获得稳定的喷雾。

MS/MS串联质谱谱图通过信息依赖的采集(IDA)和任务-循环增强来记录。在每个测定扫描中，选取3-6个信号最强、带2到3个电荷的离子，用滚动碰撞能量打碎，以获得串联质谱的信息。喷雾电压＝3000，DP＝50，FP＝220，MS扫描范围为m/z 450-1400，MSMS扫描范围为m/z 50-1800，GS1＝20，帘气为10，所用离子源为Protana NanoES电喷雾离子源。

6、质谱数据的生物信息学处理及日本血吸虫排泌蛋白的鉴定：

质谱搜索用的数据库，包括从11717个从公共数据库NCBI下载的日本血吸虫蛋白质序列(时间是2008年10月16日)。搜索软件是MASCOT(http://www.matrixscience.com/，Matrix Science)。搜索参数为：最大漏切点，3个；monoisotopic；肽电荷数，+1/+2/+3；修饰，半胱氨酸carbamoylmethylation和methionine氧化。搜索结果合并后，用下列标准进行过滤筛选：

1.对每一个串联质谱谱图的搜索结果列表，只提取排位在第一个的结果，其他的则丢弃；

2.搜索得到的肽段中如果有KR，KK，RK，RR等序列，则这个肽段丢弃；

3.搜索得到的肽段，长度在8个氨基酸以上的保留，小于8个氨基酸的丢弃；

4.重复打到的肽段，只计算其中分值最高的，把这些肽段分值加起来，做为蛋白的得分；

5.蛋白的得分超过60，就认为是可信的结果。低分的蛋白，手工检查后保留或者丢弃。匹配到宿主或者牛胰酶、角蛋白的肽段，则丢弃。

同时进行反向蛋白质序列数据库的搜索。反向蛋白库是将日本血吸虫蛋白质序列反转，保持长度、组成不变。根据正向库和反向库搜索得到的结果，确定假阳性率。计算方法：假阳性＝2*(反向库肽段数)/(正向库肽段数+反向库肽段数)。假阳性控制在0％。

二、结果

1)从被感染的动物血清中直接鉴定日本血吸虫的排泌蛋白

在国际上首次从被感染的动物血清中直接鉴定日本血吸虫的排泌蛋白。鉴定到日本血吸虫腺苷脱氨酶的2个肽段(表1)，证明了日本血吸虫的腺苷脱氨酶的确存在于宿主动物的血清中，可以被检测到，因而可以成为血吸虫临床诊断的靶标分子。

表1、日本血吸虫腺苷脱氨酶在被感染的动物血清中被发现和鉴定

2)日本血吸虫腺苷脱氨酶的序列保守性

本实施例鉴定到的日本血吸虫腺苷脱氨酶的肽段，都经过与宿主动物即兔子的序列的比较，发现这些肽段都是血吸虫特异的、不同于宿主。

3)日本血吸虫腺苷脱氨酶的功能

腺苷脱氨酶(EC：3.5.4.4)是嘌呤核苷代谢中重要的酶类，属于巯基酶。本实施例中的结果表明日本血吸虫的腺苷脱氨酶可以分泌到宿主的血液中，和宿主的免疫系统直接接触，推测可能发挥重要的免疫调节作用。因此，可以通过在感染动物或人体血液中检测血吸虫腺苷脱氨酶的存在，从而判断是否感染血吸虫，或者判断药物治疗后的驱虫效果。

序列表

<110>上海人类基因组研究中心

<120>日本血吸虫腺苷脱氨酶基因、其编码蛋白及应用

<130>NP-09-13221

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1333

<212>RNA

<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400>1

tttcagttat gtggctacct ttggatttgt ttgggattaa cttgcatgtc catctagatg     60

gttccattag gccagaaacg ttgtttgagt tatcaaatga taaaatatcc aaacctcagt    120

ttaaaacctt ggaagagctc aaagacaagt taacgcctaa aaagccacac agtttaaaag    180

acttcctgaa agcttttgag ataataatac cattaattgc tggtaagaaa gaggttttgg    240

cgcgtatatg tgaagaattc gtagaagatt gtgtacaacg tggtggttta tgttatgcgg    300

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aatctttact tcaagcaggt gtacatttcg aggtatgccc atcatcgagt tttgttacgg    780

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ctaacttctc tattaatacc gatgatccaa cattaacaga gagatgggat ttacaagaag    900

cacaatattg tttagaaaca ttaggtataa aacctagcca attaataaat gctaattata    960

atgctgcaat ctcagcattt cttactactt ctgaaaaaga aatcttaatt tcccatataa   1020

atattagatc aagaaataga ataatcaaaa ttcactccaa aacataattg ccagcttttg   1080

tttagaaaat gatgaattga aacaaaacaa aaatcaaatt aatgtccaat tataaaataa   1140

tcttggaatt tattttacat agtaactaat ctatgtttga aatgcttaag ttgataacct   1200

cattcattag aattagtgaa taaattcttg tttcttttat gaaaaatttc tctattgtga   1260

atttaacttt tgttttattg aattgatttt ctattcccgg gacattcccc tatatagctg   1320

ttttgttctg ggt                                                      1333

<210>2

<211>352

<212>PRT

<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)

<400>2

MWLPLDLFGI NLHVHLDGSI RPETLFELSN DKISKPQFKT LEELKDKLTP KKPHSLKDFL     60

KAFEIIIPLI AGKKEVLARI CEEFVEDCVQ RGGLCYAETR YCPFLLADSR LNAEEVLKTI    120

LDSLNRASKK HGIEVRSILS IMRHMPETAS ETLELAKNYQ PHGVVAIDVA GDDSVLKSQR    180

LPNEIVQTFE EAKKAGIHRT VHVGENSPAS SVYEAVNILH AERIGHGYHI LDDEKAYKSL    240

LQAGVHFEVC PSSSFVTGSV DSKILNNHPL HRFIEDKANF SINTDDPTLT ERWDLQEAQY    300

CLETLGIKPS QLINANYNAA ISAFLTTSEK EILISHINIR SRNRI IKIHS KT           352

Claims (8)

1.一种日本血吸虫腺苷脱氨酶基因，其特征在于：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的日本血吸虫腺苷脱氨酶基因，其特征在于：所述的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.2所示序列的蛋白。

3.一种日本血吸虫腺苷脱氨酶，其特征在于：具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。

4.一种日本血吸虫腺苷脱氨酶在制备血吸虫疫苗中的应用。

5.一种日本血吸虫腺苷脱氨酶在筛选药物中的应用。

6.一种日本血吸虫腺苷脱氨酶在制备抗血吸虫抗体中的应用。

7.一种日本血吸虫腺苷脱氨酶在血清学诊断方面的应用。

8.一种日本血吸虫腺苷脱氨酶基因在基因治疗方面的应用。